Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Påvisningen og kvantificeringen af Plasmodium falciparum i vandig røde blodlegemer af svækket samlede refleksion infrarødspektroskopi og multivariat dataanalyse

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til påvisning og kvantificering af Plasmodium falciparum i inficerede vandig røde blodlegemer ved hjælp af en svækket samlede refleksion infrarøde spektrometer og multivariat dataanalyse.

Abstract

Vi demonstrere en metode til kvantificering og påvisning af parasitter i vandig røde blodlegemer (RBC) ved hjælp af en simpel benchtop svækket samlede refleksion Fourier Transform infrarød (ATR-FTIR) spektrometer sammenholdt med multivariat dataanalyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum blev kultiveret til 10% parasitemia ring fase parasitter og bruges til spike frisk donor isoleret røde blodlegemer for at oprette en fortynding serien mellem 0 – 1%. 10 µL af hver prøve blev placeret på midten af vinduet ATR diamant til at erhverve spektret. Eksempeldata blev behandlet til at forbedre signal-støj-forholdet og fjerne bidrag af vand, og derefter den anden afledede blev anvendt til at løse spektrale egenskaber. Dataene blev derefter analyseret ved hjælp af to typer af MVDA: første Principal komponent analyse (PCA) til at afgøre enhver afvigende og derefter delvis mindste kvadraters Regression (PLS-R) til at bygge modellen kvantificering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Malaria er blandt de mest ødelæggende sygdomme i vor tid; over halvdelen af befolkningen lever i fare i endemiske områder og det tynger uforholdsmæssigt fattige1,2,3,4. En stor del af problemet er asymptomatiske bærere og tidlige fase patienter der fungere som reservoirer for myg vektorer5, forårsager pigge af infektion i våde årstider og gør det muligt at persistere i Fællesskaber. Malaria forårsages af fem Plasmodium parasitter, den mest dødbringende som er P. falciparum , som forårsager den mest alvorlige form af sygdommen2.

Teknikker til diagnosticering af malaria er i øjeblikket mindre end perfekt. Optisk mikroskopi, den nuværende guld standard, kan kun registrere 62-88 parasitter/µL afhængigt af den anvendte metode6. Desuden, på grund af vækstens og høje kvalifikationer kræves, i mange regioner mikroskopi misdiagnoses > 50% af tilfældene, især dem med lavt parasitaemia niveauer2, der direkte kan henføres til manglen ressourcer i området og resultater i misbrug af malariamedicin. De andre 2 vigtigste diagnostiske metoder er hurtige diagnostiske test (RDTs), der anvender antistoffer til påvisning og Polymerase Chain Reaction (PCR) assays, der diskriminerer og kvantificere parasitter fra DNA. I øjeblikket, er RDTs kun i stand til at opdage P. falciparum og P. vivax af mindst 100 parasitter/µL af blod medførende sjældnere former af sygdommen er ubehandlet. 7 , 8 derimod PCR assays diskriminerer og kvantificere forskellige arter af Plasmodium på en følsomhed på 0,0004-5 parasitter/µL af blod. Men det kræver dyre reagenser, udstyr og tekniske færdigheder, og er således ikke egnet til programmet felt.

En meget følsom, pålidelig og overkommelig teknik er afgørende at forbedre diagnose gange, og dermed forbedre patienternes resultater, og gør sygdommen eliminering muligt. Svækket samlede refleksion Fourier transform (ATR-FTIR) spektroskopi tilbyder en mulig løsning på dette problem. Tidligere arbejde har vist, at det var muligt at detektere og kvantificere P. falciparum i methanol fast blod film opnå påvisningsgrænserne for < 1 parasit/µL af blod (< 0.0002% parasitemia)9, som er sammenlignelig med PCR metoder. Nylige undersøgelser har vist, at det er muligt at detektere og kvantificere parasitter i vandige prøver og dermed fjerne trinnet fiksering. Faktorer som vanddamp, spektrale støj og data behandling skal dog tages i betragtning for optimale resultater10.

