Summary
כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.
Abstract
נדידת תאים הוא היבט חובה עבור ריפוי הפצע. יצירה מלאכותית פצעים בדגמים בעלי חיים למחקר לעיתים קרובות תוצאות בפרוצדורות ניסיוני יקר ומסובך, בעוד פוטנציאלי חסר דיוק. In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק הפלטפורמה המתאימה עבור חוקר ההתנהגות נודדות תא ריפוי הפצע, את ההשפעה של טיפולים על תאים אלה. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת בתנאים שאינם-confluent; עם זאת, גישה זו אולי לא מזכירים ריפוי בתנאים טבעיים הפצע. לשבש את תקינות אפיתל באמצעים מכניים יוצר מודל מציאותי, אך עשוי לעכב את היישום של טכניקות מולקולריות. כתוצאה מכך, טכניקות במיקרוסקופ מבוסס הם אופטימליים ללימוד נדידת תאים אפיתל במבחנה. כאן אנחנו מפרטים שתי שיטות ספציפיות, וזמינותו גירוד פצע מלאכותי, וזמינותו קבלה העברה מלאכותית, תועמד נתונים כמותיים ואיכותניים, בהתאמה, על הביצועים הנדידה של תאים אפיתל.
Introduction
נדידת תאים דרוש לריפוי הפצע, כפי שהוא אחראי על הסגר הסופי של הפער אפיתל ושיקום של פני השטח שיבשו1. ביצוע פצעים מלאכותי בבעלי חיים מאפשר להקים את ההעתק של תהליך מורכב זה ליד בתנאים פיזיולוגיים2. עם זאת, גישה זו לעתים קרובות התוצאות נהלים ניסיוני יקר ומסובך, שעשוי להיות חסרי דיוק לחקר תהליכים ברורים, בשל אופיו המורכב של תהליך ריפוי פצע.
In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק אלטרנטיבה מועיל חייתיים לחקור את התפקיד כי תאים אלה לשחק ב ריפוי הפצע ואת ההשפעות של טיפול להתנהגות הנדידה התא. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת על ידי טכניקות מולקולריות באמצעות התרבויות הלא-confluent3,4,5,6; עם זאת, שיבוש שלמות אפיתל בדרך כלל מושגת על ידי חתכים מכני טוב. בתרבות תא, זה מרמז כי עלול להיות חשוף זניח מספר התאים הפער הפצע, הם מייצגים מדגם קטן מדי עבור שיטות בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, נגעים אלה ניתן יהיה ללמוד את קנה המידה מיקרוסקופיים, מנצל המאפיינים נודדות מולדת של שורות תאים אפיתל מסוימים, כגון התא מינק ריאות אפיתל (Mv1Lu) או את התא באופן ספונטני מונצחים אנושי תקין (HaCaT) קווים.
כאן אנחנו תיאר שיטה מיקרוסקופ מתאימה לקבל נתונים כמותיים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד בהקשר של3,-4,-7,-8ריפוי הפצע. יתר על כן, אנו מציגים נוספים בשיטות שאינן מועילות ללמוד שינויים מורפולוגיים המולקולריים איכותית המתרחשים monolayers אפיתל במהלך ההעברה. בסך הכל, שיטות אלה מספקים מסגרת ללמוד dynamics והן שינויים מורפולוגיים מעורב עם תאים אפיתל התנהגות בתגובה טיפולים במהלך ריפוי הפצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מלאכותי הפצע Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים
- הכנת טפט תא
- עובד תחת תנאים סטריליים, זרע ולגדול Mv1Lu או HaCaT תאים אפיתל מבחנות תרבות באמצעות בתוספת-סרום בינוני. רענן בינוני פעם כל 24-48 שעות. לאחר תאים להגיע למפגש 80%, ניתוק תאים באמצעות של השיטה המתאימה, כלומר, trypsinization9.
הערה: Mv1Lu HaCaT שורות תאים אפיתל מתורבתים באמצעות EMEM ו- DEMEM תרבות בינוני, בהתאמה, בתוספת 2 מ מגלוטמין ו מודגרות ב 37 ° C עם אווירה מבוקרת של 5% CO2. כל קו תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-4 x 104 או 4-6 x תאים4 10/טוב, בהתאמה, הם נזרע בבקבוקון תרבות2 175 ס' ' מ, ב- 80% הנהרות מניב עד 35 x 106 Mv1Lu או עונה 1 פרק 107 HaCaT תאים. - בצלחת או תרבות טוב 12 או 24-ובכן, זרע היטב כל 2 מ"ל של תאים. רענן בינוני לאחר כל ה 24-48 מספרי הטלפון הנייד ודא גבוה מספיק כדי להגיע למפגש 100% לאחר 2-3 ימים.
