Summary
Denne oppgaven beskriver hvordan snitt-lignende lesjoner på kulturperler tarmepitelet monolayers praktisk modell sår helbredelse i vitro, muliggjør bildebehandling av AC confocal eller laser skanning mikroskopi, og som kan gi høy kvalitet kvantitative og kvalitative data for å studere både celle atferd og mekanismene som er involvert i migrasjon.
Abstract
Celle migrasjon er en obligatorisk del for sårtilheling. Lage kunstige sår på forskning dyremodeller resulterer ofte i kostbart og komplisert eksperimentelle prosedyrer, mens potensielt mangler i presisjon. In vitro kultur epithelial cellelinjer gir en passende plattform for forskning celle vandrende virkemåten sårheling og virkningen av behandlinger på disse cellene. Fysiologi av epitelceller er ofte studert i ikke-confluent forhold; men kan denne tilnærmingen ikke ligner naturlig sårheling forhold. Forstyrre epitel integriteten av mekaniske midler genererer en realistisk modell, men kan hindre bruk av molekylære teknikker. Følgelig mikroskopi basert teknikker er optimal for å studere epithelial celle migrasjon i vitro. Her detalj vi to bestemte metoder, kunstige såret scratch analysen og kunstig migrasjon foran analysen, som kan få kvantitative og kvalitative data, henholdsvis på vandrende resultatene av epitelceller.
Introduction
Celle migrasjon er nødvendige for sårheling, som er ansvarlig for endelig nedleggelsen av epitelial gapet og restaurering av forstyrret overflaten1. Utføre kunstig sår i dyremodeller tillater replikering av denne komplekse prosessen i nær fysiologiske forhold2. Men resulterer denne tilnærmingen ofte i kostbare og komplisert eksperimentelle prosedyrer, som potensielt mangler presisjon for studier av ulike prosesser, på grunn av intrikate natur sårhelende prosessen.
In vitro kultur epithelial cellelinjer gir et nyttig alternativ til dyr modeller for forskning rollen som disse cellene spille sårheling og effekten av behandling på cellen vandrende atferd. Fysiologi av epitelceller er ofte studert av molekylære teknikker bruker ikke-confluent kulturer3,4,5,6; Imidlertid er avbrudd i epitel integritet vanligvis oppnås ved fine mekanisk snitt. I cellekultur innebærer dette at ubetydelig antall celler kan bli utsatt for såret gapet, og de representerer et for lite utvalg for molekylærbiologi teknikker. Men kan disse lesjoner studeres på mikroskopisk skalaen, utnytter den medfødte vandrende egenskaper noen epithelial cellelinjer som Mink lunge Epithelial cellen (Mv1Lu) eller spontant udødeliggjort menneskelige keratinocyte (HaCaT) cellen linjer.
Her beskrev vi en metode for mikroskopi som passer å få kvantitative data om migrasjon av epitelceller i sammenheng med sårheling3,4,7,8. Dessuten, presenterer vi flere metoder som er nyttig å studere kvalitativt molekylære og morfologiske omveltningene på epithelial monolayers under overføringen. Samlet gir disse metodene en ramme for å studere både dynamikk og morfologiske endringer med tarmepitelet atferd og svar på behandlinger under sårtilheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kunstig såret Scratch analysen for kvantitative studier
- Celle monolayer forberedelse
- Arbeid under sterile forhold, frø og vokse Mv1Lu eller HaCaT epitelceller i kultur kolber ved hjelp av serum-supplert medium. Oppdater medium én gang hver 24-48 h. Når celler når 80% samløpet, koble celler ved hjelp av en passende metode, dvs, trypsinization9.
