Summary
Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification de Plasmodium falciparum infectés aqueuse globules rouges à l’aide d’un spectromètre infrarouge de la réflexion totale atténuée et analyse de données multivariées.
Abstract
Nous démontrons une méthode de dosage et détection des parasites en solution aqueuse des globules rouges (hématies) en utilisant une simple paillasse atténuée totale réflexion Fourier Transform (IRTF) spectromètre infrarouge conjointement avec (analyse de données LCVA). 3 7 P. falciparum ont été cultivés à 10 % parasitémie anneau stade des parasites et utilisé pour doper les globules rouges fraîches donateur isolé afin de créer une dilution série entre 0 – 1 %. 10 µL de chaque échantillon ont été placés au centre de la fenêtre de diamant de RTA pour acquérir le spectre. Les exemples de données a été traitées afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et à supprimer la contribution de l’eau, et alors la dérivée seconde a été appliquée pour résoudre des caractéristiques spectrales. Les données ont été ensuite analysées à l’aide de deux types de LCVA : première analyse de composantes principales (ACP) pour déterminer les valeurs aberrantes puis régression des moindres carrés partiels (PLS-R) pour construire le modèle de quantification.
Introduction
Le paludisme est parmi les maladies les plus dévastatrices de notre époque ; plus de la moitié de la population vit en péril dans les régions d’endémie et il pèse disproportionnellement faible1,2,3,4. Une grande partie de la question est les porteurs asymptomatiques et tôt les patients de stade qui agissent comme des réservoirs de moustiques vecteurs5, causant des pointes d’infection au cours de la saison humide et ce qui lui permet de persister dans les collectivités. Le paludisme est causé par des parasites Plasmodium cinq, la plus meurtrière dont est à P. falciparum , qui provoque la forme la plus sévère de la maladie2.
Actuellement, les techniques pour le diagnostic du paludisme sont loin d’être parfaites. La microscopie optique, la norme actuelle de l’or, peut seulement détecter 62-88 parasites/µL selon la méthode utilisée6. En outre, en raison de la forte intensité et hautes compétences requises, dans nombreuses régions microscopie échogrammes > 50 % des cas, en particulier ceux avec faible parasitémie niveaux2, qui sont directement attribuables au manque de ressources dans le domaine et les résultats en l’utilisation abusive de médicaments antipaludiques. Les 2 autres méthodes diagnostiques principales sont des Tests de Diagnostic rapide (TDR), qui utilisent des anticorps pour la détection et des essais de réaction en chaîne de la polymérase (PCR), qui discriminent et quantifier les parasites de l’ADN. Actuellement, les TDR sont seulement capables de détecter P. falciparum et P. vivax d’au moins 100 parasites/µL de sang résultant en des formes plus rares de la maladie étant non traitée. 7 , 8 en revanche, tests de PCR discriminer et quantifier les différentes espèces de Plasmodium à une sensibilité de 0,0004-5 parasites/µL de sang. Toutefois, elle nécessite des réactifs coûteux, des équipements et des compétences techniques et n’est donc pas approprié pour l’application sur le terrain.
Une technique très sensible, fiable et abordable est essentielle pour améliorer les temps de diagnostic et ainsi améliorer les résultats pour les patients et permettant l’élimination de la maladie. Atténué totale réflexion spectroscopie transformée de Fourier (IRTF) offre une solution à ce problème. Travaux antérieurs ont montré qu’il était possible de détecter et de quantifier à P. falciparum dans le méthanol fixé des frottis sanguins, atteindre les limites de détection de < 1 parasite/µL de sang (< 0,0002 % parasitémie)9, qui est comparable aux méthodes PCR. Des études récentes ont montré qu’il est possible de détecter et quantifier des parasites dans des échantillons aqueux et ainsi éliminer l’étape de fixation. Cependant, des facteurs tels que la vapeur d’eau, le bruit spectrale et traitement des données doivent être prises en considération pour des résultats optimaux,10.
