Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

Burada, bir protokol için Plasmodium falciparum miktar virüslü sulu kırmızı kan hücrelerinde bir zayıflatılmış toplam yansıma kızılötesi Spektrometre ve çok değişkenli veri analizi kullanarak ve algılama mevcut.

Abstract

Biz miktar yöntemi ve parazitler ve sulu kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) algılama çok değişkenli veri analizi () ile birlikte basit benchtop zayıflatılmış toplam yansıma Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spektrometresi kullanılarak göstermek MVDA). 3D 7 P. falciparum % 10 parasitemia yüzük sahne parazitler için kültürlü ve seri 0-1 arasında bir seyreltme oluşturmak için taze donör izole RBCs spike için kullanılan %. Her örneğinin 10 µL spektrum elde etmek için ATR elmas pencerenin ortasına yerleştirildi. Örnek verileri sinyal gürültü oranı artırmak için ve su katkısını kaldırmak için tedavi edildi ve sonra ikinci türev spektral özellikleri gidermek için uygulandı. Verileri daha sonra MVDA iki tür kullanarak analiz edildi: ilk asıl bileşen analizi (herhangi bir aykırı ve sonra kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R) miktar model oluşturmak için belirlemek için PCA).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sıtma bizim zaman en yıkıcı hastalıklar arasında olduğunu; endemik bölgelerde risk yarım nüfus yaşıyor ve orantısız yoksul1,2,3,4durumu. Sorunun büyük bir parçası asemptomatik taşıyıcılar ve toplumlarda kalıcı olması izin ve sivri enfeksiyon sırasında ıslak mevsim neden rezervuarlar için sivrisinek vektörel çizimler5, aracı olarak erken sahne hastalar var. Sıtma en ölümcül hastalık2en ağır formu neden P. falciparum olduğunu beş Plasmodium parazitler tarafından nedeniyle oluşur.

Şu anda, sıtma tanısı için mükemmel daha az tekniklerdir. Optik mikroskobu, geçerli altın standart, sadece 62-88 parazitler/µL kullanılan yöntem6bağlı olarak algılayabilir. Ayrıca, intensiveness ve yüksek beceri gerekli, birçok bölgeler mikroskopi misdiagnoses nedeniyle > özellikle düşük parasitaemia sahip olanlar doğrudan kaynakları alanında ve sonuçlarında eksikliği bağlanabilir2, seviyesi %50 Olguların anti-sıtma ilaçları suistimal. Hızlı tanı antikorlar algılama ve ayırımcılık ve parazitlerin DNA'ölçmek polimeraz zincir tepkimesi (PCR) deneyleri için kullanan testleri (RDTs), diğer 2 ana tanı yöntemleri vardır. Şu anda, RDTs sadece P. falciparum ve P. bağlı en az 100 parazit/µL kan hastalığı tedavi edilmezse nadir formlarda kaynaklanan tespit edebiliyoruz. 7 , 8 buna ek olarak, PCR deneyleri ayırımcılık ve Plasmodium farklı tür bir duyarlılık 0.0004-5, ölçmek parazitler/µL kan. Ancak, bu pahalı reaktifler, ekipman ve teknik beceri gerektirir ve böylece alan uygulama için uygun değildir.

Son derece hassas, güvenilir ve uygun fiyatlı bir teknik tanı kez, böylece hasta sonuçları iyileştirilmesi ve hastalık ortadan kaldırılması mümkün hale geliştirmek için önemlidir. Zayıflatılmış toplam yansıma Fourier dönüşümü (ATR-FTIR) spektroskopisi bu sorun için olası bir çözüm sunar. Önceki çalışma algılamak ve P. falciparum kan filmler algılama sınırları elde sabit metanol ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir < 1 parazit/µL kan (< %0.0002 parasitemia) PCR yöntemleri için karşılaştırılabilir olan9,. Son yıllarda yapılan çalışmalarda algılamak ve parazitler sulu örneklerinde ölçmek ve böylece fiksasyon adım ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, su buharı, spektral gürültü ve veri tedavi gibi faktörler en iyi sonuçları10için dikkate alınması gerekir.

