Summary
Эта рукопись описывает, как разрез как поражения на искусственный эпителиальных клеток монослои удобно модель раны исцеления в пробирке, позволяя для воображения, конфокальная или лазерная сканирующая микроскопия, и которые могут обеспечить высокое качество количественные и качественные данные для изучения поведения клеток и механизмы, участвующие в миграции.
Abstract
Миграции клеток является обязательным аспектом для заживления ран. Создание искусственных раны на животных моделях исследования часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, хотя потенциально не хватает точности. В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает подходящую платформу для исследования миграционных поведение ячейки в заживлении ран и влияние лечения на эти клетки. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются в условиях не притока; Однако этот подход может не напоминают природные условия заживления. Нарушения целостности эпителия механическими средствами создает реалистичной модели, но могут препятствовать применению молекулярных методов. Следовательно, микроскопии основанные методы являются оптимальными для изучения миграции эпителиальных клеток в пробирке. Здесь мы подробно два конкретных методов, искусственного рану скретч пробирного и Фронт assay искусственных миграции, который может получить количественные и качественные данные, соответственно, на мигрирующих производительность эпителиальных клеток.
Introduction
Клетки миграции необходим для заживления ран, как он несет ответственность за окончательное закрытие эпителиальных разрыва и восстановлению нарушенных поверхности1. Выполнение искусственных раны в животных моделях позволяет для репликации этого сложного процесса в физиологических условиях2. Однако этот подход часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, которые потенциально не хватает точности для изучения различных процессов, из-за сложного характера процесса заживления раны.
В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает полезной альтернативой животных моделей для изучения роли, которую эти клетки играют в заживлении ран и эффекты лечения на мигрирующих поведение клеток. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются на молекулярных методов с использованием не притока культур3,4,5,6; Однако нарушение целостности эпителия обычно достигается тонкой механической разрезов. В культуре клеток это означает, что незначительное количество клеток могут быть подвержены разрыва раны, и они представляют собой образец слишком мал для методы молекулярной биологии. Однако эти поражения могут быть изучены в микроскопических масштабе, воспользовавшись врожденной мигрирующих свойств некоторых эпителиальных клеток линий, например норки легких эпителиальных клеток (Mv1Lu) или клеток кератиноцитов спонтанно увековечен человека (HaCaT) линии.
Здесь мы описали метод для микроскопии, которая подходит для получения количественных данных о миграции эпителиальных клеток в контексте заживления3,4,,78. Кроме того мы представляем дополнительные методы, которые будут полезны для изучения качественно молекулярных и морфологических изменений, происходящих на эпителиальные монослои во время миграции. В целом эти методы предоставляют основу для изучения динамики и морфологических изменений, связанных с поведением эпителиальных клеток и ответ на лечение во время заживления ран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. искусственные рану скретч Assay количественных исследований
- Подготовка клетки однослойная
- Работая в стерильных условиях, семян и расти Mv1Lu или HaCaT эпителиальных клеток в культуре колбы с использованием сыворотки дополнено средней. Обновление среды один раз каждые 24-48 ч. После того, как клетки достигают 80% слияния, отсоедините клеток с использованием соответствующего метода, т.е., trypsinization9.
Примечание: Mv1Lu и HaCaT эпителиальных клеточных линий культивируемых с помощью EMEM и DEMEM питательной среды, соответственно, с 2 мм L-глютамина и инкубировали при 37 ° C с контролируемой атмосферой 5% CO2. Каждая линия клетки должна тщательно assayed для определения концентрации клеток и сроков, необходимых для достижения полного confluency. Обычно для Mv1Lu или HaCaT клеток, 2-4 х 104 или 4-6 x 104 клетки/Ну, соответственно, являются семенами в колбе культуры2 175 см, и на 80% слияния дает до 35 x 106 Mv1Lu или 1 x 10-7 HaCaT клетки. - В любой 12-ну или 24-ну культуры пластины семян в каждой скважине 2 мл клеток. Обновите среднего, один раз каждые 24-48 ч. числа клеток обеспечить достаточно высока, чтобы достичь 100% слияния после 2 или 3 дня.
- После того, как клетки достичь слияния, удалите сыворотки дополнено средней и дважды промыть свежей сыворотки бесплатно среднего. Держите клетки в сыворотки свободной среде за 24 ч до царапин.
Примечание: Mv1Lu или HaCaT клетки не имеют специальные подложки требований; Однако для линий клетки подвержены отсоединение спонтанно в условиях свободной от сыворотки, предварительное покрытие поверхности плиты культуры с помощью поли L-лизин решения следует рассматривать10.
- Работая в стерильных условиях, семян и расти Mv1Lu или HaCaT эпителиальных клеток в культуре колбы с использованием сыворотки дополнено средней. Обновление среды один раз каждые 24-48 ч. После того, как клетки достигают 80% слияния, отсоедините клеток с использованием соответствующего метода, т.е., trypsinization9.
- Однослойная царапин
- Работая в стерильных условиях, поцарапайте культуры монослоя перетаскиванием твердо узкий конец 20 мкл или 200 мкл стерильные микропипеткой кончиком, в зависимости от желаемой ширины нуля. Держите кончик перпендикулярно поверхности культуры увеличить разрыв однородности.
- Поместите пластины для культуры над темной поверхности четко контролировать монослое клеток. При необходимости выполните два перпендикулярных царапины (кросс образный) на каждом хорошо учиться до 4 миграции областей.
- Стирать отдельные клетки, аккуратно удалив питательной среды и осторожно добавить свежие среднего сыворотки бесплатно. Повторить два раза, или до тех пор, пока наиболее неприсоединенной клетки были удалены.
- Работая в стерильных условиях, поцарапайте культуры монослоя перетаскиванием твердо узкий конец 20 мкл или 200 мкл стерильные микропипеткой кончиком, в зависимости от желаемой ширины нуля. Держите кончик перпендикулярно поверхности культуры увеличить разрыв однородности.
- Экспериментальная процедура и сбор данных
- Принимать до 4 Предварительная обработка исходных образов, сосредоточены на скретч разрыв от каждой хорошо с помощью микроскопа Перевернутый фазово контрастной включения ПЗС-камеры. Выберите интерес областях, совместив края поля микроскопа рядом пересечение царапин.
Примечание: Как правило, изображения приобретаются с использованием 10-кратным увеличением и размер изображения 1280 x 1024 пикселей. Выбор областей интереса как описано выше помогает для легкой локализации и проверки до 4 измерений в колодец. - После того, как все фотографии приобретаются, назначать лечение скважин; Обмен в среду в скважинах с свежей среды, которая содержит выбранный лечения.
Примечание: в качестве альтернативы, для химических веществ и соединений, которые не нарушают однородность питательной среды, лечение может быть прививанным непосредственно в среде культуры. - Инкубируйте почесал пластины (37 ° C с контролируемой атмосферой, содержащих 5% CO2) до условиях наблюдения достичь 90% нуля разрыва. Избегайте полного закрытия.
Примечание: Общее сокращение разрыва аннулирует коллекции изображений после лечения, как ссылка районы не обнаруживаются и не удается установить привязки по времени для закрытия разрыва. В случае Mv1Lu или HaCaT клетки 16-19 h обязаны достичь 90% слияния. - Остановить миграции клеток, фиксируя клетки; аккуратно замените экспериментальных питательной среды с 1 мл 4% формалина в PBS. Инкубируйте 15 мин на RT.
- Вымыть клетки, чтобы удалить избыток формалин; аккуратно замените свежим PBS решение в скважинах. Повторите по крайней мере два раза.
Примечание: На данном этапе, после запечатывания, пластины может храниться при температуре 4 ° C на неопределенный срок. - Принимать после лечения ссылки изображения каждой скважины от первоначальных районов ведения захвачен после царапин. Используете же оборудование (Перевернутый оптических фазово контрастной Микроскоп включения CCD камера) и соответствующие настройки изображения (увеличение и цифровой резолюции/плотность).
Примечание: Для клеток, которые мигрируют в отдельности и заполнить пробел независимо от формирования согласованного фронта (например, клетки человека рак груди MDA-MB-231), курс изображения может позволить расчет скорости миграции отдельных клеток.
- Принимать до 4 Предварительная обработка исходных образов, сосредоточены на скретч разрыв от каждой хорошо с помощью микроскопа Перевернутый фазово контрастной включения ПЗС-камеры. Выберите интерес областях, совместив края поля микроскопа рядом пересечение царапин.
- Анализ изображений и количественная оценка миграции
- С помощью обработки изображений программное обеспечение (например, ImageJ), определить границы нуля разрыв и определяют разрыв поверхности до четырех измерений в предварительной обработки изображений. Записать данные в виде «разрыв предварительной обработки поверхности» (PREGAP). Повторите ту же процедуру для последующей обработки изображений. Запишите данные «разрыв после лечения поверхность» (POSTGAP).
- Откройте записанное изображение с помощью ImageJ. В меню «изображение», задайте тип изображения 8 бит. В меню «процесс» перейдите в меню «Фильтры» и применить фильтр «отклонение».
- В меню «изображение», введите «настроить» подменю и порога черно-белый (B & W), убедитесь в том, что «Темный фон» не выбран. В меню «процесс» перейдите в подменю «двоичный» и выберите «заполнить дыры».
- В меню «Анализ» выберите «установить измерений» и активировать «район». Затем нарисуйте измеримые области после миграции край контура таким образом делимитации разрыв.
- В меню «Анализ» выберите «анализировать частицы» и записывать значения «площадь» Рисованные площадь поверхности.
- Ввести значения PREGAP и POSTGAP Общая площадь в электронную таблицу для количественного определения абсолютной миграции как разница разрыв поверхности измерений для каждого набора отдельных образцов: PREGAP − POSTGAP [произвольной единицы]. Кроме того, нормализации абсолютной миграции данных каждого состояния для контрольных образцов: (образец / управления) * 100 [%].
Примечание: Для клеток, которые мигрируют в отдельности и заполнить пробел независимо от формирования согласованного фронта, (например, клетки человека рак груди MDA-MB-231), абсолютной миграции может рассчитываться путем подсчета клеток, вторжение в центральной полосы либо в элемент управления или обработанные образцы. - Участок количественная оценка результатов (см. Рисунок 1). Выполните статистический анализ, при необходимости.
- С помощью обработки изображений программное обеспечение (например, ImageJ), определить границы нуля разрыв и определяют разрыв поверхности до четырех измерений в предварительной обработки изображений. Записать данные в виде «разрыв предварительной обработки поверхности» (PREGAP). Повторите ту же процедуру для последующей обработки изображений. Запишите данные «разрыв после лечения поверхность» (POSTGAP).
2. искусственный миграции фронт Assay для топографических исследований
- Подготовка клетки однослойная
- Работая в стерильных условиях, место одного слоя стерилизовать круглые coverslips в пустой культуры пластины до тех пор, пока пластины поверхность полностью покрыта.
Примечание: До 12 и 33 coverslips помещается на 5 см и 10 см диаметр тарелки, соответственно. - На табличке культуры аккуратно семян достаточное количество клеток на концентрацию, что позволяет 100% слияния после 2 или 3 дня. Убедитесь, что не coverslip перекрывается соседних coverslips и предотвращения coverslips от плавающих, применяя мягкое давление с стерильных микропипеткой наконечником. Обновите носитель каждые 24-48 ч.
Примечание: Каждая линия клетки должна тщательно assayed для определения концентрации клеток и сроков, необходимых для достижения полного confluency. Обычно для Mv1Lu или HaCaT клеток, 2-3 х 106 или 2,5-4 х 106 клеток/10 см диаметр пластины, соответственно, являются семенами. Для небольших пластин необходимо сократить число клеток. - После того, как клетки достичь слияния, удалить сыворотки дополнено средней и заменить свежей сыворотки бесплатно среды. Держите клетки в сыворотки свободной среде за 24 часа, прежде чем производится искусственное рану.
Примечание: Mv1Lu или HaCaT клетки не имеют специальные подложки требований; Однако для линий клетки восприимчивыми по отключению спонтанно в сыворотки свободных условиях, предварительно покрытие поверхности культуры с помощью поли L-лизин решения следует рассматривать10.
- Работая в стерильных условиях, место одного слоя стерилизовать круглые coverslips в пустой культуры пластины до тех пор, пока пластины поверхность полностью покрыта.
- Однослойная ранив
- С помощью стерильных пинцетов, аккуратно перенести coverslip чистой 10 см пластины, содержащие свежей сыворотки бесплатно среднего. Избегайте повреждения монослоя, удерживая coverslip на периферии с помощью пинцета. Избегайте чрезмерного давления, которое может привести к поломке coverslip.
- Создание искусственных раны, перетащив стерилизованные лезвия бритвы в поперечной линии над центром coverslips. Перетащите туда и обратно, 3-4 мм для того, чтобы полностью удалить полосе центральной монослоя. Убедитесь в том, что никакого мусора клеток остается прикрепленным к краям раненых.
Примечание: на 12-мм диаметром раунд coverslip, делается надрез в середине из coverslip. Убедитесь в том оставить полоска клеток напротив главного фасада, достаточно большой (по крайней мере 2 мм) во избежание наклона coverslip в следующих шагах. - Передача раненых coverslips с ячейками вверх, к чистой 6-ну пластины содержащий по крайней мере 2 мл свежей сыворотки бесплатно среднего. Подходит до 4 раненых coverslips/хорошо.
- Осторожно промыть два раза свежих сыворотки свободный средних удалить отдельные клетки.
- Экспериментальная процедура и выборки
- Аккуратно обмен в среду в скважинах с свежей среды, которая содержит выбранный лечения.
Примечание: в качестве альтернативы, для химических веществ и соединений, которые не нарушают однородность питательной среды, лечение может быть прививанным непосредственно в среде культуры. Продолжайте с осторожностью во избежание любого потенциального отряд ячейки. - Держите пластину внутри клетки инкубатора (37 ° C, 5% CO2) для желаемого экспериментальной сроков.
- Остановить миграции клеток, фиксируя клетки; аккуратно замените экспериментальных питательной среды с 1 мл 4% формалина в PBS. Инкубируйте 15 мин на RT.
Примечание: На время курса экспериментов, удалить образцы из плиты культуры и исправить их в отдельную тарелку чтобы избежать испарения формалин, сказывается на других, текущих экспериментальных условиях. - Вымыть клетки, чтобы удалить избыток формалин; аккуратно замените свежим PBS решение в скважинах. Повторите по крайней мере два раза.
Примечание: На данном этапе, после запечатывания, пластины может храниться при температуре 4 ° C на неопределенный срок.
- Аккуратно обмен в среду в скважинах с свежей среды, которая содержит выбранный лечения.
- Топологический анализ и иммунофлюоресценции (если)
- Выполните если окрашивание и изображений на отдельных coverslips как описано в других разделах3,4,11.
- Разрушения на 10 мин, погружая coverslips в 0,3% раствора Triton X-100 в PBS.
- Блок для 30 мин, с использованием следующих блокирования решения: 0,3% альбумина Bovine сыворотки; 10% плода бычьим сывороточным; 5% обезжиренное молоко; 0,3% раствор Triton X-100 в PBS.
Примечание: Блокирование решение без молока можно заранее подготовлены и хранятся при температуре-20 ° C. - Инкубируйте 1 час при комнатной температуре внутри влажной камере, с основного антитела, разводят в молоко бесплатно блокирования решения. Место coverslips вверх вниз в решении 15 мкл антител для обеспечения надлежащего распределения.
Примечание: Рабочие разбавления антитела является переменной и будет зависеть от антител в использовании. Например антитела анти c-Jun кролик требует разбавления 1/100. - Вымойте три раза путем погружения coverslips в в 0,1% раствор Triton X-100 в PBS.
- Инкубируйте coverslips в вторичное антитело, разбавленных в молоко бесплатно блокирующий буфер для 30 мин.
Примечание: Рабочие разбавления антитела является переменной и будет зависеть от антител в использовании. К примеру коза анти кролик (488) требует разбавления 1/400 для оптимального разрешения. Другие маркировки реагентов как Фаллоидин и Хехст-33258 могут добавляться в буфер инкубации на данном этапе. - Вымойте три раза путем погружения coverslips в 0,1% раствор Triton X-100 в PBS.
- Маунт coverslips вверх вниз в 10 мкл монтажа СМИ капли (например, Vectashield) на микроскопа. Оставьте слайды в темноте при комнатной температуре на ночь для монтажа средних закалки. Впоследствии хранить при 4 ° C в темноте на неопределенный срок.
- Получите эпифлуоресцентного либо confocal микроскопии изображений структурных изменений, происходящих на перенос передний край.
Примечание: Топологических исследования могут выполняться черепица фотографии от миграции фронта внутренняя монослоя. Возможно, программное обеспечение на основе анализа интенсивности флуоресценции местных полуколичественных исследований.
- Выполните если окрашивание и изображений на отдельных coverslips как описано в других разделах3,4,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Искусственные рану скретч Assay количественных исследований: оценки эпидермального фактора роста (EGF) содействие миграции:
EGF является известный индуктор распространения эпителиальных клеток и миграции, и таким образом положительный контроль для количественной оценки миграции продвижение. Mv1Lu и HaCaT клеток монослои были использованы в рану скретч анализов и предварительной обработки изображений были получены. После прививки с 10 нг/мл EGF клетки инкубировали для 19 h до фиксации и последующей обработки изображений. Распространения было сведено к минимуму путем поддержания условий голода сыворотки. Как до, так и после лечения наборы фотографий были проанализированы с помощью ImageJ и были определены районы Центральной разрыв. Эксперимент был выполнен в двух экземплярах, регистрация четыре измерения для каждой скважины. Количественное определение абсолютной миграции была рассчитана как разница поверхностей: (PREGAP − POSTGAP). Там был больше миграционным потенциалом в стимулированных клетках Mv1Lu (рис. 1A) по сравнению с стимулировали HaCaT клеток (рис. 1B). Различия объясняются источников клетки, будучи эпителиальные клетки слизистой оболочки и кожи кератиноцитов, соответственно.
Фронт Assay искусственные миграции для топографических исследований: изменения цитоскелета конформации и пространственное выражение C-Jun:
Миграции клеток предполагает непрерывное и глубокие изменения цитоскелета структуры для поддержания клеток перемещения. HaCaT клетки монослои были использованы в передней анализов миграции условиях управления и стимулирования. Лечение с EGF потенцирует цитоскелета динамики, которые наблюдаются, если и лазерная сканирующая микроскопия (LSM; Рисунок 2A). Также результаты лечения EGF надежные киназы Mitogen-Activated белка (карта) сигнализации и c-JUN гиперэкспрессия. Черепица LSM изображения позволяет конфигурации пространственных структур. Увеличение выражение c-JUN на клетки, прилегающих к переносу фронт может быть легко раскрыта путем анализа изображений программного обеспечения; Здесь мы ввели шкалу Радуга для зеленого канала, которые соответствуют c-JUN маркировки (Рисунок 2Б).
Рисунок 1. Содействие миграции, EGF в клетках Mv1Lu и HaCaT. Фазово контрастной микроскопии изображения раненых области Mv1Lu (A) и HaCaT (B) клетки были взяты под контроль условий и по сравнению с изображения клетках, обработанных с 10 нг/мл EGF 19 ч в условиях свободной от сыворотки. Представитель микроскопии показывают степень скретч разрыв и закрытие, полученные после ранения с наконечником микропипеткой 20 мкл. Увеличение = 10 x; Шкалы бар = 100 µm. ячейки миграции был количественно и представлял как различия в области различий между процедурами и контрольных образцов для калибровочных (условные единицы; АС). Сюжет – представитель восьми независимых измерений для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Филаментов актина и изменения выражения c-JUN, пропагандируемые EGF в мигрирующих клеток HaCaT. (A) ночь 10 нг/мл EGF лечение способствует глубокие изменения в конформации филаментов актина в перенос HaCaT клеток. Клетки в начале миграции управления условий изобразить цитоскелета филаментов актина жестко структурированных, в то время как клетки лечат EGF Показать бедных миозина нитей Организации на фронте миграции. Увеличение = 63 x; Шкалы бар = 20 мкм. F-актина является красным цветом, и "Хёхст" представлена синим цветом. (B) когда иммуно флуоресценции используется в комбинации с LSM imaging для изучения c-JUN выражение после 10 нг/мл EGF лечения на перенос HaCaT клетки, черепица композиции показывают пространственное выражение шаблонов. Изображения c-Jun флуоресценции (зеленый) были преобразованы в псевдо-цвет, чтобы показать интенсивность окрашивания c Июн. Шкала цветов радуги представляет интенсивности флуоресценции для c-Jun, соответствующее палитрами на правой панели для EGF и управления. Пятнать совместно с Фаллоидин (красный) и "Хёхст"-33258 (синий) был использован для Показать клеточной структуры и ядер, соответственно. Изображения были взяты конфокального микроскопа. Обратите внимание на все большее выражение уровня ядерной c июня в районах приближается к миграции фронт. Шкалы бар = 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После кожи или слизистой нарушения барьер функция восстанавливается действиями многочисленных типов клеток, включая фибробластов или иммунной и эпителиальных клеток. Слитно, эти клетки проходят комплекс процесса с участием апоптоза, распространения, дифференциация и главное, фибробластов и эпителиальных клеток миграции, который является конечной механизма, ответственного за восстановление нарушенных тканей и Закрытие поверхностные эпителиальные разрыв1,12 таким образом, изучение клеток миграции помогает точно описать физиологические поведение эпителиальных клеток, а также определения модулирующее потенциал лечение ране исцеление.
Выполнение искусственных раны на животных моделях различных исследований позволяет для репликации этого сложного процесса в физиологических условиях2и таким образом оценку некоторых патологических состояний или эффекты фармацевтической лечение13. Однако этот подход часто приводит к дорогостоящим и сложным логистики, а также экспериментальных обременительные процедуры, которые могут генерировать данные в задержки моды13. Напротив в пробирке культуры клеток обеспечивает более удобной основой для исследования поведение клеток, участвующих в процесс заживления. В то время как культуры главной ячейки эпителиальных клеток является жизнеспособным вариантом, это может быть трудно получить и обработать клетки, которые могут осложнить сбора данных. Например в дополнение к типичным низкий проход ограничения первичных культур, первичный человеческие кератиноциты нужно фибробластов, кормления слой для роста в пробирке3. Напротив устоявшихся эпителиальных клеток культуры линии, как Mv1Lu или HaCaT, составляют модель препятствие свободного исследования, особенности поведения и характеристик как в первичной культуре клеток3,4, 14,15. Точно для изучения заживление ран, эти два клеточных линий сохраняют критической черты в их способности переносить и остановить распространение за счет ингибирования контакт к ячейке после слияния16,17.
Царапинам анализов являются надежный и универсальный метод количественной оценки миграционных возможности различных типов клеток, особенно эпителиальных и раковые клетки. В случае раковых клеток для оценки инвазивного потенциала было предложено метод нуля. Однако этот подход терпит неудачу как индикатор для инвазии, когда по сравнению с более конкретных методов, полагаясь на выражение металлопротеаз, необходимые для проникновения внеклеточного матрикса18,19. Напротив скретч анализов являются надежными для оценки миграционных производительность эпителиальных клеток и влияние различных методов лечения на эту черту. В отличие от раковых клеток линии, которые часто показывают бедных сплоченности и способность расти на несколько слоев, Mv1Lu, HaCaT и другие эпителиальных клеток линии тесно связанные формы «рост острова», которые расширяют свои поля в процессе, в зависимости от того, как распространения, но более важно по миграции клеток. Следовательно условия плотность разреженных или югу вырожденная клеток обычно используются для изучения влияния различных методов лечения на мигрирующих физиологии; особенно, когда применяются методы последующих молекулярной биологии, как эта ячейка среды минимизирует контакт ингибирование хотя максимальное соотношение активно переход клеток. Однако для эпителиальных клеток, не являющихся притока условия создают риска исключения важные существующий контакт ингибирование влияний, например в виде эпигеномные регулирования. Таким образом учиться заживление ран, вырожденная условия дают увеличение точности модели.
Для получения точной оценки, должны решаться сопутствующих факторов, влияющих на конформацию слой эпителиальных клеток или способствующих миграции. Хотя желательно слияния, важно избежать плотность чрезмерного клеток или многослойный культур, поскольку может отрицательно сказаться на этих условиях. Таким образом, обычно под контролем распространение голода в сыворотке свободных СМИ или добавлением химических веществ, как митомицин C, которые необратимо арестовать пролиферации клеток ДНК сшивки3,20, 21. Использование одного или другого опирается на поведение конкретных клеточных линий; Митомицин C является особенно указали при уменьшении сыворотки добавок требуется избежать массовых клеток отряд. Что в случае ГЭС 293T клеток, где предварительного покрытия поверхности культуры с помощью поли L-лизин это хороший вариант, чтобы избежать Mytomycin C лечение. Релиз факторов воспаления, которые могут изменить миграции также необходимо решать. Были использованы различные стратегии, основана главным образом на силиконовые вставки имитировать нарушение поверхности эпителия, достигнутые с нуля пробирного22. В то время как пластины генерировать существующие пробелы, которые позволяют миграции клеток после удаления кусок силикона, скретч метод основывается непосредственно на устранение некоторых эпителиальных монослоя для создания разрыв. Предпочтения по как создать разрыв опирается на вставок способность защищать культуру покрытия (то есть, культуры пластины или поли L-лизин) от повреждения во время царапин, а также минимизации выпуска факторов от поврежденных клеток, которые могут компромисс клетки культуры поведения23. Хотя эти характеристики могут оказаться полезными для некоторых экспериментальных параметров, т.е. оценки способности раковые клетки мигрировать, в нашем опыте мы нашли существенные недостатки использования вставок в ранозаживляющее исследования. Mv1Lu клетки способны крепления на силиконовые вставки внешней поверхности, что приводит к непреднамеренно разрывая монослоя клеток после удаления части силикона. Кроме того хотя силиконовые не придают HaCaT клеток, мы нашли уменьшилась способность для эти клетки мигрируют в генерируемые Вставка пробелов. К этому степени, воспаление и миграции тесно связанных ответы, и они, как представляется, решающее значение в контексте заживления ран в HaCaT клетках. Кроме того поскольку применение пластикового наконечника для царапать поверхность культуры не очевидным следствием на способность клеток к повторно заполнить этот пробел, в случае HaCaT клетки, такое поведение свидетельствует о том, что остатки внеклеточного матрикса в разрыв может направлять миграции в Аналогичным образом как дермы в природные раны.Однако основным источником вариации остается царапин процедура сама, как использование пластикового наконечника чтобы рана не всегда сделать такой же разрыв размера. Мы наблюдали вариации до 20% среди различных образцов, из-за несоответствия давления и положение кончика в то время нуля. Эти различия могут быть решены путем ранив монослой с более жесткой объекта; Однако любой царапины на поверхности пластиковой поставит под угрозу свободное передвижение клеток. Таким образом изменения в первоначальный нуля должны приниматься во внимание для расчета переноса; как правило увеличивая количество измерений в состоянии.
Помимо количественной оценки ранив процедур вместе с классической если методы могут качественно оценить молекулярных процессов миграции клеток. Эпителиальных клеток способность расти на coverslips является известным; в прошлом вариации нуля assays участвуют клетки мигрируют на coverslips, в различных условиях, следуют фиксации и окраски для сравнения в рану нуля экспериментальной установки24. Здесь мы обнаружили, что создание широкого пробелы в монослои, растущих на coverslips позволяет для расширения экспериментальной время курсы3,4,7. Кроме того, в этих экспериментах, если увеличивает возможности обнаружения процедуры потенциально изучить любые точные механизмы клеточном и субклеточном вовлечены, и оно ограничивается только наличие антител, подходящих для этой техники и клетки интереса. Образцы на coverslips, используемый для если монтируются на скольжениях микроскопа, которые позволяют для длительного сохранения. Это помогает применение экспериментальных установок, которые требуют длительного изучения периодов, как «черепица» подходы продемонстрировали здесь и в других местах3,4,7. В то время как стратегия «черепица» интегрирует пространственных структур с временные данные для реконструкции механизмы, участвующие в миграции, реализация инструментов анализа программного обеспечения может предоставить полу количественные оценки, основанные на местных флуоресцирования интенсивность и далее обогащать качество полученной информации. По нашему опыту плитка также предлагает возможность изучения клеток позиционные информация для выражения белков в этот тип анализа. Эту информацию было показано, чтобы иметь решающее значение для понимания и лучше перевести последствия различных агентов миграции клеток, особенно в установках, где позиция эпителиальных клеток очень важна для определения его мигрирующих поведение3 ,4,14,15.
Обе процедуры, описанные продемонстрировать большое удобство неосложненной осуществления, а также производство качественных данных. Таким образом эти подходы, основанные на исследованиях микроскопии, предлагают уникальный и мощный рамки для изучения динамики и морфологические изменения участвующих в поведении эпителиальных клеток и ответ на лечение во время заживления ран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что нет никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы хотим дать благодаря пожилых членов лаборатории, которые помогают улучшить и совершенствовать эти методы в фактическое состояние: д -р Селия Мартинес-Мора; Д-р Анна Mrowiec, доктор Catalina Руис Каньяда и доктор Antonia Alcaraz Гарсия. Мы в долгу перед Clínico больница Университарио Virgen де ла Arrixaca для решительно поддержал разработку этих методов. Также Институт де Salud Карлоса III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. План Estatal I + D + I и y Salud Карлоса III-главное Генеральной де исследования де Instituto фоменто де ла Investigación (Грант №: ПЭ13/00794); www.isciii.ES. Fondos ФЕДЕР «hacer Una manera de Europa». Мы также благодарим Universidad de Murcia, Суммирующий-Arrixaca и FFIS для административной поддержки и помощи. Наконец, мы хотим дать отдельное спасибо доктор Изабель Мартинес-Argudo и латиноамериканского факультета de Ciencias y Ambientales Bioquímica, кампус парке де-ла-де-Армас завод, Universidad Кастилья Ла Манча, Толедо за их поддержку в охотно цедирование Биомедицины и биотехнологии лабораторию, чтобы сделать возможным снят частью этой бумаги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