- אחרי התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיום בתוספת-סרום, לשטוף פעמיים עם בינונית ללא סרום טריים. לשמור תאים ללא סרום בינוני במשך 24 שעות לפני גירוד.
הערה: תאים Mv1Lu או HaCaT אין דרישות מיוחדות המצע; עם זאת, עבור שורות תאים רגישים ניתוק באופן ספונטני בתנאים ללא סרום, ציפוי מראש של המשטח צלחת תרבות באמצעות פתרון פולי-L-ליזין יש לשקול10.
- עובד תחת תנאים סטריליים, זרע ולגדול Mv1Lu או HaCaT תאים אפיתל מבחנות תרבות באמצעות בתוספת-סרום בינוני. רענן בינוני פעם כל 24-48 שעות. לאחר תאים להגיע למפגש 80%, ניתוק תאים באמצעות של השיטה המתאימה, כלומר, trypsinization9.
- טפט מגרד
- עובד בסביבה סטרילית, לגרד את טפט תרבות על-ידי בחוזקה גרירת הקצה הצר של µL 20 או 200 עצה micropipette עקר µL, בהתאם הרוחב הרצוי מאפס. שמור על הקצה בניצב למשטח תרבות להגדיל את הפער הומוגניות.
- מקם את הצלחות התרבות על-גבי משטח כהה לעקוב בבירור את טפט תא. במידת הצורך, לבצע שתי שריטות בניצב (בצורת צלב) על כל טוב ללמוד עד 4 תחומי ההעברה.
- רחץ מנותקת תאים על-ידי הסרת בעדינות תרבות בינונית, הוספת בעדינות בינוני טריים ללא סרום. חזור על שתי פעמים, או עד ביותר כעיגולים בצבע תאים הוסרו.
- עובד בסביבה סטרילית, לגרד את טפט תרבות על-ידי בחוזקה גרירת הקצה הצר של µL 20 או 200 עצה micropipette עקר µL, בהתאם הרוחב הרצוי מאפס. שמור על הקצה בניצב למשטח תרבות להגדיל את הפער הומוגניות.
- הליך ניסיוני ואיסוף נתונים
- לקחת עד 4 תמונות ההפניה טיפול טרום שבמרכזה הפער גירוד כל טוב להשתמש במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוך שילוב מצלמת CCD. בחר תחומי עניין על ידי יישור הקצה של מיקרוסקופ שדה לצומת הסמוך של שריטות.
הערה: בדרך כלל, תמונות נרכשים באמצעות הגדלה של 10 x וגודל התמונה 1,280 x 1,024 פיקסלים. בחירת אזורים ריבית כפי שתואר לעיל מסייע עבור איתור קל ונוח ואימות של עד 4 מידות לכל טוב. - לאחר כל התמונות נרכשים, לייעד בארות הטיפול; חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו.
הערה: לחלופין, כימיקלים או תרכובות אל תפריעי הומוגניות תרבות בינוני, טיפולים ניתן לקבל חיסון ישירות לתוך המדיום תרבות. - דגירה לצלחת שרוט (37 ° C עם אווירה מבוקרת המכילה 5% CO2) עד התנאים תחת תצפית יד 90% פער מאפס הסגר. הימנע הסגר מלא.
הערה: סגירת הפער הכולל יבטל אוסף התמונות שלאחר הטיפול התייחסות לתחומים שאינם לזיהוי, אין אפשרות להקים את ההפניה זמן עד לסגירת הפער. במקרה של תאים Mv1Lu או HaCaT, 16-19 h נדרשים להגיע למפגש 90%. - לעצור את נדידת תאים על-ידי תיקון התאים; בעדינות להחליף המדיום תרבות ניסיוני 1 מ"ל של פורמלין 4% ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
- לשטוף את התאים כדי להסיר עודפי פורמלין; בעדינות להחליף את הפתרון ב הבארות PBS טריים. חזור על פחות פעמיים.
הערה: בשלב זה, לאחר איטום, צלחות שניתן לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן. - קח תמונות הפניה שלאחר הטיפול של כל טוב מאזורי ההפניה המקורית כבשו לאחר גירוד. השתמש באותו הציוד (מיקרוסקופ הפוכה ניגודיות שלב אופטי שילוב מצלמת CCD) התאמת הגדרות תמונה (הגדלה ו רזולוציה דיגיטלי/צפיפות).
