Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum מימית אדום דם תאים נגועים באמצעות ספקטרומטר אינפרא-אדום השתקפות הכולל הקלוש של ניתוח נתונים רב משתנית.
Abstract
נדגים שיטה של כימות וזיהוי של טפילים של כדוריות דם אדומות מימית (RBCs) באמצעות benchtop פשוטה של ספקטרומטר הקלוש הכולל השתקפות פורייה להפוך אינפרא-אדום (ATR-FTIR) בשילוב עם ניתוח נתונים Multivariate ( MVDA). 3D 7 falciparum פ היו בתרבית כדי 10% parasitemia הטבעת הבמה טפילים, נהגה ספייק RBCs התורם טריים מבודד כדי ליצור לדילול סדרת בין 0-1%. 10 µL של כל מדגם הוצבו במרכז החלון יהלום ATR לרכוש את הספקטרום. הנתונים לדוגמה התייחסו כדי לשפר את האות לרעש יחס, כדי להסיר את התרומה של מים, אז הנגזרת השנייה הוחל לפתרון תכונות ספקטרליות. הנתונים נותחו לאחר מכן באמצעות שני סוגים של MVDA: הראשון העיקרי רכיב ניתוח (PCA) כדי לקבוע כל ליניאריים ולאחר מכן הריבועים הפחותים חלקית רגרסיה (PLS-R) כדי לבנות את הדגם כמת.
Introduction
מלריה היא בין המחלות ההרסניות ביותר של זמננו; ממחצית האוכלוסייה בסיכון באזורים אנדמיים וחיים זה פרופורציה מוטלת המסכן1,2,3,4. חלק גדול של הנושא הוא נשאים ללא תסמינים בתחילת שלב חולים לשמש מאגרים עבור יתושים וקטורים5, גורם קוצים של זיהום בעונות רטובות ומאפשר שזה נמשכות בקהילות. מלריה נגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום חמש, הקטלני ביותר מהם הוא falciparum פ הגורמת הצורה החמורה ביותר של המחלה2.
נכון לעכשיו, טכניקות לאבחון של מלריה הם פחות ממושלם. מיקרוסקופ אופטי, תקן הזהב הנוכחי, יכול לזהות רק 62-88 טפילים/µL בהתאם שיטת6. יתר על כן, עקב intensiveness מיומנות גבוהה הנדרשים, המוצאות מיקרוסקופ אזורים רבים > 50% מהמקרים, במיוחד אלה עם parasitaemia נמוך רמות2, אשר ניתן ישירות לייחס חוסר משאבים באזור ותוצאות ניצול לרעה של תרופות נגד מלריה. 2 ראשי אבחון לשיטות אחרות הן בדיקות אבחון מהיר (RDTs), אשר מנצלים נוגדנים עבור זיהוי וכן מבחני פולימראז תגובת שרשרת (PCR), אשר מפלים ולכמת טפילים מ- DNA. כיום, RDTs הם רק מסוגלים לזהות falciparum פ ו פ vivax לפחות 100 טפילים µL הדם וכתוצאה מכך צורות נדירות יותר של המחלה להיות מטופל. 7 , 8 לעומת זאת, מבחני ה-PCR להפלות ולכמת מינים שונים של הפלזמודיום -רגישות של 0.0004-5 טפילים/µL של דם. עם זאת, שזה דורש ריאגנטים יקר, ציוד, מיומנות טכנית, ולכן אינה מתאימה עבור היישום בשדה.
טכניקה מאוד רגיש, אמין ובמחיר חיוני כדי לשפר את האבחון פעמים, ובכך שיפור תוצאות המטופל ואני עושה מחלות חיסול אפשרי. הקלוש הכולל השתקפות (ATR-FTIR) ספקטרוסקופיית פורייה מציעה פתרון אפשרי לבעיה זו. עבודה קודמים הראו כי ניתן היה לזהות ולכמת falciparum פ ב מתנול קבוע סרטים דם בהשגת זיהוי גבולות < טפיל 1/µL של דם (< 0.0002% parasitemia)9, אשר דומה לדקל שיטות PCR. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שניתן לזהות, לכמת טפילים בדגימות מימית ולהסיר ובכך לשלב קיבוע. עם זאת, גורמים כמו אדי מים, רעש ספקטרלי וטיפול נתונים צריך להילקח בחשבון לקבלת תוצאות אופטימליות10.
