Summary
We hebben met succes twee substraat-specifieke γ-secretase tests gegenereerd. Zowel cel-gebaseerde testen hier gepresenteerd zijn ontworpen om het kwantificeren van de enzymatische activiteiten γ-secretase via de uitgang van firefly luciferase verslaggevers.
Abstract
We hebben een paar van cel-gebaseerde reporter gene assays voor het kwantitatief meten van γ-secretase splitsing van verschillende substraten ontwikkeld. Dit manuscript worden procedures beschreven die kunnen worden gebruikt om te controleren γ-secretase-gemedieerde splitsing van APP-C99 of Inkeping, met behulp van een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever systeem. Deze testen werden opgericht door stabiel transfecting mede HEK293 cellen met het Gal4-gedreven luciferase verslaggever gen en ofwel het C-terminal Gal4/VP16-gelabeld fragment van APP (APP-C99; CG-cellen), of de Gal4/VP16-gelabeld Notch-ΔE (NΔE; NG cellen). Met behulp van deze verslaggever assays parallel, we hebben aangetoond dat een ErbB2-remmer, CL-387,785, bij voorkeur γ-secretase splitsing van APP-C99 in CG cellen, maar niet NΔE in NG cellen kunt onderdrukken. De differentiële reacties tentoongesteld door de CG en NG cellen, wanneer behandeld met CL-387,785, vertegenwoordigen een voorkeur kenmerkend voor γ-secretase modulatoren, en deze antwoorden staan in schril contrast tot de pan-remming van de γ-secretase geïnduceerd door DAPT. Ons onderzoek levert direct bewijs dat γ-secretase activiteiten naar verschillende ondergronden kunnen worden onderscheiden in een cellulaire context. Deze nieuwe testen kunnen dus nuttige hulpmiddelen in drugontdekking voor verbeterde AD therapieën.
Introduction
Oligomere vormen van amyloid-β (Aβ) worden verondersteld te zijn de primaire oorzaak van neurodegeneratie in de hersenen van patiënten die lijden aan de ziekte van Alzheimer (AD)1. Aβ peptides worden geproduceerd door de stapsgewijze splitsing van amyloïde precursor eiwit (APP), eerst door β-secretase, en vervolgens door γ-secretase2. In het afgelopen decennium, hebben therapeutische benaderingen naar behandeling van advertentie gericht op de preventie van Aβ productie3. De meerderheid van de studies hebben gericht op ofwel de vergroting van α-secretase activiteit, die kan beletsel γ-secretase splitsing van APP en daardoor verminderen de productie van Aβ of de remming van β-en/of γ-secretase activiteiten4. Helaas, niet-selectieve inhibitie van β - of γ-secretases resultaten in onvermijdelijk bijwerkingen zijn die als gevolg van interferentie met de werking van andere fysiologische substraten voor β - en γ-secretase5,6. Ten aanzien van de γ-secretase-remmers, hebben recente studies gerapporteerd de ontdekking van een aantal chemische en genetische modulatoren die Aβ productie regelen kan filtreerpapier te verwaarlozen effecten op de essentiële γ-secretase-gemedieerde verwerking van Inkeping7 ,8,9,10,11,12, echter succesvol therapeutics zijn nog niet ontwikkeld. Dus zijn verdere systematische schermen gerechtvaardigd om te ontdekken van nieuwe genetische en chemische parameters die selectief γ-secretase-gemedieerde APP verwerking moduleren kunnen.
Γ-Secretase is bekend dat het klieven van meer dan 90 verschillende membraan-verankerd eiwitten. Onder deze substraten is Notch, waarvan de activiteit is van cruciaal belang voor de cel lot vastberadenheid en differentiatie tijdens ontwikkeling13. Selectief modulerende γ-secretase-gekatalyseerde APP verwerking in de afwezigheid van invloed zijn op de inkeping verwerking essentieel voor minimaliseren Notch-gerelateerde bijwerkingen van γ-secretase-remmers, en deze selectiviteit wordt beschouwd als een primaire factor die zal dicteren van de biologische werkzaamheid van potentiële γ-secretase modulatoren voor de chronische behandeling van AD. Er zijn een aantal arylsulfonamide derivaten, zoals GSI-953 (begacestat) en BMS-708163 (avagacestat), die zijn gevonden om te exposeren krachtige en selectieve remming van de γ-secretase14,15. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de differentiële remming van de γ-secretase splitsing van APP en Notch kan worden waargenomen met behulp van een kwantitatieve ELISA gebaseerde bepaling in combinatie met in vivo validatie met behulp van de zebravis16. Bovendien zijn assay cel-gebaseerde paradigma's vastgesteld om aan te pakken van de potentiële substraat selectiviteit van γ-secretase naar APP en Notch17,18. Met behulp van protocollen vergelijkbaar met die beschreven hierin, we hebben onlangs ontdekt een nieuwe klasse van (D)-leucinamides die krachtig γ-secretase splitsing van APP met inkeping-sparend selectiviteit19 moduleren. Samen, biedt deze collectie van studies een bewijs-van-concept ter ondersteuning van het idee dat het substraat selectiviteit en beschikbaarheid van γ-secretase onderworpen aan chemische modulatie en experimentele verificatie worden kan. Echter, deze assay platformen vaak rekenen op relatief lage-doorvoer uitlezingen en arbeidsintensieve benaderingen die mogelijk niet voldoen aan industriële normen voor de drug discovery-programma's.
We hebben recentelijk gegenereerde cel-gebaseerde luciferase reporter gene assays die kwantitatief bepalend kunnen zijn voor de katalytische activiteit van γ-secretase naar twee verschillende substraten, de 99-amino acid C-terminal fragment van APP (APP-C99) en de extracellulaire domein-verwijderd Notch peptide (NΔE). Zowel de NΔE als de APP-C99 hebben wijd gebruikt als directe substraten voor γ-secretase in verschillende testen. Voor het genereren van homogene en consistente luciferase reporter gene assays voor de splitsing van de γ-secretase van APP-C99 of NΔE, we genereerden een HEK afkomstige stabiele cellijn (CG) die constitutively een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever (uitdrukt Gal4-Luc) en Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 fusieproteïne (C99-GV). Bovendien, we genereerden een ander HEK afkomstige stabiele cellijn (NG) die constitutively Gal4-Luc en Gal4/VP16-gelabeld NΔE (NΔE-GV uitdrukt). Met behulp van deze roman substraat-specifieke γ-secretase-tests, bieden we nu een methode om te kwantificeren en te onderscheiden van de katalytische activiteit van γ-secretase naar verschillende substraten (APP-C99 in CG cellen) of NΔE in NG cellen. Bovendien waren de substraat-specifieke γ-secretase-tests ontworpen om dat bevorderlijk is voor hoge-content screening platformen. Deze tests nieuw gegenereerde γ-secretase zou de weg vrij voor de ontdekking van nieuwe γ-secretase modulatoren, die zouden kunnen cognitieve functie verbeteren door het onderdrukken van Aβ productie zonder aanleiding kunnen geven tot ongewenste remming van de inkeping voor de behandeling van de volgende generatie van advertentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. meting van de Luciferase verslaggever signalen, die met de splitsing van de γ-Secretase van APP-C99 of NΔE corresponderen
Opmerking: Raadpleeg de eerdere publicaties voor meer gedetailleerde beschrijvingen van de generatie van CG en NG cellen20,21.
-
Zaad NG of CG cellen (20, 000 cellen/well) op 96-Wells microplates op een eindvolume van 200 μl per putje in groeimedium dat is samengesteld uit Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), vermeerderd met 10% foetale runderserum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiotica (b.v. zeocin), en 200 μg/mL hygromycin B.
- Cellen tellen met een hemocytometer.
- De microplates overbrengen in een bevochtigde CO2 incubator en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
- Verwijder 100 μl van groeimedium uit elk putje.
- Voeg 100 μl per putje van groei medium met 2 μg/mL tetracycline met ofwel 0,2% dimethylsulfoxide (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) of andere gerelateerde ErbB1/ErbB2-remmers.
- Incubeer behandelde CG of NG cellen in microplates bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- 150 μl per putje groeimedium uit de microplates verwijderen.
- Voeg 50 μl per putje luciferase assay reagens toe (Zie Tabel van materialen).
-
De microplates overbrengen in een luminescentie microplate lezer.
- Het handhaven van de microplates bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met zachte agitatie.
-
Bepalen van de Firefly luciferase (FL)-uitgestoten luminescentie met behulp van een vooraf gedefinieerde programma in de luminescentie microplate lezer zijn opgeslagen.
- Open de software van de controle van het instrument (Zie Tabel van materialen voor instrument details).
- Selecteer in het menu 'Tool', 'Luminometry'.
- Kies 'Geen filter' voor emissie Filter, teek 'normaal' voor emissie diafragma, voer '1' voor tellen keer onder de instellingen 'Parameters' en klik op 'OK' om de luminescentie lezing instellen.
- Onder het tabblad 'Instrument beheer' en blader door de lijst met actieve protocollen en selecteer het vooraf opgeslagen protocol voor het lezen van luminescentie.
- Onder het tabblad 'Live weergave' definiëren de omvang van de pull-down lijst en selecteer 'Logaritme' of 'Lineaire' voor het Type.
- Schakel onder het tabblad 'Temperatuur' 'Off' voor plaat Verwarming.
- Klik op de knop 'Start' voor het uitvoeren van de luminescentie lezen.
- Desgewenst resultaten exporteren in een werkbladindeling te zetten m.b.v. de 'Verkenner' ingebed in de besturingssoftware.
2. kwantificering van γ-Secretase activiteit
-
Definieer een luminescentie signaal dat wordt uitgezonden door CG of NG cellen behandeld met 0,1% DMSO in groeimedium met 1 μg/mL tetracycline alleen als 100% relatieve γ-secretase activiteit.
- Schatting achtergrond luminescentie van CG of NG cellen door het behandelen van cellen met groeimedium dat niet de tetracycline omvat.
- Normaliseren luciferase signalen van CG of NG cellen die worden gekweekt met groeimedium dat 1 μg/mL tetracycline en beide 1 μM CL-387,785 of 1 μM van DAPT met het luciferase signaal uitgezonden door CG DMSO-behandeld of NG cellen (100% relatieve γ-secretase activiteit, als gedefinieerd in punt 2.1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Remming van ErbB2 door CL-387,785 kan de verwerking van APP-C99 door differentieel bevorderen Γ -secretase zonder Notch decollete
Om vast te stellen een cel-gebaseerde test die kwantitatief het Proteolytische splijten van een bijzonder γ-secretase substraat kan meten, we genereerden de HEK293 afkomstige CG cellijn door stabiele CO transfectie van een tetracycline-afleidbare C-terminaal Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 en een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever gen. Een parallelle NG-cellijn werd ook opgericht om assay voor het splijten van de γ-secretase van NΔE. In NG cellen waren een tetracycline-afleidbare C-terminal Gal4/VP16-gelabeld NΔE en een Gal4 promotor gestuurde luciferase verslaggever gen stabiel mede-transfected in HEK293 cellen. Het splijten van de γ-secretase van APP-C99 in CG cellen en de splitsing van de γ-secretase van NΔE in NG cellen werden eerst bevestigd door de behandeling van CG en NG cellen met verschillende concentraties van DAPT, een pan γ-secretase-remmer die het splijten van alle γ-secretase substraten blokkeert ( Figuur 1). De gegevens ook aangetoond dat γ-secretase CG andNG cellen tentoongesteld vergelijkbare niveaus van katalyse.
Voor het valideren van de efficiëntie van het substraat-specifieke cel-gebaseerde tests voor γ-secretase breuklijnen, onderzochten we de luminescentie signalen in CG en NG cellstreated met een ErbB1/2 dual-remmer CL-387,785, waarvan is aangetoond aan het differentieel moduleren De splitsing van de γ-secretase van APP-C99 en NΔE21. Wij eerder aangewezen CL-387,785 als een selectieve γ-secretase-modulator vanwege haar bemoeienis met de eiwit-eiwit interactie tussen presenilin-1 (PS1) en C99 en gebrek aan interferentie met de interactie tussen PS1 en NΔE21. Hier, uit de gegevens blijkt dat behandeling met CL-387,785 effectief de verwerking van APP-C99 in CG cellen, geblokkeerd, terwijl de proteolyse van NΔE in NG cellen niet was beïnvloed (Figuur 2). Deze resultaten tonen de effectiviteit van CG en NG cellen onderscheid te maken tussen de C99- en NΔE decollete, in een indeling die bevorderlijk is voor high-throughput screening platformen.
Figuur 1: de APP-C99-specifieke cellulaire γ-secretase assay (CG cellen). CG cellen werden zaadjes op 96-Wells microplates (20.000 cellen per putje) overnachting en behandeld met 1 μM CL-387,785 of DAPT in aanwezigheid van 1 μg/mL tetracycline bij 37 ° C gedurende 24 uur. De luminescentie afgeleid van γ-secretase-gemedieerde proteolyse voor C99-GV werd gekwantificeerd na toevoeging van 100 μl per putje luciferase assay reagens. Het signaal van de luciferase uitgestoten door cellen behandeld met voertuig alleen (0,1% DMSO) werd ingesteld als 100% relatieve luminescentie. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de inkeping-specifieke cellulaire γ-secretase assay (NG cellen). NG cellen werden zaadjes op 96-Wells microplates (20.000 cellen per putje) overnachting en behandeld met 1 μM CL-387,785 of DAPT in aanwezigheid van 1 μg/mL tetracycline bij 37 ° C gedurende 24 uur. De luminescentie afgeleid van γ-secretase-gemedieerde proteolyse voor NΔE-GV werd gekwantificeerd na toevoeging van 100 μl per putje luciferase assay reagens. Het signaal van de luciferase uitgestoten door cellen behandeld met voertuig alleen (0,1% DMSO) werd ingesteld als 100% relatieve luminescentie. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De veelbelovende resultaten van een fase 1b trial van aducanumab immunotherapie voor AD de kritische rol van Aβ hebben verankerd in de pathogenese van AD22 en suggereren dat anti-Aβ benaderingen nog steeds een levensvatbare strategie voor de ontwikkeling van anti-van de AD geneesmiddelen. We beschrijven hier, cel-gebaseerde testen voor het kwantificeren van de γ-secretase-gekatalyseerde proteolyse van APP-C99 en NΔE met behulp van firefly luciferase verslaggever systemen. APP-C99 en NΔE zijn de twee meest goed bestudeerde γ-secretase substraten en samen vertegenwoordigen beide de pathogene en fysiologische activiteiten van γ-secretase13. Onze bevindingen dat Downregulatie van ErbB2 door CL-387,785 bij voorkeur de steady-state niveaus van APP-C99 verminderen kan en secreted Aβ zijn verder onderbouwd door het substraat-specifieke cellulaire assays van γ-secretase beschreven in de huidige studie. Het huidige protocol biedt dus een efficiënte aanpak voor de ontdekking van nieuwe γ-secretase modulatoren.
De verdiensten van dit paradigma van de substraat-specifieke assay γ-secretase zijn veelzijdig. Bijvoorbeeld kunnen deze gehaltebepalingen substraat-specifieke γ-secretase worden gebruikt in een voorlopige scherm uitsluiten van potentiële remmers van de niet-selectieve γ-secretase van verdere ontwikkeling en een kwantitatieve beoordeling, die relevant is voor het minimaliseren van mogelijke bijwerkingen. De biologische werkzaamheid van actieve bestanddelen geïdentificeerd van deze methode kan vervolgens verder in neuronale cellen en diermodellen voor AD, worden gevalideerd, zoals blijkt uit de onlangs21. Bovendien, is de homogeniteit van de CG en NG stabiele cellijnen cruciaal voor de reproduceerbaarheid van onze experimentele resultaten. Nog belangrijker is, verhindert het tetracycline-afleidbare uitdrukking van de C99-GV of NΔE-GV effectief de verzadiging van luciferase verslaggever expressie die wordt gezien in andere systemen waar C99 of NΔE constitutively wordt uitgedrukt. Deze tetracycline-afleidbare expressie resulteert in een zeer betrouwbare en consistente luciferase signaal dat direct met de activiteit van de γ-secretase correleert, waardoor de vergelijking van de γ-secretase decollete activiteiten tussen twee verschillende substraten (APP-C99 versus NΔE), of uit het experiment om het experiment op een zeer efficiënte manier. Met het oog op de beste resultaten, de activiteit van tetracycline oplossing moet periodiek worden gecontroleerd (bij voorkeur één keer per maand) optimale inductie efficiëntie te waarborgen. Als bijkomend voordeel elimineert de homogeniteit van deze platforms de noodzaak voor het normaliseren van de firefly luciferase met constitutieve Renilla luciferase expressie. Tot slot kan behandelen CG en NG cellen met 1 µM avagacestat, een bekende Notch-sparend γ-secretase-remmer, dienen als een positieve controle voor de assay.
Een mogelijke waarschuwing van het gebruik van de huidige assay-platform is dat de overexpressie van substraten γ-secretase en daaropvolgende verzadiging van de transcriptionele verslaggever in onze tests heeft een aantal mogelijkheden maskeren inhiberende activiteit en bijdragen aan discrepantie remmende potentie onder de verschillende testen23. Deze mogelijke complicatie onderstreept de noodzaak van secundaire assay platforms voor het valideren van de werkzaamheid van Inkeping-sparend γ-secretase-remmers, zoals onlangs21. Een andere mogelijke beperking van deze aanpak is dat gegeven meer dan 90 verschillende membraan eiwitten zijn geïdentificeerd als γ-secretase substraten, de huidige assay platforms niet een compleet profiel van γ-secretase substraat selectiviteit bieden. Langs deze lijnen, spaarde de remming van de inkeping decollete mogelijk niet de beste uitlezing met waarvoor γ-secretase-remmers wordt geëvalueerd. Voorzichtigheid moet worden genomen als gevolg van het feit dat avagacestat, een inkeping-sparend γ-secretase-remmer, mislukt ter verbetering van de cognitie24, en het is waarschijnlijk dat Notch remming wellicht niet de enige basis voor toxiciteit pan γ-secretase remmers is gekoppeld 25. het echte nut van hits geïdentificeerd door deze nieuwe aanpak kon scharnier op als de onlangs geïdentificeerde Notch-sparend γ-secretase-remmers bezitten roman chemische entiteiten die niet aanwezig in de avagacestat zijn en de werkzaamheid van deze remmers kunnen gevalideerd met behulp van in vivo modellen van AD.
Tot slot zijn wij van mening dat de voorgestelde aanpak kan sterk het versnellen van de ontwikkeling van APP-C99-specifieke γ-secretase-remmers/modulatoren voor klinisch gebruik. Er is geen ontkenning dat γ-secretase-remmers, of ze nu Notch-sparend of niet, kon potentieel initiëren toxiciteit bij AD patiënten, hetgeen tot ongewenste verdraagbaarheid leiden zou en resultaten zoals eerder voorgesteld26. Echter, met de introductie van nieuwe chemische hulpmiddelen en verbeterde validatie regelingen21, γ-secretase moet blijven een aantrekkelijk doelwit van de drug vanwege haar biochemische complexiteit, vereisen meer preklinische en klinische studies te verkennen zijn therapeutische relevantie in AD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de faciliteit van de kern van het Instituut voor cellulaire en Organismic biologie, Academia Sinica, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan (meest 103-2320-B-001-016-MY3 aan Y.-F. L.), het programma voor translationeel innovatie van biofarmaceutische ontwikkeling-technologie ter ondersteuning van Platform as in Scheme (NP7 aan Y.-F.L.), en de Academia Sinica (aan Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
- Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
- Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
- Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
- Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
- Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
- Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
- Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
- Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
- He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
- Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
- Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
- Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
- Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
- McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
- Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
- Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
- Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
- Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
- Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
- Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
- Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
- Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
- Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).