הערה: עבור תאים נודדים בנפרד, ממלא את הפער ללא תלות היווצרות של חזית קוהרנטית (למשל, תאים אנושיים של סרטן השד של מד א-MB-231), התמונות כמובן זמן עשוי לאפשר את החישוב של מהירויות העברה תא בודד.
- לקחת עד 4 תמונות ההפניה טיפול טרום שבמרכזה הפער גירוד כל טוב להשתמש במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוך שילוב מצלמת CCD. בחר תחומי עניין על ידי יישור הקצה של מיקרוסקופ שדה לצומת הסמוך של שריטות.
- ניתוח תמונות, כימות של ההעברה
- באמצעות עיבוד תוכנה (לדוגמה, ImageJ) תמונה, להגדיר הפער מאפס הגבולות ולקבוע על פני פער מידות עד ארבע תמונות טיפול קדם. לרשום את הנתונים כמו "טיפול קדם הפער השטח" (PREGAP). חזור על הפעולות אותן לתמונות שלאחר הטיפול. לרשום את הנתונים כמו "gap שלאחר הטיפול השטח" (POSTGAP).
- פתחו את התמונה נרשם באמצעות ImageJ. בתפריט 'תמונה', להגדיר סוג תמונה 8 סיביות. בתפריט "תהליך", פתח את תפריט המשנה "מסננים" ו להחיל סינון "סטיה".
- תפריט 'תמונה', הזן "להתאים" את תפריט המשנה ואת סף הגדרת שחור-לבן (B & W), ודא "רקע כהה" לא נבחרה. בתפריט "תהליך", ללכת המשנה "בינארי" ובחר "מלא חורים".
- בתפריט "לנתח", בחרו "לקבוע מידות", להפעיל את "אזור". ואז לצייר את האזור מדיד בעקבות קו המתאר הקצה נודדים ובכך-שתוחם את הפער.
- בתפריט "לנתח", בחר "לנתח חלקיקים" והקלטה של "שטח" ערכים עבור השטח אזור מצוירות.
- להציג את ערכי השטח הכולל PREGAP ו- POSTGAP בגיליון לכמת ההעברה מוחלטת עבור כל ערכה של דוגמאות בודדות כהפרש של פער מידות משטח: − PREGAP POSTGAP [יחידות שרירותי]. בנוסף, לנרמל מוחלט העברת הנתונים של כל תנאי כדי לשלוט דגימות: (לטעום / לשלוט) * 100 [%].
הערה: עבור תאים נודדים בנפרד, ממלא את הפער ללא תלות היווצרות של חזית קוהרנטית, (למשל, תאים אנושיים של סרטן השד של מד א-MB-231), ההעברה מוחלט יכול להיות מחושב על ידי ספירת תאים פולשים מרכזי להתפשט גם ב הפקד או דגימות שטופלו. - מגרש כימות פלטי (ראה איור 1). לבצע ניתוח סטטיסטי במידת הצורך.
- באמצעות עיבוד תוכנה (לדוגמה, ImageJ) תמונה, להגדיר הפער מאפס הגבולות ולקבוע על פני פער מידות עד ארבע תמונות טיפול קדם. לרשום את הנתונים כמו "טיפול קדם הפער השטח" (PREGAP). חזור על הפעולות אותן לתמונות שלאחר הטיפול. לרשום את הנתונים כמו "gap שלאחר הטיפול השטח" (POSTGAP).
2. מלאכותי ההעברה Assay קבלה ללימודי טופוגרפיים
- הכנת טפט תא
- עבודה בתנאים סטריליים, מקום שכבה אחת של סטיריליים coverslips סיבוב צלחות ריקות תרבות עד פני השטח של הלוח מכוסה לגמרי.
הערה: עד 12 ו- 33 coverslips להתאים 5 ס מ וצלחות בקוטר 10 ס מ, בהתאמה. - על הצלחת תרבות בעדינות זרע אמצעי אחסון נאותים של תאים על ריכוז המאפשר זרימה 100% לאחר 2-3 ימים. לוודא ש-coverslip לא חופף coverslips שכנים ולמנוע coverslips צף על ידי הפעלת לחץ עדין עם טיפ micropipette סטרילי. רענן המדיום כל 24-48 שעות.
הערה: בכל שורה תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-3 x 106 או 2.5-4 x 106 תאים/10 ס מ קוטר צלחת, בהתאמה, הם נזרע. עבור לוחות קטנים יותר, מספרי הטלפון הנייד חייב זה מדע פשוט. - לאחר התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיום בתוספת-סרום והחלף בינונית ללא סרום טריים. שמור את התאים ללא סרום בינונית במשך 24 שעות לפני הפציעה מלאכותיים מתבצע.
