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Neuroscience

भ्रूण Neurogenesis के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में माउस Hindbrain

Published: January 29, 2018 doi: 10.3791/56793
Automatic Translation
1, 1
1UCL Institute of Ophthalmology

Summary

यह आलेख प्रदर्शित करता है कि कैसे माउस भ्रूण hindbrain पूरे अंग और ऊतक अनुभाग तैयारियों में विकासात्मक neurogenesis का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

माउस भ्रूण forebrain विकास के दौरान स्तनधारी neurogenesis के अध्ययन के लिए सबसे अधिक कार्यरत प्रणाली है । तथापि, उच्च तह forebrain neuroepithelium wholemount विश्लेषण करने के लिए उत्तरदाई नहीं है अंग चौड़ा neurogenesis पैटर्न की जांच । इसके अलावा, forebrain neurogenesis के तंत्र को परिभाषित मस्तिष्क के अंय भागों में neurogenesis के जरूरी पूर्वानुमान नहीं है; उदाहरण के लिए, forebrain-विशिष्ट जनक उपप्रकारों की उपस्थिति के कारण । माउस hindbrain भ्रूण neurogenesis है कि wholemount विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करता है, साथ ही ऊतक वर्गों spatiotemporal वितरण और तंत्रिका progenitors के व्यवहार का पालन करने के लिए. इसके अलावा, यह आसानी से ऐसे सेल अलगाव या आणविक जीवविज्ञान विश्लेषण के रूप में अंय बहाव अनुप्रयोगों, के लिए विच्छेदित है । माउस hindbrain के रूप में आसानी से सेल वंश रिपोर्टर और उत्परिवर्ती माउस उपभेदों कि उपलब्ध हो गए है की विशाल संख्या में विश्लेषण किया जा सकता है, यह एक स्तनधारी में सेलुलर और विकासात्मक neurogenesis के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करता है जीव. यहां, हम एक सरल और त्वरित विधि वर्तमान wholemount की तैयारी और ऊतक वर्गों में स्तनधारी तंत्रिका जनक सेल (एनपीसी) के व्यवहार के विश्लेषण के लिए माउस भ्रूण hindbrain का उपयोग करने के लिए प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

भ्रूण स्तनधारी विकास के दौरान, NPCs में विभाजित वेंट्रिकुलर (VZ) और subventricular (SVZ) क्षेत्रों के विस्तार के लिए एक प्रक्रिया में नए ंयूरॉंस उत्पंन neuroepithelium ' neurogenesis ' । नए ंयूरॉंस और उनके एनपीसी के अग्रदूतों की पीढ़ी forebrain1में बड़े पैमाने पर जांच की गई है, whilst कम अंय क्षेत्रों में इस प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है ।

forebrain एक जटिल और जटिल जोड़ संरचना है कि काफी हद तक ऊतक अनुभाग के बाद ऊतकीय तरीकों के साथ अध्ययन किया है, जो पूरे अंग चुनौतीपूर्ण भर में neurogenesis पैटर्न समझ में आता है । इसके अलावा, forebrain neurogenesis के अध्ययन के अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में या रीढ़ की हड्डी में तंत्रिकाजन्य व्यवहार के जरूरी पूर्वानुमान नहीं हैं । उदाहरण के लिए, संकेतन cues अलग सीएनएस क्षेत्रों भर में प्रतिक्रियाओं भिन्न हो सकता है, के रूप में सिलिअरी neurotrophic फैक्टर और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक है, जो पार्श्व ganglionic उभार में NPCs के स्व-नवीकरण को बढ़ावा देने के मामले में मनाया, लेकिन ड्राइव रीढ़ की हड्डी के भेदभाव progenitors2। इसके अलावा, NPCs के एक उप वर्ग है कि विकासशील forebrain आबाद और मस्तिष्क प्रांतस्था1 के विस्तार के लिए महत्वपूर्ण योगदान hindbrain और रीढ़ की हड्डी3से अनुपस्थित रहे हैं । व्युत्क्रम, यह कल्पना है कि रीढ़ की हड्डी और hindbrain शामिल वैकल्पिक एनपीसी उपप्रांतस्था में मौजूद नहीं है ।

माउस भ्रूण hindbrain स्तनधारी मस्तिष्क के विकासवादी प्राचीनतम क्षेत्र है और सेरिबैलम और brainstem उत्पंन करता है । प्रजातियों के पार अपने संरक्षण के बावजूद, अपेक्षाकृत कम hindbrain neurogenesis के बारे में जाना जाता है, एनपीसी ने उपप्रकार या उनके विनियमन सहित । माउस में hindbrain अनुसंधान के बहुमत ऊतक विभाजन की प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है, Hox जीन4द्वारा संचालित है, और बाद के पैटर्न-mitotic न्यूरॉन्स5. इसके अलावा, hindbrain विकास angiogenesis के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है6।

माउस hindbrain के विपरीत, zebrafish hindbrain बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है एक हड्डीवाला मॉडल जीव में एनपीसी भेदभाव और वंश प्रगति का पालन करें (जैसे,7,8) । चिकी hindbrain भी हड्डीवाला विकास के दौरान neurogenesis अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है (जैसे,9,10) । zebrafish hindbrain11के लिए इसी तरह, चिकी hindbrain के लिए समय12पर एनपीसी व्यवहार और विनियमन अध्ययन करने के लिए छवि जीना हो सकता है । लाइव इमेजिंग द्वारा अनुरूप अनुदैर्ध्य अवलोकन वर्तमान में स्तनधारी जीवों में संभव नहीं है, क्योंकि वे utero में विकसित. इसके अलावा, ऐसी electroporation के रूप में तकनीक के माध्यम से हेरफेर लक्षित आसानी से मुक्त रहने zebrafish भ्रूण या लड़की भ्रूण ovo में (उदा,13) पर लागू किया जा सकता है, लेकिन ऐसी तकनीक में भी अधिक चुनौतीपूर्ण है utero।