Yeni kullanıcılar ATR-FTIR spectra almak ve sulu kırmızı kan hücreleri (RBC) örnekleri10 P. falciparum tespiti için bir regresyon modeli hazırlamak nasıl göstermek için bu protokolü amaçlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lütfen uygun malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) başvurun ve uygun seviye 2 (BSL-2) eğitim aramak. Tüm kodlamayla adımları aseptik teknik kullanılarak, eğer zararlı UV ışınlarına maruz dekontaminasyon adımları, iğne sopa yaralanmalar ve biyolojik etkilenme olasılığını ortadan kaldırmak ve enfeksiyon riski olduğu anlamına gelir bir BSL-2 dolapta yapılmalıdır parazit kültür herhangi bir yaralanma girer. Ayrıca, stok kan kan bankalardan belirli hastalıklar ve kan hastalıkları kaynaklı yaymak için potansiyel ekranlı sadece potansiyel bir risk olduğunu. Yaralanma oluşumunu acil tıbbi yardım isteyin.

1. hazırlık ve 3D 7 ölçümü Plasmodium falciparum parazit seyreltme serisi

Not: Plasmodium sp. kültür son derece duyarlıdır. Taze/geçmemiş reaktifler kullanın ve parazitler düzenli olarak medya değiştirerek yem. Besleme kültürleri % 5 parasitemia iki günde aşağıda; kültürler arasında 6-%10 parasitemia bir veya iki kez bir gün besleme; ve kültürler arasında 11 – %20 4 kere a gün kadar yem. Açlıktan ölmeye başlıyor parazitler kaybetmek onların şekil ve sözleşme başlar. Böyle bir durumda, yem ve hemen da medyayı değiştirerek ve hisse senedi RBCs. toplamak donör kan antikoagülan ve ilk 6 saat içinde ölçü olarak heparin içeren kan toplama tüpler ekleyerek oranında seyreltin.

