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Chemistry

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

Abstract

Demostrar un método de cuantificación y detección de parásitos en acuoso de glóbulos rojos (gr) mediante un simple Banco atenuada Total reflexión Fourier transforman (ATR-FTIR) Espectrómetro de infrarrojos junto con análisis de datos multivariantes ( MVDA). 3 7 p. falciparum fueron cultivados a los parásitos de etapa 10% parasitemia anillo y utilizado para glóbulos rojos del donante fresco aislado para crear una dilución en serie entre 0 – 1%. 10 μl de cada muestra se colocaron en el centro de la ventana de diamante ATR para adquirir el espectro. Los datos de la muestra fue tratados para mejorar la relación señal a ruido y eliminar el aporte de agua, y luego se aplicó la segunda derivada para resolver características espectrales. Luego se analizaron los datos utilizando dos tipos de MVDA: Análisis de componentes principales el primer (ACP) para determinar cualquier afloramiento y entonces regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R) para construir el modelo de cuantificación.

Introduction

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La malaria está entre las enfermedades más devastadoras de nuestro tiempo; más de la mitad de la población vive en situación de riesgo en regiones endémicas y afecta desproporcionadamente los pobres1,2,3,4. Una gran parte del problema es la portadores asintomáticos y pacientes etapa temprana que actúan como reservorios de mosquitos vectores5, provocando picos de infección durante las temporadas húmedas y permitiendo que persisten en las comunidades. La malaria es causada por cinco parásitos Plasmodium , el más mortal de la que es p. falciparum , que causa la forma más severa de la enfermedad2.

Actualmente, las técnicas para el diagnóstico de la malaria son menos que perfecto. Microscopio óptico, el estándar de oro actual, sólo puede detectar 62-88 parásitos/μl dependiendo del método utilizado6. Además, debido a la intensidad y alta habilidad requerida, en muchas regiones la microscopia diagnostica > 50% de los casos, especialmente aquellos con baja parasitemia2, que puede ser directamente atribuido a la falta de recursos en el área y los resultados en los niveles el mal uso de medicamentos contra la malaria. Los 2 principales métodos de diagnóstico son pruebas de diagnóstico rápido (PDR), que utilizan anticuerpos para la detección y análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que discriminan y cuantificación de parásitos de ADN. En la actualidad, PDR sólo es capaces de detectar por p. falciparum y p. vivax de al menos 100 parásitos/μl de sangre dando como resultado formas más raras de la enfermedad que sin tratamiento. 7 , 8 por el contrario, ensayos PCR discriminan y cuantificar diferentes especies de Plasmodium en una sensibilidad de 5 0.0004 parásitos/μl de sangre. Sin embargo, se requiere de costosos reactivos, equipos y habilidad técnica y así no es conveniente para el uso del campo.

Una técnica altamente sensible, fiable y asequible es esencial para mejorar el diagnóstico y así mejorar los resultados del paciente y posibilitando la eliminación de la enfermedad. Espectroscopia de transformación (ATR-FTIR) de Fourier reflexión Total atenuada ofrece una posible solución a este problema. Trabajo previo ha demostrado que es posible detectar y cuantificar por p. falciparum en metanol fijada películas de sangre alcanzar los límites de detección de < 1 parásito/μl de sangre (< 0.0002% de parasitemia)9, que es comparable a los métodos de PCR. Estudios recientes han demostrado que es posible detectar y cuantificar parásitos en las muestras acuosas y así eliminar el paso de fijación. Sin embargo, factores tales como el vapor de agua, de ruido espectral y tratamiento de los datos deben tomarse en cuenta para un resultado óptimo10.

Este protocolo tiene como objetivo mostrar a los nuevos usuarios cómo adquirir espectros ATR-FTIR y preparar un modelo de regresión para la detección de p. falciparum de acuoso de las muestras de células de sangre rojas (RBC)10.

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Protocol

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Por favor consulte apropiado Material hojas de datos de seguridad (MSDS) y buscan una formación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los pasos de cultivo deben realizarse en un gabinete BSL-2 utilizando una técnica aséptica, es decir hay un riesgo de exposición a la radiación UV perjudicial de descontaminación, produzcan lesiones accidentales con agujas y posible exposición biológica y la infección si la cultura del parásito entra en cualquier lesión. Además, sangre stock de bancos de sangre sólo defendido por ciertas enfermedades y el potencial para la difusión de enfermedades transmitidas por sangre es un riesgo potencial. Buscar ayuda médica inmediata en la ocurrencia de lesiones.

1. preparación y medición de 3 7 serie de diluciones de parásito falciparum del Plasmodium

Nota: Plasmodium SP. cultura es altamente sensible. Utilizar reactivos frescos/no vencido y alimentar los parásitos regularmente cambiando los medios de comunicación. Alimentación cultivos por debajo de 5% de parasitemia cada dos días; alimentación de las culturas entre 6-10% parasitemia una o dos veces al día; y culturas entre 11-20% hasta 4 veces al día. Parásitos que están empezando a morir de hambre perderá su forma y comienzan a contraerse. En tal caso, la alimentación y diluir inmediatamente cambiando los medios de comunicación y agregando valores gr. recoger la sangre de donantes en tubos de sangre con heparina como anticoagulante y medida en las primeras 6 h.

  1. Cultura un total de 30 mL de 3 7 tensión parásitos Plasmodium falciparum según el protocolo estándar hasta que la parasitemia alcanza 10% anillos.
  2. Sincronización de parásitos
    1. 11 h después de shizogeny en el ciclo de vida del parásito, Resuspender el cultivo y la transferencia en un tubo cónico de 50 mL con una pipeta automática.
    2. Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones estándar de laboratorio (25° C y 100 kPa) durante 5 minutos.
    3. Eliminar el sobrenadante por elaborar con una pipeta o con una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora sin perturbar el pellet. Desechar el medio inútil en una solución de cloro 10%.
    4. Lentamente agregar 12 a 15 mL de solución del sorbitol el 4% en el sedimento con una pipeta automatizada y mezclar la cultura capsular y la inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.
    5. Incubar el cultivo a 37 ° C durante 15 minutos.
    6. Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones normales de laboratorio durante 5 minutos.
    7. Quite el sobrenadante como se describe en el paso 1.2.3.
    8. Añadir 10-15 mL de solución salina al 0.9% para el pellet y mezclar la solución de recubrimiento y inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.
    9. Repita el 1.2.6–1.2.8 pasos dos veces más para lavar todos los restos de sorbitol.
  3. Preparación de la serie de diluciones de parasitemia
    1. Lave el stock de glóbulos rojos como en pasos 1.2.6–1.2.9.
    2. Centrifugar el cultivo en condiciones estándar de laboratorio, stock gr a 300-400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante como en el paso 1.2.3.
    3. Calificar a tubos de microcentrífuga de 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, % 0.100, 0.250%, 0,750% y 1.000% y añadir 0 μL, 1 μl, 2.5 μl, 7.5 μl, 10 μl, 25 μl, 75 μl y 100 μl del cultivo respectivamente, usando una pipeta de 0,2-20 μl.
    4. Añadir 100 μl, 99 μl, 97,5 μl, μl 92.5, 80 μl, 75 μl, 0 y 25 μl de caldo glóbulos rojos tubos con 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0,250%, 0,750% y 1.000%, respectivamente.
    5. Centrifugar la sangre de donante fresco almacenada en tubos de anticoagulante en 1.200 x g y condiciones normales de laboratorio durante 10 minutos.
    6. Retire el plasma elaborar con una pipeta y desechando como se describe en el paso 1.2.3.
    7. Agregar 900 μl de glóbulos rojos aislados en cada tubo de microcentrífuga y homogeneizar por inversión del tubo 10 x.
  4. Adquisición espectral
    1. Utilizando el programa acompañamiento de adquisición espectral, haga clic en "Configuración del instrumento" y establecer los parámetros de colección de datos a la siguiente: 128 análisis de fondo; 32 análisis de la muestra; y la resolución 8/cm sobre la gama máxima de la muestra del instrumento.
    2. Ajuste la temperatura de la espectrómetro de ATR-FTIR por recomendación del fabricante o durante la noche.
    3. Limpie el cristal frotando suavemente en un movimiento circular usando pelusa gratis trapos humedecidos con agua ultrapura. Bien seque con otro paño libre de pelusa.
    4. Tomar una medida de fondo del aire haciendo clic en "Fondo de medición". Cada 20 minutos, limpie el cristal como en el paso 1.4.3 y repita esta medición.
    5. Abrir la vista en vivo haciendo clic en "Vista previa". Observar una línea de base plana, horizontal, que indica que el cristal esté limpio.
    6. Pipetear 10 μl de agua desionizada directamente en el centro del cristal y haz click en "Medida muestra". Repita esta medición de agua después de cada quinto muestra.
    7. Seque el cristal con un paño libre de pelusa y un movimiento circular suave.
    8. Pipetear 10 μl de muestra y haga clic en "Muestra de la medida".
    9. Limpie el cristal entre las muestras como en el paso 1.4.3.
    10. Repita hasta que se adquieren 3 repeticiones, para aleatorizar el orden de las muestras y las repeticiones.

2. multivariante análisis (MVDA)

Nota: Tratamiento de los datos debe hacerse sobre el conjunto de datos entero para evitar el ruido y la adición de picos de origen no biológico. En cambio, analizar sobre las regiones biológicamente relevantes: 2980-2800/cm y 1750/cm 850.

  1. Tratamiento de los datos
    Nota: Dos software, por ejemplo, Matlab (en adelante denominado software 1) y la X del posicionador (en adelante denominado "software 2") se utilizan como ejemplos para MVDA. 1 el software tiene la capacidad de realizar MVDA sin la adición de una interfaz gráfica de usuario (GUI). Sin embargo, se recomienda comprar una interfaz gráfica (Tabla de materiales). Las siguientes instrucciones cuando refiriéndose al software 1 asumirá que es junto con la caja de herramientas GUI disponible comercialmente, y se ha colocado el script de tratamiento de datos de ejemplo.
    1. Abra el software de análisis de datos multivariante apropiado, haga clic en "Importar datos" y seleccione el tipo de archivo para su análisis.
      1. Programa 1, la entrada "Análisis" en la ventana comando para abrir la GUI. Haga clic derecho el X box para encontrar "Importar datos".
      2. En software 2, haga clic en la ficha "Archivo" para encontrar "Importación".
    2. Importar espectros muestra, agua y línea de base como conjuntos de datos en el espacio de trabajo seleccionando todos los espectros en cada juego por separado y haciendo clic en "Abrir" y dar a cada grupo un nombre corto, por ejemplo, 'wat' conjunto de datos de espectros de agua.
    3. Seleccione nueva tabla/matriz haciendo clic en "nueva matriz, Vector" y generar un vector n × 1, donde n es el número de muestras. La parasitemia de cada muestra de entrada y el vector de nombre "Parasitemia".
      1. En 1 de software, haga clic en "Nueva Variable" en la ventana de comandos.
      2. En software 2, haga clic en el icono "Nueva matriz".
    4. Trama de datos haciendo clic en el icono"trazar datos". Inspeccione los espectros para los efectos del vapor de agua haciendo clic en "Zoom" y zoom 1800-1400/cm; más claramente observado como picos corto, agudos, estrechos a lo largo de las laderas de la amida y amida grupos II.
    5. En casos extremo de vapor de agua, abra la pestaña Editar/pre-procesos de datos y seleccione "Suavizado". Reducir el ruido o el vapor de agua fuertes contribuciones mediante el suavizado de los espectros de la muestra y agua hasta 25 puntos de suavizado o usar un método de corrección de vapor de agua.
    6. Correcta línea de base no horizontales mediante el algoritmo de corrección de línea base si es apropiado, en la misma pestaña datos editar/pre-procesos de paso 2.1.4.
    7. Promedio de agua espectros y copie las filas en una matriz de m × n equivalente al conjunto de datos muestra y reducir al 70% de intensidad multiplicándolo por 0.7.
      1. Software 1, hacerlo en la ventana de comandos, introducir la siguiente secuencia de comandos "AverageWater=mean(WaterDataset)". Luego copiar y pegar las filas para que coincida con el conjunto de datos de muestra. Para reducir la intensidad, la entrada "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
    8. Reste la media del agua en espectros de cada espectro de la muestra.
      1. Software 1, hacerlo en la ventana de comandos introduciendo la siguiente secuencia de comandos "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
    9. Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos para aplicar una segunda función derivada y luego normalizar los datos mediante la selección de función de una variable normal (SNV) y significa centro de datos.
      1. Software 1, hacerlo de una sola vez. En primer lugar seleccione "Derivada" y entrados 25 puntos de suavizado, orden Polinómico de 3 orden derivado de la muestra mediante una función de Savitzky-Golay y 25 puntos de suavizado. Continuación, seleccione "SNV" y "Media Center". Haga clic en "OK/Apply".
    10. Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos y en la columna "Variables", seleccione 2.980 – 2.800/cm y 1.750 – 850/cm asegurándose de que sólo sus cajas son marcadas.
  2. Análisis de datos
    1. Análisis de componentes principales (PCA)
      1. Haga clic en "Análisis | Descomposición"y seleccione de la PCA.
        1. En 1 de software, haga clic en "Modelo de construcción".
        2. Software 2, entrada de los métodos de la PCA. Entrada el número óptimo de componentes principales (PC) - en este trabajo, 7 - y un máximo de 100 iteraciones y seleccionar validación cruzada para el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".
      2. Respete el límite de confianza de 95%, el anillo de puntos, en una parcela de puntuaciones entre PC1 y PC2.
      3. Marque los espectros de la muestra con las puntuaciones que ocurren fuera del límite como potenciales valores extremos utilizando la herramienta"seleccionar espectros".
      4. Si los espectros marcados tienen alto Hotellings T2 valores y altos residuos Q excluyen de análisis posterior.
    2. Regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R)
      1. Haga clic en "Análisis | Regresión de"y seleccione"PLS-R".
        1. Software 1, derecha haga clic en bloquear Y y seleccione el vector "Parasitemia | Construcción de modelo".
        2. Software 2, entrada de los métodos de PLS. Seleccione el vector "Parasitemia" como "Y de referencia" y el conjunto de datos muestra como "conjunto de datos X" y seleccionar validación cruzada como el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".
      2. Analizar el modelo de regresión. Valores de R2 0,80 y raíz cuadrada media de error de validación cruzada (RMSECV) los valores menores que 0.1% parasitemia son modelos aceptables.
      3. Analizar el vector de regresión e identificar las bandas biológicas.

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Representative Results

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Trama de cuadrados mínimos parciales (PLS-R) y su vector de regresión asociado, Figura 1a y 1b respectivamente, muestran que la señal de los parásitos son bastante diferentes de los hematíes que pueden ser utilizados para formar una regresión lineal del modelo a utilizar para la predicción de parásitos en futuros conjuntos de datos.

Se generó un modelo de PLS-R robusto, lineal con un valor de R cuadrado de 0.87 y una media de raíz cuadrática del error de validación cruzada (RMSECV) de 0.13% parasitemia, Figura 1a. Incrementando los niveles de parasitemia se asocia sobre todo a bandas de ácidos nucleicos, especialmente 1042, 1083 y 1226/cm, que se asignan a la ν(C=O) de la ribosa del RNA del grupo, νs(PO4 -) y νun(PO4 -) respectivamente y forman la mayor parte negativa del vector de regresión. Esto es porque los glóbulos rojos carecen de núcleo y por lo tanto los ácidos nucleicos son fuertes indicadores para los parásitos. Además, la banda 1226/cm indica que la estructura tiene una forma de B-DNA, que pone de relieve la importancia de medir el estado acuoso12. En cambio, parásitos consuman componentes de RBC, hemoglobina principalmente, y así se espera una proteína más alta proporción de lípidos en los glóbulos rojos no infectados indicada por bandas de lípido en 2913, 2879 y 1397 cm-1 y 1631 y 1555 cm-1 de la amida y amida II modos de12,13.

Las distintas bandas muestran claramente que la señales son bandas biológicas verdadera en lugar de diferenciación basado en falsas bandas de origen no biológico como vapor de agua, que se presentan como bandas estrechas e intensas. Específicamente, la presencia de bandas de ADN, cuadro 1, se puede atribuir directamente al parásito11,12,13. En general, el vector de regresión puede interpretarse de una manera similar a las cargas de la PCA. Bandas deben correlacionar bien con bandas y a los cambios del espectro original de.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de regresión PLS-R, (a), de glóbulos rojos tacon entre 0 – 1% parasitemia y coeficiente de regresión asociado, (b). La trama de la regresión muestra la capacidad del modelo para predecir la parasitemia en cada muestra, con el conocido parasitemia en el eje x y la parasitemia predicho en el eje y. El coeficiente de regresión describe la contribución de cada banda a la capacidad predictiva del modelo, más intenso es la banda más contribuye al modelo y así cómo el parásito altera la composición química de la sangre. Reproducido y modificado de Martin, M. et al. 10 con el permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Banda de coeficiente de regresión (cm-1) Assignment25-27
2929 ΝaCH2 de lípidos, parásito
2913 ΝaCH2 de glóbulos de lípidos, rojo
2879 ΝsCH3 de glóbulos de lípidos, rojo
2861 ΝsCH2 de lípidos, parásito
1707 B ADN A ADN base par vibraciones νC = O & νC = N, parásito
1652 Amida I de las proteínas α-hélice, parásito
1631 Amida I de hoja plegada β proteínas, roja del glóbulo
1584 ΝC = N de imidazoles en los ácidos nucleicos, parásito
1555 Amida II de células de la sangre proteínas, rojo
1530 Amida II, parásito
1423 B-DNA desoxirribosa, parásito
1397 Ν(COO-) de glóbulos de lípidos, rojo
1226 ΝaPO4-B-ADN, parásito
1184 B-DNA desoxirribosa, parásito
1083 ΝaPO4-ADN, parásito
1042 ΝC = oh de la ribosa del RNA, parásito

Tabla 1: tacon de asignaciones de bandas de coeficiente de regresión de R PLS en espectros de la malaria los glóbulos rojos. En PLSR, el valor de parasitemia asociado a un espectro se calcula multiplicando el espectro preprocesado por el vector de regresión. Por lo tanto, el vector de regresión muestra la importancia y la dirección de las bandas de IR en la regresión. Porque los espectros eran preprocesados usando la segunda derivada, bandas negativas están asociadas con una parasitemia mayor mientras bandas positivas se asocian a una baja parasitemia. Reproducido y modificado de Martin, M. et al. 10 con el permiso de la Real Sociedad de química.

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Discussion

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Modelo PLS-R es un método multivariante supervisado que encuentra una relación lineal, Y = bX + E, entre las variables predictoras X (aquí, la absorbancia en cada número) y una variable continua Y (aquí, el nivel de parasitemia). En Resumen, el modelo combina las variables en X para crear un nuevo conjunto de variables latentes (LVs) que capturan la varianza en X correlacionada con Y y calcula un vector de regresión (b) que multiplicados por los resultados de un nuevo espectro en la estimación del valor y. La fuerza del modelo se puede tomar dos valores: el valor de R2 y la raíz cuadrada media Error de Cruz de validación (RMSECV). El primero describe la linealidad del modelo y así la robustez (el más cercano es a 1 mejor) y datos para los modelos con un valor de2 R menor que 0.8 se deben revisar cuidadosamente para valores atípicos y datos ruidosos. El valor RMSECV describe el error en el que se puede hacer la predicción. Siempre es mejor tratar de minimizar este número tanto como sea posible por asegurarse de excluir los valores atípicos, tratar con cuidado los datos y asegurarse de que hay es tantas repeticiones biológicas posible.

Por lo tanto es imperativo que se adquieren datos de buena calidad para la construcción del modelo. Preparación de la serie de la dilución es fundamental; específicamente asegurándose de que cada muestra de RBC es tan homogénea como sea posible. Mediante el uso de la pipeta para elaborar y expulsar a los hematíes un par de veces mientras girando o agitando suavemente el extremo del tubo de microcentrífuga de 5 a 10 veces, se evitarán las inconsistencias. En una vena similar, también es fundamental para limpiar el cristal entre cada muestra para evitar la contaminación. Con agua ultra puro y trapos libres de pelusa para limpiar el cristal y comprobar que la línea de base es plana asegura que no hay ningunos residuos que contaminarán la siguiente medición de la muestra.

El número de muestras biológicas necesarios para un modelo que es aplicable en el campo es por lo menos 30 por condición que se valida con un conjunto de datos de un número similar. Este considerable volumen sería tomar una cantidad significativa para generar y por lo tanto se trata de la limitación de la técnica. Sin embargo, como correctamente se analizan más muestras pueden agregarse al modelo predictivo y fortalecerlo. Así, una vez establecido, el modelo puede ser más preciso y puede justificar el esfuerzo necesario para configurarlo.

Dependiendo del medio ambiente y la instrumentación en el cual se toman medidas, pueden surgir varios problemas más. Si la línea no está completamente incluido en el instrumento, lo que significa las juntas no son herméticas o la ventana ATR es intercambiable con otros compartimientos de la muestra, etanol y vapor de agua pueden contaminar a los espectros. Etanol se presenta como una banda fuerte fuerte alrededor 1.070/cm 14. Esto puede evitarse midiendo en un espacio libre de etanol y desinfectar el instrumento una vez que se toman todas las medidas. Vapor de agua es causado por cambios en la atmósfera y aparece como pequeños picos positivos y negativos agudos alrededor/cm 1400 – 1.800 y 3.200 – 3.600/cm. Esto puede resolverse aumentando la frecuencia de las mediciones de fondo y purga el instrumento con nitrógeno. En casos donde purgar no está disponible y el vapor de agua es todavía bastante fuerte, suavizado de algoritmos y compensación de vapor de agua puede añadirse para preprocesamiento de datos para eliminarlos.

Esta técnica tiene una gran promesa para el futuro diagnóstico y los resultados del paciente. En primer lugar, el método en general es muy sencillo de implementar que la muestra sólo debe se pipetea en el cristal ATR y entonces se puede medir directamente y entrar en el modelo de reducción de las posibilidades de error de usuario. Esto eliminaría la necesidad de microscopista de luz altamente calificado, que actualmente en algunas regiones de África carecen de2. Debido a la sencillez, también se elimina la necesidad de costosos reactivos y equipos y por lo tanto el diagnóstico sería prácticamente gratuita para los pacientes, que es la principal limitación para PCR. Esta combinación daría lugar a un número mayor de pacientes diagnóstico mucho antes y así mejorar los resultados del paciente. La técnica tiene el potencial de sensibilidad extremadamente alta que superar la baja sensibilidad de PDR y sería capaz de detectar portadores asintomáticos antes y por lo tanto pueden ser utilizados como una técnica de proyección. Además, la técnica tiene el potencial de ser utilizado para otras enfermedades, la sangre borne o de otra manera, donde unos pocos microlitros o microgramos pueden aplicarse para el cristal.

Sin embargo, en el modelo de ejemplo hay muchas cosas que deben abordarse antes de que se puede aplicar en el campo. Validación cruzada es uno debido al bajo número de réplicas biológicas y que no es ideal; más bien tener una validación independiente para probar el modelo en su lugar es mucho mejor. Además, el RMSECV es bastante alto aquí que los niveles más bajos de cuantificación fiable. Aumentar el número de repeticiones mejorará este valor y se debe realizar antes de emplear este método en el campo. Esto se corrobora en el laboratorio ensayos9, donde RMSECV fue mucho menor debido al mayor tamaño de muestra. Además de esto, aumentando el rango de intervalo y los puntos también mejorará este valor. Para mejorar la capacidad diagnóstica, deben utilizarse cepas silvestres de p. falciparum , el 7 3 p. falciparum es una cepa de laboratorio y puede presentar una composición química diferente debido a las variaciones en el fenotipo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Financiación para los autores fue proporcionada por el Consejo de investigación australiano (futuro beca FT120100926 a BRW), nacional de salud y Consejo de investigación médica de Australia (programa beca y beca de investigación Senior a JGB; Temprana carrera becas JSR; Infraestructura para la investigación institutos de apoyo plan beca para el Instituto de Burnet), y la infraestructura operacional del gobierno victoriano estado beca para el Instituto de Burnet. Reconocemos el Sr. Finlay Shanks para apoyo instrumental.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Detección y cuantificación de <em>Plasmodium falciparum</em> en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes
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Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

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