फिर भी, माउस भ्रूण hindbrain अति सुंदर आणविक और सेलुलर तंत्र है कि neurogenesis शासन को परिभाषित करने के लिए अनुकूल है । सबसे पहले, माउस hindbrain के विश्लेषण, कई उदाहरणों में, जानकारी है कि और अधिक मानव विकास के लिए प्रासंगिक है कि कम रीढ़ अध्ययन के माध्यम से प्राप्त प्रदान करेगा । इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों की एक विशाल संख्या में उपलब्ध है कि या तो भाग्य मानचित्रण murine NPCs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या प्रासंगिक जीन के गठन या सशर्त उत्परिवर्ती alleles के साथ विनियामक तंत्र में परिवर्तन । अंत में, यह हाल ही में दिखाया गया है कि microinjection वेंट्रिकुलर hindbrain progenitors पूर्व vivo की अनुमति देता है कम से hindbrain के एक संक्षिप्त परीक्षा एनपीसी ने कैनेटीक्स14। फिर भी, वर्तमान में, बहुत कम spatiotemporal संगठन और hindbrain NPCs के व्यवहार के बारे में एक पूरे अंग संदर्भ में जाना जाता है ।

यहां, हम एक सरल और त्वरित विधि प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में hindbrain का उपयोग स्तनधारी wholemount तैयारी और ऊतक वर्गों में एनपीसी व्यवहार का विश्लेषण । हम आगे प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए विभिंन neurogenesis मानकों का अध्ययन करने के लिए immunolabeling का उपयोग करें और hindbrain नमूनों की प्रक्रिया के लिए आगे बहाव आणविक अनुप्रयोगों जैसे मात्रात्मक रिवर्स transcriptase (qRT)-पीसीआर ।

Protocol

सभी पशु काम ब्रिटेन घर कार्यालय और स्थानीय नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था ।

1. कदम और समय का सारांश

  1. एक तनाव से वयस्क चूहों के समय पर संभोग करने के लिए जांच के तहत जैविक प्रश्न का जवाब देने के लिए भ्रूण दिवस प्राप्त करने के लिए (e) ९.५-e 13.5 गर्भधारण; 12-15 दिन की आवश्यकता है ।
  2. वैकल्पिक रूप से, 5-ब्रोमो-2'-deoxyuridine (BrdU)/5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) समाधान और प्रदर्शन इंजेक्शन (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) तैयार; आवश्यकता है ~ 1 दिन से पहले या भ्रूण अलगाव के दिन पर ज, EdU/BrdU लेबलिंग की वांछित लंबाई के आधार पर ।
  3. भ्रूण अलगाव और hindbrain विच्छेदन प्रदर्शन (प्रोटोकॉल धारा 3); आवश्यकता है ~ 10 मिनट/
  4. प्रदर्शन wholemount इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग (प्रोटोकॉल खंड 4); 3 दिन की आवश्यकता है ।
  5. एक vibratome का उपयोग कर अनुभाग और फ़्लोटिंग अनुभाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग (प्रोटोकॉल अनुभाग 4): 2 दिनों की आवश्यकता है ।
  6. एक cryostat का उपयोग कर अनुभाग और cryosections के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग प्रदर्शन (प्रोटोकॉल खंड 5); 2 दिन की आवश्यकता है ।

2. BrdU या EdU के साथ गर्भवती महिला माउस इंजेक्षन (वैकल्पिक)

  1. 10 मिलीग्राम/एमएल और 1 मिलीग्राम/एमएल, क्रमशः की सांद्रता के लिए बाँझ फास्फेट में BrdU या EdU बफर खारा (पंजाब) भंग ।
    चेतावनी: BrdU और EdU विषाक्त कर रहे हैं; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
  2. गर्भवती माउस वजन और BrdU या EdU समाधान है कि १०० मिलीग्राम/kg BrdU या 5 मिलीग्राम/किलो EdU तक पहुंचने के लिए प्रशासित किया जाना चाहिए की मात्रा की गणना ।
  3. intraperitoneal मार्ग के माध्यम से या तो 1 ज या 1 दिन भ्रूण इकट्ठा करने से पहले BrdU या EdU समाधान सुई, लेबलिंग की आवश्यक लंबाई के आधार पर ।
    नोट: S-चरण में 1 h के लिए लेबलिंग hindbrain कक्षों को विज़ुअलाइज़ करें. 1 दिन के लिए लेबलिंग hindbrain NPCs की संतति visualizes ।