Ce protocole vise à montrer aux nouveaux utilisateurs comment acquérir des spectres IRTF- et préparer un modèle de régression pour la détection de P. falciparum d’aqueux d’échantillons de globules rouges (RBC)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Veuillez consulter approprié matériel fiches signalétiques (FS) et le solliciter une formation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Toutes les étapes de culture doivent se faire dans un cabinet de BSL-2 à l’aide d’une technique aseptique, indiquant qu’il existe un risque d’exposition aux rayonnements UV nocifs de mesures de décontamination, blessures par piqûre d’aiguille et biologiques potentiels d’exposition et l’infection si la culture du parasite pénètre dans les blessures. En outre, le sang stock provenant des banques de sang est seulement projeté pour certaines maladies et le potentiel de propagation de maladies à diffusion hématogène représente un risque potentiel. Chercher une aide médicale immédiate dans la survenue de blessures.
1. préparation et mesure de 3 7 séries de dilutions pour le Parasite Plasmodium falciparum
Remarque : La culture de Plasmodium sp est très sensible. Utiliser des réactifs frais/expirés et nourrir les parasites régulièrement en changeant les médias. Cultures fourragères au-dessous de parasitémie 5 % tous les deux jours ; flux des cultures entre 6-10 % parasitémie une ou deux fois par jour ; et se nourrir des cultures entre 11 et 20 % jusqu'à 4 fois par jour. Parasites qui sont en train de mourir de faim vont se déforment et commencent à se contracter. Dans ce cas, se nourrissent et diluer immédiatement en changeant les médias et en ajoutant des stock RBCs. recueillir le sang du donneur dans les tubes de prélèvement sanguin contenant de l’héparine comme anticoagulant et mesure dans les 6 premières heures.
- Un total de 30 mL de 3 7 la culture souche parasites Plasmodium falciparum selon le protocole standard jusqu'à ce que la parasitémie atteigne 10 % anneaux.
-
Synchronisation des parasites
- 11 h après shizogeny dans le cycle de vie du parasite, remettre en suspension de la culture et les transvaser dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette automatisée.
- Centrifuger la culture à 300 – 400 x g et des conditions de laboratoire standard (25° C et 100 kPa) pendant 5 min.
- Éliminer le surnageant par élaborer avec une pipette ou à l’aide d’une pipette Pasteur attachée à un vide sans déranger le culot. Jeter des déchets médias dans une solution d’eau de Javel de 10 %.
- Lentement, ajouter 12 – 15 mL de solution de sorbitol de 4 % pour le plomb à l’aide d’une pipette automatisée et la culture de la composition de bouchage et renversant le tube jusqu'à ce que la culture soit homogène.
- Incuber la culture à 37 ° C pendant 15 min.
- Centrifuger la culture à 300 – 400 x g et des conditions de laboratoire standard pendant 5 min.
- Retirez le surnageant comme indiqué au point 1.2.3.
- Ajouter 10 à 15 mL de solution saline à 0,9 % au culot et mélanger la solution de bouchage et renversant le tube jusqu'à ce que la culture soit homogène.
- Répétez les étapes 1.2.6–1.2.8 deux fois plus pour laver tous les restes de sorbitol.
-
Préparation de la série de dilution de parasitémie
- Laver le stock de globules rouges comme étapes 1.2.6–1.2.9.
- Centrifuger la culture à des conditions de laboratoire standard, stock de globules rouges à 300 – 400 g pendant 5 min et jeter le surnageant comme à l’étape 1.2.3.
- Microtubes à qualifier de 0 %, 0,010 %, 0.025 %, 0,075 %, 0,100 %, 0,250 %, 0.750 % et 1.000 % et ajoutez 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL et 100 µL de la culture, respectivement à l’aide d’une pipette de 0,2 à 20 µL.
- Ajouter 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 et 0 µL de stock RBCs aux tubes marqués 0 %, 0,010 %, 0.025 %, 0,075 %, 0,100 %, 0,250 %, 0.750 % et 1.000 %, respectivement.