Denne protokol har til formål at vise nye brugere hvordan til at erhverve ATR-FTIR spectra og forberede en regressionsmodel til påvisning af P. falciparum fra vandige røde blodlegemer (RBC) prøver10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Venligst kontakt passende materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) og søge passende biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) uddannelse. Alle dyrkningsbaserede trin skal være udført i en BSL-2 kabinettet ved hjælp af aseptisk teknik, hvilket betyder, at der er en risiko for eksponering for skadelige UV-stråling fra dekontaminering trin, nål stick skader, og potentielle biologiske eksponering og infektion, hvis parasit kulturen træder nogen skader. Derudover er stock blod fra blodbanker er kun screenet for visse sygdomme og potentiale for at sprede blod bårne sygdomme en potentiel risiko. Søge øjeblikkelig lægehjælp i forekomsten af skade.

1. forberedelse og måling af 3D 7 Plasmodium falciparum parasit fortyndingsrække

Bemærk: Plasmodium sp. kultur er meget følsomme. Brug frisk/udløbet reagenser og feed parasitter regelmæssigt ved at ændre medierne. Feed kulturer under 5% parasitemia hver anden dag; feed kulturer mellem 6-10% parasitemia en gang eller to gange om dagen; og foder kulturer mellem 11-20% op til 4 gange om dagen. Parasitter, der begynder at sulte vil miste deres form og begynde at kontrakt. I et sådant tilfælde, foder og fortyndes straks ved at ændre medierne og tilføje stock RBC. indsamle donor blod i blod indsamling rør indeholdende heparin som antikoagulans og foranstaltning inden for de første 6 h.

  1. Kultur i alt 30 mL af 3D 7 stamme Plasmodium falciparum parasitter efter standard protokol indtil parasitemia når 10% ringe.
  2. Synkronisering af parasitter
    1. 11 h efter shizogeny i livscyklus parasit resuspend kultur og overførsel til en 50 mL konisk slange ved hjælp af en automatiseret pipette.
    2. Der centrifugeres kultur på 300 – 400 x g og standard laboratorieforhold (25° C og 100 kPa) i 5 min.
    3. Fjern supernatanten ved at trække det med en pipette eller ved hjælp af Pasteurs pipette knyttet til et vakuum uden at forstyrre pelleten. Kassere affald medier i en 10% blegemiddelopløsning.
    4. Langsomt tilføje 12 – 15 mL 4% sorbitol løsning til pellet ved hjælp af en automatiseret pipette og bland kulturen af udjævningen og vende røret indtil kulturen er homogen.
    5. Inkuber kultur ved 37 ° C i 15 min.
    6. Der centrifugeres kultur på 300 – 400 x g og standard laboratorieforhold i 5 min.
    7. Fjern supernatanten, som beskrevet i trin 1.2.3.
    8. Tilføje 10-15 mL 0,9% saltvand til pellet og bland løsningen ved udjævningen og vende røret indtil kulturen er homogen.
    9. Gentag trin 1.2.6–1.2.8 to gange mere at vaske alle rester af sorbitol.
  3. Forberedelse af parasitemia fortyndingsrække
    1. Vask stock røde blodlegemer som i trin 1.2.6–1.2.9.
    2. Centrifugeres kultur på standard laboratorieforhold, stock røde blodlegemer på 300 – 400 x g i 5 min og kassér supernatanten som i trin 1.2.3.
    3. Mærke microcentrifuge rør som 0, 0.010, 0.025%, 0.075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% og 1.000%, og tilsæt 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL og 100 µL af kultur henholdsvis ved hjælp af en 0,2-20 µL pipette.
    4. Tilsæt 100 µL, 99 µL, 97.5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 og 0 µL af stock RBC til rør mærket 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% og 1,000%, henholdsvis.
    5. Centrifuge frisk donor blod indsamlet i antikoagulans rør på 1.200 x g og standard laboratorieforhold i 10 min.
    6. Fjerne plasmaet ved at trække det med en pipette og udsmid som beskrevet i trin 1.2.3.
    7. Tilføje 900 µL af isolerede røde blodlegemer i hvert microcentrifuge rør og blandes grundigt ved at invertere 10 x.
  4. Spektrale erhvervelse
    1. Ved hjælp af medfølgende spektrale erhvervelse program, klik på "Instrument Set-Up" og data indsamling parametre er angivet følgende: 128 scanninger for baggrunden; 32 scanninger for prøve; og opløsning til 8/cm over den maksimale prøve vifte af instrumentet.
    2. Indstil temperaturen af ATR-FTIR spektrometer pr. producentens anbefaling eller natten.
    3. Ren krystal af forsigtigt skrubbe i en cirkulær bevægelse ved hjælp af lint gratis klude fugtet med ultrarent vand. Derefter grundigt tørre ved hjælp af en anden lint gratis tørre.
    4. Tage en baggrund måling af luften ved at klikke på "Baggrund måling". Hver 20 min, ren krystal som i trin 1.4.3 og Gentag denne måling.
    5. Åbn visningen live ved at klikke på "Preview". Observere et fladt, vandret grundlinje, der angiver, at Krystallen er ren.
    6. Tilsæt 10 µL med deioniseret vand direkte på midten af krystal og klik på "Foranstaltning prøve". Gentag dette vand måling efter hver femte prøve.
    7. Tørre krystal ved hjælp af en lint gratis tørre og blid cirkelbevægelser.
    8. Tilsæt 10 µL af prøven og klik på "Foranstaltning prøve".
    9. Ren krystal mellem prøver som i trin 1.4.3.
    10. Gentag indtil 3 replikater er erhvervet, og sørg for at randomisere rækkefølgen af prøverne og replikater.

