Summary
여기, 선물이 탐지 및 정량화의 변형 체 falciparum 감염 수성 적혈구 감쇠 총 반사 적외선 분석기 및 다변량 데이터 분석을 사용 하는 프로토콜.
Abstract
복수 데이터 분석 (와 함께에서 간단한 벤치탑 감쇠 총 반사 푸리에 변환 적외선 (ATR FTIR) 분석기를 사용 하 여 정량화 하는 방법 및 수성 적혈구 (Rbc)에 기생충의 탐지 설명 MVDA)입니다. 3D 7 P. falciparum 10 %parasitemia 링 무대 기생충에 교양 있었다 및 시리즈를 만들 희석 0-1 사이의 절연 신선한 기증자 Rbc 스파이크 사용 %. 10 µ L 각 샘플의 스펙트럼을 얻으려고 ATR 다이아몬드 윈도우의 중앙에 배치 했다. 샘플 데이터 취급 신호 대 잡음 비를 개선 하 고 물의 기여를 제거 하 고 두 번째 파생 스펙트럼 기능 해결에 적용 했다. 데이터 다음 MVDA의 두 종류를 사용 하 여 분석 했다: 어떤 outliers 그리고 부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R) 정량화 모델 확인 첫 번째 주요 구성 요소 분석 (PCA).
Introduction
말라리아는 우리 시대의; 가장 치명적인 질병 중 하나입니다. 발병 지역에서 위험이 절반 이상의 인구가 살고 그리고 그것은 어울리지 않게 가난한1,2,,34짐. 문제의 큰 부분 무 증상 사업자 및 초기 단계 환자5모기 벡터 대 한 저수지 역할을 젖은 계절 중에 감염의 스파이크를 일으키는 원인이 되 고 지역 사회에서 계속 하 허용 이다. 말라리아는 가장 치명적인 질병2의 가장 심각한 형태를 일으키는 원인이 되는 P. falciparum 은 5 변형 체 기생충에 의해 발생 합니다.
현재, 말라리아의 진단 위한 기술을 완벽 미만입니다. 광학 현미경 검사 법, 현재 골드 표준만 사용 되는 방법6에 따라 62-88 기생충 / µ L를 검색할 수 있습니다. 많이 하 고 많은 지역 현미경 오진에서 요구 하는 높은 기술 때문에 또한, >의 경우 50%, 특히 그 낮은 parasitaemia 레벨2는 직접의 영역에 리소스 부족에 기 인할 수 있다 안티-말라리아 약의 오용입니다. 다른 2 주요 진단 메서드는 급속 한 진단 테스트 (RDTs), 검색 및 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험, 차별 하 고 계량 DNA에서 기생충에 대 한 항 체를 활용 하는. 현재, RDTs만 치료 되는 질병의 희귀 한 형태로 발생 하는 혈액의 적어도 100 기생충 / µ L의 P. vivax 그리고 P. falciparum 감지 수 있습니다. 7 , 8 반대로, PCR 분석 실험 차별 및 감도 0.0004-5의 변형 체 의 종 계량 기생충 / µ L의 혈액. 그러나, 그것은 비싼 시 약, 장비 및 기술, 필요 하 고 따라서 필드 응용 프로그램에 적합 하지 않습니다.
매우 민감한, 안정적이 고 저렴 한 기술 때 진단 시간을 따라서 환자 결과 개선 및 질병 제거를 가능 하 게 하 고 향상 시키기 위해 필수적 이다. 감쇠 총 반사 푸리에 변환 (ATR FTIR) 분광학이이 문제에 대 한 잠재적인 해결책을 제공합니다. 이전 작업으로 감지 하 고 고정 피 영화의 검출 한계를 달성 하는 메탄올에 P. falciparum 계량 가능 했다 나타났습니다 < 혈액의 1 기생 / µ L (< 0.0002 %parasitemia)9, PCR 방법에 비해. 최근 연구 결과 검출 및 계량 수성 샘플에서 기생충 따라서 정착 단계를 제거 하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 수증기, 스펙트럼 잡음 및 데이터 처리 같은 요인 최적의 결과10고려 될 필요가 있다.
이 프로토콜 ATR FTIR 스펙트럼을 취득 하 고 수성 적혈구 (RBC) 샘플10 P. falciparum 에의 검출에 대 한 회귀 모델을 준비 하는 방법 새 사용자를 표시 하는 것을 목표로.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
적절 한 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하 고 적절 한 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 훈련을 추구 하십시오. BSL-2 캐비닛 무 균 기술을 사용 하 여, 의미 오염 제거 단계, 바늘 지팡이 상해, 및 생물 학적 노출 및 감염에서 유해한 UV 방사선에 노출의 모험 경우에 모든 자란 단계를 완료 해야 합니다 기생충 문화 어떤 상해를 입력합니다. 또한, 혈액 은행에서 주식 혈액은 특정 질병 및 혈액 질병 부담을 확산에 대 한 잠재적인 상영만 잠재적인 위험. 상해의 발생에 즉각적인 의료 처치를 추구 합니다.
1. 준비 및 3D 7의 측정 변형 체 falciparum 기생충 희석 시리즈
참고: 변형 체 sp. 문화는 매우 중요 한. 신선한/만료 시 약을 사용 하 고 미디어를 변경 하 여 기생충을 정기적으로 피드. 5 %parasitemia; 두 번째 매일 아래 피드 문화 하루에 한 두 번; 6-10 %parasitemia 사이의 문화를 피드 그리고 하루에 4 회 11 ~ 20% 사이의 문화를 피드. 기생충을 굶 어 시작 하는 그들의 모양을 분실 하 고 계약을 시작 합니다. 이러한 경우, 피드 및 미디어 변경 하 고 추가 주식 Rbc. 수집 기증자 혈액 혈액 컬렉션 튜브 응고 제 및 첫 번째 6 h 내에서 측정값으로 헤 파 린을 포함 하 여 즉시 희석.
- 문화 3D 7의 30 mL의 총 변형 표준 프로토콜에 따라 변형 체 falciparum 기생충은 parasitemia 10% 반지에 도달할 때까지.
-
기생충의 동기화
- 기생충의 수명 주기에 shizogeny 후 11 h resuspend 문화 및 자동된 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브로 전송.
- 300-400 g x 5 분에 대 한 표준 실험실 조건 (25 ° C와 100 kPa)에 문화 원심
- 피 펫 그리기 또는 진공에는 펠 렛을 방해 하지 않고 연결 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다. 10% 표 백제 솔루션으로 폐기물 미디어를 삭제 합니다.
- 천천히 자동된 피 펫을 사용 하 여 펠 릿을 4 %sorbitol 솔루션의 12-15 mL을 추가 하 고 상한 및 문화는 균질 성 때까지 튜브를 거꾸로 하 여 문화를 혼합.
- 15 분 동안 37 ° C에서 문화를 품 어.
- 300-400 g x 5 분에 대 한 표준 실험실 조건에서 문화 원심
- 1.2.3 단계에서 설명한 대로 상쾌한을 제거 합니다.
- 펠 릿을 0.9% 염 분의 10-15 mL을 추가 하 고 상한 및 문화는 균질 성 때까지 튜브를 거꾸로 하 여 솔루션을 혼합.
- 단계 1.2.6–1.2.8 sorbitol의 모든 잔재를 씻어 두 번 더 반복 합니다.
-
Parasitemia 희석 시리즈의 준비
- 세척 단계 1.2.6–1.2.9에서 Rbc 증권.
- 표준 실험실 조건, 5 분 동안 300-400 x g에서 Rbc 증권에서 문화 원심 하 고 상쾌한 1.2.3 단계에서 삭제.
- 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% 및 1.000%, microcentrifuge 튜브 라벨 고 0 µ L, 1 µ L, 2.5 µ L, 7.5 µ L, 10 µ L, 25 µ L, 75 µ L 및 문화의 각각 0.2-20 µ L 피 펫을 사용 하 여 100 µ L를 추가 합니다.
- 추가 100 µ L, 99 µ L, 97.5 µ L, 92.5 µ L, 80 µ L, 75 µ L, 25, 0 µ L 재고 RBCs의 관 이라는 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750%, 및 1.000%, 각각.
- 분리기 신선한 기증자 혈액 항 응 혈 약 튜브 1200 x g 및 10 분에 대 한 표준 실험실 조건에서 수집.
- 플라즈마는 피 펫 드로잉 하 고 1.2.3 단계에서 설명한 대로 삭제 하 여 제거 합니다.
- 각 microcentrifuge 튜브로 격리 된 RBCs의 900 µ L을 추가 하 고 10 배를 반전 하 여 철저 하 게 혼합.
-
스펙트럼 획득
- 동반 스펙트럼 수집 프로그램을 사용 하 여, "악기 설정"을 클릭 하 고 다음에 데이터 컬렉션 매개 변수를 설정: 배경에; 128 검색 32 스캔 샘플; 그리고 8/cm 악기의 최대 샘플 범위를 해결.
- 하룻밤 또는 제조업체의 추천 당 ATR FTIR 계의 온도 설정 합니다.
- 크리스탈 원형 모션 린 트를 사용 하 여 무료 잎사귀 초순 물 적셔 부드럽게 닦 고 하 여 청소. 다음 다른 린 트 무료 지우기를 사용 하 여 완전히 건조 합니다.
- "배경 측정"를 클릭 하 여 공기의 배경 측정을 가져가 라. 모든 20 분 단계 1.4.3에서 크리스탈을 청소 하 고이 측정을 반복.
- "미리 보기"를 클릭 하 여 라이브 뷰를 엽니다. 크리스탈이 깨끗 한 나타내는 평면, 수평 기준선을 관찰 합니다.
- 10 µ L의 중간에 직접 이온된 수의 플라스틱을 "샘플 측정"을 클릭 합니다. 모든 5 샘플 후이 물 측정을 반복 합니다.
- 크리스탈 린 트 무료 지우기와 부드러운 원형 모션을 사용 하 여 건조.
- 플라스틱 샘플의 10 µ L을 "샘플 측정"을 클릭 합니다.
- 크리스탈 단계 1.4.3에서 샘플 사이 청소.
- 3 복제 인수, 샘플 및는 복제의 순서를 무작위로 확인 될 때까지 반복 합니다.
2. 다변량 데이터 분석 (MVDA)
참고: 데이터 처리 수행 되어야 합니다 전체 데이터 집합을 통해 소음과 비 생물학 근원의 봉우리의 추가 피하기 위하여. 반면, 생물학으로 관련 된 지구에 분석: 2980-2800/cm와 1750-850/cm.
-
데이터 처리
참고: 두 개의 소프트웨어, 예를 들면, Matlab (향후 소프트웨어 1 이라고 함)와 (이제 소프트웨어 2 라고도 함)는 Unscrambler X MVDA에 대 한 예제로 사용 됩니다. 소프트웨어 1은 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 추가 없이 MVDA 수행 수 있습니다. 그러나, GUI (테이블의 재료)를 구입 하는 것이 좋습니다. 가정 것 이다 소프트웨어 1 참조 하는 경우 다음 지침에 따라 상업적으로 사용할 수 있는 GUI 도구 상자와 함께에서 이며 예제 데이터 처리 스크립트 첨부 되었습니다.- 적절 한 다변량 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다, 그리고 "데이터 가져오기"를 클릭 하 고 분석을 위해 파일의 유형을 선택 합니다.
- 1 소프트웨어에서 GUI를 열려면 명령 창에 "분석"을 입력 합니다. 오른쪽 X 상자 찾을 "데이터 가져오기"를 클릭 합니다.
- 2 소프트웨어에서 "가져오기"를 찾으려고 "파일" 탭을 클릭 합니다.
- 별도로 각 집합에서 모든 스펙트럼을 선택 하 고 "열기"를 클릭 하 여 작업 영역에 데이터 집합으로 샘플, 물, 기준선 스펙트럼을 가져올 고 각 설정 예를 들어, '와트' 물 스펙트럼의 데이터 집합에 대 한 짧은 이름을 합니다.
- "새로운 행렬/벡터"를 클릭 하 여 새 테이블/행렬을 선택 하 고 n은 샘플의 수 n × 1 벡터를 생성. 각 샘플의 parasitemia를 입력 하 고 이름을 벡터는 'Parasitemia'.
- 1 소프트웨어에서 명령 창에 있는 "새 변수"을 클릭 합니다.
- 2 소프트웨어에서 "새로운 매트릭스" 아이콘을 클릭 합니다.
- "플롯 데이터 아이콘"을 클릭 하 여 데이터를 플롯 합니다. "확대"를 클릭 하 여 확대 1800-1400/cm; 수증기 효과 대 한 스펙트럼을 검사 가장 명확 하 게 관찰는 아 미드의 경사면을 따라 짧고, 날카로운, 좁은 봉우리로 나 아 미드 II 밴드.
- 극단적인 수증기의 경우, 편집/사전 과정 데이터 탭을 열고 "스무 딩"을 선택 합니다. 잡음 및 강한 수증기 기여 스무 딩의 최대 25 포인트를 사용 하 여 샘플 및 물 스펙트럼을 부드럽게 하 여 줄이거나 수증기 수정 방법을 사용 하 여.
- 2.1.4 단계에서 동일한 편집/사전 과정 데이터 탭에서 해당 되는 경우 기본 보정 알고리즘을 사용 하 여 올바른 비 수평 기준선.
- 물 스펙트럼 평균 샘플 데이터 집합에 해당 n × m 행렬에 행을 복사 하 고 0.7을 곱하여 70% 강도를 감소.
- 1 소프트웨어에서 그렇게 명령 창에서 다음 스크립트 "AverageWater=mean(WaterDataset)"를 입력 하 여. 그런 다음 복사-붙여넣기 행 일치 하는 샘플 데이터 집합을. 농도를, 입력 "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
- 각 샘플의 스펙트럼에서 평균 물 스펙트럼을 뺍니다.
- 1 소프트웨어에서 그렇게 명령 창에서 다음 스크립트를 입력 하 여 "WaterCorrectedData SampleDataset-AverageWater70 =".
- 두 번째 파생 기능을 적용 하 고 다음 단일 정상적인 변량 (SNV) 기능을 선택 하 여 데이터를 정규화 센터 데이터 의미 편집/사전 과정 데이터 탭을 엽니다.
- 1 소프트웨어에서 한 가지에 이렇게. 먼저 "" 및 스무 딩, 3의 다항식 순서 및 스무 딩의 25 점과 Savitzky Golay 함수를 사용 하 여 설정 하는 샘플에 파생 순서 입력된 25 포인트를 선택 합니다. 다음 선택 "SNV"와 "센터"를 의미 합니다. "좋아/적용"을 클릭 합니다.
- 편집/사전 과정 데이터 탭을 열고 선택한 변수에"열", 2980-2800/cm와 1, 750-850/cm 그들의 상자를만 났는 다는 것을 확인 합니다.
- 적절 한 다변량 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다, 그리고 "데이터 가져오기"를 클릭 하 고 분석을 위해 파일의 유형을 선택 합니다.
-
데이터 분석
- 주요 구성 요소 분석 (PCA)
- 클릭 "분석 | 분해"고 선택 PCA입니다.
- 1 소프트웨어에서 "빌드 모델"을 클릭 합니다.
- 2 소프트웨어에서 PCA 메서드를 입력 합니다. 이 작품에서-7-주 구성 요소 (PCs)의 최적의 수 입력 100 번 및 유효성 검사 방법에 대 한 선택 교차 유효성 검사의 최대. "실행"을 클릭 합니다.
- 95% 신뢰 한계, p c 1과 PC2 사이 점수 플롯에서 점선된 반지를 관찰 합니다.
- 샘플 스펙트럼으로 잠재적인 outliers "선택 스펙트럼 도구"를 사용 하 여도 밖에 서 발생 하는 점수를 표시 합니다.
- 만약 표시 된 스펙트럼 높은 Hotellings T2 값과 높은 Q 오차 제외 그들 추가 분석에서.
- 클릭 "분석 | 분해"고 선택 PCA입니다.
- 부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R)
- 클릭 "분석 | 회귀"그리고 선택" PLS-R ".