- Centrifuger le sang frais donneurs prélevé sur des tubes anticoagulant à 1 200 x g et des conditions de laboratoire standard pendant 10 min.
- Retirer le plasma en établissant avec une pipette et en jetant comme indiqué au point 1.2.3.
- Ajouter 900 µL d’hématies isolés dans chaque tube de microcentrifuge et bien mélanger en retournant le x 10.
-
Acquisition de spectrale
- Grâce au programme d’acquisition spectrale qui l’accompagne, cliquez sur « Set-up Instrument » et réglez les paramètres de collection de données à ce qui suit : 128 scans pour le fond ; 32 scans pour échantillon ; et la résolution de 8/cm au-dessus de la portée maximale de l’échantillon de l’appareil.
- Régler la température du spectromètre IRTF-par la recommandation du manufacturier ou toute la nuit.
- Nettoyer le cristal en frottant doucement dans un mouvement circulaire à l’aide de charpie gratuits Lingettes imbibé d’eau ultrapure. Sécher soigneusement à l’aide d’une autre lingette gratuit de peluches.
- Prendre une mesure de fond de l’air en cliquant sur « Mesure de fond ». Toutes les 20 min, nettoyer le cristal comme au point 1.4.3 et répéter cette mesure.
- Ouvrez l’affichage en direct en cliquant sur « Preview ». Observer une base plane et horizontale qui indique que le cristal est propre.
- Déposer 10µl d’eau désionisée directement sur le milieu du cristal et cliquez sur « Mesure Sample ». Répéter cette mesure de l’eau après chaque cinquième échantillon.
- Sécher le cristal à l’aide d’une lingette gratuit de peluches et un léger mouvement circulaire.
- Déposer 10µl d’échantillon, puis cliquez sur « Mesure Sample ».
- Nettoyer le cristal entre les échantillons comme au point 1.4.3.
- Répétez jusqu'à ce que 3 répétitions sont acquis, en vous assurant de randomiser l’ordre des échantillons et de la réplique.
2. analyse des données multivariée (LCVA)
NOTE : Le traitement de données doit être fait sur le groupe de données entier afin d’éviter le bruit et l’ajout des pics d’origine non biologique. En revanche, analyser les régions biologiquement pertinente : 2980-2800/cm et cm-850/1750.
-
Traitement de données
Remarque : Deux logiciels, par exemple, Matlab (désormais dénommé logiciel 1) et The Unscrambler X (désormais dénommé logiciel 2) sont utilisées comme exemples pour IMPOSERA. Logiciel 1 a la capacité d’exécuter IMPOSERA sans l’ajout d’une interface utilisateur graphique (GUI). Toutefois, il est recommandé d’acheter un GUI (Table des matières). Les instructions suivantes lorsque se référant au logiciel 1 qui assumera est en conjonction avec la boîte à outils GUI disponible dans le commerce, et le script de traitement de données exemple a été attaché.- Ouvrez le logiciel d’analyse de données multivariées approprié, cliquez sur « Importer des données » et sélectionnez le type de fichier pour l’analyser.
- Dans le logiciel 1 entrée « Analyse » dans la fenêtre de commande pour ouvrir l’interface graphique. Faites un clic droit la X box pour trouver « Importer des données ».
- Dans le logiciel 2, cliquez sur l’onglet « Fichier » pour trouver « Import ».
- Importer des spectres de l’échantillon, d’eau et base sous forme d’ensembles de données dans l’espace de travail en sélectionnant tous les spectres dans chaque jeu séparément et en cliquant sur « Ouvrir » et donner à chaque groupe un nom court, par exemple, « wat » de jeu de données de spectres de l’eau.
- Sélectionnez tableau/matrice à nouveau en cliquant sur « nouveau vecteur/matrice » et générer un vecteur de n × 1, où n est le nombre d’échantillons. D’entrée de la parasitémie de chaque échantillon et donnez le vecteur le nom « Parasitémie ».
- Dans le logiciel 1, cliquez sur « Nouvelle Variable » dans la fenêtre commande.
- Dans le logiciel 2, cliquez sur l’icône « Nouvelle Matrix ».
- Tracer les données en cliquant sur l’icône « tracer des données ». Inspecter les spectres pour les effets de la vapeur d’eau en cliquant sur « Zoom » et en zoomant sur 1400/1800-cm ; plus clairement observées comme des pics courts, pointus, étroits le long des pentes de l’amide I et amide bandes II.
- Dans les cas extrême de vapeur d’eau, ouvrez l’onglet edit/pre-quadrichromie données et sélectionnez « Lissage ». Réduire le bruit et/ou de la vapeur d’eau forte contribution en lissant les spectres d’échantillon et de l’eau à l’aide de jusqu'à 25 points de lissage ou d’utiliser une méthode de correction de vapeur d’eau.
- Bonne base non horizontales en utilisant l’algorithme de correction de référence le cas échéant, sous le même onglet edit/pre-quadrichromie données à l’étape 2.1.4.
- Les spectres de l’eau en moyenne et copiez les lignes dans une matrice de m × n équivalente à l’exemple de dataset et réduire à 70 % d’intensité en le multipliant par 0,7.
- Dans le logiciel 1, faire dans la fenêtre de commande en entrant le script suivant « AverageWater=mean(WaterDataset) ». Puis copiez-collez les lignes pour faire correspondre le jeu de données d’exemple. Pour réduire l’intensité, l’entrée « AverageWater70 = AverageWater * 0,70 ».
- Soustraire des spectres de la moyenne de l’eau de chaque spectre de l’échantillon.
- Dans le logiciel 1, faire dans la fenêtre de commande en entrant le script suivant « WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70 ».
- Ouvrez l’onglet edit/pre-quadrichromie données pour appliquer une fonction dérivée seconde et puis normaliser les données en sélectionnant la fonction unique variables normales (SNV) et centre de donnée.
- Dans le logiciel 1, faire en une seule fois. Sélectionnez d’abord « Dérivé » et entrée de 25 points de lissage, polynomial de 3 et un ordre dérivé sur l’échantillon à l’aide de 25 points de lissage et une fonction de Savitzky-Golay. Sélectionnez ensuite « SNV » et « Signifie Center ». Cliquez sur « OK/appliquer ».
- Ouvrez l’onglet edit/pre-quadrichromie données et en Variables « colonne », sélectionnez – 2 800/2 980 et 1 750 – 850/cm en veillant à ce que seulement leurs cases sont cochées.
- Ouvrez le logiciel d’analyse de données multivariées approprié, cliquez sur « Importer des données » et sélectionnez le type de fichier pour l’analyser.
-
Analyse des données
- Analyse en composantes principales (PCA)
- Cliquez sur « analyse | Decomposition » et sélectionnez APC.
- Dans le logiciel 1, cliquez sur « Construire un modèle ».
- Dans le logiciel 2 entrée les méthodes de l’APC. Entrez le nombre optimal de composants principaux (PC) - dans ce travail, 7 - et un maximum de 100 itérations et sélectionnez la validation croisée pour la méthode de validation. Cliquez sur « Exécuter ».
- Respectez la limite de confiance de 95 %, l’anneau en pointillés, sur le terrain de scores entre PC1 et PC2.
- Marquer les spectres de l’échantillon avec des scores qui se produisent à l’extérieur de la limite comme aberrantes possibles à l’aide de l’outil « Sélection spectres ».
- Si les spectres marqués ont élevé Hotellings T2 valeurs et haute Q résidus les excluent de l’analyse.
- Cliquez sur « analyse | Decomposition » et sélectionnez APC.
- Régression des moindres carrés partiels (PLS-R)
- Cliquez sur « analyse | Régression » et sélectionnez « PLS-R ».
- Dans le logiciel 1 clique droit Y bloc, puis sélectionnez le vecteur « parasitémie | Construire modèle ».
- Dans le logiciel 2, entrée des méthodes PLS-R. Sélectionnez le vecteur « Parasitémie » la référence « Y » et l’exemple de dataset comme « X Data Set » et sélectionnez la validation croisée comme la méthode de validation. Cliquez sur « Exécuter ».
- Analyser le modèle de régression. R2 valeurs sur 0,80 et l’erreur quadratique moyenne de validation croisée (RMSECV) les valeurs inférieure à 0,1 % parasitémie sont modèles acceptables.
- Analyser le vecteur de régression et d’identifier les bandes biologiques.
- Cliquez sur « analyse | Régression » et sélectionnez « PLS-R ».
- Analyse en composantes principales (PCA)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tracer des moindres carrés partiels (PLS-R) et son vecteur de régression associés, Figure 1 a et 1 b respectivement, montrent que le signal de parasites sont assez distincte de la SCFR qu’ils peuvent être utilisés pour former une régression linéaire modèle à utiliser pour la prédiction des parasites dans les ensembles de données futures.
Un modèle linéaire robuste PLS-R a été généré avec un coefficient de 0,87 et une moyenne de racine carré erreur de validation croisée (RMSECV) de la parasitémie de 0,13 %, Figure 1 a. Augmentation des niveaux de parasitémie sont principalement associés à acide nucléique bandes, surtout 1042, 1083 et 1226/cm, qui sont assignés à la ν de la ribose RNA group, νs(PO4 -) et νun(PO4 -) respectivement et former la plus grande partie négative du vecteur régression. C’est parce que les globules rouges n’ont pas un noyau et donc les acides nucléiques sont des indicateurs forts pour les parasites. En outre, la bande 1226/cm indique que la structure a une forme de B-ADN, qui met en évidence l’importance de mesurer l' État aqueux12. En revanche, parasites consomment des composants de RBC, principalement de l’hémoglobine, et donc une protéine plus élevée de lipides est attendue dans les érythrocytes non infectés comme il est indiqué par des bandes de lipides à 2913, 2879 et 1397 cm-1 et 1631 et 1555 cm-1 de l’amide I et II d’amide modes de12,13.
Les bandes distinctes montrent clairement que les signaux sont de véritables bandes biologiques plutôt que la distinction fondée sur des bandes parasites d’origine non biologique tels que de la vapeur d’eau, qui se présentent comme des bandes étroites et intenses. Plus précisément, la présence de bandes d’ADN, tableau 1, peut être directement attribuée au parasite11,12,13. En général, le vecteur de la régression peut être interprété d’une manière similaire aux charges par APC. Bandes doivent correspondent bien aux bandes et déplacements des spectres originales.
Figure 1 : Terrain de régression PLS-R, (a), de globules rouges enrichis entre 0 – 1 % parasitémie et coefficient de régression associés, (b). La courbe de régression illustre la capacité du modèle à prédire la parasitémie dans chaque échantillon, la parasitémie connue sur l’axe des abscisses et la parasitémie prévue sur l’axe y. Le coefficient de régression décrit la contribution de chaque bande à la capacité de prévision du modèle, plus intense, la bande est plus, il contribue au modèle, et donc comment le parasite altère la composition chimique du sang. Reproduit et mis à jour le de Martin, M. et al. 10 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Bande de Coefficient de régression (cm-1) | Assignment25-27 |
| 2929 | ΝaCH2 des lipides, parasite |
| 2913 | ΝaCH2 de globules de lipides, rouge |
| 2879 | ΝsCH3 de globules de lipides, rouge |
| 2861 | ΝsCH2 des lipides, parasite |
| 1707 | Paire de base B-ADN/ADN ADN A vibration νC = O & νC = N, parasite |
| 1652 | Amide j’ai des protéines de l’hélice α, parasite |
| 1631 | Amide j’ai de la cellule de feuille de β-plissées protéines, rouge sang |
| 1584 | ΝC = N d’imidazoles dans les acides nucléiques, parasite |
| 1555 | Amide II de globules rouges, les protéines |
| 1530 | Amide II, parasite |
| 1423 | B-ADN désoxyribose, parasite |
| 1397 | Ν(COO-) de globules de lipides, rouge |
| 1226 | ΝaPO4-de B-ADN, parasite |
| 1184 | B-ADN désoxyribose, parasite |
| 1083 | ΝaPO4-de l’ADN, parasite |
| 1042 | ΝC = O de ribose RNA, parasite |
Tableau 1 : attribution des bandes de coefficient de régression PLS-r sur les spectres du paludisme dopés globules rouges. Dans PLSR, la valeur de la parasitémie associée à un spectre est calculée en multipliant le spectre prétraité par le vecteur de la régression. Par conséquent, le vecteur de régression illustre l’importance et la direction des bandes IR dans la régression. Parce que les spectres ont été prétraitées à l’aide de la dérivée seconde, bandes négatives sont associés à une parasitémie supérieure tandis que les bandes positives sont associées à une faible parasitémie. Reproduit et mis à jour le de Martin, M. et al. 10 avec la permission de la Royal Society of Chemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modèle PLS-R est une méthode multivariée encadrée qui trouve une relation linéaire, Y = bX + E, entre les variables prédictives X (ici, l’absorbance à chaque nombre d’onde) et une variable continue Y (ici, le niveau de la parasitémie). En bref, le modèle combine les variables x pour créer un nouvel ensemble de variables latentes (LVs) qui captent la variance sur X en corrélation avec Y et calcule un vecteur de régression (b) qui a multiplié par un nouveau résultats de spectre dans l’estimation de la valeur de y. La force du modèle on peut prendre deux valeurs : la valeur de2 R et la valeur de l’erreur quadratique moyenne de Validation Cross (RMSECV). Le premier décrit la linéarité du modèle et donc de la robustesse (plus il est à 1 le mieux) et données pour les modèles avec une valeur de2 R inférieure à 0,8 doivent être examinées avec soin pour les valeurs aberrantes et données bruitées. La valeur RMSECV décrit l’erreur dans laquelle on peut faire la prédiction. Il est toujours préférable d’essayer de minimiser ce nombre autant que possible en faisant en sorte d’exclure des valeurs aberrantes, traiter soigneusement les données et en s’assurant qu’il est des réplicats biologiques autant que possible.
Il est donc impératif que les données de bonne qualité sont acquises pour la construction du modèle. Préparation de la série de dilution est critique ; plus précisément en s’assurant que chaque échantillon de RBC est aussi homogène que possible. En utilisant la pipette pour dresser et éjecter les globules rouges quelques reprises tout en agitant ou en effleurant doucement à l’extrémité du tube microcentrifuge 5 à 10 fois, on évitera les incohérences. Dans la même veine, il est également essentiel pour nettoyer le cristal entre chaque échantillon pour prévenir la contamination. À l’aide de l’eau ultra pure et lingettes gratuites de charpie pour nettoyer le cristal et en vérifiant que la base est plate assure qu’il n’y a aucun résidu qui finira par contaminer la prochaine mesure de l’échantillon.
Le nombre d’échantillons biologiques requis pour un modèle qui s’applique dans le domaine est au moins 30 par condition de validation avec un ensemble de données d’un nombre similaire. Ce volume considérable prendrait une quantité importante de générer et donc c’est la limitation de la technique. Cependant, comme plus d’échantillons sont analysés correctement ils peuvent être ajoutés au modèle prédictif et le renforcer. Ainsi, une fois établi, le modèle peut devenir plus précis et peut justifier l’effort nécessaire pour mettre en place.