Merk: Mv1Lu og HaCaT epitel cellelinjer er kultivert bruker EMEM og DEMEM kultur medium, henholdsvis, supplert med 2 mM L-glutamin, og inkubert på 37 ° C med en kontrollert atmosfære av 5% CO2. Hver celle linje må være assayed grundig for å fastslå celle konsentrasjon og timing kreves for å nå full confluency. Vanligvis for Mv1Lu eller HaCaT celler, 2-4 x 104 eller 4-6 x 104 celler/Vel, henholdsvis, er seeded i en 175 cm2 kultur kolbe, og 80% samløpet gir opptil 35 x 106 Mv1Lu eller 1 x 107 HaCaT celler. - I enten en 12-godt eller 24-vel kultur plate, frø i hver brønn 2 mL av celler. Oppdater medium når hver 24-48 h. Kontroller cellen tallene er høy nok til å nå 100% samløpet etter 2 eller 3 dager.
- Når cellene når samløpet, fjerne serum-supplert mediet og vask to ganger med frisk serum-free medium. Holde celler i serum-free medium for 24 timer før den riper.
Merk: Mv1Lu eller HaCaT ikke har spesielle substrat krav; men for cellelinjer utsatt for frakobling spontant i serum-free forhold, anses før belegget på kultur plate overflaten med en poly-L-lysine løsning10.
- Arbeid under sterile forhold, frø og vokse Mv1Lu eller HaCaT epitelceller i kultur kolber ved hjelp av serum-supplert medium. Oppdater medium én gang hver 24-48 h. Når celler når 80% samløpet, koble celler ved hjelp av en passende metode, dvs, trypsinization9.
- Monolayer riper
- Arbeid i et sterilt miljø, skrap kultur monolayer ved å dra fast smale slutten av en 20 µL eller 200 µL sterilt brønnene tips, avhengig av ønsket scratch bredde. Hold spissen vinkelrett på kultur overflaten å maksimere gapet homogenitet.
- Plass kultur platene over en mørk overflate tydelig overvåke celle monolayer. Eventuelt kan du utføre to vinkelrett riper (korsformede) på hver brønn å studere opptil 4 migrasjon områder.
- Vask frittliggende celler ved å forsiktig fjerne kultur medium og forsiktig legge frisk serum-free medium. Gjenta to ganger, eller til de fleste ledige celler er fjernet.
- Arbeid i et sterilt miljø, skrap kultur monolayer ved å dra fast smale slutten av en 20 µL eller 200 µL sterilt brønnene tips, avhengig av ønsket scratch bredde. Hold spissen vinkelrett på kultur overflaten å maksimere gapet homogenitet.
- Eksperimentelle prosedyren og datainnsamling
- Ta opptil 4 forbehandling referanse bilder sentrert på scratch gapet fra hver brønn ved å en invertert kontrast mikroskop omfatter en CCD kamera. Velg interesseområder ved å justere kanten av mikroskopet feltet til tilstøtende skjæringspunktet for riper.
Merk: Vanligvis bilder er ervervet ved hjelp av en 10 x forstørrelse og en 1280 x 1024 piksler bildestørrelse. Velge interesseområder som beskrevet ovenfor hjelper for lett lokalisering og validering av opptil 4 mål per brønn. - Når alle bildene er ervervet, angi behandling brønner; utveksle mediet i brønnene med fersk medium som inneholder utvalgte behandlinger.
Merk: Alternativt kjemikalier eller forbindelser som ikke forstyrr kultur medium homogenitet, behandlinger kan være inokulert direkte til kultur medium. - Inkuber ripete plate (37 ° C med en kontrollert atmosfære som inneholder 5% CO2) til vilkårene observasjon nå 90% scratch gapet nedleggelse. Unngå full nedleggelse.
Merk: Total gapet nedleggelse nullifies etter behandling bildesamlingen referanse områder gjenkjennes ikke og tid referansen gapet-avsluttende kan ikke opprettes. Ved Mv1Lu eller HaCaT celler må 16-19 h nå 90% samløpet. - Stoppe celle migrasjon ved å feste cellene, forsiktig erstatte eksperimentelle kultur medium med 1 mL av 4% formalin i PBS. Inkuber i 15 min på RT.
- Vask cellene for å fjerne overflødig formalin; forsiktig erstatte løsningen i brønnene med fersk PBS. Gjenta minst to ganger.
Merk: På dette stadiet, etter forseglet, plater kan lagres på 4 ° C på ubestemt tid. - Ta etter behandling referanse bilder av hver brønn fra de opprinnelige referanse områdene fanget etter riper. Bruk samme utstyret (invertert optisk kontrast mikroskop omfatter en CCD kamera) og matchende bildeinnstillingene (forstørrelse og digital oppløsning/tetthet).
Merk: For celler som migrerer individuelt og fylle gapet uavhengig dannelsen av en sammenhengende front (f.eks, MDA-MB-231 brystkreft menneskelige celler), tid-retters bildene kan tillate beregningen av enkeltcelle overføringen hastigheter.
- Ta opptil 4 forbehandling referanse bilder sentrert på scratch gapet fra hver brønn ved å en invertert kontrast mikroskop omfatter en CCD kamera. Velg interesseområder ved å justere kanten av mikroskopet feltet til tilstøtende skjæringspunktet for riper.
- Bildeanalyse og måling av migrasjon
- Bruke bildebehandling programvare (f.eksImageJ), definere scratch gapet grenser og bestemme gapet overflaten for opptil fire mål i forbehandling bilder. Registrere data som "pre-behandling gapet overflaten" (PREGAP). Gjenta samme for post-behandling bilder. Registrere data som "etter behandling gapet overflaten" (POSTGAP).
- Åpne innspilte bildet med ImageJ. I "image"-menyen, angi bildetype til 8-biters. I "process"-menyen, gå til "filtre" undermenyen og bruke "avvik" filtrering.
- I "image"-menyen, angi "Juster" undermenyen og angi terskelen til svart-hvitt (B & W), kontroller "Mørk bakgrunn" ikke er valgt. Gå til "binær" undermenyen i "process"-menyen, og velg "fylle hull".
- I "analysere"-menyen, velge "sette mål" og aktivere "området". Deretter tegn målbare området etter overføring kanten konturen dermed som avgrenser gapet.
- I "analysere"-menyen, velg "analysere partikler" og registrere "totale området" verdier for tegnede området overflaten.
- Introdusere PREGAP og POSTGAP areal verdier i et regneark å kvantifisere absolutt migrasjon for hvert sett med personlige prøver som differansen av gapet overflaten målinger: PREGAP − POSTGAP [vilkårlig enheter. I tillegg normalisere absolutt migrasjon data for hver tilstand å kontroll eksempler: (prøve / kontrollerer) * 100 [%].
Merk: For celler som migrerer individuelt og fylle gapet uavhengig dannelsen av en sammenhengende front (f.eks, MDA-MB-231 brystkreft menneskelige celler),-absolutt overføringen, kan beregnes ved å telle celler invadere en sentral stripe i kontrollen eller behandlet prøvene. - Tegne kvantifisering utganger (se figur 1). Utføre statistisk analyse om nødvendig.
- Bruke bildebehandling programvare (f.eksImageJ), definere scratch gapet grenser og bestemme gapet overflaten for opptil fire mål i forbehandling bilder. Registrere data som "pre-behandling gapet overflaten" (PREGAP). Gjenta samme for post-behandling bilder. Registrere data som "etter behandling gapet overflaten" (POSTGAP).
2. kunstig migrasjon foran analysen for topografiske studier
- Celle monolayer forberedelse
- Arbeider i sterile forhold, plasser ett lag sterilisert runde coverslips i tomme kultur plater til platens overflaten er helt dekket.
Merk: Opptil 12 og 33 coverslips plass på 5 cm og 10 cm diameter plater, henholdsvis. - På kultur plate, forsiktig frø en tilstrekkelig mengde celler i en konsentrasjon som gir 100% samløpet etter 2 eller 3 dager. Kontroller at ingen dekkglassvæske overlapper nærliggende coverslips og hindre coverslips fra flytende ved å bruke lett trykk med sterilt brønnene tips. Oppdater medium hver 24-48 h.
Merk: Hver celle linje må være assayed grundig for å fastslå celle konsentrasjon og timing kreves for å nå full confluency. Vanligvis for Mv1Lu eller HaCaT celler, er 2-3 x 106 eller 2,5-4 x 106 celler/10 cm diameter plate, henholdsvis, seeded. For mindre plater, må cellen tallene skaleres. - Når cellene når samløpet, fjerne serum-supplert mediet og erstatte med fersk serum-free medium. Holde cellene i serum-free medium for 24 timer før kunstig såret utføres.
Merk: Mv1Lu eller HaCaT ikke har spesielle substrat krav; men for cellelinjer mottakelig for frakobling spontant i serum-free forhold, anses før belegget på kultur overflaten med en poly-L-lysine løsning10.
- Arbeider i sterile forhold, plasser ett lag sterilisert runde coverslips i tomme kultur plater til platens overflaten er helt dekket.
- Monolayer såret
- Ved hjelp av sterile pinsett, forsiktig flytte en dekkglassvæske til en ren 10 cm plate som inneholder ferske serum-free medium. Unngå skade på monolayer ved å holde dekkglassvæske i periferien med pinsett. Unngå overdreven trykk som kan resultere i dekkglassvæske brudd.
- Lage kunstige sår ved å dra et sterilisert barberblad i tverrgående linje over midten av coverslips. Dra 3-4 mm frem og tilbake, for å fjerne den sentrale monolayer stripen. Kontroller at ingen celle vrakrester forblir knyttet til såret kantene.
Merk: på en 12 mm diameter runde dekkglassvæske, i snitt er gjort på det midt av dekkglassvæske. Sørg for å forlate et snev av celler overfor viktigste foran stort nok (minst 2 mm bredt) å unngå å vippe av dekkglassvæske i fremgangsmåten. - Overfør sårede coverslips celler vendt opp, til en ren 6-vel plate som inneholder minst 2 mL frisk serum-free medium. Passe opp til 4 sårede coverslips/godt.
- Forsiktig vaske to ganger med ferske serum-free medium å fjerne frittliggende celler.
- Eksperimentelle prosedyren og prøvetaking
- Forsiktig bytte medium i brønnene med fersk medium som inneholder utvalgte behandlinger.
Merk: Alternativt kjemikalier eller forbindelser som ikke forstyrr kultur medium homogenitet, behandlinger kan være inokulert direkte til kultur medium. Fortsett med forsiktighet for å unngå noen potensielle celle avdeling. - Holde platen i en celle inkubator (37 ° C, 5% CO2) for ønsket eksperimentelle timing.
- Stoppe celle migrasjon ved å feste cellene, forsiktig erstatte eksperimentelle kultur medium med 1 mL av 4% formalin i PBS. Inkuber i 15 min på RT.
Merk: For tiden kurs eksperimenter, fjerne prøvene fra kultur plate og løse dem i en separat plate å unngå formalin gasser påvirker andre, pågående eksperimentelle forhold. - Vask cellene for å fjerne overflødig formalin; forsiktig erstatte løsningen i brønnene med fersk PBS. Gjenta minst to ganger.
Merk: På dette stadiet, etter forseglet, plater kan lagres på 4 ° C på ubestemt tid.
- Forsiktig bytte medium i brønnene med fersk medium som inneholder utvalgte behandlinger.
- Immunofluorescence (hvis) og topologisk analyse
- Utføre hvis flekker og bildebehandling på individuelle coverslips som beskrevet andre steder3,4,11.
- Permeabilize for 10 min ved å fordype coverslips i en 0,3% Triton X-100 løsning i PBS.
- Blokk for 30 min bruker følgende blokkerer løsning: 0,3% Bovine Serum Albumin; 10% fosterets bovin Serum; 5% skummet melk; 0,3% Triton X-100 løsning på PBS.
Merk: Blokkerer løsning uten melk kan være forberedt på forhånd og lagret på 20 ° C. - Inkuber 1t ved romtemperatur inne en fuktig kammer, med primær antistoff fortynnet i melk-free blokkerer løsning. Plass coverslips opp-ned i 15 µL antistoff løsningen å sikre riktig distribusjon.
Merk: Antistoff arbeider fortynning er variabel og vil avhenge av antistoffer i bruk. Kanin anti-c-Jun antistoffer krever for eksempel en 1/100 fortynning. - Vask tre ganger av dipping coverslips i en i 0,1% Triton X-100 løsning i PBS.
- Inkuber coverslips i sekundære antistoff fortynnet i melk-gratis blokkering buffer for 30 min.
Merk: Antistoff arbeider fortynning er variabel og vil avhenge av antistoffer i bruk. Geit-anti-kaninen (488) krever for eksempel en 1/400 fortynning for optimal oppløsning. Andre merking reagenser som phalloidin og Hoechst-33258 kan legges til den inkubasjon bufferen på dette stadiet. - Vask tre ganger av dipping coverslips i 0,1% Triton X-100 løsning på PBS.
- Montere coverslips opp-ned i en 10 µL montering media dråpe (f.eksVectashield) plassert på et mikroskop lysbilde. La lysbildene i mørket ved romtemperatur over natten for montering middels herding. Etterpå lagre på 4 ° C i mørket på ubestemt tid.
- Få epifluorescence eller AC confocal mikroskopi bilder av strukturelle endringer forekommer på overfører stolpe.
Merk: Topologisk studier kan utføres av flislegging bilder fra overføre foran til den indre monolayer. Semi kvantitative studier er mulig ved programvare basert analyse på lokale fluorescens intensiteter.
- Utføre hvis flekker og bildebehandling på individuelle coverslips som beskrevet andre steder3,4,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kunstig såret Scratch analysen for kvantitative studier: vurdere Epidermal vekstfaktor (EGF) fremme overføring:
EGF er en velkjent induser av epitelceller spredning og migrasjon, og dermed en positiv kontroll for kvantifisere migrasjon forfremmelse. Mv1Lu og HaCaT celle monolayers ble brukt i såret scratch analyser og forbehandling bilder ble innhentet. Etter vaksinering med 10 ng/mL EGF, ble celler inkubert 19 h før fiksering og post-behandling bilder. Spredning ble holdt på et minimum av vedlikehold serum sult forhold. Både før og etter behandling sett bilder ble analysert bruker ImageJ og sentrale gap områder ble bestemt. Eksperimentet ble kjørt i duplikat, registrere fire mål for hver brønn. Kvantifisering av absolutt overføringen ble beregnet som differansen overflater: (PREGAP − POSTGAP). Det var et større vandrende potensial i stimulert Mv1Lu cellene (figur 1A) sammenlignet med stimulert HaCaT cellene (figur 1B). Forskjellene er forklart av kildene i cellen, blir mucosa epitelceller og huden keratinocytter, henholdsvis.
Kunstig migrasjon foran analysen for topografiske studier: cellen cytoskjelett Conformation og romlig uttrykk for C-juni:
Celle migrasjon innebærer kontinuerlig og dype endringer av cytoskjelett strukturen for å opprettholde celle forskyvning. HaCaT celle monolayers ble brukt i migrasjon foran analyser under kontroll og stimulering. Behandling med EGF potentiates cellen cytoskjelett dynamikken, som er observert hvis og laser skanning mikroskopi (LSM; Figur 2A). EGF behandling også gir robust Mitogen-Activated Protein (kart) kinaser signalering og c-JUN overexpression. Flislegging LSM bilder tillater konfigurasjon av romlige mønstre. Økt uttrykk for c-JUN på celler tilstøtende migrere foran kan enkelt vises ved programvare bildeanalyser; her, implementert vi en regnbue skala for den grønne kanalen, som tilsvarer c-JUN merking (figur 2B).
Figur 1. Markedsføringen av overføring av EGF i Mv1Lu og HaCaT celler. Kontrast mikroskopi bilder av sårede Mv1Lu (A) og HaCaT (B) celler ble tatt under kontroll forhold og forhold til bilder av cellene behandlet med 10 ng/mL EGF til 19 h i serum-free forhold. Representant micrographs viser omfanget av scratch gap og nedleggelse innhentet etter såret med 20 µL brønnene tips. Forstørrelse = 10 x; Skala bar = 100 µm. celle migrasjon ble kvantifisert og som variasjon av området forskjellene mellom behandlinger og kontroll prøver for hver analysen (vilkårlig enheter. AU). Tomten er representant for åtte uavhengige målinger for hvert vilkår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Utgangen filamenter og c-JUN uttrykk endringer fremmes av EGF i overfører HaCaT celler. (A) overnatting 10 ng/mL EGF behandling fremmer dyptgripende endringer i konformasjon av utgangen filamenter i overfører HaCaT celler. Celler migrasjon foran kontroll forhold portrettere et stramt strukturert begrepsordbok filamenter cytoskjelett, mens cellene behandlet med EGF viser dårlig begrepsordbok filamenter organisasjon migrasjon foran. Forstørrelse = 63 x; Skala bar = 20 µm. F-utgangen er fargekodet rød og Hoechst er representert med en blå farge. (B) når immuno-fluorescens brukes i kombinasjon med LSM imaging for å studere c-JUN uttrykk etter 10 ng/mL EGF behandling på overføring HaCaT celler, fliser komposisjoner avsløre romlige uttrykk mønstre. Bilder av c-Jun fluorescens (grønn) ble konvertert til pseudo farge vise intensiteten av c-Jun flekker. Rainbow fargeskala representerer fluorescens intensitet for c-Jun, tilsvarende colormaps på høyre paneler for EGF og kontroll. Co flekker med phalloidin (rød) og Hoechst-33258 (blå) ble brukt til å vise cellestruktur og kjerner, henholdsvis. Bildene ble tatt av AC confocal mikroskop. Merk økende uttrykk nivåer av kjernefysiske c-Jun i områder nærmer migrere foran. Skala bar = 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved huden eller slimhinnene avbrudd gjenopprettes barriere funksjonen handlingene til mange celletyper, inkludert fibroblaster eller epitel og immunsystemet cellene. Conjointly, disse cellene gjennomgår en kompleks prosess som involverer apoptose, spredning, differensiering, og viktigst, fibroblast og epithelial celle overføringen, som er den ultimate mekanismen ansvarlig for restaurering av forstyrret vev og nedleggelsen av overflatiske epiteliale gapet1,12 altså studere celle migrasjon hjelper presist beskriver fysiologiske virkemåten til epitelceller, mens også bestemme modulatory potensialet av behandlinger for sår healing.
Utføre kunstig sår på ulike forskning dyremodeller tillater replikering av denne komplekse prosessen i nær fysiologiske forhold2, og dermed vurdering av noen patologiske forhold eller effekten av legemidler behandlinger13. Men resulterer denne tilnærmingen ofte i kostbare og komplisert logistikk, samt tyngende eksperimentelle prosedyrer som kan generere dataene i en forsinket mote13. Tvert imot, gir i vitro cellekultur en enklere ramme for å forske virkemåten til celler involvert i såret helbredelsesprosessen. Mens primære cellekultur av epitelceller utgjør et levedyktig alternativ, kan det være vanskelig å få og håndtere celler som kan komplisere datainnsamling. For eksempel, behov typisk lav-passasjen begrensningen av primære kulturer, primære menneskelige keratinocytter en fibroblast fôring lag for vekst i vitro3. Tvert imot, utgjør veletablerte tarmepitelet kultur linjer, som Mv1Lu eller HaCaT, en obstacle-ledig forskning modell som funksjoner adferd og egenskaper som de i primære kultur celler3,4, 14,15. Nettopp, for å studere sårheling beholde disse to linjer viktige trekk i å overføre og stoppe spredning på grunn av celle-til-celle kontakt hemming ved samløpet16,17.
Scratch analyser er en pålitelig og fleksibel metode for å kvantifisere vandrende funksjonene i ulike celletyper, spesielt epitel og kreftceller. For tilfelle av kreftceller, har scratch metoden blitt foreslått for vurdering av invasiv potensial. Men faller denne tilnærmingen kort som en indikator for invasiveness sammenlignet med mer spesifikke metoder stole på uttrykk for metalloproteases nødvendig for gjennomtrengende ekstracellulær matrix18,19. Tvert imot, er scratch analyser pålitelig for å vurdere epitelceller vandrende ytelse og effekten av ulike behandlinger på denne egenskap. I motsetning til kreft celler linjer, som ofte viser dårlig samhold og muligheten til å vokse på flere lag, Mv1Lu, HaCaT og andre tarmepitelet linjer skjemaet tett forbundet "vekst øyer", som utvider dekningen i en prosess avhengig av begge spredning, men mer viktigere på celle migrasjon. Følgelig brukes sparsom eller sub confluent tetthet forhold konvensjonelt for studerer effekten av ulike behandlinger på vandrende fysiologi; spesielt når påfølgende molekylærbiologi teknikker brukes, som denne cellen minimerer miljø kontakt hemming mens maksimere forholdet mellom aktivt migrere celler. Imidlertid epitelceller, ikke-confluent vilkår utgjør derfor risikoen for unntatt viktig eksisterende kontakt hemming påvirkninger, for eksempel i form av epigenetic regulering. Således, for å studere sårheling, confluent betingelser gi økt gjengivelse av modellen.
For å få presise anslag, rettes samtidig faktorer påvirker konformasjon av epitelcellelaget eller bidra til overføring. Mens samløpet er ønskelig, er det viktig å unngå overdreven celle tetthet eller flerlags kulturer, siden disse forholdene kan påvirke negativt. Derfor spredning er vanligvis kontrollert av sult i serum-gratis media eller tillegg av kjemikalier som Mitomycin C, som irreversibelt arrestere celle spredning av DNA crosslinking3,20, 21. Bruk av én bruker virkemåten for bestemte linjer; Mitomycin C angis spesielt når redusert serum kosttilskudd er nødvendig for å unngå massiv celle avdeling. Som er tilfellet for HEK-293T celler, der pre belegg kultur overflaten med poly-L-lysine er et godt alternativ å unngå Mytomycin C behandling. Utgivelsen av inflammatoriske faktorer som kan endre overføring må også tas. Forskjellige strategier brukt hovedsakelig basert på silikon setter å etterligne avbrudd i epithelial overflaten med scratch analysen22. Mens setter generere eksisterende hull at celle migrasjon etter fjerner silikon stykket, bruker scratch metoden direkte fjerne noe av den epithelial monolayer å generere gapet. Preferanse på hvordan å generere gapet avhengig setter evnen til å beskytte kultur overflatebehandlingen (dvs., kultur plate eller poly-L-lysine) fra skade under skrape, samtidig som også utgivelsen av faktorer fra skadede celler som kan kompromiss celle kultur atferd23. Selv om disse egenskapene kan være nyttig for noen eksperimentelle innstillinger, dvs. vurdere muligheten av kreftceller å overføre, vår erfaring fant vi betydelige ulemper for bruk av innstikk i sårheling studier. Mv1Lu cellene er i stand til å feste til silikon sett inn ytre overflaten, noe som resulterer i utilsiktet rive av celle monolayer ved fjerning av silikon bitene. Også, selv om HaCaT cellene ikke kobler til silikon, vi fant en redusert evne til disse cellene overføre til sett inn-generert hull. Som grad, betennelse og migrering er tett forbundet svar, og dette synes å være kritisk sammen i sammenheng med sårheling i HaCaT celler. Videre siden bruker en plast tips for skrape overflaten kultur har ingen åpenbare konsekvens på evnen til cellene å gjenbefolke gapet, ved HaCaT celler, antyder slik oppførsel at ekstracellulær matrix restene gapet kan guide migrasjon i en lignende måte som dermis i et naturlig sår.Imidlertid fortsatt den viktigste kilden til variasjon avlysning prosedyren, som bruk av en plastikk tips for å gjøre såret ikke gjengir alltid samme størrelse gapet. Vi har observert variasjoner opp til 20% blant forskjellige prøver, inkonsekvens press og posisjon tips ved bunnen. Disse variasjonene kan håndteres av såret monolayer med et mer rigid objekt. men ville noen bunnen på plast overflaten sette fri bevegelse av cellene. Så må variasjoner i første grunnen tas hensyn til å beregne overføring; vanligvis ved å øke antall mål per betingelse.
I tillegg til kvantifisering, kan bruke såret prosedyrer med klassisk hvis teknikker kvalitativt vurdere molekylær prosessene av celle migrasjon. Evnen til epitelceller å vokse på coverslips er godt vet; tidligere variasjoner av scratch søk involvert cellene migrerer på coverslips utsatt for ulike forhold etterfulgt av festing og flekker for sammenligning i såret-scratch eksperimentelle oppsett24. Her fant vi at opprette bredt hull i monolayers vokser på coverslips gir for å utvide eksperimentelle tid kurs3,4,7. Videre i disse eksperimentene, hvis øker oppdagelsen mulighetene i prosedyren potensielt studere noen presis mobilnettet og subcellular mekanismer involvert, og det er bare begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer egnet til denne teknikken og cellene rundt. Eksempler på coverslips brukes hvis er montert på objektglass, som gir mulighet for utvidet bevaring. Dette hjelpemidler anvendelsen av eksperimentelle oppsett som krever lang studie perioder, som "fliser" tilnærminger utstillingsmonter her og andre steder3,4,7. Mens "fliser" strategien integrerer romlige mønstre med timelige data for å rekonstruere mekanismene som er involvert i migrasjon, kan implementering av programvareverktøy gi semi kvantitative vurderingene er basert på lokale fluorescens intensitet, og ytterligere berike kvaliteten på informasjonen. I vår erfaring tilbyr fliser også muligheten for å studere informasjon om celle-posisjon for uttrykket av proteiner i denne analysen. Opplysningene posisjonelle har vist seg å være avgjørende å forstå og oversette bedre effekten av forskjellige agenter på celle migrasjon, spesielt i oppsett der plasseringen av epitelceller er svært viktig å bestemme virkemåten vandrende3 ,4,14,15.
Begge fremgangsmåtene viser stor anvendelighet av ukomplisert implementering, samt produsere kvalitet. Dermed disse tilnærmingene som er basert på mikroskopi studier, tilbyr et unikt og mektig rammeverk for å studere både dynamikk og morfologiske endringer i epithelial celle atferd og svar på behandlinger under sårtilheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke eldre medlemmer av laboratoriet som bidrar til å forbedre og finpusse disse teknikkene til faktiske tilstand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada og Dr. Antonia Alcaraz-García. Vi er gjeld til sykehuset Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca for sterkt støtte utviklingen av disse teknikkene. Også i Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planlegge Estatal jeg + D + jeg og Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Vi takker også Universitetet i Murcia, IMIB-Arrixaca og FFIS for Administrativ støtte og hjelp. Til slutt, vi ønsker å gi en spesiell takk til Dr. Isabel Martínez-Argudo og de Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha Toledo for vennlig støtte i frivillig avstå den Biomedisin og bioteknologi laboratoriet for å muliggjøre delen filmet i dette papiret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