3.9.5 ई से Hindbrains के विच्छेदन-e 13.5 माउस भ्रूण

  1. Euthanize एक समय पर गर्भवती महिला माउस आवश्यक गर्भावधि चरण पर एक नैतिक रूप से अनुमोदित प्रक्रिया का उपयोग कर (उदा, ग्रीवा विस्थापन) । तेज कैंची का प्रयोग, काट पेरिटोनियल गुहा और ध्यान से गर्भाशय उत्पाद का खुला । भ्रूणों से युक्त उत्पाद वाले गर्भाशय को ६० एमएम की प्लास्टिक डिश में रखें जिसमें 20 मिलीलीटर बर्फ ठंडे पंजाबियों से युक्त हो ।
    नोट: रोकनेवाला तकनीक की आवश्यकता नहीं है ।
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर आगे सब विच्छेदन करते हैं । घड़ीसाज़ संदंश संख्या 5 का उपयोग करना, गर्भाशय की मांसपेशी दीवार आंसू भ्रूण को बेनकाब करने के लिए, गर्भनाल विच्छेद और जर्दी थैली हटाने के द्वारा प्रत्येक भ्रूण रिहाई ।
  3. एक व्यापक बोर खोलने के साथ एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, एक स्वच्छ प्लास्टिक डिश में बर्फ ठंडे पंजाबियों के साथ एक भ्रूण हस्तांतरण ।
  4. घड़ीसाज़ संदंश संख्या ५५ का उपयोग कर, सिर (चित्रा 1E) विच्छेद ।
  5. वैकल्पिक रूप से, ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा (जैसेबनाए रखने, एक जर्दी थैली के ¼ या लगभग 2 मिमी पूंछ टिप) जीनोमिक डीएनए अलगाव और बाद में genotyping के लिए ।
  6. घड़ीसाज़ संदंश संख्या ५५ का उपयोग करके, hindbrain neuroepithelium के समानांतर और तुरंत नीचे hindbrain वाले ऊतक को चेहरे और forebrain ऊतक (चित्रा 1F) से अलग कर दें ।
  7. स्थिति hindbrain और caudal सिर ऊतक पृष्ठीय ओर ऊपर और 4गु निलय, जो एक पतली ऊतक परत (रूफ प्लेट) द्वारा कवर किया जाता है की पहचान । ध्यान से छत की थाली पियर्स घड़ीसाज़ संदंश संख्या ५५ (चित्रा 1G) का उपयोग कर और दूर संदंश के साथ अतिरिक्त ऊतक छील, rostrally पर midline साथ चलती midbrain, और फिर पीछे caudally और रीढ़ की हड्डी पर hindbrain (चित्रा 1G ); hindbrain अब एक खुली किताब की तैयारी में उजागर किया जाना चाहिए (चित्रा ज) ।
  8. wholemount immunolabeling (विकल्प 1) के लिए hindbrains तैयार करें ।
    1. घड़ीसाज़ संदंश संख्या ५५ का उपयोग करते हुए, ध्यान से चिढ़ाना दूर शेष सिर mesenchyme और किसी भी मेनिन्जेस pial hindbrain (चित्रा संदंश) का उपयोग 1I के पक्ष से जुड़ी. midbrain और रीढ़ की हड्डी ऊतक (चित्रा 1J) केवल hindbrain ऊतक (चित्रा १) छोड़ने के लिए निकालें ।
      नोट: प्रक्रिया का यह कदम ई 9.5 या ई 10.5 में पीछा नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि ऐसा करने की संभावना hindbrain neuroepithelium नुकसान होगा; इसके अलावा, मेनिन्जेस को हटाने आवश्यक नहीं है क्योंकि hindbrain neuroepithelium पर्याप्त रूप से पतली है इस स्तर पर immunolabeling के लिए एंटीबॉडी के कुशल प्रवेश की अनुमति है । यह कदम है, तथापि, ई 11.5 बाद से, जब मस्तिष्कावरणीय ऊतक समेकित, hindbrain neuroepithelium में एंटीबॉडी पैठ बढ़ाने के लिए पीछा किया जाना चाहिए । विच्छेदन सबसे आसान है जब बर्फ में प्रदर्शन ठंडा पंजाब (प्रत्येक hindbrain के लिए स्वच्छ पंजाबियों का उपयोग करें) ।
  9. vibratome और cryosectioning के लिए hindbrains तैयार करें (विकल्प 2)
    1. घड़ीसाज़ संदंश संख्या ५५ का उपयोग करके, midbrain और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों (चित्रा 1J) को हटा दें ।
      नोट: यह आवश्यक नहीं है कि mesenchyme और मेनिन्जेस को hindbrains के लिए लक्षित हो (जैसा चित्र 1Iमें दिखाया गया है) ।
  10. प्लास्टिक डिश से hindbrains स्थानांतरण गोल करने के लिए तली हुई 2 मिलीलीटर एक पाश्चर पिपेट, महाप्राण सभी पंजाबियों का उपयोग कर ट्यूबों, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए तय हौसले से गल 4% डब्ल्यू में कोमल आंदोलन के साथ/
    सावधानी: Formaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
  11. hindbrains 3x बार पंजाबियों के साथ कुल्ला । पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अगर immunolabeling 2-3 दिनों के भीतर शुरू हो जाएगा या ५०% मेथनॉल/50% पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए १००% मेथनॉल में अब भंडारण के लिए स्थानांतरित करने से पहले-20डिग्री सेल्सियस ।

4. Wholemount इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. यदि आवश्यक हो, तो पंजाब में मेथनॉल (जैसे, ७५% मेथनॉल, ५०% मेथनॉल, 25% मेथनॉल) के कमरे के तापमान (RT) में 5 मिनट के लिए प्रत्येक और उसके बाद पंजाब में स्थानांतरित करने के लिए hindbrains को कम करने के क्रम में हाइड्रेटेड ।
    नोट: मेथनॉल की एक वर्गीकृत श्रृंखला के लिए धीरे reहाइड्रेट hindbrains और उचित ऊतक संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।
  2. ०.१% ट्राइटन X-१०० (PBT) के साथ कोमल आंदोलन से युक्त पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए Permeabilize hindbrains ।
  3. कोमल आंदोलन के साथ 10% गर्मी-निष्क्रिय बकरी सीरम युक्त PBT में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए hindbrains ।
    नोट: होस्ट प्रजातियों कि माध्यमिक एंटीबॉडी में उठाया गया से सीरम का उपयोग करें बकरी में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, सीरम मुक्त प्रोटीन ब्लॉक में मशीन, उदाहरण के लिए 5% पंजाब या एक उपयुक्त वाणिज्यिक वैकल्पिक में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन ( सामग्री की तालिकादेखें). यह गैर विशिष्ट अक्सर मनाया जाता है, जब प्राथमिक एंटीबॉडी बकरी में उठाया का उपयोग कर कम हो जाएगा ।
  4. 1% गर्मी-निष्क्रिय सीरम और कोमल आंदोलन के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश विरोधी phospho citrullinated H3 [pHH3] पतला 1:400) युक्त PBT में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर hindbrains ।
    नोट: प्राथमिक के लिए बकरी में उठाया एंटीबॉडी, सीरम के बिना PBT का उपयोग करें ।
  5. 1 एच प्रत्येक के लिए PBT के साथ 4 ° c 5x पर hindbrains धो लें ।
  6. PBT में 4 ° c पर रात भर hindbrains गर्मी उचित fluorophore युक्त-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (उदा., बकरी विरोधी खरगोश Alexa Fluor ४८८) PBT में 1:200 में प्राथमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के खिलाफ लक्षित । photobleaching से fluorophores की रक्षा के लिए यहाँ से अँधेरे में hindbrains रखें.
    ध्यान दें: बकरी में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, गैर-विशिष्ट धुंधला को कम करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के विरोधी बकरी फैब टुकड़े का उपयोग करें ।
  7. 1 एच प्रत्येक के लिए PBT के साथ 4 ° c 5x पर hindbrains धो लें ।
  8. पोस्टफिक्स में hindbrains 4% formaldehyde में 15 मिनट के लिए आरटी पर एंटीबॉडी बाध्यकारी के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए । पंजाब में दो बार संक्षेप में कुल्ला ।
  9. काले बिजली के टेप के दो परतों के साथ एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड को कवर और एक छोटे से वर्ग के स्तरित टेप से एक बड़ा एक hindbrain पकड़ करने के लिए काफी बड़ी जेब बनाने के लिए उत्पाद ।
  10. एक पाश्चर पिपेट के साथ एक जेब में प्रत्येक hindbrain स्थानांतरण, अतिरिक्त तरल निकालें और coverslip के तहत हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए एक गिलास coverslip के साथ धीरे से इसे कवर करने से पहले जेब के लिए एक उचित antifade एजेंट जोड़ें. coverslip सील और नेल पॉलिश की एक पतली परत के साथ स्लाइड करने के लिए यह प्रत्यय । छवि प्राप्ति (प्रोटोकॉल अनुभाग 7) तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर.

5. Vibratome और फ्लोटिंग सेक्शन इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. यदि आवश्यक हो, reहाइड्रेट hindbrains मेथनॉल से चरण ४.१ में वर्णित के रूप में ।
  2. पिघला हुआ 3% w/v में hindbrains एंबेड agarose आसुत जल में तैयार किया ।
    नोट: पिघला हुआ agarose लगभग 55 ° c करने के लिए ठंडा करने के लिए hindbrain को गर्मी नुकसान को रोकने के लिए embedding से पहले की अनुमति दें ।
  3. एक vibratome का उपयोग कर ७० µm की मोटाई के लिए अनुप्रस्थ hindbrain वर्गों में कटौती । एक में एक तूलिका के साथ एक हौसले से काट अनुभाग 24 अच्छी तरह से बर्फ से युक्त प्लेट के एक अच्छी तरह से ठंड पंजाबियों हस्तांतरण ।
  4. लेबल फ़्लोटिंग अनुभागों के रूप में चरण 4.2-4.7 में वर्णित है, लेकिन चरणों को संशोधित निंनानुसार: 15 मिनट प्रत्येक के लिए PBT के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर चल वर्गों धो, माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 2 एच के लिए गर्मी के समय में कमी, और टी सी में माध्यमिक एंटीबॉडी में मशीन ।
  5. वैकल्पिक रूप से, चरण ५.४ में बताए गए अनुसार अन्य epitopes के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल करने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक edu लेबलिंग किट का उपयोग करके edu+ नाभिक का पता लगाएं । अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया कॉकटेल में अस्थायी वर्गों की मशीन । 15 मिनट प्रत्येक के लिए PBT के साथ 4 ° c 3x पर hindbrain वर्गों धो लें ।
  6. वैकल्पिक रूप से, चरण ५.४ में वर्णित के रूप में अन्य epitopes के लिए लेबल करने के बाद, BrdU+ नाभिक निम्नानुसार का पता लगाएँ ।
    1. अंधेरे में 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 N हाइड्रोक्लोरिक एसिड में चल वर्गों की मशीन ।
    2. ०.१ मीटर सोडियम बोराटे बफर पीएच ८.५ में फ्लोटिंग वर्गों के लिए दो बार 5 मिनट के लिए आरटी में प्रत्येक अंधेरे में हाइड्रोक्लोरिक एसिड बेअसर करने के लिए ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में संक्षेप में 3x खंड धो लें ।
    4. चरण ५.४ में वर्णित के रूप में BrdU के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग निष्पादित करें ।
  7. 10 µ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) में counterstain सेल नाभिक करने के लिए आरटी में 2 मिनट के लिए फ्लोटिंग अनुभागों की मशीन ।
  8. पोस्टफिक्स में फ़्लोटिंग अनुभागों को 4% formaldehyde के लिए RT पर 15 मिनट के लिए
  9. पंजाब में संक्षेप में फ्लोटिंग सेक्शन धो लें । ध्यान से एक तूलिका का उपयोग कर एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए अस्थायी वर्गों हस्तांतरण. सोख्ता कागज या ऊतक का उपयोग कर अनुभाग के आसपास अतिरिक्त पंजाबियों को ऊपर की ओर ।
  10. माउंट पंजाब में ८०% ग्लिसरॉल का उपयोग कर वर्गों और एक गिलास coverslip के साथ धीरे कवर हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए । छवि प्राप्ति (चरण 7) तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर.