הערה: תאים Mv1Lu או HaCaT אין דרישות מיוחדות המצע; עם זאת, עבור שורות תאים רגישים של ניתוק באופן ספונטני בתנאים ללא סרום, ציפוי מראש של המשטח תרבות באמצעות פתרון פולי-L-ליזין יש לשקול10.
- עבודה בתנאים סטריליים, מקום שכבה אחת של סטיריליים coverslips סיבוב צלחות ריקות תרבות עד פני השטח של הלוח מכוסה לגמרי.
- טפט ופצעו
- באמצעות פינצטה סטרילי, להעביר בעדינות coverslip צלחת 10 ס מ נקי המכיל בינונית ללא סרום טריים. למנוע פגיעה של טפט על-ידי החזקת את coverslip בפריפריה עם פינצטה. הימנע לחץ רב מדי אשר עלולה לגרום coverslip שבירה.
- ליצור פצעים מלאכותי על-ידי גרירת תער סטיריליים בקו רוחבי של מרכז coverslips. גרור 3-4 מ מ מאחור וושוב, על מנת להסיר לחלוטין את רצועת טפט המרכזית. ודא שאין שאריות תאים נשאר צמוד לקצוות פצועים.
הערה: על קוטר 12-מ מ מסביב coverslip, החתך מתבצע בדלפק אמצע של coverslip. הקפד להשאיר פס של תאים מול החזית הראשית גדול מספיק (לפחות 2 מ מ רחב) כדי למנוע הטיה של coverslip בשלבים הבאים. - העבר את הפצועים coverslips תאים פונה כלפי מעלה, למדיום נקי 6-ובכן צלחת המכיל לפחות 2 מ"ל טריים ללא סרום. מתאים ל-4 פצועים coverslips/טוב.
- בעדינות לשטוף פעמיים שימוש במוצרים טריים ללא סרום בינוני כדי להסיר תאים מנותקת.
- ניתוח ניסיוני ודגימה
- בעדינות חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו.
הערה: לחלופין, כימיקלים או תרכובות אל תפריעי הומוגניות תרבות בינוני, טיפולים ניתן לקבל חיסון ישירות לתוך המדיום תרבות. . המשך בזהירות כדי למנוע כל ניתוק התא פוטנציאליים. - לשמור את הצלחת בתוך חממה התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) העיתוי ניסיוני הרצוי.
- לעצור את נדידת תאים על-ידי תיקון התאים; בעדינות להחליף המדיום תרבות ניסיוני 1 מ"ל של פורמלין 4% ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
הערה: זמן הקורס ניסויים, להסיר את הדגימות לצלחת תרבות ותקן אותן בצלחת נפרדת כדי להימנע האדים פורמלין להשפיע על התנאים ניסיוני אחרים, שוטף. - לשטוף את התאים כדי להסיר עודפי פורמלין; בעדינות להחליף את הפתרון ב הבארות PBS טריים. חזור על פחות פעמיים.
הערה: בשלב זה, לאחר איטום, צלחות שניתן לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.
- בעדינות חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו.
- Immunofluorescence (אם) וניתוח טופולוגי
- לבצע אם מכתים, הדמיה על coverslips בודדים כפי שתואר במקומות אחרים3,4,11.
- Permeabilize 10 דקות במועט coverslips בפתרון טריטון X-100 0.3% ב- PBS.
- בלוק למשך 30 דקות באמצעות חסימת הפתרון הבאים: 0.3% אלבומין שור; סרום שור עוברית 10%; חלב רזה 5%; 0.3 פתרון טריטון X-100% ב- PBS.
הערה: חסימת פתרון ללא החלב ניתן להכין מראש, המאוחסנים ב-20 ° C. - תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא לחה, עם נוגדן ראשוני מדולל בפתרון חסימה ללא חלב. מקם את coverslips הפוך בפתרון נוגדן 15 µL כדי להבטיח חלוקה נכונה.
הערה: דילול עבודה נוגדן משתנה, תלוי הנוגדן בשימוש. כך למשל, נוגדן anti-c-יוני ארנב דורש לדילול 1/100. - רחץ שלוש פעמים על ידי שילוב של coverslips בפתרון טריטון X-100 0.1% בתוך ב- PBS.
- דגירה על coverslips ב נוגדנים משניים מדולל במאגר חלב נטול החוסמים למשך 30 דקות.
