Summary
Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.
Abstract
Migração celular é um aspecto obrigatório para cicatrização de feridas. Criação artificial feridas em modelos animais de pesquisa muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, enquanto potencialmente carente de precisão. Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma plataforma adequada para pesquisar o comportamento de células migratórias na cicatrização de feridas e o impacto de tratamentos nessas células. A fisiologia das células epiteliais é frequentemente estudada em condições não-confluente; no entanto, esta abordagem pode não se assemelham a ferida natural, condições de cura. Rompendo a integridade do epitélio por meios mecânicos, gera um modelo realista, mas pode impedir a aplicação de técnicas moleculares. Consequentemente, as técnicas de microscopia com base são ideais para estudar a migração de células epiteliais in vitro. Aqui nós detalhe dois métodos específicos, o ensaio de zero ferida artificial e o ensaio de migração artificial frontal, que pode obter dados quantitativos e qualitativos, respectivamente, sobre o desempenho migratório das células epiteliais.
Introduction
Migração celular é necessária para a cicatrização de feridas, como é responsável para o fechamento final do gap epitelial e restauração da superfície interrompidos1. Apresentando ferimentos artificiais em modelos animais permite a replicação deste complexo processo em perto de condições fisiológicas2. No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, que potencialmente carecem de precisão para o estudo de processos distintos, devido à natureza complexa do processo de cicatrização de feridas.
Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma alternativa útil para modelos animais para pesquisar o papel que estas células desempenham na cicatrização de feridas e os efeitos do tratamento sobre comportamento migratório de célula. A fisiologia das células epiteliais geralmente é estudada por técnicas moleculares usando não confluente culturas3,4,5,6; no entanto, o rompimento da integridade do epitélio é geralmente conseguido incisões mecânicas fina. Em cultura de células, isto implica que o insignificante número de células pode ser exposto para a abertura da ferida, e representam uma amostra muito pequena para as técnicas de biologia molecular. No entanto, estas lesões podem ser estudadas em escala microscópica, aproveitando as propriedades migratórias inatas de algumas linhas de células epiteliais, tais como a célula epitelial de pulmão vison (Mv1Lu) ou a célula de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizado (HaCaT) linhas.
Aqui nós descrevemos um método para a microscopia que é adequado para obter dados quantitativos sobre a migração de células epiteliais no contexto de3,4,7,8de cicatrização de feridas. Além disso, apresentamos métodos adicionais que são úteis para estudar mudanças qualitativamente moleculares e morfológicas que ocorrem em monocamadas epiteliais durante a migração. Em geral, esses métodos fornecem uma estrutura para estudar a dinâmica e a mudanças morfológicas envolvidas com comportamento de célula epitelial e resposta aos tratamentos durante a cicatrização de feridas.
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Protocol
1. artificial ferida ensaio zero para estudos quantitativos
- Preparação de monocamadas de células
- Trabalhando sob condições estéreis, de sementes e desenvolvem-se células epiteliais Mv1Lu ou HaCaT em frascos de cultura usando meio de soro-completada. Atualize médio uma vez cada 24-48 h. Depois que as células alcançar 80% de confluência, desanexe células usando um método adequado, ou seja, tripsinização9.
Nota: Mv1Lu HaCaT linhas de células epiteliais são cultivadas usando meio de cultura EMEM e DEMEM, respectivamente, suplementado com 2 mM L-glutamina e incubadas a 37 ° C, com uma atmosfera controlada de 5% de CO2. Cada linha da célula deve ser analisada cuidadosamente para determinar a concentração de células e temporização necessária para alcançar a plena confluência. Normalmente para as células de Mv1Lu ou HaCaT, 2-4 x 104 ou 4-6 x 104 células/poço, respectivamente, são semeados em um frasco de cultura2 175 cm, e em 80% a confluência rende até 35 x 106 Mv1Lu ou 1 x 107 células de HaCaT. - Em qualquer uma placa de cultura bem-12 ou 24-bem, as sementes em cada poço 2 mL de células. Atualize a média uma vez a cada 24-48 h. Certifique-se de números de telemóvel são altos o suficiente para alcançar a confluência de 100% após 2 ou 3 dias.