2. multivariat dataanalyse (MVDA)

NOTE: Data behandling skal ske over hele datasættet for at undgå støj og tilsætning af toppene af ikke-biologiske oprindelse. Derimod analysere over de biologisk relevante regioner: 2980-2800/cm og 1750-850/cm.

  1. Data behandling
    Bemærk: To software, fx Matlab (herefter benævnt software 1) og The Unscrambler X (herefter benævnt software 2) bruges som eksempler for MVDA. Software 1 har evnen til at udføre MVDA uden tilsætning af en grafisk brugergrænseflade (GUI). Men, det anbefales at købe en GUI (Tabel af materialer). Følgende instruktioner når henviser til software 1 vil antage, er sammen med kommercielt tilgængelige GUI værktøjskassen, og scriptet eksempel data behandling har været tilknyttet.
    1. Åbn den relevante flerdimensionale data analyse software, skal du klikke på "importdata" og vælg typen fil til analyse.
      1. I software 1, input "Analyse" i den befale rude at åbne GUI. Højreklik på X-box for at finde "importdata".
      2. Klik på fanen "File" at finde "Import" i software 2.
    2. Importere prøve, vand og baseline spektre som datasæt til arbejdsområdet ved at vælge alle spektre i hvert sæt separat og klikke på "Åbn" og give hvert sæt et kort navn, fx "wat' for datasæt af vand spektre.
    3. Vælg ny tabel/matrix ved at klikke på "ny Matrix/vektor" og generere en n × 1 vektor, hvor n er antallet af prøver. Input parasitemia af hver prøve og give vektoren navn 'Parasitemia'.
      1. I software 1, skal du klikke på "Ny variabel" i kommandovinduet.
      2. Klik på ikonet "Nye Matrix" i software 2.
    4. Plotte data ved at klikke på "Afbilde Data ikon". Inspicere spektre for vanddamp effekter ved at klikke på "Zoom" og zoomer ind på 1800-1400/cm; mest tydeligt observeret som kort, skarpe, smalle toppe langs skråningerne af akrylamid jeg og AMID II bands.
    5. I tilfælde af ekstreme vanddamp, åbne fanen Rediger/pre-transparente data, og vælg "Udjævning". Reducere støj og/eller stærk vanddamp bidrag ved at udglatte prøve og vand spektrene ved hjælp af op til 25 point af udjævning eller bruge en vanddamp korrektion metode.
    6. Korrekte ikke-horisontale baseline ved hjælp af den oprindelige korrektion algoritme eventuelt under samme under fanen Rediger/pre-transparente data i trin 2.1.4.
    7. Gennemsnitlig vand spectra og kopiere rækker ind i en n × m matrix svarer til prøven datasæt og reducere det til 70% intensitet ved multiplikation med 0,7.
      1. I software 1, skal du gøre det i kommandovinduet ved at indtaste følgende script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Derefter kopiere indsætte rækker for at matche eksempeldatasættet. For at reducere intensiteten, input "AverageWater70 = AverageWater * 0,70".
    8. Subtrahere gennemsnitlige vand spektre fra hver prøve spektrum.
      1. I software 1, gøre det i kommandovinduet ved at indtaste følgende script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
    9. Åbn fanen Rediger/pre-transparente data for at anvende en anden afledte funktion, og derefter normalisere dataene ved at vælge enkelt normale variate (SNV) funktion og betyde center data.
      1. I software 1, skal du gøre det på én gang. Først vælge "Afledte" og input 25 point af gulvafslibning, polynomiske rækkefølge af 3 og afledte ordre på prøve ved hjælp af 25 point af udjævning og en Savitzky-Golay funktion. Vælg derefter "SNV" og "Betyde Center". Klik på "Okay/anvende".
    10. Åbn fanen Rediger/pre-transparente data og "Kolonne variabler", Vælg 2,980-2.800/cm og 1.750 – 850/cm ved at sikre kun deres bokse er afkrydset.
  2. Dataanalyse
    1. Principal komponent analyse (PCA)
      1. Klik på "analyse | Nedbrydning"og vælg PCA.
        1. I software 1, skal du klikke på "Bygge Model".
        2. I software 2, inputmetoder PCA. Input det optimale antal Principal Components (pc'er) - i dette arbejde, 7 - og højst 100 gentagelser, og vælg cross-validering til valideringsmetoden. Klik på "Kør".
      2. Observere konfidensgrænse på 95%, den stiplede ring på score plot mellem PC1 og PC2.
      3. Markere prøve spektre med noder, der opstår uden for grænsen som potentielle outliers ved hjælp af "Vælg Spectra værktøj".
      4. Hvis de markerede spektre har høje udelukke Hotellings T2 værdier og høje Q residualer dem fra yderligere analyse.
    2. Delvis mindste kvadraters Regression (PLS-R)
      1. Klik på "analyse | Regression"og vælg"PLS-R".
        1. I software 1, højre klik på Y blok og vælg vektoren "Parasitemia | Bygge Model".
        2. I software 2, inputmetoder PLS-R. Vælg vektor "Parasitemia" som referencen"Y" og prøve datasæt som "X datasæt" og vælg cross-validering som Valideringsmetoden. Klik på "Kør".
      2. Analysere regressionsmodellen. R2 værdier over 0,80 og kvadratiske fejl af cross-validering (RMSECV) værdier, der er mindre end 0,1% parasitemia er acceptable modeller.
      3. Analysere regression vektor og identificere de biologiske bands.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Delvis mindste kvadraters (PLS-R) plot og dens tilknyttede regression vektor, figur 1a og 1b henholdsvis, viser, at signalet fra parasitter er tydelig nok fra de røde blodlegemer, som de kan bruges til at danne en lineær regression model skal bruges til den forudsigelse af parasitter i fremtidige datasæt.

En robust, lineære PLS-R modellen blev genereret med en R-kvadreret værdi af 0.87 og en rod betyde squared cross valideringsfejl (RMSECV) af 0,13% parasitemia, figur 1a. Stigende parasitemia niveauer er primært knyttet til nukleinsyre bands, især 1042, 1083 og 1226/cm, som er knyttet til ν(C=O) fra RNA ribose gruppe, νs(PO4 -) og νen(PO4 -) henholdsvis, og danne den store negative del af regression vektor. Dette er fordi RBC mangler en cellekerne og dermed nukleinsyrer er stærke indikatorer for parasitter. Derudover angiver 1226/cm bånd, at strukturen har en B-DNA form, som understreger vigtigheden af måling i den vandige stat12. Derimod parasitter forbruge RBC komponenter, primært hæmoglobin, og dermed et højere protein til lipid forholdet forventes i ikke-inficerede RBC angivet af lipid bands på 2913, 2879 og 1397 cm-1 og 1631 og 1555 cm-1 fra akrylamid I og AMID II tilstande12,13.

De forskellige bands viser tydeligt, at signalerne er sande biologiske bands snarere end differentiering baseret på falske bands af ikke-biologiske oprindelse som vanddamp, som udgør som smalle og intens bands. Specifikt, kan tilstedeværelsen af DNA bands, tabel 1, direkte tilskrives parasit11,12,13. I almindelighed, kan regression vektor fortolkes på en lignende måde at belastninger i partnerskabs-og samarbejdsaftalen. Bands skal korrelere godt med bands og forskydninger af de oprindelige spektre.