הערה: דילול עבודה נוגדן משתנה, תלוי הנוגדן בשימוש. לדוגמה, העז-נגד-הארנב (488) מחייב לדילול 1/400 רזולוציה מיטבית. ריאגנטים תיוג אחרים כגון phalloidin ו- Hoechst 33258 ניתן להוסיף למאגר הדגירה בשלב זה. - רחץ שלוש פעמים על ידי שילוב של coverslips בפתרון טריטון X-100 0.1% ב- PBS.
- הר coverslips על ההפוכות ב- 10 µL הרכבה מדיה טיפה (למשל, Vectashield) מניחים על שקופית מיקרוסקופ. להשאיר את השקופיות בחשיכה בטמפרטורת החדר למשך הלילה עבור הרכבה בינונית התקשות. לאחר מכן, לאחסן ב 4 ° C בחושך ללא הגבלת זמן.
- להשיג epifluorescence או מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של שינויים מבניים המתרחשים בקצה הקדמי נודדים.
הערה: מחקרים טופולוגי יכול להתבצע על ידי ריצוף תמונות מהחזית העברת טפט הפנימי. מחקרים כמותיים למחצה אפשריים על ידי ניתוח תוכנה המבוססת על עוצמות קרינה פלואורסצנטית מקומיים.
- לבצע אם מכתים, הדמיה על coverslips בודדים כפי שתואר במקומות אחרים3,4,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפצע מלאכותי Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים: הערכת גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) קידום של ההעברה:
EGF היא משרן ידועים של התפשטות תאים אפיתל, הגירה, ובכך פקד חיובי לכימות תנועת הגירה קידום. Monolayers תא Mv1Lu, HaCaT שימשו מבחני מאפס הפצע, טיפול קדם תמונות התקבלו. לאחר חיסון עם 10 ננוגרם למ"ל EGF, התאים היו מודגרות עבור 19 h לפני קיבוע ותמונות שלאחר הטיפול. התפשטות נשמר עד למינימום על ידי שמירה על תנאי רעב סרום. ערכות והאיות שלאחר הטיפול של תמונות נותחו באמצעות ImageJ, האזורים הפער המרכזי היו נחושים. הניסוי היה להפעיל כפולות, רישום מידות 4 עבור כל טוב. כימות של ההעברה מוחלטת מחושב כהפרש של משטחים: (PREGAP − POSTGAP). התאים Mv1Lu מגורה (איור 1 א') לעומת התאים HaCaT מגורה (איור 1B) היה פוטנציאל גדול הנדידה. ההבדלים מוסברים על ידי מקורות תא, להיות רירית בתאי אפיתל ועור keratinocytes, בהתאמה.
העברה מלאכותית Assay קבלה ללימודי טופוגרפיים: וריאציות קונפורמציה Cytoskeletal ואת הביטוי המרחבי של C-יוני:
נדידת תאים כרוך שינויים מתמשך, עמוק של מבנה שלד התא על מנת לקיים הזחה תא. HaCaT תא monolayers שימשו את מבחני הקבלה של ההעברה בתנאים גירוי ובקרה. טיפול עם EGF potentiates את הדינמיקה cytoskeletal, אשר הם נצפו על ידי אם לייזר סריקה מיקרוסקופ (LSM; איור 2A). EGF טיפול גם התוצאה kinases Mitogen-Activated חלבון (מפה) חזקים איתות ביטוי c-יוני. ריצוף LSM תמונות מאפשרת קביעת תצורה של דפוסי מרחבית. ביטוי מוגבר של c-JUN-תאים סמוכים לחזית נודדים יכול להיחשף בקלות על ידי ניתוח תמונות תוכנה; כאן, אנחנו ליישום בקנה מידה קשת עבור הערוץ הירוק, אשר מתאימות את c-יוני תיוג (איור 2B).
איור 1. קידום של הגירה ידי EGF בתאים Mv1Lu ו- HaCaT. תמונות בניגודיות שלב מיקרוסקופיה של האזור הפצוע של Mv1Lu (א) ו HaCaT (B) התאים היו נלקח בתנאים שליטה, לעומת תמונות של תאים שטופלו 10 ננוגרם למ"ל EGF עבור 19 h בתנאים ללא סרום. נציג micrographs להראות את מידת הפער מאפס וסגירת שהושג לאחר ופצעו עם טיפ micropipette 20 µL. הגדלה = 10 x; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. התא ההעברה הייתה לכמת מיוצג וריאציה של אזור ההבדלים בין טיפולים ודוגמאות פקד עבור כל assay (יחידות שרירותי; AU). העלילה היא הנציגה של שמונה מדידות עצמאי עבור כל תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. חוטים אקטין ושינויים c-יוני הביטוי קידום על ידי EGF בתאים HaCaT נודדים. (א) EGF ng/mL 10 לילה טיפול מקדם שינויים עמוקים קונפורמציה של אקטין חוטים בתאים HaCaT נודדים. תאים בחזית ההעברה של תנאי השליטה מתארים שלד התא חוטים של אקטין בחוזקה מובנית, בעוד תאים שטופלו EGF להראות אקטין המסכן חוטים הארגון בחזית ההעברה. הגדלה = 63 x; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. F-אקטין הוא בצבע אדום, Hoechst מיוצג על-ידי צבע כחול. (B) כאשר חיסונית-זריחה משמש בשילוב עם הדמיה LSM ללמוד c-יוני ביטוי לאחר טיפול 10 ננוגרם למ"ל EGF על העברת תאים HaCaT, ריצוף יצירות חושפים דפוסי ביטוי מרחבי. תמונות של c-יוני קרינה פלואורסצנטית (ירוק) הומרו צבע מדומה כדי להראות את עוצמת c-יוני מכתים. הסולם הקשת צבע מייצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית c-ג'ון, המתאים colormaps על לוחות נכון EGF ובקרה. צביעת במשותף עם phalloidin (אדום) ו Hoechst-33258 (כחול) שימש כדי להציג מבנה תאים, גרעינים, בהתאמה. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. הערה את רמות ביטוי הגוברת של גרעיני c-יוני באזורים מתקרב החזית נודדים. סרגל קנה מידה = 40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על העור או קרום רירי השיבושים, הפונקציה מכשול משוחזר על ידי הפעולות של סוגי תאים רבים, לרבות fibroblasts תאים אפיתל ואת המערכת החיסונית. בצמדים, תאים אלו עוברים מתחם פרוצס מעורבים אפופטוזיס, התפשטות, בידול, חשוב, פיברובלסט ואפיתל תא ההעברה, אשר הוא מנגנון האולטימטיבי האחראי על שיקום של הרקמה שיבשו את סגירת הפער אפיתל שטחי1,12 וכך, לומד נדידת תאים עוזר בדיוק לתאר את התנהגות פיזיולוגית של תאי אפיתל, תוך קביעת גם את הפוטנציאל modulatory של טיפולים הפצע ריפוי.
ביצוע פצעים מלאכותי בדגמים בעלי חיים מחקריות שונות מאפשר להקים את ההעתק של תהליך מורכב זה ב יד בתנאים פיזיולוגיים2, ובכך את ההערכה של מצבים פתולוגיים מסוימים או את ההשפעות של התרופות טיפולים13. עם זאת, גישה זו לעתים קרובות התוצאות לוגיסטיקה יקר ומסובך, כמו גם הליכי ניסיוני מעיק היוצרים עשוי נתונים אופנה מושהית13. להפך, במבחנה תרבית תאים מספקת מסגרת נוחה יותר עבור לחקור את אופן הפעולה של התאים המעורבים תהליך ריפוי הפצע. ואילו התרבות התא העיקרי של תאי אפיתל כנגד מהווה אופציה בת קיימא, זה יכול להיות קשה להשיג ואת להתמודד עם התאים, אשר יכול לסבך את איסוף הנתונים. למשל, בנוסף ההגבלה נמוך-מעבר טיפוסי של תרבויות העיקרי, ראשי keratinocytes האנושי צריך של פיברובלסט האכלה שכבה של צמיחה במבחנה3. להפך, שורות התרבות תאים אפיתל ומבוססת, כמו Mv1Lu או HaCaT, מהווים מודל מחקר ללא מכשול זה התנהגות תכונות ומאפיינים כמו אלה ראשי התרבות תאים3,4, 14,15. . בדיוק, לצורך המחקר של ריפוי הפצע, שורות תאים שני אלה שומרים על תכונות קריטיות ביכולתם להעביר ולעצור התפשטות בשל סימן דיכוי לתא על הנהרות16,17.
