Summary
Эта статья демонстрирует, как мыши эмбриональные задний мозг может использоваться в качестве модели для изучения развития нейрогенез в целом органа и ткани секции подготовки.
Abstract
Переднего мозга эмбриона мыши является наиболее часто работающие системы для изучения млекопитающих нейрогенез во время разработки. Однако очень складчатые переднего neuroepithelium не поддается wholemount анализ для изучения нейрогенез орган всей модели. Кроме того определение механизмов нейрогенез переднего мозга не обязательно прогнозировать нейрогенез в других частях мозга; Например, благодаря наличию переднего конкретных прародитель подтипы. Задний мозг мыши обеспечивает альтернативную модель для изучения эмбриональных нейрогенез, которая поддается wholemount анализа, а также разделов ткани соблюдать пространственно-временных распределения и поведение нейронных прародителей. Кроме того он легко расчлененные для других нисходящие приложения, такие как анализ изоляции или молекулярной биологии клетки. Как задний мозг мыши могут легко анализироваться в огромное количество клеток линии репортер и мыши мутантных штаммов, которые стали доступны, он предлагает мощную модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов развития нейрогенез в млекопитающих организм. Здесь мы представляем простой и быстрый метод, чтобы использовать задний мозг зародыша мыши для анализа поведения млекопитающих нейронных прародитель клеток (NPC) в подготовке wholemount и разделах ткани.
Introduction
Во время эмбрионального развития млекопитающих НИПы разделить желудочков (VZ) и субвентрикулярной зоны (SVZ) нейроэпителия расширение для создания новых нейронов в процесс называется «нейрогенез». Поколение новых нейронов и их прекурсоров NPC широко исследована в переднего1, пока меньше известно об этом процессе в других регионах.
Мозга является сложной и сложной сложил структура, во многом учился с гистологических методов после разрезания ткани, что делает понимание нейрогенез шаблонов через весь орган сложной. Кроме того исследования переднего нейрогенез не обязательно прогнозирования нейрогенный поведения в других регионах мозга или спинного мозга. Например сигнализации, что сигналы могут выявить различные ответы в различных регионах ЦНС, как отмечено в случае цилиарной нейротрофических факторов и лейкемия ингибирующего фактора, которые способствуют самообновлению НИПы в боковые Ганглиозный возвышение, но диск дифференциация спинного прародителями2. Кроме того, отсутствуют суб класс NPCs, которые заполняют развивающегося мозга и в значительной степени способствовать расширению коре1 задний мозг и спинной мозг3. Наоборот это мыслимо, что спинного мозга и задний мозг содержат альтернативные NPC подтипы не присутствует в коре головного мозга.
Задний мозг зародыша мыши эволюционной старейший район млекопитающих мозга и генерирует мозжечка и ствола мозга. Несмотря на его сохранения видов относительно мало известно о задний мозг нейрогенез, включая подтипы NPC или их регулирования. Большинство исследований задний мозг мыши была сосредоточена на процесс сегментации ткани, движимый гомеозисных генов4и структурирования пост митотическая нейронов5. Кроме того как модель для изучения механизмов развития ангиогенеза6использовался задний мозг.
В отличие от мыши задний мозг данио рерио задний мозг широко используется NPC дифференциации и линии прогрессии в организме позвоночных модель (например,,78). Задний мозг куриных также были использованы для изучения нейрогенез во время позвоночных разработки (например,9,10). Подобно данио рерио задний мозг11, куриных задний мозг может быть живой образ для изучения поведения NPC и регулирование в течение времени12. Наблюдением живой изображений аналогичные продольной возможен не в настоящее время в организмах млекопитающих, потому, что они разрабатывают внутриутробно. Кроме того целевые манипуляции через методы, такие как электропорации могут быть легко применены Свободноживущие zebrafish эмбриона или куриных эмбрионов в ovo (например,13), но такие методы являются также более сложным в внутриутробно.
Тем не менее задний мозг зародыша мыши изысканно подходит определение молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют нейрогенез. Во-первых анализ задний мозг мыши во многих случаях, предоставит информацию, более актуальными для людей события чем получены путем изучения Нижняя позвоночных. Кроме того, огромное количество штаммов генетически модифицированные мыши доступны что может либо использоваться для сопоставления мышиных НИПы судьбы или изменить механизмы регулирования с учредительных или условного мутантные аллели соответствующих генов. Наконец, он недавно было показано, что микроинъекции желудочков задний мозг прародителями ex vivo позволяет по крайней мере краткий анализ задний мозг NPC кинетики14. Тем не менее, в настоящее время, очень мало известно о пространственно-временных Организации и поведение задний мозг НИПы в контексте всего органа.
Здесь мы показываем, простой и быстрый способ использовать задний мозг как мощная модель для анализа млекопитающих поведение NPC в разделах ткани и wholemount препараты. Мы далее предоставляют протоколы для использования immunolabeling для изучения параметров различных Нейрогенез и процесс задний мозг образцы далее вниз по течению молекулярной приложений таких количественных обратной транскриптазы (qRT)-PCR.
Protocol
Все животные работа была проведена в соответствии с UK Home Office и местные этические принципы.
1. изложение шагов и времени
- Выполнять приурочен вязки взрослых мышей от штамм подходит для ответа на биологические вопрос расследуется для получения эмбриональных день (e) 9,5 e13.5 беременности; требуется 12-15 дней.
- При необходимости, подготовить 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) / 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) решения и выполнения инъекции (протокол раздел 2); требует ~ 1 час в день до или в день эмбриона изоляции, в зависимости от желаемой длины EdU/BrdU маркировки.
- Выполнения диссекции эмбриона изоляции и задний мозг (протокол раздел 3); требует ~ 10 мин/эмбриона.
- Выполнить wholemount иммунофлюоресценции маркировки (протокол раздел 4); требует 3 дней.
- Раздел с помощью vibratome и выполнять плавающей секции иммунофлюоресценции маркировки (протокол раздел 4): требует 2 дней.
- Раздел с помощью криостат и выполнять иммунофлюоресценции маркировки cryosections (протокол раздел 5); требует 2 дней.
2. придать беременных женщин мышь с BrdU или Эду (опционально)
- Растворите BrdU или EdU в стерильных фосфатный буфер (PBS) до концентрации 10 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно.
Предупреждение: BrdU и EdU токсичны; надевайте соответствующую защиту. - Весят беременных мыши и вычислить объем BrdU или EdU решения, которое должно осуществляться для достижения 100 мг/кг BrdU или 5 мг/кг EdU.
- Внедрять решение BrdU или EdU через внутрибрюшинного маршрут либо 1 ч или 1 день до получения эмбрионов, в зависимости от необходимой длины маркировки.
Примечание: Маркировки для 1 h визуализирует задний мозг клеток в S-фазе. Маркировка на 1 день визуализирует потомства задний мозг РНУ.
3. Вскрытие Hindbrains от e9.5 - e13.5 мышь эмбрионов
- Усыпить приурочен беременные женщины мыши, с помощью этически утвержденной процедуры на стадии требуется гестационного (например, шейки матки дислокации). С помощью острых ножниц, разрезали брюшной полости и тщательно акцизных матки. Место подакцизным матки, содержащего эмбрионы в 60 мм пластиковая блюдо, содержащий 20 мл ледяной PBS.
Примечание: Асептической техники не требуется. - Выполните все дальнейшие рассечение, с использованием рассечения микроскопа. С помощью часовщик щипцы номер 5, разорвать мышцы матки стены, чтобы разоблачить эмбрионы, выпуск каждого эмбриона путем разрыва пуповины и удалить желточного мешка.
- Используя широкий родила открытия стерильные пипетки Пастера, передача каждого эмбриона в чистые пластиковые блюдо с ледяной PBS.