Figure 1
Figur 1: PLS-R regression plot, litra a, af røde blodlegemer spiked mellem 0 – 1% parasitemia og tilknyttede regression koefficient, (b). Regression plot viser modellen evne til at forudsige parasitemia i hver prøve, med det kendte parasitemia på x-aksen og de forudsagte parasitemia på y-aksen. Regression koefficient beskriver bidrag af hvert bånd til den prædiktive kapacitet model, jo mere intens bandet er jo mere det bidrager til modellen, og dermed hvordan parasit ændrer den kemiske sammensætning af blodet. Gengivet og modificeret fra Martin, M. et al. 10 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Regression koefficient Band (cm-1) Assignment25-27
2929 ΝaCH2 fra lipider, parasit
2913 ΝaCH2 fra lipider, røde blodlegemer
2879 ΝsCH3 fra lipider, røde blodlegemer
2861 ΝsCH2 fra lipider, parasit
1707 B-DNA/A-DNA basepar vibrationer νC = O & νC = N, parasit
1652 AMID jeg fra α-helix proteiner, parasit
1631 AMID jeg fra β-plisseret ark proteiner, røde blodlegemer
1584 ΝC = N fra af imidazoler i nukleinsyrer, parasit
1555 AMID II fra proteiner, røde blodlegemer
1530 AMID II, parasit
1423 B-DNA Deoxyribose, parasit
1397 Ν(COO-) fra lipider, røde blodlegemer
1226 ΝaPO4-fra B-DNA, parasit
1184 B-DNA Deoxyribose, parasit
1083 ΝaPO4-fra DNA, parasit
1042 ΝC = O fra RNA ribose, parasit

Tabel 1: tildelinger af regression koefficient bands af PLS-R på spektre af malaria spiked RBC. I PLSR, er den parasitemia værdi tilknyttet et spektrum beregnet ved at multiplicere den forhåndsbehandlede spektrum af regression vektor. Derfor, regression vektor skildrer den betydning og ledelse af IR bands i regressionen. Fordi spectra var preprocessed ved hjælp af den anden afledede, er negative bands forbundet med en højere parasitemia, mens positive bands er forbundet med en lav parasitemia. Gengivet og modificeret fra Martin, M. et al. 10 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PLS-R-model er en overvåget multivariat metode, der finder en lineær sammenhæng, Y = bX + E, mellem de prædiktive variabler X (her, absorbans ved hver wavenumber) og en kontinuerlig variabel Y (her, parasitemia niveauet). Kort sagt, modellen kombinerer variabler i X til at oprette et nyt sæt af latent variabler (LVs) at fange afvigelse på X korreleret med Y, og beregner en regression vektor (b) der ganges med en ny spektrum resultater i forbindelse med vurdering af y-værdi. Styrken af modellen kan tages fra to værdier: den R2 og kvadratiske fejl af Cross validering (RMSECV) værdi. Tidligere beskriver lineariteten af modellen og dermed robustheden (jo tættere det er at 1 jo bedre) og data for modeller med en R2 værdi mindre end 0,8 skal gennemgås omhyggeligt for outliers og støjende data. Værdien RMSECV beskriver den fejl hvor forudsigelsen kan laves. Det er altid bedst at forsøge at minimere dette nummer så meget som muligt ved at sikre, at udelukke outliers, omhyggeligt behandle data og at sikre, at der er så mange biologiske replikater som muligt.

Det er således bydende nødvendigt, at god kvalitetsdata er erhvervet til at bygge modellen. Forberedelse af fortyndingsrække er kritisk. specifikt at sikre at hver RBC prøve er så homogene som muligt. Ved hjælp af en pipette til at udarbejde og udsende de røde blodlegemer et par gange mens hvirvlende eller forsigtigt svippede i slutningen af microcentrifuge rør 5 – 10 gange, vil uoverensstemmelser blive undgået. I samme ånd er det også afgørende for ren krystal mellem hver prøve at forhindre forurening. Ved hjælp af ultra rent vand og lint gratis klude til ren krystal og kontrollere, at grundlinjen er flad sikrer, at der er ingen rester, der vil forurene næste prøve måling.