מבחני הזמני הם שיטה אמינה ופסיביות לכימות היכולות הנדידה של סוגי תאים שונים, במיוחד אפיתל ותאים סרטניים. על המקרה של תאים סרטניים, השיטה מאפס הוצע להערכת פוטנציאל פולשני. עם זאת, גישה זו נופל קצר כמחוון עבור invasiveness לעומת שיטות ספציפיות יותר בהסתמך על הביטוי של metalloproteases לצורך חדירה של מטריצה חוץ-תאית18,19. להפך, מבחני מאפס אמינים להערכת הביצועים הנדידה של תאים אפיתל ואת השפעת טיפולים שונים על תכונה זו. בניגוד שורות תאי סרטן, אשר לעתים קרובות להציג לכידות המסכן ואת היכולת לגדול על מספר שכבות, Mv1Lu, HaCaT ואיי אחרים תאים אפיתל קווים טופס קשורה באופן הדוק "צמיחה", אשר הרחיבו את מתח הרווחים שלהם בתהליך בהתאם שניהם התפשטות, אבל יותר חשוב על נדידת תאים. כתוצאה מכך, תנאי צפיפות תא דליל או תת confluent משמשים כמקובל ללמוד את ההשפעות של טיפולים שונים על הפיזיולוגיה הנדידה; במיוחד כאשר שיטות בביולוגיה מולקולרית הבאים מוחלים, כתא זו הסביבה ממזער סימן דיכוי בזמן למקסם את היחס של פעיל מעביר תאים. עם זאת, עבור תאים אפיתל, תנאים שאינם confluent מהווים את הסיכון למעט השפעות חשובות סימן דיכוי הקיימת מראש, למשל בדמות תקנה epigenetic. לפיכך, ללמוד ריפוי הפצע, התנאים confluent להיוועץ נאמנות מוגברת של המודל.
כדי לקבל הערכות מדויקות, והמצוות גורמים המשפיעים על קונפורמציה של שכבת תאים אפיתל או לתרום ההעברה צריך להתייחס. בזמן למפגש היא הרצויה, חשוב למנוע צפיפות מוגזמת תא או תרבויות מרובה שכבות, מאז תנאים אלה עשוי להשפיע באופן שלילי. לכן, התפשטות נשלטת בדרך כלל על ידי הרעבה בתקשורת ללא סרום או התוספת של כימיקלים כמו מיטומיצין C, אשר בלתי הפיך לעצור את התפשטות תאים על-ידי ה-DNA crosslinking3,20, 21. שימוש אחד מהשניים מסתמך על ההתנהגות של שורות תאים ספציפיים; מיטומיצין C במיוחד מצוינת כאשר מופחת סרום תוספי נדרשת כדי למנוע ניתוק התא מסיבית. זה המקרה עבור תאים HEK-293T, שם מראש ציפוי המשטח תרבות באמצעות פולי-L-ליזין היא אפשרות טובה להימנע מטיפול Mytomycin C. שחרורו של גורמים דלקתיים שעלולים לשנות את ההעברה גם צריך לטפל. אסטרטגיות שונות שימשו, המבוסס בעיקר על סיליקון מוסיף לחקות שיבוש השטח אפיתל מושגת עם גירוד assay22. בעת הוספת ליצור פערים קיימים לאפשר נדידת תאים לאחר הסרת את פיסת סיליקון, השיטה מאפס מסתמכת ישירות על הסרת חלק אפיתל חד שכבתי כדי להפיק את הפער. העדפה על איך ליצור את הפער מסתמך על היכולת של מוסיף להגן על ציפוי פני השטח של תרבות (כלומר, תרבות צלחת או פולי-L-ליזין) מפני נזק במהלך מגרד, תוך מזעור גם על שחרורו של גורמים של תאים פגומים שלא ניתן להתפשר תא תרבות התנהגות23. אף על פי מאפיינים אלו עשוי להיות שימושי עבור חלק מההגדרות ניסיוני, קרי, הערכת היכולת של תאים סרטניים להגר, החוויה שלנו מצאנו חסרונות משמעותיים לשימוש מוסיף בלימודי ריפוי הפצע. Mv1Lu תאים המסוגלים הצמדת המשטח החיצוני הוספה סיליקון, כשהתוצאה היא קריעת בשוגג טפט תא בעת הסרת החלקים סיליקון. בנוסף, למרות HaCaT תאים לא לצרף סיליקון, מצאנו בעל יכולת מופחתת עבור תאים אלה להעביר לתוך הפערים שנוצרו על-ידי הוספה. לזה במידה, דלקת והעברה הן תגובות המשויכות בחוזקה, אלה מופיעים להיות ביקורתי יחד בהקשר של ריפוי הפצע בתאים HaCaT. יתר על כן, מאז החלת טיפ פלסטיק מגרד את פני השטח של תרבות יש סיבה נראית לעין על היכולת של התאים לשקם את הפער, במקרה של תאים HaCaT, התנהגות כזו מרמזת כי מטריצה חוץ-תאית שרידים של הפער להנחות העברה ב- אופנה דומות כמו הדרמיס פצע טבעי.עם זאת, המקור העיקרי של וריאציה נשאר ההליך של גירוד עצמו, כמו השימוש טיפ פלסטיק כדי להפוך את הפצע לא תמיד רינדור הפער גודל זהה. הבחנו וריאציות עד 20% בין מדגמים שונים, עקב חוסר עקביות של לחץ ומעמד של קצה בזמנו של שריטה. וריאציות אלה יכולים להתבצע על ידי ופצעו את טפט עם חפץ יותר נוקשה; עם זאת, שום שריטה על משטח הפלסטיק עשוי לסכן את התנועה החופשית של התאים. אז, וריאציות השריטה הראשוני חייב להילקח בחשבון לחישוב ההעברה; בדרך כלל, על ידי הגדלת מספר מדידות לכל תנאי.
בנוסף כמת, החלת ופצעו הליכים יחד עם שיטות קלאסיות אם יכול להעריך איכותית את התהליכים מולקולרית של נדידת תאים. היכולת של תאי אפיתל כנגד גדלים על coverslips הוא היטב יודע; בעבר, וריאציות של השריטה מבחני תאים מעורב בהעברה על coverslips חשופים למצבים שונים, ואחריו תיקון, צביעת להשוואה הגדרת הניסוי הפצע-גירוד24. הנה, מצאנו כי יצירת פערים monolayers גוברת על coverslips רחב מאפשר להאריך את זמן הניסוי קורסים3,4,7. יתר על כן, בניסויים אלה, אם מגביר יכולות זיהוי של ההליך ללמוד באופן פוטנציאלי ומנגנונים שונים מדויק הסלולר, subcellular מעורב, זה רק מוגבל בשל הזמינות של נוגדנים מתאים טכניקה זו את תאים עניין. דוגמאות על coverslips משמש אם הם רכוב על שקופיות מיקרוסקופ, אשר מאפשרים לשימור המורחבת. זה מסייע היישום של כיוונונים ניסיוני הדורשים תקופות לימוד ארוך, כמו הגישות "ריצוף" הציגה כאן ושם3,4,7. ואילו האסטרטגיה "ריצוף" משתלב המרחבי תבניות נתונים זמני לשחזור את המנגנונים המעורבים בהעברה, היישום של כלי ניתוח תוכנה יכול לספק הערכות כמותיות למחצה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקומיים עוצמה, ולהעשיר עוד יותר את איכות המידע הנקלט. מניסיוננו, ריצוף מציעה גם את האפשרות של הלומדים לפי מיקום התא מידע עבור הביטוי של חלבונים מסוג זה וזמינותו. מידע לפי מיקום זה הוכח להיות קריטי להבין, עדיף לתרגם את ההשפעות של סוכנים שונים על נדידת תאים, בפרט setups איפה המיקום של תאים אפיתל חשובה מאוד לקבוע את אופן הפעולה הנדידה שלו3 ,4,14,15.
בשני הליכים תיאר מדגימים הנוחות הגדולה על ידי יישום מסובכת, כמו גם בהפקת איכות הנתונים. לפיכך, גישות אלה המבוססות על מחקרים מיקרוסקופ, מציעים מסגרת ייחודי ורב עוצמה כדי ללמוד dynamics והן שינויים מורפולוגיים מעורב בהתנהגות התא אפיתל, בתגובה טיפולים במהלך ריפוי פצעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
אנחנו רוצים לתת תודות לחברים ישנים יותר של המעבדה המסייעים לשפר, לשכלל את הטכניקות האלו למצבו בפועל: ד ר סיליה מרטינז-Mora; ד ר אנה Mrowiec, ד ר קטלינה רואיז-Cañada, ד"ר אנטוניה אלקאראז-גארסיה.... . אנחנו חבים החולים Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca לתמיכה בחריפות את הפיתוח של טכניקות אלה. גם אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III, Fondo דה Investigaciones Sanitarias. תוכנית Estatal אני + D + אני ואת אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי-Subdirección גנרל דה Evaluación y מטאליסט de la Investigación (מענק מס: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos פדר "Una בדרך זו דה ש אירופה". אנו מודים גם למד דה מורסיה, IMIB-Arrixaca ו- FFIS עבור מנהלי תמיכה וסיוע. לבסוף, אנחנו רוצים לתת תודה ד ר איזבל Martínez-Argudo, את Facultad עצמה Ambientales y Bioquímica, קמפוס Tecnológico de la Fábrica דה ארמאס, למד קסטיליה לה מנצ'ה, טולדו על תמיכתם סוג של ויתור מרצון מיוחדת וההתערבות והמעבדה ביוטכנולוגיה לעשות אפשרי החלק מצולם של מאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
