Summary
Vi har vellykket generert to substrat-spesifikke γ-secretase analyser. Begge cellebasert analyser som presenteres her er utformet for å kvantifisere γ-secretase enzymatisk aktivitetene via produksjon av firefly luciferase journalister.
Abstract
Vi har utviklet et par cellebasert reporter genet analyser kvantitativt måle γ-secretase spalting av forskjellige underlag. Dette manuskriptet beskriver fremgangsmåter som kan brukes til å overvåke γ-secretase-mediert spalting av APP-C99 eller hakk, bruker Gal4 promoter-drevet firefly luciferase reporter system. Disse analyser ble etablert av stabilt co transfecting HEK293 celler med Gal4-drevet luciferase reporter genet og enten Gal4/VP16-merket C-terminalen fragmentet av APP (APP-C99; CG celler), eller den Gal4/VP16-merket hakk-ΔE (NΔE; NG celler). Bruker disse reporter analyser parallelt, vi har vist at en ErbB2 hemmer, CL-387,785, fortrinnsvis kan undertrykke γ-secretase spalting av APP-C99 i CG celler, men ikke NΔE i NG celler. Differensial svarene utstilt av CG og NG cellene, når behandlet med CL-387,785, representerer en foretrukket karakteristisk for γ-secretase modulatorer, og disse svarene er i sterk kontrast til pan-hemming av γ-secretase av DAPT. Våre studier gir direkte bevis at γ-secretase aktiviteter mot ulike underlag kan differensieres i mobilnettet sammenheng. Disse nye analyser kan derfor være nyttig verktøy i stoffet funnet forbedret AD terapi.
Introduction
Oligomeric former for amyloid-β (Aβ) antas å være den primære årsaken til neurodegeneration i hjernen til pasienter som lider av Alzheimers sykdom (AD)1. Aβ peptider produseres av gradvis spalting av amyloid forløper protein (APP), først ved β-secretase og deretter γ-secretase2. I det siste tiåret, har terapeutiske metoder mot behandling av Annonsen fokusert på forebygging av Aβ produksjon3. Fleste studier har fokusert på enten augmentation av α-secretase aktivitet, som kan utelukke γ-secretase spalting av APP og dermed redusere produksjonen av Aβ eller hemming av β-og/eller γ-secretase aktiviteter4. Dessverre, ikke-selektive hemming av β - eller γ-secretases fører uunngåelig bivirkninger som er på grunn av forstyrrelser med funksjon av andre fysiologiske substrater β - og γ-secretase5,6. Med hensyn til γ-secretase hemmere, har studier rapportert oppdagelsen av en rekke kjemiske og genetiske modulatorer som kan regulere Aβ produksjon mens du presser ubetydelige effekt på viktige γ-secretase-mediert behandlingen av hakk7 ,8,9,10,11,12, men vellykket therapeutics har ennå ikke blitt utviklet. Dermed er ytterligere systematisk skjermer garantert for å oppdage romanen genetiske og kjemiske modifikatorer som modulere selektivt γ-secretase-mediert APP behandling.
Den ble-Secretase er kjent for å holde seg mer enn 90 ulike membran-forankret proteiner. Blant disse underlag er hakk, der aktiviteten er kritisk for cellen skjebne besluttsomhet og differensiering under utvikling13. Selektivt modulerende γ-secretase-katalysert APP behandling i fravær av påvirker hakk behandling vil være avgjørende for minimere hakk-relaterte bivirkninger av γ-secretase hemmere, og denne selektiviteten er antatt å være en primær faktor som vil diktere biologiske effekten av potensielle γ-secretase modulatorer for kronisk behandling av Annonsen. Det har vært en rekke arylsulfonamide derivater, som GSI-953 (begacestat) og BMS-708163 (avagacestat), som har blitt funnet for å ha potent og selektiv hemming av γ-secretase14,15. En tidligere studie har vist at differensial hemming av γ-secretase spalting av APP og hakk kan observeres med en kvantitativ ELISA-baserte analysen sammen i vivo validering bruker sebrafisk16. Videre er cellebasert analysen paradigmer etablert for å løse potensielle substrat selektivitet av γ-secretase mot APP og hakk17,18. Bruker protokoller ligner beskrevet her, har vi nylig oppdaget en roman klasse av (D)-leucinamides som modulerer potently γ-secretase spalting av APP med hakk-sparing selektivitet19. Sammen gir denne samlingen av studier en proof-of-concept-støtter ideen om at substrat selektivitet/tilgjengeligheten av γ-secretase kan kjemisk modulering og eksperimentell verifikasjon. Men stole disse analysen plattformene ofte på relativt lav gjennomstrømming readouts og arbeidskrevende tilnærminger som ikke oppfyller bransjestandarder for drug discovery programmer.
Vi har nylig generert cellebasert luciferase reporter genet analyser som kvantitativt kan avgjøre katalytisk aktiviteten til γ-secretase mot to forskjellige underlag, 99-amino acid C-terminalen fragmentet av APP (APP-C99) og den ekstracellulære domenet slettet hakk peptid (NΔE). Både APP-C99 og NΔE har vært mye brukt som direkte underlag av γ-secretase i ulike analyser. Vil generere homogen og konsekvent luciferase reporter genet analyser for γ-secretase cleavage APP-C99 eller NΔE, generert vi en HEK-avledet stabil cellen linje (CG) som constitutively uttrykker en Gal4 promoter-drevet firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) og Gal4/VP16-merket APP-C99 fusion protein (C99-GV). I tillegg generert vi en annen HEK-avledet stabil cellen linje (NG) som constitutively uttrykker Gal4-Luc og Gal4/VP16-merket NΔE (NΔE-GV). Bruker disse romanen substrat-spesifikke γ-secretase analyser, tilby vi nå en metode for å kvantifisere og skille katalytisk aktiviteten til γ-secretase mot forskjellige underlag (APP-C99 i CG celler) eller NΔE i NG celler. Videre var substrat-spesifikke γ-secretase analyser ment å være til høyt innhold screening plattformer. Disse nygenererte γ-secretase-analyser kan bane vei for oppdagelsen av romanen γ-secretase modulatorer som kan bedre kognitiv funksjon ved å undertrykke Aβ produksjon uten fremlokkende uønskede hakk hemming for neste generasjons behandling annonse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. måling av Luciferase Reporter signaler, som tilsvarer γ-Secretase spalting av APP-C99 eller NΔE
Merk: Se de tidligere publikasjonene detaljerte beskrivelser av generasjon av CG og NG celler20,21.
-
Frø NG eller CG celler (20, 000 celler/vel) på 96-brønnen microplates på et endelig antall 200 μL/godt i vekst medium som består av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) pluss 10% fosterets bovin serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiotika (f.eks zeocin), og 200 μg/mL hygromycin B.
- Telle celler med en hemocytometer.
- Overføre til microplates til en fuktet CO2 inkubator og ruge på 37 ° C over natten.
- Fjerne 100 μL vekstmediet i hver brønn.
- Legge til 100 μL/vel vekst medium som inneholder 2 μg/mL tetracycline med enten 0,2% dimethyl sulfoxide (DMSO) 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) eller andre relaterte ErbB1/ErbB2-hemmere.
- Inkuber behandlet CG eller NG celler i microplates ved 37 ° C i 24 timer.
- Fjern 150 μL/vel oppblomstringen medium fra microplates.
- Legge til 50 μL/vel luciferase analysen reagens (se Tabell for materiale).
-
Overføring av microplates til en luminescence microplate leser.
- Opprettholde microplates ved romtemperatur for 5 min med mild agitasjon.
-
Bestemme Firefly luciferase (FL)-slippes ut luminescence bruker et forhåndsdefinert program lagret i luminescence microplate leseren.
- Åpne instrument kontroll programvare (se Tabell for materiale for instrumentet detaljer).
- Velg 'Luminometry' 'Verktøy'-menyen.
- Under "Parameters" innstillingene, velger "Nei filter" for utslipp Filter, sjekke 'Normal' for utslipp blenderåpning, angi '1' for teller tid, og klikk på 'OK' sette opp luminescence lesing.
- Under kategorien 'Maskinstyring' Bla gjennom listen over aktive protokoller og velg forhåndslagrede protokollen for lesing luminescence.
- Under kategorien "Live skjermen" definere skalaen fra i rullegardinlisten, og velg "Logaritmen" eller "Lineær" for typen.
- Velg 'Av' Plate Varmeovn under kategorien "Temperatur".
- Klikk "Start" for å utføre luminescence lesing.
- Etter behov kan du eksportere resultatene til et regneark ved hjelp av "Explorer" i Kontrollprogramvaren.
2. kvantifisering av γ-Secretase aktivitet
-
Definere en luminescence signal fra CG eller NG-cellene behandlet med 0,1% DMSO i vekst medium som inneholder 1 μg/mL tetracycline alene som 100% relativ γ-secretase aktivitet.
- Estimere bakgrunn luminescence fra CG eller NG celler ved behandling av celler med vekst medium som ikke inkluderer tetracycline.
- Normalisere luciferase signaler fra CG eller NG celler som er kultivert med vekstmediet som inneholder 1 μg/mL tetracycline og enten 1 μM CL-387,785 eller 1 μM av DAPT med luciferase signalet slippes ut av DMSO-behandlet CG eller NG celler (100% relativ γ-secretase aktivitet, som definert i 2.1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hemming av ErbB2 av CL-387,785 kan ulikt fremme behandling av APP-C99 av Den ble -secretase uten at det påvirker hakk cleavage
For å etablere et cellebasert analysen som kvantitativt kan måle proteolytisk spalting av en bestemt γ-secretase substrat, generert vi HEK293-avledet CG celle linjen av stabil co transfection av en tetracycline-induserbart C-terminalt Gal4/VP16-merket APP-C99 og et Gal4 promoter-drevet firefly luciferase reporter gen. En parallell NG cellen linje ble også etablert til analysen for γ-secretase spalting av NΔE. I NG celler var en tetracycline-induserbart C-terminalen Gal4/VP16-merket NΔE og et Gal4 promoter-drevet luciferase reporter gen stabilt co transfekterte i HEK293 celler. I γ-secretase spalting av APP-C99 i CG celler og cleavage γ-secretase av NΔE i NG celler ble først bekreftet ved å behandle CG og NG celler med ulike konsentrasjoner av DAPT, en pan γ-secretase inhibitor som blokkerer i spalting av alle γ-secretase underlag ( Figur 1). Dataene viste også at den ble secretase i CG andNG celler utstilt sammenlignbare nivåer av katalyse.
For å validere effektiviteten av underlaget-spesifikk celle-baserte analyser for γ-secretase cleavages, undersøkte vi luminescence signalene i CG og NG cellstreated med en ErbB1/2 dual inhibitor CL-387,785, som har vist til ulikt modulerer Den ble-secretase spalting av APP-C99 og NΔE21. Vi har tidligere identifisert CL-387,785 som en selektiv γ-secretase-modulator på grunn av sin innblanding protein-protein samspillet mellom presenilin-1 (PS1) og C99 og mangel på forstyrrelse av samspillet mellom PS1 og NΔE21. Her, data viser at behandling med CL-387,785 effektivt blokkert behandlingen av APP-C99 i CG celler, mens proteolyse av NΔE i NG celler ikke var påvirket (figur 2). Disse resultatene viser effektiviteten av CG og NG cellene skille mellom C99 og NΔE cleavage, i et format som bidrar til høy gjennomstrømming screening plattformer.
Figur 1: APP-C99-spesifikke mobilnettet γ-secretase analysen (CG celler). CG celler var frø på 96-brønnen microplates (20 000 celler/vel) overnatting og behandles med 1 μM CL-387,785 eller DAPT i nærvær av 1 μg/mL tetracycline ved 37 ° C i 24 timer. Luminescence avledet fra γ-secretase-mediert proteolyse av C99-GV ble kvantifisert etter tillegg av 100 μL/vel luciferase analysen reagens. Luciferase signalet fra cellene behandlet med kjøretøy alene (0,1% DMSO) ble angitt som 100% relativ luminescence. Dataene vises i gjennomsnittlig ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: hakk-spesifikke mobilnettet γ-secretase analysen (NG celler). NG celler var frø på 96-brønnen microplates (20 000 celler/vel) overnatting og behandles med 1 μM CL-387,785 eller DAPT i nærvær av 1 μg/mL tetracycline ved 37 ° C i 24 timer. Luminescence avledet fra γ-secretase-mediert proteolyse i NΔE-GV ble kvantifisert etter tillegg av 100 μL/vel luciferase analysen reagens. Luciferase signalet fra cellene behandlet med kjøretøy alene (0,1% DMSO) ble angitt som 100% relativ luminescence. Dataene vises i gjennomsnittlig ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lovende resultater fra en fase 1b prøveversjon av aducanumab immunterapi for Annonsen har etablert Aβ kritisk rolle i patogenesen av AD22 og foreslå at anti-Aβ tilnærminger er fremdeles en levedyktig strategi for utvikling av anti-annonse narkotika. Her beskriver vi cellebasert analyser for kvantifisere γ-secretase-katalysert proteolyse APP-C99 og NΔE bruker firefly luciferase reporter systemer. APP-C99 og NΔE er de to mest godt studert γ-secretase underlag og representerer sammen både patogene og fysiologiske aktiviteter γ-secretase13. Våre funn at downregulation av ErbB2 av CL-387,785 fortrinnsvis kan redusere stabil nivåer av APP-C99 og utskilles Aβ er videre underbygges av underlaget-spesifikke mobilnettet analyser av γ-secretase beskrevet i studien. Gjeldende protokollen gir dermed en effektiv fremgangsmåte for oppdagelsen av romanen γ-secretase modulatorer.