  1. Kültür 3D 7 30 mL toplam parasitemia % 10 yüzük ulaşıncaya kadar Plasmodium falciparum parazitler standart protokolüne göre süzün.
  2. Parazitler ve eşitleme
    1. 11 h parazit yaşam döngüsü içine shizogeny sonra resuspend kültür ve transfer bir otomatik pipet kullanarak bir 50 mL konik tüp içine.
    2. 300-400 x g ve 5 min için Standart laboratuvar koşulları (25 ° C ve 100 kPa) kültür santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant pipet ile çizim veya pelet bozmadan bir vakuma bağlı bir Pasteur pipet kullanarak kaldırın. Atık medya % 10 çamaşır suyu çözüm atın.
    4. Yavaş yavaş 12-15 mL % 4 sorbitol çözeltisi kullanarak bir otomatik pipet Pelet ve kapatma ve kültür homojen olana tüp ters çevirme kültür karıştırın.
    5. 15 dakika 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
    6. 300-400 x g ve 5 min için Standart laboratuvar koşulları kültür santrifüj kapasitesi.
    7. Süpernatant 1.2.3 adımda anlatıldığı gibi kaldırın.
    8. 10-15 mL % 0,9 serum için Pelet ve çözüm kapatma ve kültür homojen olana tüp ters çevirme karıştırın.
    9. Adımları 1.2.6–1.2.8 sorbitol tüm kalıntıları yıkamak için iki kez daha tekrarlayın.
  3. Parasitemia seyreltme serisi hazırlanması
    1. Stok RBCs adımları 1.2.6–1.2.9 olduğu gibi yıkayın.
    2. Standart laboratuvar koşulları, hisse senedi RBCs 300 – 400 x g 5 min için de, kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant adım 1.2.3 olduğu gibi atın.
    3. Microcentrifuge tüpler % 0, %0.010, % 0,025, %0.075, %0,100, %0,250, %0.750 ve %1.000 etiketleyin ve 0 µL, 1 µL, 2.5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL ve kültürünün sırasıyla 0,2-20 µL pipet kullanarak 100 µL ekleyin.
    4. 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 ve 0 µL stokunun RBCs tüpler etiketli %0, %0.010, % 0,025, %0.075, %0,100, %0,250, %0.750 ve %1.000, sırasıyla ekleyin.
    5. 1200 x g ve 10 min için Standart laboratuvar koşulları, antikoagülan tüpler santrifüj taze donör kan toplanır.
    6. Bu bir pipet ile çizerek ve 1.2.3. adımda açıklandığı gibi atarak plazma kaldırın.
    7. İzole RBCs 900 µL her microcentrifuge tüp içine ve 10 x ters çevirme tarafından iyice karıştırın.
  4. Spektral edinme
    1. Eşlik eden spektral satın alma programı kullanarak, "Enstrüman Set-Up" tıklatın ve veri koleksiyon parametrelerini şu şekilde ayarlayın: 128 taramalar için arka plan; örnek için 32 inceden inceye gözden geçirmek; ve çözünürlük 8/cm enstrümanın en büyük örnek aralığında.
    2. ATR-FTIR Spektrometre üreticisinin tavsiye başı sıcaklık ayarlayın veya bir gece.
    3. Kristal ücretsiz mendil Ultrasaf Su ile nemlendirilmiş lint kullanarak dairesel bir hareketle hafifçe ovma tarafından temiz. O zaman başka bir tüysüz ücretsiz temizleme işlemi kullanarak iyice kurulayın.
    4. "Arka plan ölçüm" tıklatarak arka plan ölçüm hava almak. Her 20 dk, kristal adım 1.4.3 olduğu gibi temiz ve bu ölçüm yineleyin.
    5. Canlı görüntü "Önizleme" seçeneğini tıklatarak açın. Kristal temiz olduğunu gösterir bir düz, yatay temel gözlemlemek.
    6. Deiyonize su doğrudan orta kristalin üzerinde 10 µL pipet ve "Ölçü örnek"'ı tıklatın. Her beşinci örnek sonra bu su ölçüm yineleyin.
    7. Tüysüz ücretsiz mendil ve yumuşak dairesel hareketlerle kullanarak kristal kuru.
    8. Örnek 10 µL pipet ve "Ölçü örnek"'ı tıklatın.
    9. Adım 1.4.3 olduğu gibi örnek arasında kristal temiz.
    10. Örnekleri ve çoğaltır sırasını rastgele emin 3 çoğaltır iktisap kadar yineleyin.

2. çok değişkenli veri analizi (MVDA)

Not: Veri tedavi tüm veri kümesi üzerinde gürültü ve biyolojik olmayan kökenli doruklarına ilavesi önlemek için yapmanız gerekir. Buna ek olarak, biyolojik olarak ilgili bölgeleri üzerinde analiz: 2980-2800/cm ve 1750-850/cm.