6. Cryostat खोदी और Cryosection इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

  1. यदि आवश्यक हो, reहाइड्रेट hindbrains मेथनॉल से चरण ४.१ में वर्णित के रूप में ।
  2. पंजाब में 30% डब्ल्यू/वी सुक्रोज में hindbrains की मशीन ठंड से पहले cryoprotect hindbrains के लिए ।
    नोट: Hindbrains ठंड के लिए तैयार कर रहे हैं, जब वे ट्यूब के नीचे करने के लिए डूब गए हैं, जो आमतौर पर ई के लिए 2 ज ≤ लेता है 9.5-10.5 Hindbrains और e 11.5 के लिए 3-6 h-13.5 Hindbrains.
  3. ऑप्टिकल काटने तापमान यौगिक में hindbrains जलमग्न (oct) और सूखी बर्फ पर-४० ° c और-५० ° c करने के लिए isopentane ठंडा करने के लिए अक्टूबर में hindbrains युक्त मोल्ड स्थानांतरित करके जल्दी से फ्रीज ।
    नोट: जमे हुए, एंबेडेड hindbrains-20 ° c अल्पावधि और-80 ° c लंबे समय तक अनुभाग में संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. electrostatically चिपकने वाला माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए एक cryostat और हस्तांतरण का उपयोग कर 10 µm की एक मोटाई के लिए अनुप्रस्थ hindbrain वर्गों में कटौती.
    नोट: Hindbrain cryosections लेबलिंग तक-20 ° c अल्पावधि और-८० ° c लंबी अवधि में संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. 15 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड की स्लाइड को शुष्क वर्गों के लिए मशीन । अक्टूबर को भंग करने और एक पीएपी पेन का उपयोग cryosections चारों ओर एक hydrophobic बाधा निशान के लिए पंजाबियों के साथ धो cryosections । चरण 5.4-5.8 दोहराएं ।
  6. दोहराएँ चरण ५.१० ग्लिसरॉल के स्थान पर एक polyvinyl शराब आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर.

7. छवि अधिग्रहण

  1. एक epifluorescent या फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त लेंस के साथ सुसज्जित छवि नमूनों का उपयोग जलीय मीडिया घुड़सवार स्लाइड और ऑप्टिकल फिल्टर immunolabeling के लिए इस्तेमाल किया fluorophores के लिए उपयुक्त ।
  2. पूरे hindbrain या एक hindbrain अनुभाग की छवि के लिए, 10x आवर्धन के लिए एक लेंस का उपयोग करें (उदा., चित्र b); ठहराव के लिए hindbrains क्षेत्रों की कल्पना करने के लिए, एक 40X आवर्धन (उदा., चित्र 2d) का उपयोग करें और व्यक्तिगत कक्षों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, एक 63x आवर्धन (उदा., चित्र 2c) के साथ एक लेंस का उपयोग करें ।

8. वैकल्पिक तरीके

  1. चरण ३.८ के बाद, homogenize hindbrains प्रवाह cytometry अनुप्रयोगों के लिए एक एकल कक्ष निलंबन के उत्पादन के लिए15।
  2. ३.८ चरण के बाद, homogenize RT-qPCR (उदा., 16) के लिए एकल सेल सस्पेंशन से आरएनए निकालने के लिए फिक्स्ड hindbrains.
    नोट: आरएनए के क्षरण को रोकने के लिए सभी रिएजेंटों और उपकरणों बाँझ और RNase मुक्त रखा जाता है सुनिश्चित करें.
  3. चरण ३.८ के बाद, NPCs को अलग करने के लिए homogenize unhindbrainsed और उंहें के रूप में neurospheres इन विट्रो में प्रोपेगेट hindbrain एनपीसी व्यवहार17के विश्लेषण के लिए ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी एजेंट और उपकरण neurosphere संस्कृतियों के जीवाणु/फंगल संदूषण को रोकने के लिए बाँझ रखा जाता है ।

Representative Results

इस खंड के परिणामों के उदाहरण है कि प्राप्त किया जा सकता है जब wholemount और ऊतक अनुभाग विश्लेषण के माध्यम से माउस भ्रूण hindbrain में neurogenesis का अध्ययन दिखाता है ।

हम बताते है कि wholemount के immunolabeling के लिए एक एंटीबॉडी के साथ microdissected hindbrain mitotic मार्कर pHH3 NPCs में विभाजन VZ (चित्रा बी - डी) । हम एक उच्च आवर्धन पर pHH3+ NPCs का बँटवारा (चित्रा 2c) के विभिन्न चरणों पर प्रकाश डालते हैं. हम सचित्र है कि इस लेबलिंग विधि hindbrain विकास के कई लगातार चरणों में प्रदर्शन करने के लिए इस अंग में एनपीसी बँटवारा का समय पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए उपयुक्त है (चित्र 2d) ।

हमें पता चलता है कि इमेजिंग अनुप्रस्थ immunolabeled vibratome वर्गों के hindbrain 1 h के बाद EdU इंजेक्शन, mitotic NPCs की दरार अभिविंयास visualizes (चित्र 3 बी), pseudostratified, साइकिल चालन के काइनेटिक परमाणु प्रवासन पैटर्न progenitors18 (चित्र बी, डी), और समग्र VZ संरचना (चित्र बी - डी) । ध्यान दें कि mitotic pHH3+ NPCs केवल वेंट्रिकुलर सतह पर मौजूद है और अधिक नहीं (आंकड़ा 3सी), जो NPCs19में और अधिक प्रतिबद्ध forebrain के बेसल डिवीजन पैटर्न विरोधाभासों है ।

हम यह भी वर्णन कैसे सायक्लिंग NPCs और उनके विभेदित संतति BrdU या EdU के साथ लेबल के लिए एनपीसी वंश प्रगति का आकलन कर सकते है (चित्रा 4) । माउस के अनुप्रस्थ cryosections के immunolabeling के hindbrain 1 दिन बाद BrdU इंजेक्शन के लिए BrdU और Ki67 में साइकलिंग NPCs की संख्या और स्थिति को दर्शाता है neuroepithelium (चित्रा 4a, बी), जिससे की संख्या स्व-नवीनीकरण NPCs सभी BrdU+ कोशिकाओं (चित्रा 4a, सी) के बीच Ki67+ BrdU+ कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करके परिभाषित किया जा सकता है ।

अंत में, हम RC2 के लिए hindbrain vibratome वर्गों, तंत्रिका-विशिष्ट मध्यवर्ती रेशा nestin में एक प्रतिजन, एनपीसी endfeet (चित्रा 5B) और प्रक्रियाओं (चित्रा 5C) कल्पना करने के लिए immunolabeling का एक उदाहरण दिखाते हैं । Vibratome वर्गों, बल्कि पतली cryosections से, उच्च branched NPCs के बेहतर अवलोकन और समग्र neuroepithelial संरचना की भी अनुमति देते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : एक ई 11.5 माउस भ्रूण से एक hindbrain के विच्छेदन में महत्वपूर्ण कदम । (क - घ) hindbrain microdissection का योजनाबद्ध चित्रण. (क) caudal सिर ऊतक लाल बिंदीदार लाइनों के साथ विच्छेद द्वारा हटा दिया जाता है । (ख) छत की थाली को चुभ जाता है और फिर midline (ऊर्ध्वाधर लाल रेखाओं) के साथ दोनों rostral और caudal दिशाओं में दूर बेहाल हो जाता है और फिर बाद में hindbrain neuroepithelium प्रकट करने के लिए । (ग) neuroepithelium दोनों संरचनाओं के बीच संदंश डालने के बाद मेनिन्जेस से दूर pried है, और midbrain और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों लाल बिंदीदार लाइनों के साथ संदंश के साथ ऊतक विच्छेद द्वारा हटा रहे हैं । (D) यह कार्यविधि समतल hindbrain को पैदावार देती है । (ई-कश्मीर) hindbrain microdissection प्रक्रिया में प्रमुख चरणों की छवि कैप्चर । (ङ) भ्रूण को चिन्हांकित रेखा के साथ विच्छेद करके decapitated जाता है । (च) hindbrain और 4गु निलय, रूफ प्लेट द्वारा परिबद्ध, आबकारी और बिंदीदार रेखाओं के साथ विच्छेद करके सिर से अलग कर रहे हैं । (छ) 4th निलय एक छोटा सा छेद छत की थाली (तारे) में चुभ जाता है पहले ऊपर केंद्रित है । छेद ऊतक छीलने से चौड़ा है ध्यान से दोनों rostrally और caudally midline (तीर) के साथ hindbrain को बेनकाब । hindbrain pial पक्ष नीचे तैनात है और एक खुली किताब तैयारी में गुना छोड़ दिया (ज; काले ऐरोहेड इंगित करता है hindbrain तंत्रिका ऊतक) । यदि hindbrain wholemount immunolabeling के लिए आवश्यक हो तो pial झिल्ली को hindbrain (I) का उपयोग कर आसपास के neuroepithelium झिल्ली से धीरे से मस्तिष्कावरणीय संदंश द्वारा निकाल दिया जाता है । hindbrain (K) को अलग करने के लिए अतिरिक्त midbrain (mb) और स्पाइनल कॉर्ड (sc) के ऊतकों को निकाल दिया जाता है ( Jमें डॉटेड रेखाएं) । स्केल बार: ५०० (ई) के लिए µm, ३०० µm के लिए (F - K) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Wholemount immunolabeling hindbrain भर में एनपीसी mitoses यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । (क) योजनाबद्ध रूप से hindbrain वेंट्रिकुलर परत में mitotic NPCs के एन फेस इमेजिंग को गाये. वी, वेंट्रिकुलर hindbrain पक्ष; पी, pial hindbrain ओर । (B) फोकल टाइल स्कैन जेड स्टैक ऑफ़ e 10.5 hindbrain म् wholemount immunolabeling फॉर mitotic मार्कर pHH3 (red) । सफेद बॉक्स में (D) दूसरे पैनल में उच्च आवर्धन पर दिखाए गए क्षेत्र को इंगित करता है । (ग) प्री-anaphase (white ऐरोहेड) और anaphase (black ऐरोहेड) mitotic आंकड़े mitotic NPCs के कुल पलटने के भीतर विशिष्ठ हैं । (D) wholemount pHH3 लेबलिंग का टाइम कोर्स e 9.5-13.5 से । स्केल बार्स: ५०० µm (B); (C) में 20 µm; १०० µm (D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : rostral hindbrain में उनके कीटाणु जोन के भीतर साइकलिंग NPCs. (क) योजनाबद्ध रूप से hindbrain वेंट्रिकुलर सतह पर और periventricular क्षेत्र में क्रमशः mitotic (हरा) और एस-फेज (लाल) NPCs की स्थिति का चित्रण. hindbrain के माध्यम से एक आभासी पार अनुभाग सही पर उच्च आवर्धन पर प्रदर्शित किया जाता है । काला तीर एनपीसी संतति के प्रवास की दिशा है कि अंतर क्षेत्र की ओर कोशिका चक्र से बाहर निकल गए है इंगित करता है । (B) 1 h EdU पल्स प्राप् त भ्रूण से एक फ़्लोटिंग e 6.0 hindbrain अनुभाग का फोकल जेड स्टैक; pHH3 और EdU के लिए immunolabeling mitotic (हरा) और एस-चरण (लाल) NPCs, क्रमशः कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । Hindbrain सतहों बिंदीदार लाइनों द्वारा चिह्नित हैं; वी, वेंट्रिकुलर hindbrain पक्ष; पी, pial hindbrain ओर । एक सफेद बॉक्स द्वारा संकेत क्षेत्र इनसेट में उच्च आवर्धन पर दिखाया गया है; तीर anaphase में एक एनपीसी के क्लीवेज विमान, वेंट्रिकुलर सतह के सापेक्ष संकेत मिलता है । (ग) एकल चैनल प्रदर्शित pHH3 immunolabeling केवल । Mitotic NPCs सियान ऐरोहेड द्वारा संकेत कर रहे हैं; बेसल डिवीजनों की कमी Δ द्वारा दर्शाई गई है । (D) एकल चैनल केवल EdU लेबलिंग को प्रदर्शित करना । EdU+ NPCs अपने काइनेटिक परमाणु प्रवास के कारण एक pseudostratified वितरण अपनाने । दूरी है कि NPCs वेंट्रिकुलर सतह से दूर पलायन मापा जा सकता है, के रूप में एक प्रतिनिधि नारंगी रेखा के साथ संकेत दिया । स्केल बार्स: १०० µm (B -D); (B) में इनसेट में 10 µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Ki67 लेबलिंग के साथ BrdU के संयोजन के लिए hindbrain एनपीसी स्वयं नवीकरण क्षमता निर्धारित करते हैं । (क) फोकल जेड ढेर एक ई 10.5 hindbrain cryosection के लिए लेबलिंग के बाद Ki67 (हरा) और BrdU (लाल) के बाद एक 1 दिन BrdU पल्स । वेंट्रिकुलर ज़ोन में दोहरे-धनात्मक कक्ष NPCs होते हैं, जिनमें BrdU शामिल होते हैं और Ki67 लेबलिंग द्वारा दर्शाई गई कक्ष चक्र के माध्यम से अभी भी चलती हैं. कुल BrdU+ जनसंख्या के बीच दोहरे-लेबल वाले कक्षों का अनुपात स्व-नवीनीकरण NPCs के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. (b, c) एकल चैनल प्रदर्शित Ki67 (b) और BrdU (c) केवल immunolabeling । एक BrdU+ सेल है कि Ki67 की कमी है और इसलिए संभावना है कि कोशिका चक्र से बाहर निकला है (ए,सी) में एक सियान ऐरोहेड द्वारा संकेत दिया है । Hindbrain सतहों बिंदीदार लाइनों द्वारा चिह्नित हैं; वी, वेंट्रिकुलर hindbrain पक्ष; पी, pial hindbrain ओर । स्केल बार: ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : Nestin immunolabeling visualizes एनपीसी ने प्रक्रियाओं और endfeet । (क - ग) इम्यूनोफ्लोरेसेंस RC2, जो तंत्रिका मध्यवर्ती रेशा nestin पर एक epitope पहचानता है के लिए, hindbrain neuroepithelium भर में एनपीसी आकृति विज्ञान दिखाता है । (a) किसी e 11.5 hindbrain से किसी फ़्लोटिंग सेक्शन का फोकल जेड स्टैक निंन RC2 immunolabeling; बॉक्स्ड क्षेत्र (b, b '; शिखर/वेंट्रिकुलर क्षेत्र) और (c, c '; बेसल क्षेत्र) में अधिक आवर्धन पर दिखाए जाते हैं । Hindbrain सतहों बिंदीदार लाइनों द्वारा चिह्नित हैं; वी, वेंट्रिकुलर hindbrain पक्ष; पी, pial hindbrain ओर । (ख, ग) (A) में बॉक्स्ड क्षेत्रों के फोकल z स्टैक; एकल ऑप्टिकल अनुभागों में दिखाया गया है (B ', C '), क्रमशः । एक एनपीसी ने वेंट्रिकुलर सतह पर लंगर endfoot शिखर में एक तीर द्वारा संकेत दिया है (B ') । एकल और fasciculated एनपीसी ने प्रक्रियाओं में सफेद और काले ऐरोहेड द्वारा इंगित कर रहे है (C '), क्रमशः । स्केल बार्स: १०० µm, (A); (B, C) के लिए 25 µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक मॉडल के रूप में माउस भ्रूण hindbrain का उपयोग करने के लिए विकास neurogenesis के तंत्र का अध्ययन । विभिन्न immunolabeling तरीकों की एक किस्म का उपयोग करना, hindbrain NPCs कल्पना की जा सकती है और ऊतक वर्गों में उनकी संख्या मात्रा या अंग wholemounts के पार. विच्छेदन और फ्लैट शरीर रचना विज्ञान की आसानी सुनिश्चित करता है कि hindbrain एक ' खुली किताब ' तैयारी में छवि को अंग चौड़ा neurogenesis पैटर्न के बारे में जानकारी इकट्ठा किया जा सकता है ।

हम आगे कि एनपीसी आकृति विज्ञान और सेल चक्र से संबंधित एनपीसी ने स्थिति को आसानी से तैरते में visualized किया जा सकता है या hindbrain के cryosections दिखाते हैं । दोनों व्यवहार के लिए नई जनक आबादी को परिभाषित शोषण किया जा सकता है, के रूप में पहले स्तनधारी telencephalon20में प्रदर्शन किया गया है । उदाहरण के लिए, अर्ली-गठित Sox2+ neuroepithelia और Pax6+ शिखर रेडियल glia hindbrain21,22में मौजूद हैं, लेकिन hindbrain का अभाव Tbr2+ बेसल progenitors3 .

प्रोटोकॉल यहां भी वर्णित रहने इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा विशिष्ट एनपीसी ने उपजनसंख्या के व्यवहार का पालन अनुकूलित किया जा सकता है और/ इस उदाहरण के लिए, tamoxifen-inducible Sox1-iCreERT2 transgene और Rosa26tdTomato रिपोर्टर23ले जाने चूहों से hindbrains अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है ।

murine neurogenesis के ज्ञान को बढ़ाने के अलावा, hindbrain अध्ययन मोटे तौर पर प्रासंगिक तंत्रिकाजन्य तंत्र है कि प्रजातियों के पार साझा कर रहे है स्पष्ट सकता है, क्योंकि hindbrain एक अत्यधिक संरक्षित मस्तिष्क क्षेत्र है कि अधिक समान होने की उंमीद है forebrain से हड्डीवाला प्रजातियों के बीच ।

के रूप में hindbrain neurogenesis forebrain neurogenesis23से एक अपेक्षाकृत कम समय खिड़की पर जगह लेता है, यह पर्याप्त रूप से भ्रूण मंचन की तुलना के लिए आवश्यकता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । तदनुसार, प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह गिनती और अपने hindbrain को अलग करने से पहले एक भ्रूण में somite जोड़े की संख्या रिकॉर्डिंग से बचा है । hindbrain ऊतक ही नाजुक है और संदंश इसलिए ध्यान से संभाला जाना चाहिए जब सिर mesenchyme और मेनिन्जेस से hindbrain ऊतक अलग; अभ्यास ' चलाता है इसलिए मूल्यवान भ्रूण के विच्छेदन से पहले उचित हो सकता है की एक जोड़ी का प्रयास किया है । इसके अलावा, hindbrains एक ट्यूब से दूसरे के लिए एक व्यापक बोर पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के बजाय संदंश के साथ नुकसान से बचने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए (पिपेट खोलने साफ कैंची के साथ टिप के काटने से चौड़ा किया जा सकता है) । अंत में, हालांकि असामान्य, एस-चरण NPCs में EdU/BrdU निगमन की सीमा चर हो सकता है, विशेष रूप से कम के दौरान (यानी, 1 ज) दालों. लेबलिंग में सुधार करने के लिए, सुनिश्चित करें कि EdU/BrdU में समाधान लोड करने से पहले ठीक से भंग किया गया है सिरिंज और पेरिटोनियल गुहा में ध्यान से इंजेक्ट । खराब इंजेक्शन, जैसे दुर्घटना के द्वारा बनाए गए लोगों के रूप में, खोने या EdU/BrdU समाधान फँसाने और यह प्रचलन में प्रवेश करने से रोकने में परिणाम होगा ।

Disclosures

किसी भी लेखक के हितों या परस्पर विरोधी हितों की होड़ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Vasiliki Chantzara के बाहर ले जाने के लिए समय पर संभोग और जैविक संसाधन इकाई के UCL संस्थान में माउस पशुपालन के लिए नेत्र विज्ञान के कर्मचारियों को धंयवाद । यह अध्ययन एक वेलकम ट्रस्ट जांचकर्ता पुरस्कार 095623/z/11/जेड के लिए सीआर द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) VWR 211-2120 Also available from other commercial suppliers
Plastic cell culture dish, 60 mm Thermo Fisher 150288 Also available from other commercial suppliers
Cell culture plates, 12-well Thermo Fisher 150628 Also available from other commercial suppliers
Pasteur pipettes Copan 200C Also available from other commercial suppliers
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 FST 91150-20
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 FST 11295-51
29G needle/syringe BD BD Micro-Fine +1ml
Anti-phospho-histone H3 primary antibody Millipore 06-570 Goat, dilution 1:400
Anti-BrdU primary antibody Abcam ab6326 Rat, dilution 1:400
Anti-Ki67 primary antibody BD Biosciences 550609 Mouse, dilution 1:400
Anti-RC2 primary antibody Developmental Studies Hybridoma Bank RC2 Mouse (IgM), dilution 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody Thermo Fisher A11029 Dilution 1:200
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody Thermo Fisher A11037 Dilution 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher A21042 Dilution 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody Thermo Fisher A11001 Dilution 1:200
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody Thermo Fisher A11007 Dilution 1:200
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Sigma D9542 Use at 10 μg per mL
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) Sigma 900584
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) Sigma B5002
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Thermo Fisher C10086
Heat-inactivated goat serum Sigma G9023
Bovine serum albumin Sigma A7906
DAKO protein-block serum free Agilent X0909
Triton X-100 Sigma T8787 Also available from other commercial suppliers
Phosphate buffer saline Sigma P4417 Also available from other commercial suppliers
Paraformaldehyde Sigma P6148 Also available from other commercial suppliers
Sodium tetraborate Sigma B9876 Also available from other commercial suppliers
Sucrose Sigma S0389 Also available from other commercial suppliers
Agarose Sigma A9539 Also available from other commercial suppliers
Super PAP pen liquid blocker Ted Pella, Inc. 22309
SlowFade Antifade Kit Thermo Fisher S-2828
Glycerol Fisher Scientific 10337700
Mowiol Millipore 475904
OCT Scigen 4583 Also available from other commercial suppliers
Isopentane Sigma M32631 Also available from other commercial suppliers
Methanol Thermo Fisher 10675112 Also available from other commercial suppliers
Hydrochloric acid Thermo Fisher 10316380 Also available from other commercial suppliers
Microscope slides VWR 631-0912
Superfrost microscope slides VWR 631-0108
Thermometer VWR 620-0858
Cover glass VWR 631-0137
Stereo Microscope, Leica MZ16 Leica not applicable
Confocal laser scanning microscope  LSM710 Zeiss not applicable

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References

  1. Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
  2. Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
  3. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
  4. Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
  5. Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
  6. Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
  7. Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
  8. Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
  9. Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
  10. Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
  11. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  12. Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
  13. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
  14. Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
  15. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  16. Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
  17. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  18. Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
  19. Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
  20. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
  21. Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
  22. Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
  23. Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३१ Neurogenesis तंत्रिका जनक hindbrain स्तनधारी विकास चूहा बँटवारा स्व-नवीनीकरण इम्यूनोफ्लोरेसेंस wholemount फ्लोटिंग सेक्शन cryosection
भ्रूण Neurogenesis के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में माउस Hindbrain
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Tata, M., Ruhrberg, C. The Mouse… More

Tata, M., Ruhrberg, C. The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56793, doi:10.3791/56793 (2018).

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