- 소프트웨어 1, 오른쪽 Y 블록을 클릭 하 고 선택 벡터 "Parasitemia | 모델 작성할 ".
- 2 소프트웨어, PLS-R 메서드를 입력 합니다. "Y" 및 샘플 데이터 집합으로 "X 데이터 집합" 및 유효성 검사 방법으로 선택 교차 유효성 검사로 벡터 "Parasitemia"를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다.
- 회귀 모델을 분석 합니다. 0.80 및 교차 유효성 검사 (RMSECV) 값을 0.1 %parasitemia 보다는 더 적은의 평균 제곱근 오차 R2 값은 수락 가능한 모델입니다.
- 회귀 벡터 분석 및 생물 학적 밴드를 식별 합니다.
- 클릭 "분석 | 회귀"그리고 선택" PLS-R ".
- 주요 구성 요소 분석 (PCA)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
부분 최소 제곱 (PLS-R) 플롯 및 그것의 관련 된 회귀 벡터, 그림 1a 및 1b 각각 기생충에서 신호는 충분히 Rbc 양식에 사용 되는 선형 회귀 모델에 사용할 수 있는 다른 표시는 미래의 데이터 세트에서 기생충 예측
강력 하 고, 선형 PLS-R 모델 0.87의 R-제곱 값이 생성 하 고 루트 평균 제곱 그림 1a0.13 %parasitemia 교차 유효성 검사 오류 (RMSECV). 증가 parasitemia 레벨은 주로 관련 된 핵 산 밴드, 특히 1042, 1083 1226/cm, RNA ribose에서는 ν(C=O)에 할당 되는 그룹, νs(포4-)와 ν는는(포4-) 각각, 및 형성 주요 부정적인 부분 회귀 벡터의. 이 때문에 Rbc 부족 핵 따라서 핵 산 기생충에 대 한 강력한 지표입니다. 또한, 1226/cm 밴드 구조 B DNA 형태, 수성 상태12에서 측정의 중요성을 강조 하는 것을 나타냅니다. 반면, 기생충 RBC 구성 요소, 주로 헤모글로빈, 소비 하 고 따라서 지질 비율이 더 높은 단백질 감염된 Rbc 예상 되 나 고 아 II 미드 지질 밴드 2879 2913, 1397 cm-1 에 아 미드에서 1631 및 1555 cm-1 에 표시 된 대로 모드12,13.
독특한 밴드는 명확 하 게 좁고 강렬한 밴드로 존재 하는 수증기, 등 비 생물학 근원의 스 퓨 리 어스 밴드를 기반으로 하는 차별화 보다는 신호는 사실 생물 밴드 보여줍니다. 특히, DNA 밴드, 테이블 1의 존재 기생충11,,1213에 직접 표시 될 수 있습니다. 일반적으로, 회귀 벡터는 PCA에서 선적을 비슷한 방식으로 해석할 수 있다. 밴드는 밴드와 원래 스펙트럼의 교대 잘 상관 한다.
그림 1: PLS-R 회귀 플롯, (a), 0-1 사이 아군 Rbc의 %parasitemia 및 관련된 회귀 계수, (b). 회귀 플롯에서는 x 축에 알려진된 parasitemia 및 y 축에 예측된 parasitemia 각 샘플에서 parasitemia를 예측 하는 모델의 기능을 보여 줍니다. 회귀 계수 모델 및 따라서 기생충 혈액의 화학 성분을 변경 하는 방법에 기여 하는 더 더 강렬한 밴드는 모델의 예측 기능에 각 밴드의 기여를 설명 합니다. 복제 및 수정에서 마틴, M. 그 외 여러분 화학의 왕 사회 허가 10 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 회귀 계수 밴드 (cm-1) | Assignment25-27 |
| 2929 | 지질에서 νaCH2 기생충 |
| 2913 | 지질, 붉은 혈액 세포에서 νaCH2 |
| 2879 | 지질, 붉은 혈액 세포에서 νsCH3 |
| 2861 | 지질에서 νsCH2 기생충 |
| 1707 | B-DNA/A-DNA 기본적인 쌍 진동 νC = O & νC = N, 기생충 |
| 1652 | 아 미드 나 α 나선 단백질에서 기생충 |
| 1631 | 아 미드 나 β 주름을 잡은 시트 단백질, 붉은 혈액 세포에서 |
| 1584 | ΝC = 핵 산에 imidazoles에서 N 기생충 |
| 1555 | 단백질, 붉은 혈액 세포에서 아 미드 II |
| 1530 | 아 미드 II, 기생충 |
| 1423 | B-DNA Deoxyribose, 기생충 |
| 1397 | 지질, 붉은 혈액 세포에서 ν(COO-) |
| 1226 | ΝaPO4-B-DNA에서 기생충 |
| 1184 | B-DNA Deoxyribose, 기생충 |
| 1083 | ΝaPO4-DNA에서 기생충 |
| 1042 | ΝC = O RNA ribose에서 기생충 |
표 1: 말라리아의 스펙트럼에 PLS-R의 회귀 계수 밴드의 할당 아군 Rbc. PLSR, 스펙트럼과 관련 된 parasitemia 값은 전처리 스펙트럼 회귀 벡터를 곱하여 계산 됩니다. 따라서, 회귀 벡터 중요성 및 회귀에 IR 밴드의 방향을 보여 주며. 스펙트럼은 두 번째 파생을 사용 하 여 전처리 했다, 때문에 부정적인 밴드 긍정적인 밴드는 낮은 parasitemia와 연결 하는 동안 더 높은 parasitemia 연결 되어 있습니다. 복제 및 수정에서 마틴, M. 그 외 여러분 화학의 왕 사회 허가 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PLS-R 모델은 Y 선형 관계를 찾는 감독된 복수 방법 = bX + E, 예측 변수 X 사이 (여기에서, 각 wavenumber에 흡 광도)와 연속 변수 Y (여기, parasitemia 수준). 모델 변수 x Y, X 상관에 차이 캡처 잠재 변수 (LVs)의 새로운 집합을 만들 결합 하 고 회귀 벡터 (b)를 계산 하는 즉, 새로운 스펙트럼 결과 y 값의 추정에 의해 하는. 모델의 강도 두 값에서 반입할 수 있습니다: R2 값과 평균 제곱근 오차의 교차 유효성 검사 (RMSECV). 전 설명 모델과 따라서 견고성의 선형성 (가까이 그것은 1로 더 나은) outliers 및 시끄러운 데이터에 대 한 R2 값이 0.8 보다 작은 모델에 대 한 데이터를 신중 하 게 검토 되어야 합니다. RMSECV 값 예측을 만들 수 있는 오류를 설명 합니다. 그것은 항상 최선을 시도 하 고 신중 하 게 데이터를 처리 하는 이상 값을 제외 하 여이 수 가능한 최소화 하 고 가능한 많은 생물 복제는 확인 하는 있다.
따라서 좋은 품질의 데이터 모델 작성에 대 한 인수는 필수적입니다. 희석 시리즈의 준비는 중요 합니다. 특히 각 RBC 샘플은 가능한 균질 성 확인 하는. 세우는 Rbc 소용돌이 또는 부드럽게 터치 microcentrifuge 튜브의 끝 5-10 시간 동안 몇 번을 추출 하는 피 펫을 사용 하 여 불일치를 피할 것입니다. 비슷한 맥락에서 그것은 또한 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 크리스탈 청소에 중요 한입니다. 크리스탈과 기준선은 플랫 확인 청소 울트라 순수 물과 린 트 무료 물티슈를 사용 하 여 다음 샘플 측정을 오염 시킬 것 이다 아무 잔류물은 보장 합니다.
필드에 적용 되는 모델에 필요한 생물 학적 샘플의 수는 적어도 30 비슷한 숫자의 데이터 세트와 함께 유효성을 검사 하는 조건. 이 상당한 볼륨을 생성 하는 상당한 금액을 걸릴 것 이라고 하 고 따라서 이것은 기술의 한계입니다. 그러나, 더 많은 샘플 분석 제대로 그들은 예측 모델에 추가 될 수 있다 고 그것을 강화. 따라서, 모델 보다 정확 하 게 될 수 있고 그것을 설정 하는 데 필요한 노력을 정당화 할 수 있다.
환경에는 측정을 수행한 계측에 따라 몇 가지 추가 문제가 발생할 수 있습니다. 경우는 beamline 악기에 완전히 포함 되지, 합동은 밀폐 또는 ATR 창입니다 다른 샘플 구획 상호 의미 에탄올과 수증기 수 오염 스펙트럼. 에탄올은 1,070/cm 14주위에 강한 날카로운 밴드도 나타납니다. 이 에탄올에서 자유 공간에서 측정 하 고는 모든 측정을 수행한 후에 장비를 소독 하 여 피할 수 있습니다. 수증기는 대기권에 있는 변화에 의해 발생 및 주위 작은 날카로운 긍정 및 부정적인 첨단으로 나타납니다 1400-1800 /cm와 3200-3600/cm. 이 배경 측정의 및 질소로 악기를 제거 하 여 해결할 수 있습니다. 경우에 정화는 사용할 수 없습니다 수증기는 여전히 매우 강한, 스무 딩 알고리즘 및 수증기 보상은 그들을 제거 하려면 데이터 사전 처리를 추가할 수 있습니다.
이 기술은 미래 진단 및 환자 결과 대 한 약속을 많이 보유 하고있다. 첫째, 방법은 전반적으로 매우 간단 그 샘플 ATR 크리스탈에 pipetted만 필요 하 고 직접 측정 될 수 있다 하 고 사용자 오류에 대 한 가능성을 줄이는 모델에 입력 하는 다음 구현 하. 이 제거 고도로 숙련 된 가벼운 현미경에 대 한 필요는 현재 아프리카의 일부 지역에서에서 부족2. 단순, 비싼 시 약 및 장비에 대 한 필요성은 또한 제거 하 고 따라서 진단 것 거의 비용 무료 환자에 대 한, 즉 PCR에 대 한 주요 제한. 이 조합은 훨씬 더 빨리 그리고 따라서 개선 환자 결과 진단을 위해 오는 환자 수가 이어질 것 이다. 기술은은 RDTs의 낮은 감도 극복할 것 이다 징후가 없는 운반대 빨리 하 고 따라서 사용할 수 있습니다 심사 기법으로 감지할 수 있을 것 이라고 하는 매우 높은 감도 대 한 잠재력이 있다. 또한, 기술은 다른 질병에 대 한 사용, 혈액 부담 하거나, 어디 몇 microliters 또는 마이크로 그램에 적용할 수 있는 크리스탈을 가능성이 있다.
그러나, 예를 들어 모델에서 필드에 적용할 수 있습니다 전에 해결 될 필요가 있는 많은 것 들이 있다. 교차 유효성 검사 생물 복제의 낮은 수의 하나 이며 그것은 이상적인; 오히려 별도 유효성 검사 설정 모델을 테스트 하는 데 대신 훨씬 낫다. 또한,는 RMSECV은 꽤 높은 여기 정량화의 저수준을 신뢰할 수 없는 만드는. 이 값을 향상 됩니다 복제의 수를 증가 하 고 필드에서이 메서드를 사용 하기 전에 수행 되어야 합니다. 이 실험실 실험9, RMSECV는 더 큰 샘플 크기 때문에 훨씬 낮은 뒷받침 이다. 이, 간격 범위와 포인트를 증가 뿐만 아니라이 값도 향상 됩니다. 추가 진단 기능을 향상, P. falciparum 의 야생 종자를 사용 해야 합니다, 그리고 3D 7 P. falciparum 은 실험실 긴장 이다 표현 형에 있는 변이 때문에 다른 화학 성분을 제공할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
호주 연구 협의회에 의해 제공 된 저자에 게 자금 (BRW 미래 친목 FT120100926), 국가 건강 및 의료 연구 위원회의 호주 (프로그램 그랜트와 수석 연구 친목 JGB; 초기 경력 동호회 JSR; 연구 인프라 지원 체계 부여 버넷 연구소 연구소), 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 버넷 연구소를 부여. 우리 경 음악 지원 씨 Finlay 정강이 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor blood | - | - | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | - | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | - | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361 (1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