  1. Veri tedavi
    Not: İki yazılım, Örneğin, Matlab (bundan böyle 1 yazılım olarak da adlandırılır) ve Unscrambler (bundan böyle 2 yazılım olarak da adlandırılır) X MVDA için örnek olarak kullanılır. Yazılım 1 MVDA bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) ek gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Ancak, bu bir GUI (Tablo reçetesi) satın almak için tavsiye edilir. Yazılım 1 atıfta bu üstlenecek yaparken aşağıdaki talimatlara piyasada bulunan GUI araç kutusu ile birlikte, ve örnek veri tedavi senaryo bağlı.
    1. Uygun çok değişkenli veri analizi yazılımı açın, "Veri al" seçeneğini tıklatın ve çözümleme için dosya türünü seçin.
      1. Yazılım 1, "Analiz" GUI açmak için command window içine girdi. Sağ X box "Veri al" bulmak için tıklatın.
      2. Yazılım 2, "Alma" bulmak için "dosya" sekmesini tıklatın.
    2. Tüm spectra her kümede ayrı ayrı seçip "Aç" düğmesini tıklatarak veri kümeleri olarak örnek, su ve temel spectra çalışma alanına alma ve her kümesi, Örneğin, 'wat' su spectra ürününün veri kümesi için kısa bir ad verin.
    3. Yeni Tablo/Matris "yeni Matrix/vektör" tıklatarak seçin ve n örnek sayısına nerede bir n × 1 vektör oluşturmak. Her örnek parasitemia giriş ve vektör 'Parasitemia' adını verin.
      1. Yazılım 1, "Yeni değişken" komut penceresinde tıklatın.
      2. Yazılım 2, "Yeni Matrix" simgesini tıklatın.
    4. Verileri ' "Çizmek veri simgesini" çizmek. "Zoom" tıklayarak ve 1800-1400/cm üzerinde yakınlaştırma spectra su buharı efektler için incelemek; en açık biçimde gözlenen Amid yamaçları boyunca kısa, keskin, dar tepeler olarak ben ve Amid II bantları.
    5. Aşırı su buharı durumlarda Düzenle/pre-process data sekmesini açın ve "Düzeltme" seçin. Gürültü ve/veya güçlü su buharı katkıları düzgünleştirme 25 puan kullanarak örnek ve su spectra yumuşatma tarafından azaltmak veya su buharı düzeltme yöntemini kullanabilirsiniz.
    6. Uygunsa, adım 2.1.4 aynı Düzenle/pre-process veri sekmesindeki temel düzeltme algoritması kullanarak doğru yatay-temel.
    7. Su spectra ortalama ve örnek veri kümesi için eşdeğer bir n × m matris satırları kopyalayın ve 0,7 tarafından çarpılarak % 70 yoğunluğu azaltmak.
      1. Yazılım 1, bunu komut penceresinde aşağıdaki komut dosyası "AverageWater=mean(WaterDataset)" girerek. Sonra Kopyala-Yapıştır örnek veri kümesi eşleşen satırları. Giriş yoğunluğu azaltmak için "AverageWater70 AverageWater = * 0,70".
    8. Her örnek spektrum üzerinden ortalama su spectra çıkarma.
      1. Yazılım 1, komut penceresinde aşağıdaki komut dosyası girerek bunu "WaterCorrectedData SampleDataset-AverageWater70 =".
    9. İkinci türev işlevi uygular ve sonra verileri tek normal değişken (SNV) işlevi seçerek normal duruma getirmeye ve ortalama Merkezi veri Düzenle/pre-process veri sekmesini açın.
      1. Yazılım 1, tek seferde bunu. Önce "Türev" ve giriş 25 puan yumuşatma, polinom 3 sırasını ve düzgünleştirme 25 puan ve çetinkaya-deniyordun işlevini kullanarak Ayarla örnek üzerinde türev sipariş seçin. O zaman seçme "SNV" ve "Demek Merkez". Tamam/Uygula "'ı" tıklatın.
    10. Düzenle/pre-process data sekmesini açın ve sadece onların kutuları işaretli olmasını sağlayarak 2.980-2800/cm ve 1750 – 850/cm "Sütun değişkenleri", seçin.
  2. Veri Analizi
    1. Asıl adı bileşen analizi (PCA)
      1. Tıklatın "analiz | Ayrışma"ve seçme PCA.
        1. Yazılım 1, "Model inşa"'i tıklatın.
        2. Yazılım 2, PCA yöntemleri girdi. En iyi dizi sorumlusu bileşen (adet) - iş, 7 - giriş ve en çok 100 yinelemeden ve seçim çapraz doğrulama için doğrulama yöntemi. "Çalıştır" ı tıklatın.
      2. % 95 güven sınırı, kesikli halkada puanları Arsa PC1 ve PC2 arasında gözlemlemek.
      3. Örnek spectra sınırı dışında "Seçin Spectra aracı" kullanarak potansiyel aykırı ortaya puanları ile işaretleyin.
      4. İşaretli spectra yüksek varsa Hotellings T2 değerleri ve yüksek Q fazlalıklar onları daha fazla çözümleme dışı bırakmak.
    2. Kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R)
      1. Tıklatın "analiz | Regresyon"ve seçme"PLS-R".
        1. Yazılım 1, şu Y bloğu'nu tıklatın ve vektör seçin "Parasitemia | Model oluşturmak".
        2. Yazılım 2, PLS-R yöntemleri girdi. "Parasitemia" vektör seçim çapraz doğrulama doğrulama yöntemi olarak örnek veri kümesi olarak "X veri kümesi" ve "Y başvuru" olarak seçin. "Çalıştır" ı tıklatın.
      2. Regresyon modelini analiz. R2 değerleri üzerinden 0,80 ve %0,1 parasitemia daha az olan çapraz doğrulama (RMSECV) değerleri, ortalama karekök hata kabul edilebilir modellerdir.
      3. Regresyon vektör analiz ve biyolojik grupları tanımlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kısmi en küçük kareler (PLS-R) Arsa ve onun ilişkili regresyon vektör, Şekil 1a ve 1b sırasıyla, parazit sinyal bir doğrusal regresyon modeli için kullanılacak form için kullanılabilir RBCs yeterince farklı olduğunu göstermektedir tahmin parazitler ve gelecekteki veri kümesi.

Sağlam, doğrusal PLS-R modeli 0,87 bir R-kare değeri ile oluşturulan ve %0.13 parasitemia, 1a rakam, çapraz doğrulama hata (RMSECV) kök ortalama kare. Artan parasitemia düzeyleri aslen nükleik asit bantları ile ilgili özellikle 1042, 1083 ve 1226/cm, ν(C=O) için RNA riboz atanmış olan Grup, νs(PO4 -) ve νbir(PO4 -) sırasıyla ve formu regresyon vektör büyük negatif bölümü. Bunun nedeni bir çekirdek RBCs eksikliği ve nükleik asitler parazitleri için güçlü göstergeleri olan olmasıdır. Ayrıca, 1226/cm bant yapısı içinde sulu devlet12ölçme önemini vurgular bir B-DNA formu sahip olduğunu gösterir. Buna ek olarak, parazitler tüketmek RBC bileşenleri, öncelikle hemoglobin, ve böylece lipid oranı daha yüksek bir protein bulaşmamış RBCs beklenen belirtildiği şekilde lipid grupların 2913, 2879 ve 1397 cm-1 ve 1631 ve 1555 cm-1 Amid gelen ben ve Amid II modları12,13.

Farklı bantları yerine yoğun ve dar şeritler halinde mevcut sahte bantları gibi su buharı, biyolojik olmayan menşe farklılaşma temel sinyalleri gerçek biyolojik bantları vardır açıkça gösteriyor. Özellikle, DNA bantları, Tablo 1, varlığı için parazit11,12,13doğrudan bağlanabilir. Genel olarak, regresyon vektör PCA yükleri için benzer bir şekilde yorumlanabilir. Bantları bantları ve özgün spectra vardiya ile ilişkilendirmek.

Figure 1
Şekil 1: PLS-R regresyon arsa, (a), 0-1 arasında çivili RBCs, ilişkili regresyon katsayısı, (b)ve % parasitemia. Regresyon Arsa modeli her örneğinde, bilinen parasitemia x ekseni ve y ekseni üzerinde tahmin edilen parasitemia parasitemia tahmin yeteneği gösterir. Regresyon katsayısı daha yoğun daha fazla model ve böylece nasıl parazit kan kimyasal bileşimi değiştirir katkıda grubudur modeli öngörü yeteneği her grubun katkısı açıklar. Çoğaltılamaz ve değiştirilmiş dan Martin, M. vd. 10 Royal Society Kimya izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Regresyon katsayısı Band (cm-1) Assignment25-27
2929 Lipidler, üzerinden νaCH2 parazit
2913 Lipidler, kırmızı kan hücre νaCH2
2879 Lipidler, kırmızı kan hücre νsCH3
2861 Lipidler, üzerinden νsCH2 parazit
1707 B-DNA/A-DNA baz çifti titreşim νC O & νC = = N, parazit
1652 Amid α-helix proteinler, dan parazit
1631 Amid β-Pileli sayfası proteinler, kırmızı kan hücresi dan
1584 νc = N imidazoles nükleik asitler, parazit
1555 Amid II gelen proteinler, kırmızı kan hücresi
1530 Amid II, parazit
1423 B-DNA deoksiriboz, parazit
1397 Lipidler, kırmızı kan hücre ν(COO-)
1226 ΝaPO4-B-DNA, parazit
1184 B-DNA deoksiriboz, parazit
1083 ΝaPO4-DNA, parazit
1042 νc = O RNA riboz parazit

Tablo 1: atamaları gruplarından regresyon katsayısı biri PLS-R spectra sıtma üzerinde çivili RBCs. PLSR içinde bir spektrum ile ilişkili parasitemia değerini Önişlenmiş spektrum regresyon vektör tarafından çarpılarak hesaplanır. Bu nedenle, regresyon vektör önemi ve regresyon IR bantlarında yönünü gösteriyor. Spectra ikinci türev kullanarak Önişlenmiş çünkü pozitif bantları düşük parasitemia ile ilişkilendirilse de negatif bantları ile daha yüksek bir parasitemia ilişkilidir. Çoğaltılamaz ve değiştirilmiş dan Martin, M. vd. 10 Royal Society Kimya izniyle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PLS-R modeli Doğrusal bir ilişki, Y bulduğu bir yöntemdir denetimli birden fazla varyasyon = bX + E on, akıllı değişken X arasındaki (burada, her wavenumber absorbans) ve sürekli değişken Y (burada, parasitemia düzey). Kısacası, model değişkenleri x korelasyon x ile Y farkı yakalamak gizli değişkenler (LVs) yeni bir dizi oluşturmak için birleştirir ve regresyon vektör (b) hesaplar bu y değeri tahmin yeni bir spektrum sonuçları ile çarpılır. İki değer modeli gücünü alınabilir: R2 değeri ve ortalama karekök hata, çapraz doğrulama (RMSECV) değeri. Eski model ve böylece sağlamlık doğrusallık (yakın bunu 1 olarak daha iyi) açıklanır ve R2 değeri 0,8 daha az modelleri için verileri gerekir gözden geçirileceğini dikkatle aykırı ve gürültülü verileri için. RMSECV değeri tahmini yapılabilir hata açıklanır. Her zaman deneyin ve aykırı, dikkatle tedavi verileri dışlamak emin olarak bu sayıyı mümkün olduğunca en aza indirmek en iyi ve bu orada emin gibi birçok biyolojik çoğaltır mümkün olduğunca vardır.

Bu nedenle kaliteli veri modeli oluşturmak için satın aldığım zorunludur. Seyreltme serisi hazırlanması çok önemlidir; Özellikle her RBC örnek olarak homojen olduğundan emin. Pipet çekip dönen veya hafifçe microcentrifuge tüp sonu 5-10 kat flicking sırasında birkaç kez RBCs çıkarma kullanarak, tutarsızlıkları kaçınılması. Benzer şekilde, kristal kontaminasyonu önlemek için her örnek arasında temizlemek için önemlidir. Kristal ve satır taban çizgisi düz kontrol temizlemek için ultra saf su ve tüy bırakmayan ücretsiz mendil kullanarak sonraki örnek ölçüm kontamine hiçbir kalıntı sağlar.

Biyolojik örnekler alanında uygun bir model için gerekli en az 30 benzer bir numara bir veri kümesi ile doğrulanır koşul başına sayısıdır. Bu önemli birimi oluşturmak için önemli miktarda alacağını ve böylece bu tekniğin kısıtlamadır. Ancak, daha fazla örnek doğru analiz edilir gibi onlar öngörü modeli için eklenen ve güçlendirmek. Böylece, kez kurulan modeli daha doğru olabilir ve bunu kurmak için gerekli çaba iki yana yaslayabilirsiniz.

Çevre ve üzerinde ölçümler alınır araçları bağlı olarak, birkaç diğer sorunları ortaya çıkabilir. Beamline tamamen enstrüman değil alınmış, eklem hava geçirmez değildir ya da ATR pencere diğer örnek bölmeleri ile değiştirilebilir anlamı etanol ve su buharı spectra kontamine. Etanol 1070/cm 14etrafında güçlü bir keskin bant olarak görünür. Bu etanol ücretsiz bir alanda ölçme ve sadece tüm ölçümler alınır sonra araç dezenfeksiyon önlenebilir. Su buharı atmosferde değişiklikler nedeniyle oluşur ve küçük keskin pozitif ve negatif tepeler olarak görünür 1400-1800 /cm ve 3200-3600/cm. Bu arka plan ölçüm sıklığı artan ve azot aletle Temizleme tarafından çözülebilir. Tasfiye kullanılamaz ve su buharı hala oldukça güçlü olduğu yerde durumlarda, algoritmalar ve su buharı tazminat yumuşatma veri ön işleme için bunları kaldırmak için eklenebilir.

Bu teknik söz hasta sonuçları ve gelecekte teşhis için bir çok tutar. Öncelikle, genel olarak örnek yalnızca ATR kristal pipetted ihtiyacı var ve sonra doğrudan ölçülebilir ve Kullanıcı hata olasılığını azaltarak modeline giriş uygulanması çok kolay yöntemdir. Bu çok yetenekli ışık microscopist, ihtiyacını olan Afrika'nın bazı bölgelerde Şu anda2eksik ortadan kaldırabilir. Kolaylık olması nedeniyle, aynı zamanda pahalı reaktifler ve ekipman ihtiyacını ortadan kaldırılır ve böylece tanı olacaktır maliyet ücretsiz neredeyse hastalar için olan PCR büyük sınırlama. Bu arada çok erken ve böylece hasta sonuçları iyileştirilmesi tanı için gelen hastaların daha yüksek sayılara yol açacak. Teknik RDTs düşük hassasiyetleri aşmak ve asemptomatik taşıyıcılar er ve böylece bir tarama Teknik olarak kullanılabilir tespit etmek mümkün olacaktır son derece yüksek hassasiyetleri için potansiyele sahiptir. Ayrıca, teknik diğer hastalıklar için kullanılan, bir kaç microliters veya mikrogram için kristal nerede uygulanabilir kan kaynaklı veya başka türlü potansiyeline sahiptir.

Ancak, örnek modeli alanında uygulanabilmesi ele alınması gereken çok şey vardır. Çapraz doğrulama bir biyolojik çoğaltır az sayıda nedeniyle ve bu ideal değil; daha doğrusu sahip ayrı bir doğrulama modeli test etmek için ayarla bunun yerine çok daha iyidir. Ayrıca, RMSECV miktar alt düzeylerini güvenilmez yapma burada oldukça yüksektir. Çoğaltır artırıldığında bu değer artıracak ve alanında bu yöntemle contalı profillerde önce yapılmalıdır. Bu laboratuvar denemeleri9nerede RMSECV daha büyük örnek boyutu nedeniyle çok daha düşük, doğruladı. Buna ek olarak, artan aralığı aralığı ve puan da bu değer de artıracaktır. Teşhis yeteneği daha da geliştirmek, P. falciparum vahşi suşları kullanılmalıdır, 3D 7 olarak P. falciparum bir laboratuvar yük olduğunu ve varyasyonlar nedeniyle farklı bir kimyasal bileşimi fenotip takdim edeyim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar için finansman Avustralya Araştırma Konseyi tarafından sağlanan (gelecek bursu FT120100926 BRW için), Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya'da (Program grant ve kıdemli araştırma bursu için JGB; Erken kariyer bursu JSR; Altyapı araştırma enstitüleri destek düzeni Grant Burnet Enstitüsü için), ve Victoria Eyalet hükümeti operasyonel alt yapıyı desteklemek Burnet Enstitüsü için Grant. Bay Finlay Shanks enstrümantal desteği anıyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Arnold. Great Britain. 361 (1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11, (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18, (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13, (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142, (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39, (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48, (4), (1952).
Algılama ve miktar için <em>Plasmodium falciparum</em> içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter