Summary
Questo manoscritto descrive come incisione-come le lesioni fatta su monostrati di cellule epiteliali in coltura convenientemente modello ferita curativa in vitro, che consente per l'imaging di confocal o microscopia di esame del laser, e che in grado di fornire alta qualità dati quantitativi e qualitativi per studiare il comportamento delle cellule sia i meccanismi coinvolti nella migrazione.
Abstract
Migrazione delle cellule è un aspetto obbligatorio per la guarigione della ferita. Creazione artificiale ferite su modelli animali di ricerca spesso risultati in costose e complicate procedure sperimentali, mentre potenzialmente manca di precisione. Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce una piattaforma adatta per la ricerca il comportamento migratorio delle cellule nella guarigione delle ferite e l'impatto dei trattamenti su queste cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata in condizioni di non-confluenti; Tuttavia, questo approccio non analoghe condizioni di guarigione naturale. Compromettere l'integrità dell'epitelio con mezzi meccanici genera un modello realistico, ma può ostacolare l'applicazione delle tecniche molecolari. Di conseguenza, tecniche di microscopia di base sono ottimali per lo studio della migrazione delle cellule epiteliali in vitro. Qui dettagliamo due metodi specifici, il dosaggio di gratta e Vinci di ferita artificiale e analisi anteriore della migrazione artificiale, che può ottenere dati quantitativi e qualitativi, rispettivamente, sulle prestazioni migratoria delle cellule epiteliali.
Introduction
Migrazione delle cellule è necessaria per la guarigione delle ferite, come è responsabile per la chiusura definitiva del divario epiteliale e restauro del perturbato superficie1. L'esecuzione di ferite artificiali nei modelli animali consente per la replica di questo complesso processo in vicino a condizioni fisiologiche2. Tuttavia, questo approccio comporta spesso costose e complicate procedure sperimentali, che potenzialmente mancano di precisione per lo studio di processi distinti, a causa della natura complessa del processo di guarigione.
Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce un'utile alternativa ai modelli animali per la ricerca il ruolo che queste cellule svolgono nella guarigione della ferita e gli effetti del trattamento su comportamento migratore delle cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata mediante tecniche molecolari utilizzando colture non-confluenti3,4,5,6; Tuttavia, la rottura dell'integrità dell'epitelio viene solitamente ottenuta da fini incisioni meccaniche. Nella coltura cellulare, questo implica che trascurabile numero di cellule può essere esposti al divario di ferita, e che rappresentano un campione troppo piccolo per tecniche di biologia molecolare. Tuttavia, queste lesioni possono essere studiate su scala microscopica, sfruttando le proprietà innate migratori di alcune linee cellulari epiteliali, come il visone epiteliali del polmone delle cellule (Mv1Lu) o la cella spontaneamente immortalizzate dei cheratinociti umani (HaCaT) linee.
Qui abbiamo descritto un metodo per microscopia che è adatto per ottenere dati quantitativi sulla migrazione delle cellule epiteliali nel contesto della cicatrizzazione3,4,7,8. Inoltre, vi presentiamo ulteriori metodi che sono utili per studiare i cambiamenti qualitativamente morfologiche e molecolari che si verificano su monostrati epiteliali durante la migrazione. Nel complesso, questi metodi forniscono un quadro per studiare la dinamica e il cambiamenti morfologici coinvolti con il comportamento delle cellule epiteliali e la risposta ai trattamenti durante la guarigione della ferita.
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Protocol
1. artificiale ferita Scratch test per studi quantitativi
- Preparazione dello strato monomolecolare delle cellule
- Lavorando in condizioni sterili, di semi e far crescere cellule epiteliali Mv1Lu o HaCaT in matracci di cultura utilizzando medium siero-completato. Aggiornamento media una volta ogni 24-48 h. Dopo le cellule raggiungono 80% confluenza, staccare le cellule utilizzando un metodo appropriato, cioè, trypsinization9.
Nota: Mv1Lu e HaCaT linee cellulari epiteliali sono coltivate utilizzando il terreno di coltura EMEM e DEMEM, rispettivamente, completati con 2 mM L-Glutammina e incubate a 37 ° C con atmosfera controllata di 5% CO2. Ogni linea cellulare deve essere accuratamente analizzato per determinare la concentrazione delle cellule e la tempistica necessaria per raggiungere confluency di completo. In genere per Mv1Lu le cellule HaCaT, 2-4 x 104 o 4-6 x 104 cellule/pozzetto, rispettivamente, sono seminati in un matraccio di cultura di 175 cm2 , e all'80% confluenza rendimenti fino a 35 x 106 Mv1Lu o 1 x 107 cellule di HaCaT. - In entrambi una piastra di coltura 12-pozzetti o 24 pozzetti, semi in ciascun pozzetto 2 mL di cellule. Aggiornare media una volta ogni 24-48 h. Assicurarsi che i numeri delle cellule sono abbastanza in alto per raggiungere la confluenza del 100% dopo 2 o 3 giorni.
- Dopo che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il medium siero-completato e lavare due volte con medium privo di siero fresco. Mantenere le cellule in medium senza siero per 24 h prima il graffio.
Nota: Le cellule Mv1Lu o HaCaT non hanno requisiti substrato speciale; Tuttavia, per linee cellulari sensibili allo scollegamento spontaneamente in circostanze senza siero, pre-rivestimento di superficie della piastra di coltura utilizzando una soluzione di poli-L-lisina dovrebbe essere considerato10.
- Lavorando in condizioni sterili, di semi e far crescere cellule epiteliali Mv1Lu o HaCaT in matracci di cultura utilizzando medium siero-completato. Aggiornamento media una volta ogni 24-48 h. Dopo le cellule raggiungono 80% confluenza, staccare le cellule utilizzando un metodo appropriato, cioè, trypsinization9.
- Monostrato graffiare
- Lavora in un ambiente sterile, scratch il monostrato di cultura trascinando saldamente l'estremità sottile di un 20 µ l o suggerimento di micropipetta sterile µ l 200, a seconda della larghezza desiderata di gratta e Vinci. Tenere la punta perpendicolare alla superficie di cultura per massimizzare l'omogeneità di gap.
- Posizionare le piastre di coltura sopra una superficie scura per monitorare chiaramente strato monomolecolare della cellula. Se necessario, è possibile eseguire due graffi perpendicolare (a forma di croce) su ciascun pozzetto per studiare fino a 4 aree di migrazione.
- Lavare le cellule indipendente rimuovendo delicatamente il terreno di coltura e delicatamente aggiungendo medium privo di siero fresco. Ripetere due volte, o fino a quando non sono state rimosse la maggior parte delle cellule non collegate.
- Lavora in un ambiente sterile, scratch il monostrato di cultura trascinando saldamente l'estremità sottile di un 20 µ l o suggerimento di micropipetta sterile µ l 200, a seconda della larghezza desiderata di gratta e Vinci. Tenere la punta perpendicolare alla superficie di cultura per massimizzare l'omogeneità di gap.
- Raccolta di dati e procedura sperimentale
- Prendere fino a 4 immagini di riferimento pre-trattamento centrati sul divario gratta e Vinci da ogni pozzetto usando un microscopio a contrasto di fase invertita che incorpora una telecamera CCD. Selezionare le aree di interesse allineando il bordo del campo del microscopio fino all'incrocio adiacente di graffi.
Nota: In genere, le immagini vengono acquisite utilizzando un ingrandimento di 10x e una dimensione di immagine di 1.280 x 1.024 pixel. Selezione di aree di interesse come descritto in precedenza aiuta per la facile localizzazione e convalida di fino a 4 misurazioni per pozzetto. - Una volta che tutte le immagini sono acquisite, designare pozzi di trattamento; scambiare il mezzo nei pozzetti con medium fresco che contiene trattamenti selezionati.
Nota: In alternativa, prodotti chimici o di composti che non disturbare omogeneità del terreno di coltura, trattamenti possono essere inoculati direttamente nel terreno di coltura. - Incubare la piastra graffiata (37 ° C con atmosfera controllata che contiene 5% CO2) fino a quando le condizioni di osservazione portata 90% divario gratta e Vinci di chiusura. Evitare la chiusura completa.
Nota: Chiusura totale gap Annulla raccolta foto post-trattamento come aree di riferimento non sono rilevabili e non è possibile stabilire il riferimento temporale per la chiusura del divario. Nel caso di Mv1Lu le cellule HaCaT, 16-19 h sono necessari per raggiungere la confluenza del 90%. - Interrompere la migrazione cellulare fissando le cellule; delicatamente e sostituire il terreno di coltura sperimentale con 1 mL di formalina 4% in PBS. Incubare per 15 minuti a TA.
- Lavare le cellule per rimuovere l'eccesso formalina; sostituire delicatamente la soluzione nei pozzetti con PBS fresco. Ripetere almeno due volte.
Nota: In questa fase, dopo la sigillatura, piastre possono essere memorizzati a 4 ° C a tempo indeterminato. - Prendere le immagini di riferimento post-trattamento dei pozzetti delle aree di riferimento originale catturato dopo graffiare. Utilizzare la stessa attrezzatura (microscopio a contrasto di fase ottico invertito che incorpora una telecamera CCD) e corrispondenti impostazioni immagine (ingrandimento e risoluzione digitale/densità).
Nota: Per le cellule che migrano singolarmente e colmare il divario indipendentemente dalla formazione di un fronte coerente (ad es., cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231), le immagini di corso di tempo possono permettere il calcolo della velocità di migrazione delle cellule individuali.
- Prendere fino a 4 immagini di riferimento pre-trattamento centrati sul divario gratta e Vinci da ogni pozzetto usando un microscopio a contrasto di fase invertita che incorpora una telecamera CCD. Selezionare le aree di interesse allineando il bordo del campo del microscopio fino all'incrocio adiacente di graffi.
- Analisi dell'immagine e la quantificazione delle migrazioni
- Utilizzando software (ad es., ImageJ) elaborazione delle immagini, definire i limiti del divario di gratta e Vinci e determinare la superficie di gap per fino a quattro misure in immagini di pre-trattamento. Registrare i dati come "superficie di pre-trattamento gap" (PREGAP). Ripetere la stessa procedura per le immagini di post-trattamento. Registrare i dati come "superficie di post-trattamento gap" (POSTGAP).
- Aprire l'immagine registrata usando ImageJ. Nel menu "immagine", impostare il tipo di immagine a 8 bit. Nel menu "processo", vai al sottomenu di "filtri" e applicare il filtro "varianza".
- Nel menu "immagine", immettere "regolare" sottomenu e soglia impostata in bianco e nero (B & W), assicurarsi che "Dark background" non è selezionata. Nel menu "processo", accedere al sottomenù "binario" e selezionare "riempire i buchi".
- Nel menu "analizzare", selezionare "set di misure" e attivare "area". Quindi disegnare l'area misurabile seguendo il profilo di bordo migrazione così che delimita il divario.
- Nel menu "analizzare", seleziona "analizza le particelle" e registrare valori di "superficie totale" per la superficie di area disegnata.
- Introdurre i valori di area totale PREGAP e POSTGAP in un foglio di calcolo per quantificare la migrazione assoluta per ogni set di campioni individuali come la differenza di misure superficie gap: PREGAP − POSTGAP [unità arbitrarie]. Inoltre, normalizzare i dati migrazione assoluta di ciascuna condizione di campioni di controllo: (campione / controllo) * 100 [%].
Nota: Per le cellule che migrano singolarmente e colmare il divario indipendentemente dalla formazione di un fronte coerente, (ad es., cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231), la migrazione assoluta può essere calcolata contando le cellule che invadono una centrale striscia sia in il controllo o i campioni trattati. - Trama quantificazione uscite (Vedi Figura 1). Se necessario, effettuare analisi statistiche.
- Utilizzando software (ad es., ImageJ) elaborazione delle immagini, definire i limiti del divario di gratta e Vinci e determinare la superficie di gap per fino a quattro misure in immagini di pre-trattamento. Registrare i dati come "superficie di pre-trattamento gap" (PREGAP). Ripetere la stessa procedura per le immagini di post-trattamento. Registrare i dati come "superficie di post-trattamento gap" (POSTGAP).
2. artificiale migrazione anteriore analisi per studi topografici
- Preparazione dello strato monomolecolare delle cellule
- Posto di lavoro in condizioni sterili, uno strato di lamelle rotonde sterilizzate in piastre di coltura vuoto fino a coperta completamente la superficie della piastra.
Nota: Fino a 12 e 33 coprioggetti montare su 5 cm e 10 cm Diametro piastre, rispettivamente. - Sulla piastra di coltura, delicatamente seme un adeguato volume di cellule ad una concentrazione che consente il 100% confluenza dopo 2 o 3 giorni. Assicurarsi che nessun vetrino coprioggetti si sovrappone coprioggetti vicini e impedire che coprioggetti galleggianti applicando pressione delicata con una punta di una micropipetta sterile. Aggiornare il mezzo ogni 24-48 h.
Nota: Ogni linea cellulare dovrà essere analizzato accuratamente per determinare la concentrazione delle cellule e la tempistica necessaria per raggiungere confluency di completo. In genere per Mv1Lu le cellule HaCaT, 2-3 x 106 o 2.5-4 x 10 piastra6 cellule/10 cm di diametro, rispettivamente, sono seminati. Per piatti più piccoli, numeri di cellulare devono essere ridimensionati. - Dopo che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il medium siero-completato e sostituirli con medium privo di siero fresco. Mantenere le cellule in medium senza siero per 24 h prima che venga eseguita la ferita artificiale.
Nota: Le cellule Mv1Lu o HaCaT non hanno requisiti substrato speciale; Tuttavia, per linee cellulari suscettibili di scollegamento spontaneamente in circostanze senza siero, pre-rivestimento della superficie cultura utilizzando una soluzione di poli-L-lisina dovrebbe essere considerato10.
- Posto di lavoro in condizioni sterili, uno strato di lamelle rotonde sterilizzate in piastre di coltura vuoto fino a coperta completamente la superficie della piastra.
- Ferendo monostrato
- Con pinzette sterili, spostare delicatamente un vetrino coprioggetto un piatto pulito 10 cm contenente terreno privo di siero fresco. Evitare di danneggiare il monostrato tenendo il vetrino coprioggetto alla periferia con una pinzetta. Evitare una pressione eccessiva che potrebbe causarne la rottura del vetrino coprioggetti.
- Creare ferite artificiali trascinando una lama di rasoio sterilizzata in una linea trasversale sopra il centro di lamelle. Trascina avanti e indietro, 3-4 mm al fine di rimuovere completamente la striscia centrale dello strato monomolecolare. Assicurarsi che nessun detriti cellulari rimangono attaccata ai bordi feriti.
Nota: su un diametro di 12 mm tondo vetrino coprioggetti, l'incisione è fatta presso la metà del coprivetrino. Assicurarsi di lasciare una striscia di cellule di fronte alla facciata principale abbastanza grande (almeno 2 mm di larghezza) per evitare il ribaltamento del coprivetrino nei passaggi seguenti. - Trasferimento coprioggetti feriti con le cellule rivolto verso l'alto, per un pulito 6 pozzetti contenenti almeno 2 mL fresco medium senza siero. Montare fino a 4 lamelle/pozzetto feriti.
- Lavare delicatamente due volte utilizzando prodotti freschi medium senza siero per rimuovere le cellule indipendente.
- Campionamento e procedura sperimentale
- Delicatamente e scambiare il mezzo nei pozzetti con medium fresco che contiene trattamenti selezionati.
Nota: In alternativa, prodotti chimici o di composti che non disturbare omogeneità del terreno di coltura, trattamenti possono essere inoculati direttamente nel terreno di coltura. Procedere con cautela per evitare qualsiasi potenziale distacco cellulare. - Tenere la piastra all'interno di un'incubatrice di cellulare (37 ° C, 5% CO2) per l'intervallo di tempo desiderato sperimentale.
- Interrompere la migrazione cellulare fissando le cellule; delicatamente e sostituire il terreno di coltura sperimentale con 1 mL di formalina 4% in PBS. Incubare per 15 minuti a TA.
Nota: Per ora corso esperimenti, rimuovere i campioni dalla piastra di coltura e fissarli in una piastra separata per evitare vapori di formalina che interessano le condizioni sperimentali di altre, in corso. - Lavare le cellule per rimuovere l'eccesso formalina; sostituire delicatamente la soluzione nei pozzetti con PBS fresco. Ripetere almeno due volte.
Nota: In questa fase, dopo la sigillatura, piastre possono essere memorizzati a 4 ° C a tempo indeterminato.
- Delicatamente e scambiare il mezzo nei pozzetti con medium fresco che contiene trattamenti selezionati.
- Immunofluorescenza (IF) e analisi topologica
- Eseguire se macchiatura e imaging su vetrini coprioggetti individuali come descritto altrove3,4,11.
- Permeabilize per 10 min immergendo le lamelle in una soluzione di Triton X-100 0,3% in PBS.
- Blocco per 30 min, utilizzando la seguente soluzione bloccante: 0,3% albumina di siero bovino; 10% di siero fetale bovino; 5% di latte scremato; 0,3 soluzione di Triton X-100% in PBS.
Nota: Soluzione senza latte di blocco può essere preparato in anticipo e conservato a-20 ° C. - Incubare per 1 h a temperatura ambiente all'interno di una camera umida, con l'anticorpo primario diluito in latte-libera soluzione bloccante. Posizionare i vetrini coprioggetti capovolto, nel 15 µ l di soluzione di anticorpo per assicurare la corretta distribuzione.
Nota: La diluizione di lavoro dell'anticorpo è variabile e dipende l'anticorpo in uso. Ad esempio, l'anticorpo di coniglio anti-c-Jun richiede una diluizione 1/100. - Lavare tre volte immergendo i coprioggetti in una soluzione di Triton X-100 in 0,1% in PBS.
- Incubare i vetrini coprioggetti in anticorpo secondario diluito in tampone bloccante senza latte per 30 min.
Nota: La diluizione di lavoro dell'anticorpo è variabile e dipende l'anticorpo in uso. Ad esempio, la capra-anti-Rabbit (488) richiede una diluizione di 1/400 per risoluzione ottimale. Altri reagenti d'etichettatura come falloidina e Hoechst 33258 possono essere aggiunti al buffer di incubazione in questa fase. - Lavare tre volte immergendo i coprioggetti in soluzione di Triton X-100 0,1% in PBS.
- Montare i vetrini coprioggetti capovolto in un 10 µ l montaggio supporti goccia (ad es., Vectashield) posto su un vetrino da microscopio. Lasciare le diapositive al buio a temperatura ambiente durante la notte per l'indurimento di medie di montaggio. In seguito, di conservare a 4 ° C al buio a tempo indeterminato.
- Ottenere epifluorescenza o immagini di microscopia confocal di cambiamenti strutturali che si verificano al bordo anteriore la migrazione.
Nota: Studi topologici possono essere eseguiti da affiancamento immagini dalla parte anteriore la migrazione per l'interno dello strato monomolecolare. Gli studi semi-quantitativi sono possibili mediante analisi di software basato sulle intensità di fluorescenza locale.
- Eseguire se macchiatura e imaging su vetrini coprioggetti individuali come descritto altrove3,4,11.
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Representative Results
Il dosaggio zero ferita artificiale per studi quantitativi: valutazione del fattore di crescita epidermico (EGF) Promozione della migrazione:
L'EGF è un ben noto induttore della proliferazione di cellule epiteliali e migrazione e così un controllo positivo per quantificare la promozione di migrazione. Monostrati di cellule umane Mv1Lu e HaCaT sono stati utilizzati nelle analisi gratta e Vinci della ferita e immagini di pre-trattamento sono stati ottenuti. Dopo l'inoculazione con 10 ng/mL EGF, le cellule sono state incubate per 19h prima fissazione e immagini di post-trattamento. Proliferazione è stato mantenuto al minimo mantenendo condizioni di inedia del siero. Set pre- e post-trattamento delle immagini sono stati analizzati usando ImageJ e le aree di lacuna centrale sono state determinate. L'esperimento è stato eseguito in duplice copia, registrazione di quattro misure per ciascun pozzetto. Quantificazione della migrazione assoluta è stato calcolato come la differenza delle superfici: (PREGAP − POSTGAP). C'era un maggiore potenziale migratorio nelle cellule stimolate Mv1Lu (Figura 1A) rispetto alle cellule HaCaT stimolate (Figura 1B). Le differenze si spiegano con le fonti di cellule, essendo mucosa cellule epiteliali e pelle keratinocytes, rispettivamente.
Il saggio su migrazione artificiale per studi topografici: variazioni nella conformazione del citoscheletro ed espressione spaziale di C-Jun:
Migrazione delle cellule comporta continui e profondi cambiamenti della struttura citoscheletro al fine di sostenere lo spostamento delle cellule. Monostrati di cellule HaCaT sono stati utilizzati nelle analisi migrazione anteriore in condizioni di controllo e stimolazione. Trattamento con EGF rafforza la dinamica del citoscheletro, che vengono osservata da IF e laser microscopia (LSM; Figura 2A). Trattamento di EGF provoca anche robusta chinasi di proteina mitogen (mappa) segnalazione e iperespressione di c-JUN. Affiancamento immagini LSM consente la configurazione di modelli spaziali. Aumentata espressione di c-JUN alle celle adiacenti alla parte anteriore la migrazione può essere facilmente rivelato da software di analisi di immagine; qui, abbiamo implementato una scala di arcobaleno per il canale verde, che corrisponde alla c-JUN etichettatura (Figura 2B).
Figura 1. Promozione della migrazione da EGF in cellule Mv1Lu e HaCaT. Immagini di microscopia di contrasto di fase della zona ferita di Mv1Lu (A) e le cellule HaCaT (B) sono state scattate in condizioni di controllo e rispetto alle immagini di cellule trattate con 10 ng/mL EGF per 19 h in circostanze senza siero. Rappresentante micrografie mostrano l'entità del divario di gratta e Vinci e chiusura ottenuta dopo la ferita con una punta di una micropipetta 20 µ l. Ingrandimento = 10x; Barra della scala = 100 µm. Cell migrazione è stato quantificato e rappresentato come variazione delle differenze zona tra trattamenti e campioni di controllo per ogni dosaggio (unità arbitrarie; AU). La trama è rappresentante di otto misure indipendenti per ogni condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Filamenti di actina e cambiamenti di espressione di c-JUN, promossi da EGF in cellule HaCaT migranti. (A) durante la notte 10 ng/mL EGF trattamento promuove cambiamenti profondi nella conformazione dei filamenti dell'actina in cellule HaCaT migranti. Le cellule nella parte anteriore di migrazione delle condizioni di controllo ritrarre un citoscheletro di filamenti di actina strettamente strutturato, mentre le cellule trattate con EGF Visualizza organizzazione di filamenti di actina poveri nella parte anteriore di migrazione. Ingrandimento = 63 x; Barra della scala = 20 µm. F-actina è rosso con codifica a colori, e Hoechst è rappresentato da un colore blu. (B) quando immuno-fluorescenza è usato in combinazione con LSM imaging per lo studio di espressione di c-JUN dopo il trattamento di 10 ng/mL EGF su migrazione delle cellule di HaCaT, composizioni di piastrelle rivelano modelli di espressione spaziale. Immagini di fluorescenza di c-Jun (verde) sono stati convertiti in pseudo-colore per mostrare l'intensità della colorazione di c-Jun. La scala dei colori arcobaleno rappresenta l'intensità di fluorescenza per c-Jun, corrispondenti a ColorMap sui pannelli di destra per EGF e controllo. Co-macchiatura con falloidina (rosso) e Hoechst-33258 (blu) è stata utilizzata per mostrare la struttura delle cellule e dei nuclei, rispettivamente. Immagini sono state scattate da un microscopio confocale. Nota i crescenti livelli di espressione di c-Jun nucleare nelle aree in fase di migrazione davanti. Barra della scala = 40 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Alla pelle o rottura della membrana mucosa, la funzione della barriera viene ripristinata dalle azioni di numerosi tipi di cellule, tra cui fibroblasti o cellule epiteliali ed immuni. Congiuntamente, queste cellule subiscono un complesso processo che coinvolge l'apoptosi, proliferazione, differenziazione e soprattutto, dei fibroblasti ed epiteliale delle cellule migrazione, che è il meccanismo ultimo responsabile per il restauro del tessuto perturbato e la chiusura del divario epiteliale superficiale1,12 in tal senso, studiare la migrazione delle cellule aiuta a descrivere precisamente il comportamento fisiologico delle cellule epiteliali, mentre anche determinazione del potenziale modulatory dei trattamenti per la ferita guarigione.
L'esecuzione di ferite artificiali su modelli animali di ricerca differenti consente per la replica di questo complesso processo in vicino a condizioni fisiologiche2e quindi la valutazione di alcune condizioni patologiche o gli effetti di prodotti farmaceutici trattamenti13. Tuttavia, questo approccio comporta spesso costosa e complicata logistica, come pure le onerose procedure sperimentali che potrebbero generare dati in un modo in ritardo di13. Al contrario, in vitro coltura cellulare fornisce un quadro più conveniente per la ricerca il comportamento delle cellule coinvolte nel processo di guarigione arrotolato. Mentre la coltura delle cellule primarie di cellule epiteliali costituisce una valida opzione, può essere difficile da ottenere e gestire le cellule, che possono complicare la raccolta dei dati. Per esempio, oltre la restrizione bassa-passaggio tipica delle culture primarie, keratinocytes umani primari bisogno un fibroblasto alimentazione strato per la crescita in vitro3. Al contrario, linee di cultura consolidata delle cellule epiteliali, come Mv1Lu o HaCaT, costituiscono un modello di ricerca privo di ostacolo che caratteristiche comportamento e caratteristiche come quelle in coltura primaria celle3,4, 14,15. Precisamente, per lo studio della guarigione delle ferite, queste linee due cellulari mantengono tratti critici nella loro capacità di migrare e fermare la proliferazione a causa di inibizione da contatto cellula--cellula su confluenza16,17.
Saggi di gratta e Vinci sono un metodo affidabile e versatile per quantificare le capacità migratorie di tipi differenti delle cellule, soprattutto epiteliali e le cellule tumorali. Per il caso delle cellule tumorali, il metodo gratta e Vinci è stato proposto per la valutazione del potenziale dilagante. Tuttavia, questo approccio falls breve come un indicatore per l'invasività rispetto ai metodi più specifici basandosi sull'espressione di metalloproteasi necessari per penetrare la matrice extracellulare18,19. Al contrario, saggi di gratta e Vinci sono affidabili per valutare le prestazioni migratoria delle cellule epiteliali e l'effetto dei trattamenti differenti su questo tratto. In contrasto con linee di cellule di cancro, che mostrano spesso scarsa coesione e la capacità di crescere su diversi strati, Mv1Lu, HaCaT e altre cellule epiteliali linee forma strettamente connessa "crescita isole", che si espandono i loro margini in un processo a seconda sia proliferazione, ma più d'importanza in migrazione cellulare. Di conseguenza, condizioni di densità delle cellule sparse o Sub-confluenti sono convenzionalmente utilizzate per studiare gli effetti dei diversi trattamenti sulla fisiologia migratoria; soprattutto quando vengono applicate tecniche di biologia molecolare successive, come questa cella ambiente minimizza l'inibizione del contatto mentre massimizzando il rapporto di attivamente la migrazione di cellule. Tuttavia, per le cellule epiteliali, non-confluenti condizioni comportano il rischio di escluse importanti influenze di inibizione da contatto pre-esistenti, per esempio sotto forma di regolazione epigenetica. Così, per studiare la guarigione della ferita, confluenti condizioni conferiscono una maggiore fedeltà del modello.
Per ottenere stime precise, fattori concomitanti che interessano la conformazione dello strato delle cellule epiteliali o contribuendo alla migrazione dovrebbero essere affrontati. Mentre la confluenza è desiderato, è importante evitare densità eccessiva delle cellule o multistrate culture, poiché queste condizioni possono influenzare negativamente. Di conseguenza, proliferazione è comunemente controllata da inedia in media senza siero o con l'aggiunta di sostanze chimiche come la mitomicina C, che irreversibilmente arrestare la proliferazione delle cellule di DNA reticolazione3,20, 21. l'uso di uno o l'altro si basa sul comportamento delle linee cellulari specifiche; Mitomicina C è particolarmente indicato quando ridotto il completamento del siero è necessaria per evitare il distacco massiccia delle cellule. Che è il caso per le cellule HEK 293T, dove pre-rivestimento della superficie di cultura utilizzando poli-L-lisina è una buona opzione per evitare il trattamento Mytomycin C. Anche il rilascio di fattori infiammatori che potrebbero alterare la migrazione deve essere affrontato. Diverse strategie sono state utilizzate, basata principalmente su inserti in silicone per simulare la rottura della superficie epiteliale ottenuta con il dosaggio zero22. Mentre inserti generano lacune preesistenti che consentono la migrazione delle cellule dopo aver tolto il pezzo di silicone, il metodo gratta e Vinci si basa direttamente sulla rimozione di alcune del monolayer epiteliale per generare il divario. Preferenza su come generare il divario si basa sulla capacità degli inserti per proteggere il rivestimento di superficie della cultura (vale a dire, la piastra di coltura o poli-L-lisina) da danni durante lo scratch, anche riducendo al minimo il rilascio di fattori da cellule danneggiate che possono compromettere il comportamento di cultura cellulare23. Anche se queste caratteristiche potrebbero essere utile per alcune impostazioni sperimentali, cioè, valutare la capacità delle cellule tumorali di migrare, nella nostra esperienza abbiamo trovato svantaggi significativi per l'utilizzo di inserti in studi di cicatrizzazione. Le cellule Mv1Lu sono in grado di associare per la superficie esterna di inserto in silicone, che si traduce in involontariamente lo strappo di strato monomolecolare della cellula durante la rimozione dei pezzi in silicone. Inoltre, sebbene le cellule HaCaT non si associa al silicone, abbiamo trovato una diminuita capacità di queste cellule di migrare negli spazi vuoti generati da inserire. A quella misura, infiammazione e migrazione sono risposte strettamente associate, e questi sembrano essere critici insieme nel contesto della guarigione della ferita in cellule HaCaT. Inoltre, poiché l'applicazione di una punta in plastica per graffiare la superficie di cultura non ha alcuna conseguenza apparente sulla capacità delle cellule di ripopolare il divario, nel caso di cellule HaCaT, tale comportamento suggerisce che i resti di matrice extracellulare nel divario possono guida migrazione in un modo simile come derma in una ferita naturale.Tuttavia, la principale fonte di variazione rimane la procedura graffia se stesso, come l'uso di punte in plastica per rendere la ferita non esegue il rendering sempre lo stesso spazio di dimensione. Abbiamo osservato variazioni fino al 20% tra diversi campioni, a causa di incoerenza della pressione e la posizione della punta al momento della graffiatura. Queste variazioni possono essere affrontate da ferendo il monostrato con un oggetto più rigido; Tuttavia, qualsiasi graffio sulla superficie di plastica metterebbe a repentaglio la libera circolazione delle cellule. Quindi, variazioni nel graffio iniziale devono tenere in considerazione per calcolare la migrazione; in genere, aumentando il numero di misurazione a condizione.
Oltre alla quantificazione, applicando procedure ferentesi insieme con tecniche classiche se può valutare qualitativamente i processi molecolari della migrazione cellulare. La capacità delle cellule epiteliali di crescere sulle lamelle è noto; in passato, variazioni dello scratch test cellule coinvolte la migrazione sulle lamelle esposte a condizioni diverse, seguite da fissazione e colorazione per il confronto all'interno del setup sperimentale ferita-zero24. Qui, abbiamo trovato che creando ampie lacune negli strati monomolecolari della crescita sulle lamelle permette di estendere il tempo sperimentale corsi3,4,7. Inoltre, in questi esperimenti, se aumenta le capacità di rilevamento della procedura per studiare potenzialmente qualsiasi precisi meccanismi cellulari e subcellulari coinvolti, ed è solo limitata dalla disponibilità di anticorpi adatti a questa tecnica e la celle di interesse. Campioni sulle lamelle utilizzate per se sono montati su vetrini da microscopio, che consentono di conservazione esteso. Questo aiuta l'applicazione delle messe a punto sperimentali che richiedono periodi di studio lungo, come gli approcci di "affiancamento" presentato qui e altrove3,4,7. Mentre la strategia di "affiancamento" integra modelli spaziali con dati cronologici per ricostruire i meccanismi coinvolti nella migrazione, l'implementazione di strumenti di analisi del software può fornire valutazioni semi-quantitativa basate sulla fluorescenza locale intensità e arricchire ulteriormente la qualità delle informazioni ottenute. Nella nostra esperienza, piastrellatura offre anche la possibilità di studiare informazioni posizionali in cella per l'espressione delle proteine in questo tipo di analisi. Queste informazioni posizionali ha dimostrate di essere fondamentale per capire e tradurre meglio gli effetti di diversi agenti sulla migrazione cellulare, specialmente nelle configurazioni dove la posizione delle cellule epiteliali è molto importante per determinare il suo comportamento migratore3 ,4,14,15.
Entrambe le procedure descritte dimostrano grande convenienza di semplice attuazione, nonché a produrre dati di qualità. Così, questi approcci basati su studi di microscopia, offrono un quadro unico e potente per studiare la dinamica e il cambiamenti morfologici coinvolti nel comportamento delle cellule epiteliali e risposta ai trattamenti durante la guarigione delle ferite.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Vogliamo ringraziare i membri più anziani del laboratorio che aiutano a migliorare e perfezionare queste tecniche allo stato effettivo: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada e Dr. Antonia Alcaraz-García. Siamo in debito con l'Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca per sostenere fortemente lo sviluppo di queste tecniche. Anche l'Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Piano Estatal I + D + io e Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (n. Grant: PI13/00794); www.ISCIII.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Ringraziamo anche Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca e FFI per assistenza e supporto amministrativo. Infine, vogliamo dare un ringraziamento speciale Dr. Isabel Martínez-Argudo e la Facultad de Ciencias y Ambientales Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo per il loro supporto gentile in volentieri cedendo il Biomedicina e biotecnologie laboratorio per rendere possibile la parte filmata di questa carta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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