Fordelene ved dette γ-secretase substrat-spesifikke analysen paradigmet er mangesidig. For eksempel kan disse substrat-spesifikke γ-secretase-analyser benyttes en foreløpig skjermen utelukke potensielle ikke-selektive γ-secretase hemmere fra videreutvikling og gir en kvantitativ vurdering som er relevant for å minimere mulige bivirkninger. Den biologiske effekten av aktive forbindelser identifisert fra denne metoden kan deretter videre valideres i neuronal celler og dyremodeller annonse, som vist i nylig21. I tillegg er homogenitet av CG og NG stabil celle linjene kritisk til reproduserbarhet på eksperimentelle resultatene. Viktigere, hindrer tetracycline-induserbart uttrykk for C99-GV eller NΔE-GV effektivt metning av luciferase reporter uttrykk som er sett i andre systemer der C99 eller NΔE er constitutively uttrykt. Tetracycline-induserbart uttrykket resulterer i et svært pålitelig og konsekvent luciferase signal som direkte korrelerer med γ-secretase aktivitet, slik at sammenligning av γ-secretase cleavage aktiviteter mellom to forskjellige underlag (APP-C99 versus NΔE), eller fra eksperimentet å eksperiment i en svært effektiv måte. For å oppnå de beste resultatene, aktiviteten til tetracycline løsning bør overvåkes regelmessig (fortrinnsvis en gang per måned) å sikre optimal induksjon effektivitet. Som en ekstra fordel eliminerer homogenitet av disse plattformene behovet for normalisering firefly luciferase med grunnleggende Renilla luciferase uttrykk. Til slutt, behandle CG og NG celler med 1 µM avagacestat, en kjent hakk-sparing γ-secretase hemmer, kan tjene som en positiv for analysen.
En mulig påminnelse om bruker stede analysen plattformen er at overuttrykte γ-secretase underlag og påfølgende metningen til en transcriptional journalist i våre analyser har noen muligheter til å maskere hemmende aktivitet og bidra til discrepant hemmende styrke blant de ulike analyser23. Dette mulig komplikasjon understreker behovet for sekundære analysen plattformer å validere effekten av hakk-sparing γ-secretase hemmere, som vist sist21. En annen potensiell begrensning av denne tilnærmingen er at gitt mer enn 90 forskjellige membran proteiner har blitt identifisert som den ble-secretase underlag, nåværende analysen plattformene ikke gir en fullstendig profil over γ-secretase substrat selektivitet. Langs disse linjene, kan sparsom hemming av hakk cleavage ikke være den beste avlesning å evaluere γ-secretase hemmere. Forsiktighet bør utvises skyldes at avagacestat, en hakk-sparing γ-secretase hemmer, unnlater å forbedre kognisjon24, og det er sannsynlig at hakk hemming er det eneste grunnlaget for toksisitet forbundet med pan γ-secretase hemmere 25. sant verktøyet treff identifisert av denne nye tilnærmingen kan hengslene på hvis det nylig identifisert hakk-sparing γ-secretase hemmere har romanen kjemiske enheter som ikke finnes i avagacestat, og effekten av disse hemmere kan være godkjent bruker i vivo modeller av Annonsen.
Avslutningsvis tror vi at presentert tilnærming kan sterkt påskynde utviklingen av APP-C99-spesifikke γ-secretase hemmere/modulatorer for klinisk bruk. Det er ingen fornektelse at γ-secretase hemmere, enten de er hakk-sparing eller ikke, kan potensielt starte toksisitet i AD pasienter, som ville føre til uønskede toleranse og resultater som tidligere foreslått26. Men med innføring av nye kjemiske verktøy og forbedret validering ordninger21, γ-secretase fortsetter å være et attraktivt narkotika mål på grunn av sin biokjemiske kompleksitet, krever mer prekliniske og kliniske studier for å utforske sin terapeutiske relevans i Annonsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke kjernen anlegget Institute av mobilnettet og Organismic biologi, Academia Sinica, kundestøtte. Denne studien ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (mest 103-2320-B-001-016-MY3 til Y.-F. L.), programmet for translasjonsforskning innovasjon biofarmasøytisk utvikling-teknologi som støtter plattform aksen fargeskjemaet (NP7 å Y.-F.L.), og Academia Sinica (å Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
- Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
- Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
- Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
- Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
- Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
- Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
- Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
- Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
- He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
- Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
- Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
- Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
- Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
- McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
- Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
- Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
- Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
- Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
- Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
- Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
- Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
- Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
- Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).