- Depois que as células alcançar confluência, remover o meio suplementado por soro e lavar duas vezes com meio livre de soro fresco. Manter as células em meio livre de soro durante 24 h antes o arranhador.
Nota: Células Mv1Lu ou HaCaT não tem exigências especiais de substrato; no entanto, para linhas de células sensíveis a desanexação espontaneamente em condições de livre de soro, pré-revestimento de superfície da placa de cultura, usando uma solução de poli-L-lisina deve ser considerado10.
- Trabalhando sob condições estéreis, de sementes e desenvolvem-se células epiteliais Mv1Lu ou HaCaT em frascos de cultura usando meio de soro-completada. Atualize médio uma vez cada 24-48 h. Depois que as células alcançar 80% de confluência, desanexe células usando um método adequado, ou seja, tripsinização9.
- Monocamada coçar
- Trabalhando em um ambiente estéril, arranhe a monocamada de cultura arrastando-se firmemente a extremidade estreita de um 20 µ l ou 200 µ l de micropipeta estéril ponta, dependendo da largura zero desejada. Mantenha a ponta perpendicular à superfície de cultura para maximizar a homogeneidade de lacuna.
- Coloque as placas de cultura sobre uma superfície escura para monitorar claramente a monocamada de células. Se necessário, realize dois arranhões perpendiculares (em forma de cruz) em cada poço para estudar até 4 áreas de migração.
- Lavam-se células desanexadas removendo suavemente o meio de cultura e suavemente adicionando meio livre de soro fresco. Repita duas vezes, ou até mais solteira células foram removidas.
- Trabalhando em um ambiente estéril, arranhe a monocamada de cultura arrastando-se firmemente a extremidade estreita de um 20 µ l ou 200 µ l de micropipeta estéril ponta, dependendo da largura zero desejada. Mantenha a ponta perpendicular à superfície de cultura para maximizar a homogeneidade de lacuna.
- Coleção de dados e procedimento experimental
- Com até 4 imagens de referência de pré-tratamento centradas sobre o fosso de risco de cada poço usando um microscópio de contraste de fase invertida, incorporando uma câmera CCD. Selecione áreas de interesse, alinhando a borda do campo do microscópio para o cruzamento adjacente de arranhões.
Nota: Normalmente, imagens são adquiridas utilizando uma ampliação de 10x e um tamanho de imagem de 1.280 x 1.024 pixels. Seleção de áreas de interesse, como descrito acima ajuda para fácil localização e validação de até 4 medições por bem. - Uma vez que todas as imagens são adquiridas, designar poços de tratamento; câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados.
Nota: Como alternativa, para produtos químicos ou compostos que não perturbe a homogeneidade do meio de cultura, tratamentos podem ser inoculados diretamente no meio de cultura. - Incube a placa riscada (37 ° C com uma atmosfera controlada contendo 5% CO2) até as condições em fechamento de abertura zero observação alcance 90%. Evite o fechamento completo.
Nota: Encerramento Total lacuna anula coleção pós-tratamento de imagens, como áreas de referência não são detectáveis e a referência de tempo para o fechamento de lacuna não pode ser estabelecida. No caso de células Mv1Lu ou HaCaT, 16-19 h são necessários para alcançar a confluência de 90%. - Parar a migração celular, fixando as células; delicadamente, substitua o meio de cultura experimental com 1 mL de formol a 4% em PBS. Incubar durante 15 min em RT.
- Lavar as células para remover o formol em excesso; Substitua suavemente a solução em poços com PBS fresco. Repita pelo menos duas vezes.
Nota: Nesta fase, após a selagem, placas podem ser armazenadas a 4 ° C indefinidamente. - Com imagens de referência pós-tratamento de cada poço das áreas de referência original capturado depois de coçar. Use os mesmos equipamentos (microscópio de contraste de fase ótica invertida incorporando uma câmera CCD) e definições de imagem correspondente (ampliação e resolução digital/densidade).
Nota: Para as células que migram individualmente e preencher a lacuna independentemente da formação de uma frente coerente (por exemplo, células humanas de câncer de mama MDA-MB-231), as imagens do tempo-curso podem permitir o cálculo das velocidades de migração de células individuais.
- Com até 4 imagens de referência de pré-tratamento centradas sobre o fosso de risco de cada poço usando um microscópio de contraste de fase invertida, incorporando uma câmera CCD. Selecione áreas de interesse, alinhando a borda do campo do microscópio para o cruzamento adjacente de arranhões.
- Análise de imagem e quantificação da migração
- Usando o software (por exemplo, ImageJ) de processamento de imagem, definir limites de risco lacuna e determinar a superfície de abertura para até quatro medições no pré-tratamento de fotos. Gravar os dados como "superfície de lacuna de pré-tratamento" (PREGAP). Repita o mesmo procedimento para pós-tratamento fotos. Gravar os dados como "superfície de pós-tratamento lacuna" (POSTGAP).
- Abra a imagem gravada usando o ImageJ. No menu "imagem", defina o tipo de imagem de 8 bits. No menu "processo", ir para o submenu "filtros" e aplicar a filtragem de "desvio".
- No menu "imagem", digite "ajustar" submenu e definir o limiar para preto e branco (B & W), certifique-se de "Fundo escuro" não está seleccionado. No menu "processo", ir para o submenu "binário" e selecione "tapar buracos".
- No menu "analisar", selecione "definir medidas" e ative a "área". Em seguida, desenhe a área mensurável, seguindo o contorno de borda migrando delimita, assim, a lacuna.
- No menu "analisar", selecione "analisar partículas" e gravar valores de "área total" para a superfície da área desenhada.
- Introduzir o PREGAP e POSTGAP valores de área total em uma folha de cálculo para quantificar a migração absoluta para cada conjunto de amostras individuais como a diferença de medições de superfície lacuna: PREGAP − POSTGAP [unidades arbitrárias]. Além disso, normalizar dados de migração absoluta de cada condição para amostras de controlo: (amostra / controle) * 100 [%].
Nota: Para as células que migram individualmente e preencher a lacuna independentemente da formação de uma frente coerente, (por exemplo, células humanas de câncer de mama MDA-MB-231), a migração absoluta pode ser calculada pela contagem de células invadindo uma central na tira o controle ou as amostras tratadas. - Plotagem de saídas de quantificação (ver Figura 1). Realizar análise estatística se necessário.
- Usando o software (por exemplo, ImageJ) de processamento de imagem, definir limites de risco lacuna e determinar a superfície de abertura para até quatro medições no pré-tratamento de fotos. Gravar os dados como "superfície de lacuna de pré-tratamento" (PREGAP). Repita o mesmo procedimento para pós-tratamento fotos. Gravar os dados como "superfície de pós-tratamento lacuna" (POSTGAP).
2. ensaio da frente de migração artificial para estudos topográficos
- Preparação de monocamadas de células
- Trabalhando em condições estéreis, coloque uma camada de lamelas redondas esterilizadas em placas de cultura vazia até a superfície da chapa é completamente coberto.
Nota: Até 12 e 33 lamelas cabem em 5 cm e placas de 10 cm de diâmetro, respectivamente. - Na placa de cultura, sementes delicadamente um volume adequado de células em uma concentração que permite a confluência de 100% após 2 ou 3 dias. Certifique-se de que sem lamela se sobrepõe as lamelas de vizinhas e impedir que as lamelas flutuando aplicando uma pressão suave com uma ponta da micropipeta estéril. Atualize o meio cada 24-48 h.
Nota: Cada linha da célula deve ser analisada cuidadosamente para determinar a concentração de células e temporização necessária para alcançar a plena confluência. Normalmente para as células de Mv1Lu ou HaCaT, 2-3 x 106 ou 2.5-4 x 10 placa de6 células/10 cm de diâmetro, respectivamente, são semeados. Para placas menores, deve ser reduzido número de células. - Depois que as células alcançar confluência, remover o meio de soro-completados e substitua meio livre de soro fresco. Manter as células em meio livre de soro durante 24 h antes que a ferida artificial é realizada.
Nota: Células Mv1Lu ou HaCaT não tem exigências especiais de substrato; no entanto, para linhas de células suscetíveis de desanexação espontaneamente em condições de livre de soro, pre-revestimento da superfície da cultura usando uma solução de poli-L-lisina deve ser considerado10.
- Trabalhando em condições estéreis, coloque uma camada de lamelas redondas esterilizadas em placas de cultura vazia até a superfície da chapa é completamente coberto.
- Monocamada ferindo
- Usando uma pinça estéril, movimente suavemente uma lamela para um prato limpo 10 cm contendo meio livre de soro fresco. Evite danificar a monocamada, segurando a lamela na periferia, com uma pinça. Evite pressão excessiva, o que pode resultar na ruptura da lamela.
- Crie feridas artificiais, arrastando uma lâmina de barbear esterilizada em uma linha transversal sobre o centro das lamelas. Arraste 3 a 4 mm e para trás, a fim de remover completamente a tira central monocamada. Certifique-se de que detritos nenhuma célula permanece anexado às bordas da ferida.
Nota: em um diâmetro de 12 mm redondo lamela, a incisão é feita na meados da lamela. Certifique-se de deixar um traço de células em frente a frente principal grande o suficiente (pelo menos 2 mm de largura) para evitar a inclinação da lamela nas etapas a seguir. - Transferi as lamelas de feridos com células virada para cima, para uma limpeza 6 placa contendo pelo menos 2 mL soro livre meio fresco. Cabem até 4 lamelas feridos/bem.
- Delicadamente, lave duas vezes com produtos frescos meio livre de soro para remover células desanexadas.
- Amostragem e procedimento experimental
- Delicadamente câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados.
Nota: Como alternativa, para produtos químicos ou compostos que não perturbe a homogeneidade do meio de cultura, tratamentos podem ser inoculados diretamente no meio de cultura. Proceda com cuidado para evitar qualquer potencial desprendimento de células. - Manter a placa dentro de uma incubadora de célula (37 ° C, 5% CO2) para a altura desejada experimental.
- Parar a migração celular, fixando as células; delicadamente, substitua o meio de cultura experimental com 1 mL de formol a 4% em PBS. Incubar durante 15 min em RT.
Nota: Para curso de experiências de tempo, remova as amostras da placa de cultura e corrigi-los em um prato separado para evitar os vapores de formol que afectam as condições experimentais, outras em andamento. - Lavar as células para remover o formol em excesso; Substitua suavemente a solução em poços com PBS fresco. Repita pelo menos duas vezes.
Nota: Nesta fase, após a selagem, placas podem ser armazenadas a 4 ° C indefinidamente.
- Delicadamente câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados.
- Imunofluorescência (IF) e análise topológica
- Realizar-se a coloração e imagem latente em lamelas individuais como descrito em outra parte3,4,11.
- Permeabilize por 10 min por imersão lamelas em uma solução de Triton X-100 0,3% em PBS.
- Bloco para 30 min, usando a seguinte solução de bloqueio: 0,3% albumina de soro bovino; 10% de soro fetal bovino; 5% de leite desnatado; 0,3 solução de Triton X-100% em PBS.
Nota: Obstrui a solução sem leite pode ser preparado antecipadamente e armazenado a-20 ° C. - Encube por 1h à temperatura ambiente dentro de uma câmara úmida, com anticorpo primário, diluído em solução de bloqueio isento de leite. Coloque as lamelas de ponta-cabeça na solução de anticorpo de 15 µ l para garantir a distribuição adequada.
Nota: A diluição de trabalho do anticorpo é variável e dependerá do anticorpo em uso. Por exemplo, o anticorpo anti-c-Jun requer uma diluição de 1/100. - Lavar três vezes mergulhando as lamelas em uma solução de Triton X-100 em 0,1% em PBS.
- Incube as lamelas em anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio isento de leite por 30 min.
Nota: A diluição de trabalho do anticorpo é variável e dependerá do anticorpo em uso. Por exemplo, o bode-anticoelho (488) requer uma diluição de 1/400 para resolução ideal. Outros reagentes rotulagem como faloidina e Hoechst 33258 podem ser adicionados para o buffer de incubação nesta fase. - Lavar três vezes mergulhando as lamelas em solução de Triton X-100 0,1% em PBS.
- Monte as lamelas de ponta-cabeça em 10 µ l montagem mídia queda (por exemplo, Vectashield) colocada sobre uma lâmina de microscópio. Deixe os slides no escuro à temperatura ambiente durante a noite para o endurecimento de médio de montagem. Depois, loja a 4 ° C, no escuro, indefinidamente.
- Obter imagens de microscopia confocal de mudanças estruturais que ocorrem na borda frontal migrando ou epifluorescência.
Nota: Estudos topológicos podem ser executados por fotos da frente migrando para a interior monocamada de ladrilho. Semi-quantitativa de estudos são possíveis pela análise de software baseado em intensidades de fluorescência local.
- Realizar-se a coloração e imagem latente em lamelas individuais como descrito em outra parte3,4,11.
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Representative Results
Ensaio de zero ferida artificial para estudos quantitativos: avaliação fator de crescimento epidérmico (EGF) promoção da migração:
EGF é um conhecido indutor de proliferação de células epiteliais e migração e, portanto, um controle positivo para quantificar a promoção de migração. Monocamadas de células Mv1Lu e HaCaT foram utilizadas em ensaios de zero a ferida e pré-tratamento fotos foram obtidas. Após a inoculação com 10 ng/mL EGF, as células foram incubadas durante 19 h antes da fixação e pós-tratamento fotos. Proliferação foi mantida a um mínimo, mantendo as condições de fome de soro. Conjuntos de pré e pós-tratamento de fotos foram analisados usando o ImageJ e determinaram-se as áreas de abertura central. O experimento foi executado em duplicado, registrando quatro medições para cada poço. Quantificação da migração absoluta foi calculada como a diferença de superfícies: (PREGAP − POSTGAP). Havia um maior potencial migratório nas células Mv1Lu estimuladas (figura 1A) em comparação com as células de HaCaT estimuladas (figura 1B). As diferenças são explicadas por fontes da célula, sendo a mucosa células epiteliais e pele queratinócitos, respectivamente.
Ensaio frente de migração artificial para estudos topográficos: variações na conformação do citoesqueleto e espacial expressão de C-Jun:
Migração celular envolve mudanças contínuas e profundas da estrutura do citoesqueleto a fim de manter o deslocamento da célula. Monocamadas de células de HaCaT foram utilizadas os ensaios de migração da frente sob condições de controle e estimulação. Tratamento com EGF potencializa a dinâmica do citoesqueleto, que é observada por IF e laser microscopia (LSM; Figura 2A). Tratamento de EGF também resulta em robusto quinases de proteína Mitogen-Activated (mapa) sinalização e superexpressão de c-JUN. Imagens LSM de ladrilho permite a configuração de padrões espaciais. Aumento da expressão de c-JUN em células adjacentes para a frente de migração pode ser facilmente revelado por análise de imagem de software; aqui, nós implementamos uma escala de arco-íris para o canal verde, que correspondem a rotulagem do c-JUN (Figura 2B).
Figura 1. Promoção de migração por EGF em células Mv1Lu e HaCaT. Imagens de microscopia de contraste de fase da área ferida de Mv1Lu (A) e HaCaT (B) células foram tomadas sob condições de controle e em comparação com imagens das células tratadas com 10 ng/mL EGF para 19 h em condições de livre de soro. Micrografias representativas mostram a extensão da lacuna zero e encerramento obtidos após ferimento com uma ponta de micropipeta de 20 µ l. Ampliação = 10 x; Barra de escala = 100 µm. célula de migração foi quantificada e representada como variação das diferenças entre os tratamentos e controle de amostras para cada ensaio (unidades arbitrárias; área AU). O enredo é representante de oito medições independentes para cada condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Filamentos de actina e mudanças de expressão de c-JUN, promovidas pela EGF na migração de células de HaCaT. (A), durante a noite 10 ng/mL EGF tratamento promove mudanças profundas na conformação dos filamentos de actina em células migrando de HaCaT. Células na frente das condições de controle de migração retratar um citoesqueleto de filamentos de actina rigidamente estruturado, enquanto as células tratadocom com EGF mostrar organização de filamentos de actina pobre na parte dianteira de migração. Ampliação = 63 x; Barra de escala = 20 µm. F-Actina é o código de cores vermelho, e Hoechst é representada por uma cor azul. (B) quando imuno-fluorescência é usado em combinação com LSM imaging para estudar a expressão de c-JUN após tratamento de 10 ng/mL EGF na migração de células de HaCaT, composições de azulejos revelam padrões de expressão espacial. Imagens de fluorescência c-Jun (verde) foram convertidas em pseudo cor para mostrar a intensidade da coloração de c-Jun. A escala de cores do arco-íris representa a intensidade de fluorescência para c-Jun, correspondente a colormaps nos painéis da direito para EGF e controle. Co de coloração com faloidina (vermelho) e Hoechst-33258 (azul) foi usado para mostrar a estrutura celular e núcleos, respectivamente. Imagens foram tiradas por um microscópio confocal. Observe o aumento dos níveis de expressão de c-Jun nuclear em áreas chegando a frente de migração. Barra de escala = 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em cima da pele ou mucosa interrupção, função de barreira é restaurada pelas ações de numerosos tipos de células, incluindo fibroblastos ou células epiteliais e imunes. Em conjunto, estas células passam por um complexo processo envolvendo a apoptose, proliferação, diferenciação e importante, fibroblastos e epiteliais células migração, que é o derradeiro mecanismo responsável pela restauração do tecido interrompida e o encerramento do fosso epitelial superficial1,12 assim, estudando a migração celular ajuda a descrever precisamente o comportamento fisiológico das células epiteliais, enquanto também determinar o potencial moduladora de tratamentos para a ferida cura.
Realizando feridas artificiais em modelos animais de pesquisa diferentes permite a replicação deste processo complexo em perto de condições fisiológicas2e, portanto, a avaliação de algumas condições patológicas ou os efeitos de produtos farmacêuticos tratamentos13. No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em logística complicada e onerosa, bem como procedimentos experimentais pesados que podem gerar dados em uma moda atrasada13. Pelo contrário, em vitro cultura de pilha fornece uma estrutura mais conveniente para pesquisar o comportamento das células envolvidas no processo de cura da ferida. Enquanto a cultura de células primárias de células epiteliais constitui uma opção viável, pode ser difícil de obter e manipular as células, que podem complicar a coleta de dados. Por exemplo, juntamente com a restrição de baixo-passagem típica de culturas primárias, queratinócitos humanos primários necessário um fibroblasto alimentação camada para crescimento em vitro3. Pelo contrário, as linhas de cultura de células epiteliais bem estabelecida, como Mv1Lu ou HaCaT, constituem um modelo de pesquisa livre de obstáculos que apresenta comportamento e características como as de cultura primária células3,4, 14,15. Precisamente, para o estudo da cicatrização de feridas, estas linhas de duas células mantêm traços críticos na sua capacidade de migrar e parar a proliferação devido à inibição de contato célula a célula sobre a confluência16,17.
Ensaios de risco são um método confiável e versátil para quantificar os recursos migratórios de diferentes tipos de células, especialmente epiteliais e células cancerosas. Para o caso de células de câncer, o método zero tem sido proposto para avaliação do potencial invasivo. No entanto, esta abordagem está aquém como um indicador para invasividade quando comparado com métodos mais específicos, baseando-se na expressão de metaloproteases necessários para penetrar a matriz extracelular18,19. Pelo contrário, ensaios zero são fiáveis para avaliar o desempenho migratório das células epiteliais e o efeito de diferentes tratamentos sobre essa característica. Em contraste com as linhas de células de câncer, que frequentemente mostram pobre coesão e a capacidade de crescer em várias camadas, Mv1Lu, HaCaT e outras células epiteliais linhas forma firmemente associada "crescimento ilhas", que expandem as suas margens em um processo dependendo ambas proliferação, mas mais importante ainda no migração de celular. Consequentemente, as condições de densidade celular esparsas ou sub confluente convencionalmente são utilizadas para estudar os efeitos de diferentes tratamentos sobre a fisiologia migratória; especialmente quando são aplicadas técnicas subsequentes de biologia molecular, como esta célula ambiente minimiza a inibição de contato enquanto maximizar o rácio de ativamente migrando as células. No entanto, para as células epiteliais, condições não-confluente levantar o risco de excluindo influências importantes de inibição de contato pré-existente, por exemplo sob a forma de regulamento epigenética. Assim, para estudar a cicatrização de feridas, confluentes condições conferem maior fidelidade do modelo.
Para obter estimativas precisas, devem ser dirigidas concomitantes fatores afetando a conformação da camada de células epiteliais ou contribuindo para a migração. Enquanto confluência é desejada, é importante evitar a densidade celular excessiva ou culturas de várias camadas, desde que estas condições podem afectar negativamente. Portanto, proliferação comumente é controlada pela inanição em media serum-free ou pela adição de produtos químicos como mitomicina C, que prender irreversivelmente a proliferação celular por DNA reticulação3,20, 21. a utilização de um ou outro depende do comportamento das linhas de célula específica; Mitomicina C é especialmente indicada quando reduzido suplementação de soro é necessário para evitar o desprendimento de massa celular. Esse é o caso de células HEK-293T, onde pre-revestimento da superfície de cultura usando poli-L-lisina é uma boa opção para evitar o tratamento de Mytomycin C. A liberação de fatores inflamatórios que podem alterar a migração também precisa ser tratada. Diferentes estratégias têm sido utilizadas, baseados principalmente em inserções do silicone para imitar a ruptura da superfície epitelial, alcançada com o zero do ensaio22. Enquanto inserções geram lacunas existentes que permitem a migração celular, depois de retirar a peça do silicone, o método zero depende diretamente removendo alguns da monocamada epitelial para gerar a lacuna. Preferência em como gerar a lacuna baseia-se na capacidade de inserções para proteger o revestimento de superfície de cultura (ou seja, placa de cultura ou poli-L-lisina) contra danos durante a coçar, minimizando também a liberação de fatores de células danificadas, o que pode comprometa o comportamento de cultura de nível23. Embora estas características podem ser útil para algumas configurações experimentais, ou seja, avaliar a capacidade das células cancerosas de migrar, em nossa experiência encontramos desvantagens significativas para o uso de pastilhas em estudos de cicatrização de feridas. Mv1Lu células são capazes de anexar à silicone inserir superfície exterior, que resulta em sem querer rasgar a monocamada de células após a remoção das peças do silicone. Também, embora as células HaCaT não anexar ao silicone, encontramos uma capacidade diminuída para essas células para migrar em lacunas geradas por inserção. Que extensão, inflamação e migração são respostas firmemente associadas, e estes parecem ser críticos juntos no contexto da cicatrização de feridas em células HaCaT. Além disso, desde que aplicar uma ponta plástica para riscar a superfície de cultura não tem nenhuma consequência aparente sobre a capacidade das células para repovoar a lacuna, no caso de células HaCaT, tal comportamento sugere que os restos de matriz extracelular na brecha guie a migração em um estilo similar ao dermis em uma ferida natural.No entanto, a principal fonte de variação continua a ser o procedimento arranhando em si, como o uso de uma ponta plástica para fazer a ferida sempre não processa a mesma diferença de tamanho. Observamos variações de até 20% entre amostras diferentes, devido à inconsistência de pressão e a posição da ponta no momento do zero. Estas variações podem ser abordadas por ferindo a monocamada com um objeto mais rígido; no entanto, qualquer arranhão na superfície do plástica colocaria em risco a livre circulação das células. Então, variações no zero inicial devem ser tomadas em consideração para calcular a migração; Normalmente, aumentando o número de medição por condição.
Além de quantificação, aplicar procedimentos ferindo juntamente com técnicas clássicas se pode qualitativamente avaliar os processos moleculares de migração celular. A capacidade das células epiteliais de crescer em lamelas é bem conhecidas; no passado, as variações da risque ensaios envolvidas células migrando em lamelas expostas a diferentes condições, seguidas de fixação e coloração para comparação dentro da ferida-zero configuração experimental24. Aqui, nós achamos que criando aberturas largas em monocamadas crescendo em lamelas permite para estender o tempo experimental cursos3,4,7. Além disso, em experiências, se aumenta as capacidades de detecção do procedimento potencialmente estudar qualquer precisos mecanismos celulares e subcelulares envolvidos, e só é limitada pela disponibilidade de anticorpos adequados para esta técnica e o células de interesse. Amostras nas lamelas usadas para se são montadas em corrediças do microscópio, que permitem a conservação prolongada. Isso ajuda a aplicação de configurações de experimentais que requerem períodos de tempo de estudo, como as abordagens de "telha" apresentou aqui e alhures,3,4,7. Enquanto a estratégia de "telha" integra padrões espaciais com dados temporais para reconstruir os mecanismos envolvidos na migração, a implementação de ferramentas de análise de software pode fornecer semi-quantitativa de avaliações com base no local da fluorescência intensidade e enriquecer ainda mais a qualidade das informações obtidas. Em nossa experiência, a telha também oferece a possibilidade de estudar a informação posicional de célula para a expressão de proteínas neste tipo de ensaio. Esta informação posicional foi mostrada para ser crucial para compreender e traduzir melhor os efeitos dos diferentes agentes na migração celular, especialmente em instalações onde a posição das células epiteliais é muito importante para determinar seu comportamento migratório3 ,4,14,15.
Ambos os procedimentos descritos demonstram grande conveniência pela implementação descomplicada, bem como produzir dados de qualidade. Assim, essas abordagens baseadas em estudos de microscopia, oferecer uma estrutura única e poderosa para estudar a dinâmica e a mudanças morfológicas envolvidos no comportamento de célula epitelial, e a resposta aos tratamentos durante a cicatrização de feridas.
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Disclosures
Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Queremos dar graças aos membros mais velhos do laboratório que ajudam a melhorar e refinar essas técnicas ao seu estado real: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada e Dr. Antonia Alcaraz-García. Estamos em dívida com o Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoiar fortemente o desenvolvimento dessas técnicas. Também o Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plano Estatal eu + D + I e o Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (n º de Grant: PI13/00794); www.ISCIII.es. reciclage FEDER "Una manera de hacer Europa". Agradecemos também a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca e FFIS para assistência e apoio administrativo. Finalmente, queremos dar um agradecimento especial ao Dr. Isabel Martínez-Argudo e a Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, a Universidad Castilla la Mancha, Toledo pelo apoio gentil em ceder de bom grado a Biomedicina e biotecnologia laboratório para tornar possível a filmada parte deste trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
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