פרוטוקול זה נועד להראות משתמשים חדשים כיצד לרכוש ATR-FTIR ספקטרה ולהכין מודל רגרסיה איתור falciparum פ מ דגימות מימית של תאי דם אדומים (RBC)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נא להתייעץ עם המתאים חומר בטיחות נתונים גיליונות (MSDS) ומחפשים הכשרה מתאימה אבטחה ברמה 2 (BSL-2). כל השלבים culturing חייב להיעשות בארון BSL-2 באמצעות הטכניקה aseptic, כלומר יש סיכון של חשיפה לקרינה UV המזיקות של שלבי טיהור, המחט מקל פציעות, וחשיפה ביולוגית אפשרית זיהום אם התרבות טפיל מזין פציעות. יתר על כן, דם מניות של בנק הדם הוא רק מוקרן מסוימים מחלות ואת הפוטנציאל להפצת דם מחלות שמקורן הוא סיכון פוטנציאלי. מבקשים לסיוע רפואי מיידי להתרחשות הפגיעה.
1. הכנה ומדידה של 3D 7 הפלזמודיום falciparum טפיל דילול סדרה
הערה: הפלזמודיום sp. התרבות היא רגישה מאוד. השתמש ריאגנטים טריים/נתמלאה ולהאכיל הטפילים באופן קבוע על-ידי שינוי בתקשורת. להאכיל תרבויות מתחת 5% parasitemia כל יום השני; להאכיל תרבויות בין 6-10% parasitemia פעם או פעמיים ביום; ולהאכיל תרבויות בין 11 – 20% עד 4 פעמים ביום. טפילים מתחילים לרעוב לאבד את צורתם, להתחיל חוזה. במקרה כזה, להאכיל, לדלל באופן מיידי על-ידי שינוי בתקשורת והוספת מניות RBCs. לאסוף הדם של התורם צינורות איסוף דם המכיל הפארין קרישה ו מידה בתוך ה 6 הראשון.
- תרבות סך של 30 מ של 3D 7 זן הפלזמודיום falciparum טפילים לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עד parasitemia מגיע טבעות 10%.
-
סינכרון של טפילים
- h 11 לאחר shizogeny לתוך מחזור החיים של הטפיל, resuspend את התרבות ואת העברת לתוך צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות פיפטה אוטומטיות.
- Centrifuge התרבות 300 – 400 x g ותנאי מעבדה סטנדרטיים (25° C ו- 100 kPa) במשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע ממלאים אותו עם פיפטה או באמצעות פיפטה של פסטר המצורפת ואקום מבלי להפריע בגדר. להשליך פסולת מדיה לתוך פתרון 10% מלבין.
- לאט להוסיף 12-15 מ של 4% בסורביטול פתרון בגדר באמצעות פיפטה אוטומטיות ומערבבים את התרבות על ידי מיצוי, היפוך הצינור עד התרבות היא הומוגנית.
- דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- Centrifuge התרבות 300 – 400 x g ותנאי מעבדה סטנדרטיים עבור 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
- להוסיף 10 – 15 מ ל תמיסת 0.9% בגדר ומערבבים את הפתרון על ידי מיצוי, היפוך הצינור עד התרבות היא הומוגנית.
- חזור על השלבים של 1.2.6–1.2.8 עוד פעמיים, כדי לשטוף את כל שרידי בסורביטול.
-
הכנה של הסדרה דילול parasitemia
- רחץ מניות RBCs כמו צעדים 1.2.6–1.2.9.
- Centrifuge התרבות-תנאי מעבדה סטנדרטיים, מניות RBCs ב 300-400 g x עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע כמו שלב 1.2.3.
- תווית צינורות microcentrifuge 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% ו- 1.000%, וכן להוסיף 0 µL, 1 µL, 2.5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL, 100 µL של תרבות בהתאמה באמצעות פיפטה µL של 0.2-20.
- להוסיף 100 µL, 99 µL, 97.5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 ו- 0 µL של מניות RBCs צינורות שכותרתה 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% של 1.000%, בהתאמה.
- צנטריפוגה הדם של התורם טריים אסף צינורות קרישה-1,200 x g ותנאי מעבדה סטנדרטיים עבור 10 דקות.
- הסר את הפלזמה על ידי ממלאים אותו עם פיפטה ומחיקת כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
- מוסיפים µL 900 של RBCs מבודד לתוך כל שפופרת microcentrifuge ומערבבים היטב על-ידי היפוך 10 x.
-
רכישת ספקטרלי
- באמצעות תוכנית רכישת ספקטרלי הנלווה, לחץ על "כלי הגדרת", קבע את הפרמטרים אוסף הנתונים הבאים: 128 סריקות של רקע; סריקות 32 עבור מדגם; והרזולוציה 8/ס מ על פני הטווח המרבי מדגם של המכשיר.
- הגדר את הטמפרטורה של ספקטרומטר ATR-FTIR לפי המלצות של יצרן או למשך הלילה.
- לנקות את הקריסטל על ידי בעדינות לניתוח תנועה מעגלית באמצעות מוך מגבונים חינם ולחה הנדסה גנטית. ואז ביסודיות יבש באמצעות אחר מוך חינם לנגב.
- לקחת מידה רקע באוויר על ידי לחיצה על "רקע מדידות". כל 20 דקות, לנקות את הקריסטל כמו שלב 1.4.3 וחזור על המדידה הזו.
- פתח את התצוגה בשידור חי על ידי לחיצה על "תצוגה מקדימה". התבונן תוכנית בסיסית, אופקי שטוח המציין הקריסטל הוא נקי.
- פיפטה 10 µL יונים המים ישירות באמצע של הקריסטל על ולחץ על "מדד Sample". חזור על המדידה הזו מים אחרי כל הדוגמה החמישי.
- יבש את הקריסטל באמצעות מחיקה ללא מוך ותנועה מעגלית עדינה.
- פיפטה µL 10 מדגם ולחץ על "מדד Sample".
- לנקות את הקריסטל בין דוגמאות כמו שלב 1.4.3.
- חזור על עד 3 משכפל נרכשים, מקפיד אקראי סדר הדגימות והן את משכפל.
2. ניתוח נתונים רב משתנית (MVDA)
הערה: הנתונים הטיפול חייב להתבצע מעל את כל ערכת הנתונים כדי למנוע רעש ותוספת של פסגות ממוצא הלא-ביולוגיים. לעומת זאת, לנתח מעל האזורים הרלוונטיים ביולוגית: 2980-2800/ס"מ ו- 1750-850/ס"מ.
-
טיפול נתונים
הערה: שתי תוכנות, למשל, Matlab (המכונה מעתה ואילך תוכנה 1) ו- X Unscrambler (המכונה מעתה ואילך התוכנה 2) משמשים כדוגמאות עבור MVDA. תוכנה 1 יש את היכולת של ביצוע MVDA בלי התוספת של ממשק משתמש גרפי (GUI). עם זאת, מומלץ לרכוש GUI (טבלה של חומרים). ההוראות הבאות כאשר בהתייחס לתוכנה 1 יניחו את זה בשיתוף עם הכלים GUI זמינים מסחרית, חובר התסריט טיפול נתונים לדוגמה.- פתח את תוכנת ניתוח נתונים רב משתנית מתאים, לחץ על "ייבוא נתונים" ובחר את סוג הקובץ לניתוח.
- תוכנה 1, קלט "ניתוח" לתוך חלון הפקודה לפתיחת GUI. הימני, לחץ בתיבה X כדי לאתר "ייבוא נתונים".
- תוכנה 2, לחץ על הכרטיסיה 'קובץ' כדי למצוא "ייבוא".
- לייבא ספקטרה לדוגמה, מים, בסיסית כמו ערכות נתונים לתוך סביבת העבודה על-ידי בחירת הספקטרום של כל קבוצה בנפרד ולחיצה על 'פתח' ולתת כל קבוצה שם קצר, למשל, "וואט" עבור ערכת נתונים של מים ספקטרה.
- בחר טבלה חדשה/מטריצה על ידי לחיצה על "חדשות מטריקס וקטורי" וצור וקטור n × 1, כאשר n הוא מספר דוגמאות. קלט את parasitemia של כל מדגם ולתת המבוססת על השם 'Parasitemia'.
- תוכנה 1, לחץ על "משתנה חדש" בחלון הפקודה.
- תוכנה 2, לחץ על הסמל "מטריקס חדש".
- להתוות נתונים על-ידי לחיצה על "להתוות נתונים הסמל". לבחון את הספקטרום לאפקטים אדי מים על-ידי לחיצה על "זום", התקרבות 1800-1400/ס"מ; ובמופתים נצפתה כמו פסגות קצר, חד, צרה לאורך המדרונות של אמיד אמיד ואני להקות II.
- במקרים של אדי מים אקסטרים, לפתוח את הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process ובחר "Smoothing". להפחית את רעש ו/או תרומות אדי מים חזקה על-ידי החלקת ספקטרום מדגם ומים באמצעות עד 25 נקודות של החלקה או להשתמש בשיטה תיקון אדי מים.
- בסיסית שאינם אופקיים הנכון באמצעות אלגוריתם התיקון בסיסית ובמידת הצורך, תחת הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process באותו שלב 2.1.4.
- ממוצע ספקטרה מים ו להעתיק את השורות מטריצה m n × המקביל לערכת מדגם לצמצם את זה ל-70% בעוצמה על ידי הכפלת זה 0.7.
- תוכנה 1, לעשות זאת בחלון הפקודה על-ידי הזנת בתסריט הבא "AverageWater=mean(WaterDataset)". לאחר מכן העתק-הדבק השורות כדי להתאים את ערכת הנתונים לדוגמה. כדי להפחית את העוצמה, קלט "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
- להחסיר ספקטרה המים הממוצעת של כל ספקטרום מדגם.
- תוכנה 1, לעשות זאת בחלון הפקודה על-ידי הזנת ה-script הבא "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
- פתיחת הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process כדי להחיל פונקציה נגזרת שנייה, ו ואז לנרמל את הנתונים על-ידי בחירה בפונקציה מהמתכנתים נורמלי יחיד (SNV), כלומר מרכז הנתונים.
- תוכנה 1, לעשות זאת בבת אחת. תחילה בחר "נגזרת" קלט 25 נקודות החלקה, פולינומיאלי מסדר 3 והסדר נגזרות על הדגימה ערכת באמצעות 25 נקודות של החלקה, פונקציה Savitzky-Golay. לאחר מכן בחר "SNV" ו- "מרכז מתכוון". לחץ על "בסדר/החל".
- פתיחת הכרטיסיה נתונים עריכה/טרום-process, במשתני"טורים", בחר 2,980 – 2800/cm ו- 1,750 – 850/ס"מ על-ידי מוודא שרק תיבות שלהם הם תיקתק.
- פתח את תוכנת ניתוח נתונים רב משתנית מתאים, לחץ על "ייבוא נתונים" ובחר את סוג הקובץ לניתוח.
-
ניתוח נתונים
- ניתוח גורמים של המנהל (PCA)
- לחץ על "ניתוח | הפירוק", PCA בחר.
- תוכנה 1, לחץ על "לבנות מודל".
- תוכנה 2, קלט את השיטות PCA. קלט מספר אופטימלי של הרכיבים העיקריים (אישיים) - בעבודה זו, 7 - ועד למקסימום של 100 איטראציות, בחר קרוס-אימות עבור שיטת אימות. לחץ על "הפעל".
- שים לב למגבלת ביטחון 95%, הטבעת מקווקו, על העלילה ציונים בין PC1 PC2.
- סמן ספקטרום מדגם עם ציונים המתרחשות מחוץ למגבלת כמו ליניאריים פוטנציאליים באמצעות "ספקטרה הכלי בחירת".
- אם מסומן ספקטרום גבוה Hotellings T2 וערכים תמלוגים Q גבוה אל תכלול אותם ניתוח נוסף.
- לחץ על "ניתוח | הפירוק", PCA בחר.
- שיטת הריבועים הפחותים חלקית רגרסיה (PLS-R)
- לחץ על "ניתוח | רגרסיה", בחר"PLS-R".
- תוכנה 1, מיד לחץ על בלוק Y ובחר וקטור "Parasitemia | לבנות מודל".
- תוכנה 2, קלט את השיטות PLS-R. בחר את הווקטור "Parasitemia" ההפניה"Y", את ערכת הנתונים לדוגמה כמו "X ערכת נתונים" ובדיקת בחר קרוס-כשיטת אימות. לחץ על "הפעל".
- לנתח את מודל רגרסיה. R2 ערכים מעל 0.80 ושגיאה שורש ממוצע הריבועים של צלב-אימות ערכי (RMSECV) נמצאים במרחק של פחות מ- 0.1% parasitemia הם מודלים מקובלים.
- לנתח את הווקטור רגרסיה ולזהות הלהקות ביולוגי.
- לחץ על "ניתוח | רגרסיה", בחר"PLS-R".
- ניתוח גורמים של המנהל (PCA)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הריבועים הפחותים חלקית (PLS-R) מגרש ולהראות שלה רגרסיה המשויך וקטור, איור 1a ו 1b בהתאמה, כי האות תוזנה נבדלים מספיק RBCs כי הם יכולים לשמש כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית לשמש חיזוי של טפילים בערכות נתונים בעתיד.
מודל PLS-R חזקים ליניארי נוצר עם ערך R בריבוע של 0.87, שורש ממוצע בריבוע שגיאת אימות צולב (RMSECV) של 0.13% parasitemia, איור 1a. רמות הולכות וגדלות parasitemia קשורים בעיקר עם להקות חומצת גרעין, במיוחד 1042, 1083 1226/cm, אשר מוקצים את ν(C=O) מן ריבוז RNA קבוצה, νs(PO4 -) וν(PO4 -) בהתאמה, ויוצרים החלק השלילי העיקרי של הווקטור רגרסיה. זה בגלל RBCs חסרי גרעין, ולכן חומצות גרעין הם אינדיקטורים חזקים עבור הטפילים. יתר על כן, הלהקה 1226/cm מציין כי יש המבנה טופס B-DNA, אשר מדגיש את חשיבות מדידת המדינה מימית12. לעומת זאת, טפילים צורכים RBC רכיבים, בעיקר המוגלובין, וצפויה ובכך חלבון גבוה יותר ליחס השומנים ב RBCs נגוע כמצוין על-ידי רצועות השומנים 2913, 2879 1397 ס מ-1 ו- 1631, 1555 ס מ-1 מ אמיד השנייה אמיד ואני מצבי12,13.
הלהקות ברורים מראים בבירור כי הסימנים להקות ביולוגי אמיתי ולא בידול בהתבסס על להקות כדין ממוצא הלא-ביולוגיים כגון אדי מים, מציג כרצועות צר ונמרץ. באופן ספציפי, הנוכחות של ה-DNA להקות, טבלה 1, נזקפים ישירות טפיל11,12,13. באופן כללי, אפשר לפרש את הווקטור רגרסיה באופן דומה כדי loadings ב PCA. להקות צריך לתאם עם להקות ו משמרות של ספקטרום המקורי.
איור 1: מגרש רגרסיה PLS-R, (א), של RBCs עלה בין 0-1% parasitemia ומקדם רגרסיה משויך, (b). העלילה רגרסיה מדגים את היכולת של המודל לחזות את parasitemia בכל מדגם, עם parasitemia ידוע בציר ה-x, את parasitemia החזוי בציר ה-y. מקדם רגרסיה מתאר את התרומה של כל הלהקה יכולת החיזוי של המודל, אינטנסיבי יותר הלהקה הוא יותר היא תורמת את המודל ובכך איך הטפיל משנה את ההרכב הכימי של הדם. מרטין לשכפל, ששונה מ, מ. ואח 10 , ברשות החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הלהקה מקדם רגרסיה (ס מ- 1) | Assignment25-27 |
| 2929 | ΝaCH2 של שומנים, טפיל |
| 2913 | ΝaCH2 של תאי הדם שומנים, אדום |
| 2879 | ΝsCH3 של תאי הדם שומנים, אדום |
| 2861 | ΝsCH2 של שומנים, טפיל |
| 1707 | זוג בסיסים ב- DNA/A-DNA רטט νC = O & νC = N, טפיל |
| 1652 | אמיד אני של סליל α חלבונים, טפיל |
| 1631 | אמיד אני מתא הדם של גיליון קפלים β חלבונים, אדום |
| 1584 | ΝC = N מ- imidazoles, חומצות גרעין, טפיל |
| 1555 | אמיד II מתא הדם חלבונים, אדום |
| 1530 | השנייה אמיד, טפיל |
| 1423 | B-DNA Deoxyribose, טפיל |
| 1397 | Ν(COO-) של תאי הדם שומנים, אדום |
| 1226 | ΝaPO4-מ B-DNA, טפיל |
| 1184 | B-DNA Deoxyribose, טפיל |
| 1083 | ΝaPO4-מה-DNA, טפיל |
| 1042 | ΝC = O מ- RNA ריבוז, טפיל |
טבלה 1: הקצאות של להקות מקדם רגרסיה של PLS-R על ספקטרום של מלריה עלה RBCs. ב- PLSR, ערך parasitemia המשויך קשת מחושב על-ידי הכפלת את קשת עיבוד מקדים הווקטור רגרסיה. לפיכך, הווקטור רגרסיה מתארת את החשיבות ואת הכיוון של הלהקות IR ברגרסיה. בגלל ספקטרום היו בקובייה באמצעות הנגזרת השנייה, להקות שליליים הם קשורים parasitemia גבוהה יותר בעוד להקות חיובי משויכים parasitemia נמוך. מרטין לשכפל, ששונה מ, מ. ואח 10 , ברשות החברה המלכותית לכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל PLS-R היא שיטה רב משתנית תחת פיקוח המוצאת הקשר הליניארי, Y = bX + E, בין המשתנים חזוי X (כאן, את ספיגת-כל מספר גל) ו- Y משתנה רציף (כאן, רמת parasitemia). בקיצור, המודל משלב את המשתנים ב- X כדי ליצור קבוצה חדשה של המשתנים החבויים (אותו) כי ללכוד את השונות ב- X בקורלציה עם Y, ולאחר מחשבת את וקטור רגרסיה (b) זה מוכפל תוצאות ספקטרום חדש ההערכה של ערך y. כוחו של המודל ניתן לקחת מלוגנו שני ערכים: הערך2 R ואת הערך שורש ממוצע הריבועים שגיאה של לעבור אימות (RMSECV). לשעבר מתאר על ליניאריות של המודל ובכך החוסן (קרוב יותר זה 1 יותר) ואני חייב לסקור נתונים עבור דגמים עם R2 ערך של פחות מ- 0.8 בקפידה עבור ליניאריים ונתונים רועש. הערך RMSECV מתאר את השגיאה שבו התחזית יכול להתבצע. תמיד עדיף לנסות ולצמצם ככל האפשר את מספר זה על-ידי בדיקה לא לכלול ליניאריים, להתייחס בזהירות את הנתונים והם שתוודא כי שם משכפל ביולוגיים רבים ככל האפשר.
ולכן הכרחי כי נתוני איכות טובה נרכש לצורך בניית המודל. הכנה של הסדרה דילול היא קריטית; במיוחד מוודאת כי כל מדגם RBC הוא הומוגני כמו ככל האפשר. באמצעות פיפטה כדי לצייר והוצא את RBCs כמה פעמים בזמן מתערבל או מצליף בעדינות את קצה הצינורית microcentrifuge 5 – 10 פעמים, להימנע חוסר עקביות. בנוסף, חשוב גם לנקות את הקריסטל בין כל מדגם למניעת זיהום. שימוש מים אולטרא טהורים ומגבונים ללא מוך לנקות את הקריסטל ובדיקת כי הבסיס הוא שטוח מבטיח כי ישנם ללא שאריות זה לזהם את המדידה הדגימה הבא.
המספר של דגימות ביולוגיות הדרושים עבור דגם זה ישים בשדה הוא לפחות 30 במצב שאומת עם ערכת נתונים של מספר דומה. נפח ניכר זה היה לוקח כמות משמעותית ליצירת וכך וכך זה המגבלה של הטכניקה. עם זאת, כפי יותר דוגמאות מנותחות כראוי הם ניתן להוסיף את מודל ניבוי, לחזק את זה. לכן, הוקמה לאחר, המודל יכול להיות מדויקת יותר, יכול להצדיק את המאמץ הדרוש כדי להגדיר אותו.
בהתאם לסביבה את המכשור בו המידות נלקחות, יכול להיווצר מספר בעיות נוספות. אם הפרעות לקרן החלקיקים אינה תחומה מלא בכלי, כלומר המפרקים אינם אטום או החלון ATR הוא להחלפה עם תאים אחרים לדוגמה, אתנול וביו -אדי מים יכול לזהם את הספקטרום. אתנול מופיע בתור להקה חדה חזק סביב מ-1070 ל/ס מ 14. זה יכול להימנע על ידי מדידת בחלל חופשי מאתנול וחיטוי המכשיר רק לאחר כל המדידות נלקחים. אדי מים נגרמת על ידי שינויים באווירה ומופיע פסגות חדות קטנים חיוביים ושליליים סביב 1400 – 1,800 /cm ו- 3,200 – 3,600/ס"מ. זה ניתן לפתור על ידי הגדלת התדירות של רקע מדידות והמחסור המכשיר עם חנקן. במקרים שבו מנקה אינו זמין ואין אדי המים הוא עדיין די חזק, החלקת אלגוריתמים ופיצויים אדי מים ניתן להוסיף עיבוד נתונים מראש כדי להסיר אותם.
טכניקה זו מחזיקה הרבה הבטחה לקבלת תוצאות המטופל ולכלי בעתיד. ראשית, השיטה היא בסך הכל מאוד פשוט ליישם כי המדגם צריך להיות רק pipetted על גבי הגביש ATR, ואז זה ניתן למדוד ישירות, ניתן להזין לתוך המודל להפחית את הפוטנציאל לטעויות משתמש. זה לסלק את הצורך microscopist אור מיומנים, אשר כיום באזורים מסוימים של אפריקה חסרים2. בגלל הפשטות, הצורך ריאגנטים יקר וציוד גם מסולקת, ובכך האבחון יהיה כמעט ללא עלות עבור חולים, וזו המגבלה העיקרית עבור ה-PCR. שילוב זה יוביל למספר גבוה יותר של המטופלים מגיעים לאבחון הרבה קודם ובכך שיפור תוצאות המטופל. הטכניקה יש הפוטנציאל של רגישויות גבוהות ביותר יהיה להתגבר על רגישויות נמוך של RDTs ולא יהיה מסוגל לזהות נשאים אסימפטומטיים מוקדם ובכך יכול לשמש טכניקה הקרנה. בנוסף, הטכניקה יש פוטנציאל לשמש עבור מחלות אחרות, דם הספיק או אחרת, איפה כמה microliters או מיקרוגרם ניתן ליישם את הקריסטל.
עם זאת, הדגם דוגמה יש דברים רבים שצריך להתייחס לפני זה יכול להיות מיושם בשטח. אימות צולב הוא אחד עקב מספר נמוך של משכפל ביולוגי, זה לא אידיאלי; אלא שיש אימות נפרד להגדיר כדי לבדוק את הדגם במקום הוא הרבה יותר טוב. יתר על כן, RMSECV הוא גבוה למדי, והנה עושה רמות נמוכות יותר של כימות לא אמין. הגדלת מספר משכפל ישתפרו ערך זה, צריך לעשות לפני העסקת בשיטה זו בשטח. זה הוא לאשר מעבדה בניסויים9, איפה RMSECV היה נמוך בהרבה בגלל גודל המדגם גדול יותר. בנוסף לכך, להגדיל את טווח מרווח ואת הנקודות גם תשפר גם בערך זה. בכדי לשפר את יכולת האבחון, זני בר של falciparum פ אמור לשמש, כמו 7 3D falciparum פ היא זן מעבדה ו עשוי להציג הרכב כימי שונה בשל הבדלים פנוטיפ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מימון ליוצרים סופק על ידי המועצה מחקר אוסטרלי (העתיד מלגת FT120100926 כדי BRW), הלאומי לבריאות, רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה (תוכנית גרנט, בכיר מחקר לאגודה כדי JGB; הקריירה המוקדמת מלגות JSR; תשתית למחקר מוסדות תמיכה גרנט ערכת למכון ברנט), התשתית המבצעית של הממשלה ויקטוריאני המדינה לתמוך גרנט למכון ברנט. אנו להכיר מר פינלי שאנקס לקבלת תמיכה אינסטרומנטלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor blood | - | - | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | - | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | - | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361 (1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