- С помощью часовщик щипцы номер 55, разорвать голову (Рисунок 1E).
- При необходимости сохраните небольшой кусок ткани (например, ¼ желточного мешка или примерно 2 мм кончик хвоста) для геномной ДНК изоляции и последующих генотипирования.
- С помощью часовщик щипцы номер 55, акцизных ткани, содержащие задний мозг параллельно и немедленно ниже neuroepithelium задний мозг, чтобы отделить его от лица и переднего ткани (Рисунок 1F).
- Установите задний мозг и спинной стороне хвостового ткани головы вверх и идентифицировать 4й желудочек, которая покрыта тонким слоем ткани (плиты крыши). Тщательно проколоть пластину крыши с помощью часовщик щипцы номер 55 (рис. 1 g) и очистить от избыточной ткани с щипцами, рострально двигаясь вдоль средней линии над мозга, а затем каудально над задней задний мозг и спинной мозг (Рисунок 1 g ); задний мозг теперь должна быть доступна в открытой книге подготовка (Рисунок 1 H).
- Подготовка hindbrains wholemount immunolabeling (вариант 1).
- С помощью часовщик щипцы номер 55, тщательно дразнить прочь оставшихся головы мезенхимы и любой мозговых оболочек, придает сетчаточных стороне задний мозг, используя пинцет (Рисунок 1I). Удаление мозга и спинного тканей (Рисунок 1J) оставить только задний мозг ткани (рис. 1 K).
Примечание: Этот шаг процедуры не следует e9.5 или e10.5, потому что попытка сделать это будет скорее всего ущерба задний мозг neuroepithelium; Кроме того удаление мозговых оболочек не является существенным, потому что neuroepithelium задний мозг достаточно тонкий на данном этапе, чтобы позволить эффективного проникновения антител для immunolabeling. Этот шаг следует, однако, следовать от e11.5 года, когда консолидирует менингеальные ткани, активизировать проникновение антитела в задний мозг neuroepithelium. Диссекция является простым, при выполнении в ледяной PBS (использование чистой PBS для каждого задний мозг).
- С помощью часовщик щипцы номер 55, тщательно дразнить прочь оставшихся головы мезенхимы и любой мозговых оболочек, придает сетчаточных стороне задний мозг, используя пинцет (Рисунок 1I). Удаление мозга и спинного тканей (Рисунок 1J) оставить только задний мозг ткани (рис. 1 K).
- Подготовка hindbrains к vibratome и cryosectioning (вариант 2)
- С помощью часовщик щипцы номер 55, удалите мозга и спинного тканей (Рисунок 1J).
Примечание: Нет необходимости снимать мезенхимы и мозговых оболочек hindbrains предназначен для разрезания (как показано на рисунке 1I).
- С помощью часовщик щипцы номер 55, удалите мозга и спинного тканей (Рисунок 1J).
- Передачи hindbrains из пластиковых блюдо круглодонные 2 мл пробирок с помощью пипетки Пастера, аспирационная все PBS и исправить втечение 2 ч при температуре 4° C с нежно агитации в свежей талой формальдегида 4% w/v, растворенных в PBS.
Предупреждение: Формальдегид токсичных; надевайте соответствующую защиту. - Промывайте hindbrains 3 x раз с PBS. Хранить при 4 ° C в PBS, если immunolabeling будут начинаться в течение 2-3 дней или заменить PBS methanol/50% PBS 50% за 5 мин до перехода на 100% метанола для более длительного хранения при-20° C.
4. Wholemount иммунофлюоресценции
- Если требуется, увлажняет hindbrains в последовательно уменьшается разведений метанола в PBS (например, метанол 75%, 50% метанола, 25% метанола) при комнатной температуре (RT) за 5 мин и затем перенести на PBS.
Примечание: Адаптированная серия метанола требуется мягко увлажняет hindbrains и обеспечить сохранение надлежащего ткани. - Разрушения hindbrains за 30 мин при температуре 4 ° C в PBS, содержащие 0,1% тритон X-100 (PBT) с нежным агитации.
- Инкубируйте hindbrains за 1 час при 4 ° C в ПБТ, содержащие 10% тепло инактивированная козьего сыворотки с нежным агитации.
Примечание: Использование сыворотки от видов хост, что вторичные антитела были подняты в. Для первичного антитела, поднятые в козла, инкубировать в сыворотке свободно белка блока, например 5% бычьего сывороточного альбумина в подходящей альтернативой коммерческим или PBS (см. Таблицу материалы). Это позволит уменьшить неспецифичный пятнать, часто наблюдается при использовании первичного антитела, поднятые в козла. - Инкубировать hindbrains на ночь при 4 ° C в ПБТ, содержащей 1% тепло инактивированная сыворотки и первичных антител с нежным агитации (например, кролик анти фосфористой гистонов H3 [pHH3] разводят 1: 400).
Примечание: Для первичного антитела, поднятые в козла, используйте PBT без сыворотки. - Мыть hindbrains на 4 ° C 5 x с PBT за 1 час.
- Инкубируйте hindbrains на ночь при 4 ° C в ПБТ, содержащие соответствующие конъюгированных Флюорофор вторичные антитела (например, коза анти кролик Alexa Fluor 488) при 1: 200 в ПБТ, направлены против основного антитела, которые используются. Держите hindbrains в темноте здесь на защитить флуорофоров от Фотообесцвечивание.
Примечание: Для первичного антитела, поднятые в козла, используйте анти коза Fab фрагментов вторичных антител для уменьшения неспецифичный пятнать. - Мыть hindbrains на 4 ° C 5 x с PBT за 1 час.
- Постфиксная hindbrains в 4% формальдегида в PBS для 15 мин на RT для долгосрочного сохранения антитела связывая. Кратко промывайте дважды в PBS.
- Покрытие стекла микроскопа с двумя слоями черной изоленты и акцизных небольшой площади из слоистых ленты для создания кармана, достаточно большой, чтобы держать один задний мозг.
- Перевод каждого задний мозг в карман с пипетка Пастера, удалить лишнюю жидкость и добавить соответствующие antifade реагента в карман перед покрывая его медленно с стекла coverslip, чтобы избежать захвата воздушных пузырей под coverslip. Уплотнение coverslip и прикрепить его к слайду с тонким слоем лака. Сохранить слайд на 4 ° C в темноте до захвата изображений (протокол раздел 7).
5. Vibratome секционирование и плавающей секции иммунофлуоресценции
- При необходимости, увлажняет hindbrains от метанола, как описано в пункте 4.1.
- Внедрение hindbrains в расплавленном 3% w/v агарозы подготовлен в дистиллированной воде.
Примечание: Разрешить расплавленной агарозы остыть до приблизительно 55° C кратко перед встраивания для предотвращения повреждения тепла задний мозг. - Вырежьте поперечный задний мозг секции толщиной 70 мкм, с помощью vibratome. Перевод каждого свежесрезанных секции с кистью в одну скважину 24-ну пластины, содержащие ледяной PBS.
- Этикетке плавающей секции, как описано в шагах 4.2-4,7, но изменять шаги следующим: Вымойте плавающей секции на 4 ° C 3 x с PBT 15 мин каждая, уменьшить время инкубации для вторичных антител к 2 h, и инкубировать в вторичное антитело на RT.
- При необходимости после маркировки с антитела для другие epitopes, как описано в шаге 5.4, обнаружить Эду+ ядер с помощью EdU маркировки комплект согласно инструкциям производителя. Инкубируйте плавающей секции в реакции коктейль на 30 минут при 37 ° C в темноте. Задний мозг мыть разделы на 4 ° C 3 x 15 мин с PBT.
- При необходимости после маркировки для другие epitopes, как описано в шаге 5.4, обнаружить следующим BrdU+ ядер.
- Инкубируйте плавающей секции в 2 N соляной кислоты при 37 ° C на 30 мин в темноте.
- Инкубируйте плавающей секции в 0,1 М Борат натрия буфер рН 8,5 дважды за 5 мин на RT в темноте, чтобы нейтрализовать соляную кислоту.
- Вымойте плавающей секции 3 x кратко в PBS на 4 ° C.
- Выполните иммунофлюоресценции, обозначать BrdU как описано в пункте 5.4.
- Инкубируйте плавающей секции для 2 мин на RT в 10 мкг/мл 4', 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI) в PBS в изображение клеточных ядер.
- Постфиксная плавающей секции в 4% формальдегида для 15 мин на RT.
- Вымойте плавающей секции кратко в PBS. Тщательно передачи плавающей секции стекло микроскопа с помощью кисти. Вытереть излишки PBS вокруг раздела с помощью промокательной бумаги или ткани.
- Смонтируйте разделы, с помощью 80% глицерина в PBS и крышку медленно с coverslip стекла во избежание захвата воздушных пузырьков. Сохранить слайд на 4 ° C в темноте до захвата изображений (шаг 7).
6. криостата секционирование и Cryosection иммунофлюоресценции маркировки
- При необходимости, увлажняет hindbrains от метанола, как описано в пункте 4.1.
- Инкубируйте hindbrains в 30% w/v сахарозы в ФБР в cryoprotect hindbrains до замораживания.
Примечание: Hindbrains готовы для замораживания, когда они потоплены на дно трубки, которая обычно занимает ≤ 2 h для e9.5 10,5 hindbrains и 3-6 ч для hindbrains e11.5 13,5. - Погрузите hindbrains оптических резки температуры смеси (OCT) и быстро заморозить путем передачи формы, содержащие hindbrains в OCT изопентан, охлаждается до-40 ° C до-50 ° C на сухой лед.
Примечание: Замороженные, встроенный hindbrains может храниться при-20 ° C краткосрочной и долгосрочной перспективе-80 ° C до секционирование. - Вырежьте поперечный задний мозг секции толщиной до 10 мкм с помощью криостат и передачи электростатически клей Микроскоп слайды.
Примечание: Cryosections задний мозг может храниться при-20 ° C краткосрочной и долгосрочной перспективе-80 ° C до маркировки. - Инкубируйте слайды в РТ за 15 мин высохнуть разделы слайды. Мыть cryosections с PBS растворить OCT и Марк гидрофобный барьер вокруг cryosections с помощью пера PAP. Повторите шаги 5.4-5.8.
- Повторите шаг 5.10 использование поливинилового спиртовой основе монтажа средних вместо глицерина.
7. изображение приобретение
- Примеры изображений с помощью epifluorescent или Конфокальный микроскоп лазерное сканирование с линзы подходят для водного медиа монтируется слайды и светофильтры подходят для флуорофоров, используемые для immunolabeling.
- Для изображения весь задний мозг или задний мозг секции, используйте объектив для 10 крат (например, Рисунок 2B); чтобы визуализировать hindbrains областей для количественной оценки, используйте 40 кратном (например, Рисунок 2D), а также визуализировать отдельных ячеек, используйте объектив с 63 x увеличением (например, рис. 2 c).
8. альтернативные методы
- После шаг 3,8 гомогенизировать нефиксированных hindbrains для производства одноклеточного подвеска для проточной цитометрии приложения15.
- После шаг 3,8 гомогенизировать нефиксированных hindbrains чтобы извлечь РНК из одной ячейки суспензий для RT-ПЦР (например, 16).
Примечание: Убедитесь, что все реагенты и оборудование находятся стерильные и РНКазы бесплатно на протяжении для предотвращения деградации РНК. - После шаг 3,8 гомогенизировать нефиксированных hindbrains изолировать НПС и распространять их в vitro как neurospheres для анализа задний мозг NPC поведение17.
Примечание: Убедитесь, что все реагенты и оборудование находятся стерильные для предотвращения загрязнения бактериальное/грибковых культур нейросферы.
Representative Results
Этот раздел иллюстрирует примеры результатов, которые могут быть получены при изучении нейрогенез в эмбриональных задний мозг мыши через wholemount и ткани раздел анализа.
Мы покажем что wholemount immunolabeling microdissected задний мозг с антитело для митотическая маркер pHH3 визуализирует деления НИПы в VZ (Рисунок 2B – D). Мы показываем pHH3+ НПС с высоким увеличением выделить различные этапы митоза (рис. 2 c). Мы показывали этот обозначая метод подходит для выполняться на несколько последовательных этапов развития задний мозг соблюдать время курс ВСНП митоз в этом органе (Рисунок 2D).
Мы покажем, что визуализации поперечных полученных vibratome разделы задний мозг 1 ч после инъекции Эду, визуализирует расщепления ориентации митотическая РНУ (рисунок 3B), псевдомногослойный, interkinetic миграции ядерного модель Велоспорт прародителями18 (рисунок 3B, D) и общая структура VZ ( Dрисунок 3B – ). Обратите внимание, что митотическая pHH3+ НПС присутствуют только на поверхности желудочков и не более basally (рис. 3 c), которая контрастирует базальной отдел шаблон более совершенные РНУ в переднего19.
Мы также иллюстрируют, как велосипедные НПС и их дифференцированной потомства могут быть помечены с BrdU или EdU оценить NPC линии прогрессии (рис. 4). Immunolabeling поперечной cryosections задний мозг мыши 1 день после инъекции BrdU BrdU и Ki67показывает число и расположение Велоспорт НИПы в neuroepithelium (рис. 4A, B), согласно которой количество само обновление NPC могут быть определены путем вычисления процент Ki67+ BrdU+ ячейки среди всех ячеек BrdU+ (Рисунок 4A, C).
Наконец мы покажем пример immunolabeling задний мозг vibratome секций для RC2, антиген в нейронных конкретных промежуточного накаливания Нестин, чтобы визуализировать NPC endfeet (Рисунок 5B) и процессы (рис. 5 c). Vibratome секции, а не тонкие cryosections, позволяют улучшение наблюдения чрезвычайно разветвленной NPC, а также общей структуры нейроэпителиальных.
Рисунок 1 : Ключевые шаги в рассечение задний мозг из эмбриона мыши e11.5. ( DA – ) Схематически microdissection задний мозг. (A) хвостовой головы ткани удаляется путем отсечения вдоль красной пунктирной линии. (B) плиты крыши пронзил и затем войной прочь в ростральной и хвостовой направлениях вдоль средней линии (вертикальной красной линии) и затем боково раскрыть neuroepithelium задний мозг. (C) neuroepithelium разжал от мозговых оболочек после вставки щипцы между обеими структурами, и тканей мозга и спинного мозга, удаляются по разрыву ткани с щипцами вдоль красной пунктирной линии. (D) Эта процедура дает плоский задний мозг. (KE–) Захват изображения из ключевых этапов в процедуре microdissection задний мозг. (E) эмбрион обезглавлен, разорвав вдоль пунктирной линии. (F) задний мозг и 4й желудочек, окруженная плиты крыши, вырезана и отделены от головы отсечения по пунктирным линиям. (G) 4й желудочек ориентирован вверх прежде чем небольшое отверстие является пронзили на знаке крыши (звездочка). Отверстие расширяется, пилинг ткани тщательно и рострально каудально вдоль средней линии (стрелки) подвергать задний мозг. Задний мозг это позиционируется сетчаточных стороной вниз и влево, чтобы сложить из в открытой книге подготовки (H; черная стрелка указывает задний мозг нервной ткани). Если задний мозг требуется для wholemount immunolabeling, сетчаточных мембрану удаляется, нежно выломав задний мозг neuroepithelium от окружающих менингеальные мембраны, с помощью щипцов, (я). Превышение среднего мозга (МБ) и спинного мозга (sc) ткани является удаленным (пунктирные линии в J) изолировать задний мозг (K). Линейки: 500 мкм (E), 300 мкм ( KF – ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Wholemount immunolabeling может использоваться для количественного определения NPC митозов через задний мозг. (A) схемы, иллюстрирующие en лицом изображений митотическая РНУ в слое желудочков задний мозг. V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. (B) конфокальный плитка сканирования z стек задний мозг e10.5, после wholemount immunolabeling для pHH3 митотическая маркер (красный). Белый квадрат обозначает область показана на увеличение на второй панели в (D). (C) предварительно анафазе (белая стрелка) и митотические фигуры анафазе (черная стрелка) различимым в течение всего когорты митотическая РНУ. (D) время курс wholemount pHH3 маркировки от e9.5 13,5. Масштаб бары: 500 мкм (B); 20 мкм (C); 100 мкм в (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Велоспорт НИПы в пределах их зародышевые зоны в ростральной задний мозг. (A) схема, изображающих положение митотическая (зеленый) и S-фазы (красный) NPC на задний мозг желудочковой поверхности и в районе лейкомаляция, соответственно. В увеличение справа отображается виртуальный сечение через задний мозг. Черная стрелка указывает направление миграции NPC потомства, что вышли клеточного цикла к зоне дифференциации. (B) конфокальный z стек плавающей секции задний мозг e11.0 из эмбриона, который получил 1 h EdU импульса; immunolabeling для pHH3 и EdU был использован для визуализации митотическая (зеленый) и S-фазы (красный) НПС, соответственно. Задний мозг поверхности обозначаются пунктирными линиями; V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. Области, свидетельствует белая коробка показана на увеличение в вставкой; стрелки указывают плоскости спайности NPC в анафазе, по отношению к поверхности желудочков. (C) один канал отображения pHH3 immunolabeling только. Митотическая НИПы обозначаются голубой стрелок; Δ. (D) одноканальный отображение EdU маркировки только указывается отсутствие базальный отделы. Эду+ НПС принять псевдомногослойный распределения из-за их interkinetic ядерной миграции. Расстояние, на которое НИПы мигрируют от поверхности желудочков может быть измерена, как указал представитель оранжевой линией. Масштаб бары: 100 мкм (B -D); 10 мкм в врезные (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Объединение BrdU с Ki67 маркировки для определения способности самообновлению задний мозг NPC. (A) конфокальный z стек задний мозг cryosection e10.5 после маркировки для Ki67 (зеленый) и BrdU (красный) после 1 день BrdU пульс. Двойной положительных клеток в зоне желудочков, NPCs, которые включали BrdU и по-прежнему движутся через клеточный цикл, как указано Ki67 маркировки. Доля двойной меченых клетки среди всего населения BrdU+ представляет процент (самостоятельного обновления NPCB, C). Одноместный каналы Отображение Ki67 (B) и BrdU (C) immunolabeling только. BrdU+ клеток, что не хватает Ki67 и поэтому, вероятно, покинувшую клеточный цикл обозначается голубой стрелкой (A,C). Задний мозг поверхности обозначаются пунктирными линиями; V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. Линейки: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Нестин immunolabeling визуализирует NPC процессов и endfeet. ( CA – ) Иммунофлюоресценции для RC2, который признает epitope на нейронных промежуточного накаливания Нестин, иллюстрирующий NPC морфология neuroepithelium задний мозг. (A) конфокальный z стек плавающей секции из e11.5 задний мозг после RC2 immunolabeling; в штучной упаковке районов показаны на увеличение в (B, B'; апикальной/желудочков региона) и (C, C'; базальной региона). Задний мозг поверхности обозначаются пунктирными линиями; V, желудочковая задний мозг стороне; P, стороне сетчаточных задний мозг. (B, C) Конфокальный z стеки в штучной упаковке районов (A); один оптический разделы отображаются в (B', C'), соответственно. NPC апикальной endfoot якорь на поверхности желудочков обозначается стрелкой (B). Одно- и fasciculated процессы NPC обозначаются белые и черные стрелки в (C'), соответственно. Масштаб бары: 100 мкм, (A); 25 мкм (B, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Этот протокол описывает, как использование эмбриональных задний мозг мыши как модель для изучения механизмов развития нейрогенез. С помощью различных методов различных immunolabeling, задний мозг NPC могут быть визуализированы, и их число количественно в разделах ткани или органа wholemounts. Простота диссекции и плоские анатомии гарантирует, что задний мозг может отражаться в подготовке «открытая книга» для сбора информации на нейрогенез орган всей модели.
Далее мы покажем, что NPC морфологии и связанных с клеточного цикла NPC позиционирования могут быть легко визуализированы в плавающей- или cryosections задний мозг. Обе поведения может быть использована для определения новых прародитель населения, как ранее было выполнено в млекопитающих конечного мозга20. К примеру раннем образована Sox2+ neuroepithelia и апикального радиальной глии Pax6+ присутствуют в задний мозг21,22, но задний мозг не хватает базальной прародителями Tbr2+ 3 .
Протокол, описанные здесь, также может быть адаптирована к наблюдать за поведением определенных NPC субпопуляций, люминесцентные маркировки для живых изображений и/или линии трассировки в фиксированных тканей. Это может быть достигнуто, например, изучая hindbrains от мышей, перевозящих тамоксифен индуцибельной трансген Sox1-iCreERT2 и Rosa26tdTomato репортер23.
Помимо повышения знаний о мышиных нейрогенез, изучая задний мозг может прояснить широко соответствующие нейрогенный механизмы, которые являются общими для всех видов, потому что задний мозг является весьма сохранены мозга регионе, которая, как ожидается, будет больше похож между позвоночных видов чем переднего мозга.
Как задний мозг нейрогенез происходит за сравнительно короткий интервал времени чем переднего нейрогенез23, важно рассмотреть вопрос о необходимости для сравнения адекватно устроили эмбрионов. Соответственно экспериментальные предвзятости избегается путем подсчета и записи числа Сомит пар в эмбрион до изоляции его задний мозг. Самой ткани задний мозг является хрупким и щипцами должны поэтому рассматриваться тщательно отделяя задний мозг ткани от головы мезенхимы и мозговых оболочек; несколько «практика работает» поэтому может быть целесообразно перед попыткой рассечение ценных эмбрионов. Кроме того hindbrains должны быть переданы из одной трубы в другой с помощью пипетки Пастера широкий родила, а не щипцов, чтобы избежать повреждения (Пипетка открытия можно увеличилась на режущий кончик с чистой ножницами). Наконец хотя редко, степень включения EdU/BrdU в S-фазе NPC может быть переменной, в частности во время коротких (т.е., 1 ч) импульсов. Для улучшения маркировки, убедитесь, что EdU/BrdU должным образом расторгнут перед загрузкой раствор в шприц и тщательно привнести в брюшной полости. Бедные инъекции, например подкожно, случайно, приведет к потери или захвата EdU/BrdU решение и предотвратить его попадание кровообращение.
Disclosures
Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Василики Chantzara для проведения запланированных вязки и сотрудники группы биологических ресурсов в UCL Института офтальмологии для мыши животноводства. Это исследование было поддержано Уэллком доверять следователь награду 095623/Z/11/Z для CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
| Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
| Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
| Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
| 29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
| Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
| Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
| Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
| Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
| 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
| Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
| Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
| Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
| Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
| Mowiol | Millipore | 475904 | |
| OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
| Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
| Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Thermometer | VWR | 620-0858 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |
References
- Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
- Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
- Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
- Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
- Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
- Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
- Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
- Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
- Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
- Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
- Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
- Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).