Selon l’environnement et de l’instrumentation à laquelle les mesures sont prises, plusieurs autres questions peuvent se poser. Si le faisceau n’est pas entièrement englobée dans l’instrument, ce qui signifie que les joints ne sont pas étanche à l’air ou la fenêtre de la RTA est interchangeable avec les autres compartiments de l’échantillon, l’éthanol et la vapeur d’eau peuvent contaminer les spectres. L’éthanol apparaît comme une bande forte forte autour de 1 070/cm 14. Cela peut être évité en mesurant dans un espace libre de l’éthanol et désinfecter l’instrument uniquement une fois que toutes les mesures sont effectuées. Vapeur d’eau est causée par des changements dans l’atmosphère et apparaît comme petits pics acérés de positifs et négatifs autour/cm 1400 – 1 800 et 3 200-3 600/cm. Cela peut être résolu en augmentant la fréquence des mesures de fond et de purge de l’appareil avec de l’azote. Dans les cas où la purge n’est pas disponible et la vapeur d’eau est encore très forte, lissage des algorithmes et l’indemnisation de la vapeur d’eau peut être ajouté au traitement des données avant de les enlever.
Cette technique tient beaucoup de promesse pour le futur diagnostic et résultats pour les patients. Tout d’abord, la méthode est globalement très simple à mettre en oeuvre car l’échantillon doit seulement être reversé sur le cristal d’ATR, et puis elle peut être mesurée directement et être entré dans le modèle, diminuant le risque d’erreur de l’utilisateur. Cela éliminerait la nécessité pour la microscopie lumineuse hautement qualifié, qui, actuellement, dans certaines régions d’Afrique manquent2. En raison de la simplicité, le besoin de coûteux réactifs et équipements est également éliminé et donc le diagnostic serait pratiquement gratuite pour les patients, qui est la limitation majeure pour l’ACP. Cette combinaison conduirait à un nombre plus élevé de patients venant pour diagnostic beaucoup plus tôt et ainsi améliorer les résultats pour les patients. La technique a le potentiel pour les très hautes sensibilités qui permettrait de surmonter la faible sensibilité des TDR et serait en mesure de détecter les porteurs asymptomatiques plus tôt et donc peuvent être utilisés comme une technique de dépistage. En outre, la technique a le potentiel d’être utilisé pour d’autres maladies, sang embarqués ou non, où quelques microlitres ou microgrammes peut être appliqué pour le cristal.
Toutefois, dans le modèle d’exemple, il y a beaucoup de choses qui doivent être abordées avant elle peut être appliquée dans le domaine. Validation croisée est un en raison du faible nombre de réplicats biologiques et ce n’est pas idéal ; ayant plutôt une validation distincte défini pour tester le modèle au lieu de cela est beaucoup mieux. En outre, la RMSECV est assez élevé ici rendant les niveaux inférieurs de la quantification non fiable. Augmentation du nombre de réplicats permettra d’améliorer cette valeur et doit être fait avant d’employer cette méthode dans le domaine. Cela est corroboré dans laboratoire essais9, où RMSECV était beaucoup plus faible en raison de la taille d’échantillon supérieure. En outre, augmentant la gamme de l’intervalle et points améliorera également cette valeur aussi bien. Afin d’améliorer la capacité de diagnostic, des souches sauvages de P. falciparum doivent être utilisées, comme les 7 3 P. falciparum est une souche de laboratoire et peut présenter une composition chimique différente en raison de variations dans le phénotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs a été financé par l’Australian Research Council (Future bourse FT120100926 à BRW), National Health and Medical Research Council of Australia, (programme de subventions et de bourse de recherche Senior à JGB ; Bourses de carrière précoce JSR ; Infrastructure de recherche des instituts de subvention de régime de soutien à l’Institut Burnet), et le soutien de l’Infrastructure opérationnelle du gouvernement Victorien État subvention à l’Institut Burnet. Nous remercions M. Finlay Shanks pour soutien instrumental.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor blood | - | - | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | - | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | - | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361 (1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