Antallet af biologiske prøver, der kræves til en model, der er gældende på området er mindst 30 pr. betingelse, der er valideret med et datasæt af et lignende antal. Denne betydelige mængde ville tage en betydelig mængde til at generere og dermed det er begrænsningen i teknikken. Men efterhånden som flere prøver analyseres korrekt de kan føjes til den prognosemodel og styrke den. Således, når etableret, modellen kan blive mere præcis og kan retfærdiggøre den indsats, der kræves til at sætte det op.

Afhængigt af miljøet og instrumentering som målinger, kan der opstå flere yderligere spørgsmål. Hvis beamline ikke fuldt ud er lukket i instrumentet, kan betyder enten leddene ikke er lufttæt, eller vinduet ATR er udskiftelige med andre prøve rum, ethanol og vanddamp forurene spektre. Ethanol vises som en stærk skarp bånd omkring 1,070/cm 14. Dette kan undgås ved at måle i et rum fri for ethanol og desinfektion instrumentet, kun når alle målinger. Vanddamp er forårsaget af ændringer i atmosfæren og vises som små skarpe positive og negative toppe omkring 1400 – 1.800 /cm og 3.200-3.600/cm. Dette kan løses ved at øge hyppigheden af baggrundsmålinger og udrensning instrument med kvælstof. I tilfælde hvor udrensning ikke er tilgængelig og vanddamp er stadig ganske stærk, kan gulvafslibning algoritmer og vanddamp kompensation tilføjes data forbehandling til at fjerne dem.

Denne teknik holder en masse løfte for fremtidige diagnostik og patient resultater. For det første er metoden generelt meget enkle at gennemføre prøven må kun være pipetted på ATR krystal og derefter det kan måles direkte og være inddata i den model at reducere potentialet for brugerfejl. Dette ville fjerne behovet for højt uddannede lette microscopist, som i øjeblikket i nogle regioner i Afrika mangler2. På grund af enkelhed, behovet for dyre reagenser og udstyr er også elimineret og dermed diagnostiske ville være næsten gratis for patienter, som er den største begrænsning for PCR. Denne kombination vil føre til højere antal patienter kommer for diagnose meget hurtigere og dermed forbedre patienternes resultater. Teknikken har potentiale til meget høje følsomheder, der ville overvinde RDTs lav følsomhed og ville være i stand til at påvise asymptomatiske bærere hurtigere og dermed kan bruges som en screening teknik. Teknikken har desuden kan bruges til andre sygdomme, blod båret eller på anden måde, hvor et par microliters eller mikrogram kan anvendes til krystal.

Men i eksempel modellen der er mange ting, der skal løses, før det kan anvendes i feltet. Cross validering er en grund til det lave antal biologiske replikater og det er ikke ideelt; hellere have en separat efterprøvelse sat til at teste modellen i stedet er meget bedre. Desuden, RMSECV er ganske høj her gør de lavere niveauer af kvantificering upålidelige. Øge antallet af gentagelser vil forbedre denne værdi og skal gøres før du anvender denne metode i feltet. Dette bekræftes i laboratoriet forsøg9, hvor RMSECV var meget lavere på grund af den større stikprøvestørrelse. Ud over dette, vil øge intervallet rækkevidde og point også forbedre denne værdi. Yderligere forbedre den diagnostiske evne, vilde stammer af P. falciparum bør anvendes, som 3D 7 P. falciparum er et laboratorium stamme og kan præsentere en anden kemisk sammensætning på grund af variationer i fænotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Finansiering af forfatterne blev leveret af det australske Forskningsråd (fremtid Fellowship FT120100926 til BRW), National sundhed og medicinsk forskning Rådet for Australien (Program grant og Senior Research Fellowship at BENTS; Tidlig karriere stipendier JSR; Infrastruktur for forskning institutter støtte ordningen tilskud til Burnet Institute), og den victorianske stats regering operationelle infrastruktur støtte Grant Burnet Institute. Vi anerkender Mr. Finlay Shanks for instrumental støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Arnold. Great Britain. 361 (1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11, (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18, (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13, (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142, (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39, (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48, (4), (1952).
Påvisningen og kvantificeringen af <em>Plasmodium falciparum</em> i vandig røde blodlegemer af svækket samlede refleksion infrarødspektroskopi og multivariat dataanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter