Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

الكشف والتحديد الكمي المنجلية في "مائي خلايا الدم الحمراء" بتخفيف مجموع انعكاس الأشعة تحت الحمراء الطيفي وتحليل البيانات متغير

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

نقدم هنا، على بروتوكول للكشف والتحديد الكمي المنجلية في المصابين خلايا الدم الحمراء مائي استخدام الانعكاس الكلي الموهنة مطياف الأشعة تحت الحمراء وتحليل بيانات متعددة المتغيرات.

Abstract

نظهر أسلوب القياس الكمي والكشف عن الطفيليات في مائي خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) باستخدام benchtop بسيطة مطياف "يخفف مجموع انعكاس فورييه تحويل الأشعة تحت الحمراء" (أية تي آر-فتير) بالاشتراك مع (تحليل البيانات متعددة مفدا). 7 3 المنجلية مثقف للطفيليات مرحلة خاتم تطفلن 10% ويستخدم لارتفاع كرات الدم الحمراء المانحة جديدة معزولة لإنشاء إضعاف سلسلة بين 0 – 1%. ووضعت 10 ميليلتر لكل عينة في وسط النافذة الماس ATR للحصول على الطيف. وعولج نموذج البيانات لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء وإزالة مساهمة المياه، وثم طبق المشتقة الثانية لحل الخصائص الطيفية. ثم حللت البيانات باستخدام نوعين من مفدا: الأولى الرئيسية مكون تحليل (PCA) لتحديد أي القيم المتطرفة ومن ثم "انحدار المربعات الجزئية" (الثابتة والمتنقلة-R) بناء نموذج القياس الكمي.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الملاريا من بين الأمراض الأكثر تدميرا في عصرنا؛ ويعيش أكثر من نصف السكان المعرضين للخطر في المناطق الموبوءة، وأنها تشكل عبئا غير متناسب الفقراء1،2،،من34. جزء كبير من هذه المسألة هو أعراض الناقلين وأوائل المرحلة المرضى التي تعمل كخزانات للبعوضة الناقلة5، تسبب طفرات عدوى خلال مواسم الرطب ويسمح لها بالاستمرار في المجتمعات المحلية. بسبب الملاريا خمسة المتصورة الطفيليات، وهي الأكثر دموية التي المنجلية التي تسبب أشد أشكال المرض2.

تقنيات لتشخيص الملاريا حاليا أقل من الكمال. يمكن كشف بصرية مجهرية، معيار الذهب الحالي، فقط 62-88/ميليلتر الطفيليات اعتماداً على الطريقة المستخدمة6. وعلاوة على ذلك، نظراً لكثافة والمهارة العالية المطلوبة، في العديد من مناطق الفحص المجهري ميسدياجنوسيس > 50% حالات، لا سيما المصابين بالطفيليات تدني المستويات2، التي يمكن أن تعزى مباشرة إلى الافتقار إلى الموارد في المنطقة والنتائج في إساءة استخدام العقاقير المضادة للملاريا. 2 الرئيسية التشخيص أساليب أخرى هي "الاختبارات التشخيصية السريعة" (اختبارات)، التي تستخدم الأجسام المضادة للكشف، وفحوصات Polymerase سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)، التي تنطوي على تمييز وتحديد كمية الطفيليات من الحمض النووي. اختبارات حاليا فقط قادراً على الكشف عن المنجلية و النشيطة P. للطفيليات على الأقل 100/ميليلتر من الدم أدى إلى أشكال أكثر ندرة هذا المرض دون علاج. 7 , 8 وفي المقابل، تميز فحوصات بكر والتحديد الكمي للأنواع المختلفة من المتصورة في حساسية 0.0004-5 الطفيليات/ميليلتر دم. ومع ذلك، يتطلب الكواشف باهظة الثمن، والمعدات والمهارات التقنية، وهكذا ليست مناسبة للتطبيق الميداني.

تقنية بالغة الحساسية، ويمكن الاعتماد عليها ومعقولة أمر أساسي لتحسين تشخيص مرات، وبالتالي تحسين نتائج المرضى ومما يجعل من الممكن القضاء على المرض. مجموع انعكاس فورييه الموهنة التحويل (أية تي آر-فتير) التحليل الطيفي يقدم حل محتملة لهذه المشكلة. العمل السابقة قد أظهرت أنه من الممكن لكشف وتحديد المنجلية في الميثانول الثابتة الأفلام الدم تحقيق حدود الكشف < 1 الطفيلي/ميليلتر من الدم (< تطفلن 0.0002 ٪)9، وشبيهة بطرق PCR. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن من الممكن للكشف والتحديد الكمي للطفيليات في عينات مائي وبالتالي القضاء على خطوة التثبيت. ومع ذلك، عوامل مثل بخار الماء والضوضاء الطيفية ومعالجة البيانات بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار لتحقيق أفضل النتائج10.

هذا البروتوكول يهدف إلى إظهار المستخدمين الجدد كيفية اكتساب الأطياف ATR-فتير وإعداد نموذج انحدار للكشف عن المنجلية من العينات المائية في "خلايا الدم الحمراء" (RBC)10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الرجاء استشارة مناسبة صحائف بيانات سلامة المواد (MSDS) والتماس السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL-2) توفير التدريب المناسب. يجب القيام بجميع الخطوات تثقيف في خزانة BSL-2 استخدام تقنية العقيم، بمعنى أن هناك خطر تعرض للأشعة فوق البنفسجية الضارة من خطوات إزالة التلوث والإصابة بإبرة عصا الإصابات، والتعرض البيولوجي المحتمل إذا ثقافة الطفيلي يدخل أي إصابات. وعلاوة على ذلك، مخزون الدم من بنوك الدم فقط فحص لبعض الأمراض وإمكانية انتشار الأمراض المنقولة بالدم خطر محتمل. التماس المساعدة الطبية الفورية في حدوث الإصابة.

1-إعداد وقياس 7 3 "سلسلة إضعاف الطفيلي" المنجلية

ملاحظة: الثقافة sp. المتصورة حساسة للغاية. استخدام كواشف طازجة/السارية وتغذية الطفيليات بانتظام عن طريق تغيير وسائط الإعلام. تغذية الثقافات أدناه تطفلن 5% كل يوم الثاني؛ تغذية الثقافات بين 6-10% تطفلن مرة واحدة أو مرتين في يوم؛ وتغذية الثقافات بين 11-20 ٪ لتصل إلى 4 مرات في يوم. سوف تفقد شكلها الطفيليات التي هي بداية لتجويع والبدء في العقد. وفي هذه حالة، تغذية وتمييع فورا بتغيير وسائل الإعلام وإضافة الأسهم كرات الدم الحمراء-جمع التبرع بالدم في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على الهيبارين تخثر الدم والتدبير ضمن ح 6 الأولى.

  1. الثقافة ما مجموعة 30 مل من 3 7 سلالة الطفيليات المنجلية ووفقا لبروتوكول قياسي حتى يصل تطفلن خواتم 10%.
  2. المزامنة للطفيليات
    1. ح 11 بعد شيزوجيني في دورة حياة الطفيلي، ريسوسبيند بالثقافة ونقلها في أنبوب 50 مل مخروطية ماصة مؤتمتة باستخدام.
    2. الطرد المركزي في الثقافة في 300-400 x ز وظروف المختبر القياسية (25 درجة مئوية و 100 كيلو باسكال) لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة المادة طافية بالرسم مع ماصة أو باستخدام ماصة باستور تعلق على فراغ دون إزعاج بيليه. تجاهل وسائل الإعلام النفايات إلى حل التبييض 10%.
    4. ببطء إضافة 12 – 15 مل محلول السوربيتول 4% إلى بيليه استخدام ماصة الآلي وخلط الثقافة بوضع سقف وعكس الأنبوب حتى تصبح الثقافة متجانسة.
    5. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. الطرد المركزي في الثقافة في 300-400 x ز وظروف المختبر القياسية لمدة 5 دقائق.
    7. إزالة المادة طافية كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
    8. إضافة 10 – 15 مل من المحلول الملحي 0.9 في المائة إلى بيليه، ومزج الحل بوضع سقف وعكس الأنبوب حتى تصبح الثقافة متجانسة.
    9. كرر 1.2.6–1.2.8 خطوات أكثر من مرتين لغسل جميع مخلفات من السوربيتول.
  3. إعداد سلسلة تمييع تطفلن
    1. تغسل الأوراق المالية كرات الدم الحمراء كما هو الحال في 1.2.6–1.2.9 الخطوات.
    2. الطرد المركزي في الثقافة في ظروف المختبر القياسية، المخزون كرات الدم الحمراء في 300-400 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية كما في الخطوة 1.2.3.
    3. تسمية أنابيب ميكروسينتريفوجي ك 0% و 0.010%، 0.025%، 0.075%، 0.100%، 0.250%، 0.750% و 1.000%، وإضافة 0 ميليلتر، 1 ميليلتر، ميليلتر 2.5، ميليلتر 7.5، 10 ميليلتر، 25 ميليلتر، ميليلتر 75 و 100 ميليلتر من ثقافة استخدام ماصة ميليلتر 0.2-20 التوالي.
    4. إضافة 100 ميليلتر، ميليلتر 99، 97.5 ميليلتر، 92.5 ميليلتر، ميليلتر 80، ميليلتر 75، ميليلتر 25 و 0 للأسهم كرات الدم الحمراء إلى أنابيب توسم 0%، 0.010%، 0.025%، 0.075%، 0.100%، 0.250%، 0.750%، و 1.000 في المائة، على التوالي.
    5. جمع الدم مانحة جديدة للطرد المركزي في أنابيب التخثر في 1200 × ز وظروف المختبر القياسية لمدة 10 دقائق.
    6. إزالة البلازما بإعداد مع ماصة، وتجاهل كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
    7. إضافة 900 ميليلتر من كرات الدم الحمراء منعزلة في كل أنبوبة ميكروسينتريفوجي ومزيج دقيق من عكس 10 x.
  4. اقتناء الطيفية
    1. باستخدام برنامج اقتناء الطيفية المصاحبة لها، انقر فوق "إنشاء أداة" وتعيين المعلمات جمع البيانات إلى ما يلي: فحص 128 للخلفية؛ مسح 32 للعينة؛ والقرار 8/سم على نطاق الصك على عينة كحد أقصى.
    2. تعيين درجة حرارة مطياف ATR-فتير كل توصية الشركة المصنعة أو بين ليلة وضحاها.
    3. تنظيف الكريستال بالغسل بلطف في حركة دائرية باستخدام لنت مجاناً مناديل مبللة بالماء عالي النقاوة. ثم دقة الجاف باستخدام آخر مسح الحرة لينت.
    4. تأخذ قياس خلفية للهواء بواسطة النقر فوق "قياس الخلفية". تنظيف الكريستال كما في الخطوة 1.4.3 كل 20 دقيقة، وكرر هذا القياس.
    5. فتح طريقة العرض الحية بواسطة النقر فوق "معاينة". مراقبة خط أساس المسطحة الأفقية، والتي تشير إلى أن الكريستال نظيفة.
    6. "الماصة؛" 10 ميليلتر من المياه مباشرة إلى منتصف البلورة، وانقر فوق "نموذج التدبير". كرر هذا القياس الماء بعد كل عينة الخامسة.
    7. الجاف للبلورة باستخدام مسح حرة لينت وحركة دائرية رقيقة.
    8. "الماصة؛" 10 ميكروليتر من عينة وانقر فوق "نموذج التدبير".
    9. تنظيف الكريستال بين العينات كما هو الحال في الخطوة 1.4.3.
    10. كرر حتى تكتسب 3 replicates، مع التأكد من ترتيب العينات و replicates بطريقة عشوائية.

2-تحليل البيانات المتغيرات (مفدا)

ملاحظة: معالجة البيانات يجب أن يتم عبر مجموعة البيانات كلها تجنبا للضوضاء وإضافة قمم أصل غير البيولوجية. وفي المقابل، تحليل أكثر المناطق البيولوجية ذات الصلة: 2980-2800/سم و 1750-850/سم.

  1. معالجة البيانات
    ملاحظة: اثنين البرمجيات، مثلاً، تستخدم Matlab (يشار إليها من الآن فصاعدا البرمجيات 1) و X أونسكرامبلير (يشار إليها من الآن فصاعدا البرمجيات 2) كأمثلة مفدا. البرمجيات 1 لديها القدرة على أداء مفدا دون إضافة واجهة مستخدم رسومية (GUI). ومع ذلك، ينصح بشراء واجهة المستخدم الرسومية (جدول المواد). الإرشادات التالية عند الإشارة إلى البرامج 1 سوف يفترض أن يتم بالتزامن مع أدوات واجهة المستخدم الرسومية المتاحة تجارياً، وقد أرفقت المثال البيانات معالجة البرنامج النصي.
    1. فتح برنامج تحليل البيانات متعدد المتغيرات المناسبة وانقر فوق "استيراد بيانات" وحدد نوع الملف للتحليل.
      1. في البرنامج 1، إدخال "التحليل" في إطار الأوامر لفتح واجهة المستخدم الرسومية. الحق انقر فوق مربع X لإيجاد "استيراد بيانات".
      2. في البرنامج 2، انقر فوق علامة التبويب "ملف" للبحث عن "استيراد".
    2. استيراد الأطياف عينة والمياه وخط الأساس كمجموعات من البيانات في مساحة العمل بتحديد جميع الأطياف في كل مجموعة على حدة والنقر فوق "فتح"، وإعطاء كل مجموعة اسم قصير، مثلاً، 'وات' لمجموعة البيانات الأطياف المياه.
    3. حدد الجدول/مصفوفة جديدة بواسطة النقر فوق "مصفوفة جديدة/ناقل" وتوليد متجه ن × 1, حيث n هو عدد العينات. إدخال تطفلن كل عينة وتعطي الموجه اسم 'تطفلن'.
      1. في البرنامج 1، انقر فوق "متغير جديد" في إطار الأوامر.
      2. في البرنامج 2، انقر فوق رمز "مصفوفة جديدة".
    4. رسم البيانات بواسطة النقر فوق "رسم بيانات الرمز". فحص الأطياف لآثار بخار الماء عن طريق النقر فوق "تكبير" التكبير على 1800-1400/سم؛ الأكثر وضوح لاحظ كقمم قصيرة وحادة وضيقة على طول منحدرات أميد أنا واميد العصابات الثانية.
    5. وفي الحالات المتطرفة من بخار الماء، فتح علامة التبويب تحرير/قبل-معالجة البيانات، وحدد "تجانس". تقليل الضوضاء و/أو مساهمات قوية بخار الماء بتجانس الأطياف عينة والمياه باستخدام يصل إلى 25 نقطة لتجانس أو استخدام أسلوب تصحيح بخار الماء.
    6. خط أفقي غير الصحيح باستخدام خوارزمية تصحيح الأساس إذا كان ذلك مناسباً، تحت علامة التبويب تحرير/قبل-معالجة البيانات نفسها في خطوة 2.1.4.
    7. متوسط المياه الأطياف ونسخ الصفوف في مصفوفة م × ن مكافئ إلى dataset عينة والحد منه بشدة 70% بضرب من 0.7.
      1. في البرمجيات 1، وذلك في إطار الأوامر عن طريق إدخال البرنامج النصي التالي "AverageWater=mean(WaterDataset)". ثم نسخ ولصق الصفوف لمطابقة مجموعة بيانات نموذج. للحد من الكثافة، الإدخال "AverageWater70 = أفيراجيواتير * 0.70".
    8. طرح الماء متوسط الأطياف من كل طيف العينة.
      1. في البرمجيات 1، وذلك في إطار الأوامر عن طريق إدخال البرنامج النصي التالي "واتيركوريكتيداتا = سامبليداتاسيت-AverageWater70".
    9. فتح علامة التبويب تحرير/قبل-معالجة البيانات لتطبيق دالة مشتقة ثانية، ثم تطبيع البيانات عن طريق تحديد دالة variate عادي واحد (الهولندية) ويعني مركز البيانات.
      1. في البرنامج 1، القيام بذلك دفعة واحدة. أولاً حدد "مشتق"، و 25 نقطة الإدخال تجانس وترتيب متعدد الحدود من 3 وترتيب المشتقة في العينة تعيين باستخدام 25 نقطة لتجانس ودالة Savitzky غولي. ثم حدد "الهولندية" ومركز "يعني". انقر فوق "تطبيق/بخير".
    10. فتح علامة التبويب تحرير/قبل-معالجة البيانات وفي "المتغيرات العمود"، حدد 2,980 – 2,800/سم و 1,750 – 850/سم عن طريق التأكد من أن يتم قليلاً فقط على مربعات.
  2. تحليل البيانات
    1. تحليل العنصر الرئيسي (PCA)
      1. انقر فوق "تحليل | التحلل "وحدد محكمة التحكيم الدائمة.
        1. في البرنامج 1، انقر فوق "إنشاء نموذج".
        2. في البرنامج 2، إدخال أساليب محكمة التحكيم الدائمة. إدخال العدد الأمثل للمكونات الرئيسية (أجهزة كمبيوتر)-في هذا العمل، 7-وبحد أقصى قدرة 100 مرة من التكرار، وعبر التحقق من تحديد لأسلوب التحقق من الصحة. انقر فوق "تشغيل".
      2. مراقبة حدود الثقة 95%، الحلبة متقطع، في مؤامرة عشرات بين PC1 و PC2.
      3. علامة الأطياف عينة مع الدرجات التي تحدث خارج الحد كالقيم المتطرفة المحتملة باستخدام "أداة الأطياف حدد".
      4. إذا الأطياف ملحوظ لدى ارتفاع قيم T هوتيلينجس2 وارتفاع س البواقي استبعادها من مزيد من التحليل.
    2. انحدار المربعات الجزئية (الثابتة والمتنقلة-R)
      1. انقر فوق "تحليل | تراجع "وحدد" الثابتة والمتنقلة-R ".
        1. الحق فوق كتلة Y في البرنامج 1، وحدد الناقل "تطفلن | بناء نموذج ".
        2. في البرنامج 2، إدخال الأساليب الثابتة والمتنقلة-R. حدد متجه "تطفلن" "Y reference" وعينه dataset ك "X مجموعة البيانات" وعبر تحديد-التحقق من الصحة كأسلوب التحقق من الصحة. انقر فوق "تشغيل".
      2. تحليل نموذج الانحدار. R2 القيم أكثر من 0.80 وجذر متوسط مربع الخطأ عبر التحقق من صحة القيم (رمسيكف) التي أقل من 0.1% تطفلن نماذج مقبولة.
      3. تحليل متجه الانحدار وتحديد النطاقات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ارسم المربعات الجزئية (الثابتة والمتنقلة-R) ولها متجه الانحدار المرتبطة بها، و الشكل 1a و 1b على التوالي، تبين أن الإشارة من الطفيليات متميزة ما يكفي من كرات الدم الحمراء التي يمكن استخدامها للنموذج نموذج انحدار خطي لاستخدامها التنبؤ بالطفيليات في مجموعات البيانات مستقبلا.

تم إنشاء نموذج الثابتة والمتنقلة-R قوية، خطي ذات قيمة التربيعي 0.87 ويعني جذر التربيع خطأ التحقق من الصحة عبر (رمسيكف) من تطفلن 0.13 في المائة، الشكل 1a. تزايد تطفلن مستويات مرتبطة أساسا بعصابات الحمض النووي، ولا سيما 1042، 1083 و 1226/سم، التي تم تعيينها إلى ν(C=O) من الريبوز الجيش الملكي النيبالي المجموعة، νs4) و ν4) على التوالي، وتشكل الجزء السلبي الرئيسي من متجه الانحدار. هذا بسبب نقص كرات الدم الحمراء نواة وبالتالي فالأحماض النووية مؤشرات قوية للطفيليات. وعلاوة على ذلك، الفرقة 1226/سم يشير إلى أن الهيكل نموذج ب-الحمض النووي، الذي يسلط الضوء على أهمية قياس في الدولة مائي12. وفي المقابل، الطفيليات تستهلك مكونات ربك، أساسا من الهيموغلوبين، وهكذا يتوقع بروتين أعلى بنسبة الدهون في كرات الدم الحمراء مصابة كما يتبين من عصابات الدهن في 2913، 2879 و 1397-1 سم و 1631 وأغار سم-1 من أميد الأول والثاني أميد وسائط12،13.

نطاقات مميزة تظهر بوضوح أن الإشارات عصابات البيولوجية الحقيقية بدلاً من التفريق استناداً إلى عصابات زائفة من أصل غير البيولوجية مثل بخار الماء، الذي يقدم كنطاقات ضيقة ومكثفة. على وجه التحديد، وجود عصابات الحمض النووي، الجدول 1، يمكن أن يعزى مباشرة إلى الطفيلي11،،من1213. وبصفة عامة، يمكن تفسير متجه الانحدار بطريقة مماثلة للشحنات في محكمة التحكيم الدائمة. ينبغي الربط بين عصابات جيدا مع العصابات ونوبات من أطياف الأصلي.

Figure 1
رقم 1: الثابتة والمتنقلة-R انحدار الأرض، (أ)، من كرات الدم الحمراء ارتفعت بين 0 – 1% تطفلن ومعامل الانحدار المرتبطة بها، (ب). وارسم الانحدار يوضح قدرة النموذج على التنبؤ تطفلن في كل عينة، مع تطفلن المعروفة على المحور السيني وتطفلن المتوقعة على المحور ص. معامل الانحدار يصف مساهمة كل من الفرقة القدرة التنبؤية للنموذج، وأكثر كثافة الفرقة أكثر فإنه يسهم في النموذج ومن ثم كيف الطفيلي يغير التركيب الكيميائي للدم. المستنسخة والمعدلة من مارتن, M. et al. 10 مع إذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الفرقة معامل الانحدار (سم-1) Assignment25-27
2929 ΝaCH2 من الدهون، الطفيلي
2913 ΝaCH2 من خلايا الدم الدهون، أحمر
2879 ΝsCH3 من خلايا الدم الدهون، أحمر
2861 ΝsCH2 من الدهون، الطفيلي
1707 زوج قاعدي ب-الحمض النووي/A--الحمض النووي الاهتزاز νC = س & νC = N، والطفيلي
1652 أميد أنا من البروتينات α-الحلزون، الطفيلي
1631 أميد أنا من خلايا الدم والبروتينات، والأحمر ورقة الطيات بيتا
1584 ΝC = N من إيميدازوليس في الأحماض النووية، الطفيلي
1555 أميد الثاني من خلايا الدم والبروتينات، وأحمر
1530 أميد الثاني، والطفيلي
1423 ه ب-الحمض النووي "ديوكسي ريبوز"، والطفيلي
1397 Ν(COO-) من خلايا الدم الدهون، أحمر
1226 ΝaPO4-ب-الحمض النووي، من الطفيلي
1184 ب-الحمض النووي "ديوكسي ريبوز"، والطفيلي
1083 ΝaPO4-من الحمض النووي، والطفيلي
1042 ΝC = يا من الجيش الملكي النيبالي الريبوز، الطفيلي

الجدول 1: تعيينات عصابات معامل الانحدار من الثابتة والمتنقلة-R في أطياف الملاريا ارتفعت كرات الدم الحمراء. في بلسر، يحسب قيمة تطفلن المرتبطة بطائفة بضرب الطيف معالجة متجه الانحدار. ومن ثم، يصور متجه الانحدار بأهمية والاتجاه لنطاقات الأشعة تحت الحمراء في الانحدار. لأنه كان preprocessed الأطياف باستخدام المشتقة الثانية، العصابات السلبية المرتبطة تطفلن أعلى بينما العصابات إيجابية ترتبط تطفلن منخفضة. المستنسخة والمعدلة من مارتن, M. et al. 10 مع إذن من "المجتمع الملكي للكيمياء".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نموذج الثابتة والمتنقلة-R هو أسلوب متعدد المتغيرات تحت إشراف يرى وجود علاقة خطية، Y = bX + ه، بين المتغيرات التنبؤية X (هنا، امتصاص في كل وافينومبير) ومستمر متغير Y (هنا، ومستوى تطفلن). وباختصار، النموذج يجمع بين المتغيرات في العاشر لإنشاء مجموعة جديدة من المتغيرات الكامنة (LVs) أن القبض على الفرق في العاشر يرتبط مع Y، ويحسب متجه انحدار (ب) أن مضروباً نتائج طيف جديد في تقدير قيمة y. قوة النموذج الذي يمكن أن تؤخذ من قيمتين: قيمة2 R وقيمة جذر متوسط مربع الخطأ للصليب التحقق من الصحة (رمسيكف). السابق يصف الخطي للنموذج، ومن ثم على متانة (أقرب هو إلى 1 على نحو أفضل) ويجب إعادة النظر بعناية في البيانات للنماذج ذات قيمة2 R أقل من 0.8 للقيم المتطرفة وبيانات صاخبة. قيمة رمسيكف وصف الخطأ التي يمكن التنبؤ بها. من الأفضل دائماً في محاولة لتقليل هذا العدد إلى أقصى حد ممكن عن طريق التأكد من استبعاد القيم المتطرفة، معالجة البيانات بعناية والتأكد من أن هناك replicates البيولوجي أكبر عدد ممكن.

وبالتالي من الضروري أن يتم الحصول على بيانات ذات نوعية جيدة لبناء النموذج. إعداد سلسلة تمييع أمر بالغ الأهمية؛ تحديداً التأكد من أن كل عينة ربك متجانسة قدر الإمكان. باستخدام ماصة بإعداد وإخراج كرات الدم الحمراء عدة مرات بينما يحوم أو التحريك بلطف نهاية الأنبوب ميكروسينتريفوجي 5 – 10 مرات، سيتم تجنب التناقضات. على نفس المنوال، من المهم أيضا لتنظيف الكريستال بين كل عينة لمنع التلوث. استخدام المياه النقية فائقة ولينت مناديل مجاناً لتنظيف الكريستال والتحقق من أن خط الأساس شقة يضمن أن هناك لا بقايا سوف تلوث بقياس العينة التالي.

عدد العينات البيولوجية التي يتطلبها نموذجا قابلاً للتطبيق في الميدان هو على الأقل 30 الواحدة شرط أن يتم التحقق من صحة مع مجموعة بيانات لعدد مماثل. هذا الحجم الكبير سوف تأخذ كمية كبيرة لتوليد وهكذا هذا هو الحد من هذه التقنية. ومع ذلك، كما يتم تحليل عينات أكثر بشكل صحيح أنهم يمكن إضافتها إلى نموذج تنبؤي وتعزيزها. وهكذا، فور إنشاء النموذج يمكن أن تصبح أكثر دقة ويمكن تبرير الجهد اللازم لإعداده.

اعتماداً على البيئة والأجهزة التي يتم أخذ القياسات، يمكن أن تنشأ عدة قضايا أخرى. إذا كان بيمليني غير محاطة بالكامل في الصك، بمعنى أما المفاصل غير محكم أو النافذة ATR للتبادل مع سائر المقصورات عينة، الإيثانول وبخار الماء يمكن أن تلوث الأطياف. يظهر الإيثانول كعصابة قوية حادة حول 1,070/سم 14. ويمكن تجنب هذا بقياس في مساحة حرة من الإيثانول وتعقيم الصك إلا عندما تؤخذ جميع القياسات. بخار الماء هو الناجمة عن التغيرات في الغلاف الجوي، ويظهر كقمم إيجابية وسلبية حادة صغيرة حول 1400 – 1,800/cm و 3,200 – 3,600/سم. يمكن حل هذه بواسطة زيادة تواتر قياسات الخلفية وتطهير الصك مع النيتروجين. في الحالات حيث يتم حذف غير متوفر وبخار الماء لا يزال قويا جداً، يمكن إضافة تجانس الخوارزميات وتعويض بخار الماء إلى البيانات المعالجة التمهيدية لإزالتها.

هذا الأسلوب يحمل الكثير من الوعد للمستقبل التشخيص ونتائج المرضى. أولاً، عموما الطريقة بسيطة للغاية لتنفيذ في هذا يحتاج فقط أن بيبيتيد العينة على البلورة ATR، ثم يمكن أن يقاس مباشرة وتكون مدخلات النموذج الحد من احتمالات الخطأ المستخدم. وهذا سيقضي على الحاجة إلى مهارات عالية ميكروسكوبيست الخفيفة، حاليا في بعض المناطق من أفريقيا تفتقر إلى2. سبب البساطة، أيضا القضاء على الحاجة إلى الكواشف باهظة الثمن، والمعدات، وهكذا سيكون التشخيص تقريبا مجاناً للمرضى، وهو القيد الرئيسي لبكر. وهذا المزيج سيؤدي إلى إعداد أكبر من المرضى القادمين تشخيص أسرع بكثير، وبالتالي تحسين نتائج المرضى. التقنية كامنة للحساسيات عالية للغاية من شأنه التغلب على الحساسيات منخفضة في اختبارات، وسيكون قادراً على اكتشاف أعراض الناقلين عاجلاً، وبالتالي يمكن استخدامها كأسلوب فحص. وعلاوة على ذلك، قد التقنية يمكن أن تستعمل لأمراض أخرى، والدم تتحمل أو خلاف ذلك، حيث يمكن تطبيق بعض ميكروليتيرس أو ميكروغرام للبلورة.

ومع ذلك، في النموذج المثال هناك الكثير من الأمور التي تحتاج إلى معالجة قبل أن يمكن تطبيقها في الميدان. التحقق من الصحة عبر واحد بسبب انخفاض عدد replicates البيولوجية والتي ليست مثالية؛ بدلاً من ذلك بعد التحقق من صحة منفصلة لاختبار النموذج بدلاً من ذلك أفضل بكثير. وعلاوة على ذلك، رمسيكف عالية جداً هنا جعل المستويات الدنيا للقياس الكمي لا يمكن الاعتماد عليها. زيادة عدد replicates ستحسن هذه القيمة ويجب أن يتم قبل استخدام هذا الأسلوب في الحقل. وهذا يؤكد صحة في مختبر تجارب9، حيث كان رمسيكف أقل بكثير بسبب حجم عينة أكبر. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم زيادة النطاق الفاصل الزمني ونقاط أيضا تحسين هذه القيمة، وكذلك. لزيادة وتحسين القدرة على التشخيص، ينبغي استخدام السلالات البرية من المنجلية ، 7 3 المنجلية هو سلالة مختبر، وقد عرض تركيبة كيميائية مختلفة بسبب الاختلافات في النمط الظاهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم توفير التمويل للمؤلفين من قبل "مجلس البحوث الأسترالية" (مستقبل الزمالة FT120100926 إلى برو)، الوطنية الصحية والطبية البحوث مجلس أستراليا (برنامج المنح و "زمالة للبحث أقدم" للبنوك؛ أوائل الوظيفي زمالات جسر؛ البنية التحتية للبحوث معاهد دعم نظام المنح للمعهد برنيت)، ودعم البنية التحتية التشغيلية حكومة الدولة الفيكتوري منحة لمعهد برنيت. ونسلم السيد فينلي شانكس لدعم دور فعال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Arnold. Great Britain. 361 (1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11, (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18, (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13, (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142, (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39, (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48, (4), (1952).
الكشف والتحديد الكمي <em>المنجلية</em> في "مائي خلايا الدم الحمراء" بتخفيف مجموع انعكاس الأشعة تحت الحمراء الطيفي وتحليل البيانات متغير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter