Summary
Detta manuskript beskriver hur snittet-liknande lesioner på odlade epitelial cell enskiktslager bekvämt modell såret helande i vitro, möjliggör avbildning av confocal eller laser scanning mikroskopi, och som kan ge hög kvalitet kvantitativa och kvalitativa data för att studera både cell beteende och mekanismerna som är involverade i flyttning.
Abstract
Cellmigration är en obligatorisk aspekt för sårläkning. Att skapa konstgjorda sår på forskning djurmodeller ofta resulterar i kostsamma och komplicerade experimentella rutiner, medan potentiellt saknar precision. In vitro kultur av epitelceller linjer ger en lämplig plattform för forska cell flyttande beteendet i sårläkning och effekten av behandlingar på dessa celler. Epitelceller fysiologi studeras ofta i icke-konfluenta villkor; Detta tillvägagångssätt kan dock inte liknar naturliga förutsättningar för sårläkning. Störa epitel integritet på mekaniskt sätt genererar en realistisk modell, men kan hindra tillämpningen av molekylärbiologiska metoder. Följaktligen, mikroskopi baserat tekniker är optimal för att studera epitelial cellmigration in vitro-. Här detalj vi två specifika metoder, konstgjorda såret scratch analysen och konstgjorda migration främre analysen, som kan få kvantitativa och kvalitativa data, respektive på flyttande prestanda av epitelceller.
Introduction
Cellmigration krävs för sårläkning, som ansvarar för den slutliga nedläggningen av epitelial klyftan och restaurering av störd ytan1. Utför artificiella sår i djurmodeller möjliggör replikering av denna komplexa process i nära fysiologiska villkor2. Dock leder detta synsätt ofta till kostsamma och komplicerade experimentella rutiner, som potentiellt saknar precision för att studera olika processer, intrikata pågrund av sårläkning processen.
In vitro kultur av epitelceller linjer ger ett bra alternativ till djurmodeller för forska den roll som dessa celler spelar i sårläkning och effekterna av behandling på cell flyttande beteende. Epitelceller fysiologi studeras ofta av molekylära tekniker använder icke-konfluenta kulturer3,4,5,6; störningar av epitel integritet uppnås dock vanligen genom fina mekaniska snitt. Cellodling innebär detta att försumbart antal celler kan utsättas för såret klyftan, och de utgör ett alltför litet urval för molekylärbiologi tekniker. Dock kan dessa lesioner studeras i mikroskopisk skala, utnyttja egenskaperna för medfödda flyttande av vissa epitelceller linjer, såsom Mink Lung epitelial cellen (Mv1Lu) eller cellen spontant förevigade mänskliga keratinocyter (HaCaT) linjerna.
Här har vi beskrivit en metod för mikroskopi som är lämplig att få kvantitativa uppgifter om migration av epitelceller i samband med sårläkning3,4,7,8. Dessutom presenterar vi ytterligare metoder som är bra att studera kvalitativt molekylära och morfologiska förändringar som sker på epitelial enskiktslager under migreringen. Sammantaget ger dessa metoder en ram för att studera både dynamik och morfologiska förändringar med epitelial cell beteende och svar på behandlingar under sårläkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. konstgjorda såret Scratch test för kvantitativa studier
- Cell enskiktslager förberedelse
- Arbetar under sterila förhållanden, utsäde och växa Mv1Lu eller HaCaT epitelceller i kultur kolvar på serum-kompletteras medium. Uppdatera medium en gång varje 24-48 h. När celler når 80% sammanflödet, lossa celler med hjälp av en lämplig metod, dvs., trypsinization9.
Obs: Mv1Lu HaCaT epitelial cell linjer odlas med hjälp av EMEM och DEMEM odlingsmedium, respektive, kompletterat med 2 mM L-glutamin och inkuberas vid 37 ° C med kontrollerad atmosfär av 5% CO2. Varje cellinje måste analyseras noggrant för att avgöra cellkoncentrationen och timing som krävs för att nå full konfluens. Typiskt för Mv1Lu eller HaCaT celler, 2-4 x 104 eller 4-6 x 104 celler per brunn, respektive är seedade i en 175 cm2 kultur kolv, och på 80% sammanflödet ger upp till 35 x 106 Mv1Lu eller 1 x 107 HaCaT celler. - I antingen en 12-väl eller 24 brunnar kultur plattan frö i varje brunn 2 mL av celler. Uppdatera medium när varje 24-48 h. se till att cell nummer är tillräckligt hög för att nå 100% sammanflödet efter 2 eller 3 dagar.
- När cellerna når sammanflödet, ta bort serum-kompletteras medium och tvätta två gånger med färska serumfritt medium. Håll celler i serumfritt medium för 24 h innan det kliar.
Obs: Mv1Lu eller HaCaT celler inte har speciella substrat krav; dock för cellinjer mottagliga för du lossar spontant i serumfritt villkor, bör före beläggning av kultur platta ytan med hjälp av en poly-L-lysin lösning övervägas10.
- Arbetar under sterila förhållanden, utsäde och växa Mv1Lu eller HaCaT epitelceller i kultur kolvar på serum-kompletteras medium. Uppdatera medium en gång varje 24-48 h. När celler når 80% sammanflödet, lossa celler med hjälp av en lämplig metod, dvs., trypsinization9.
- Enskiktslager repor
- Arbetar i en steril miljö, repa den kultur enskiktslager genom att stadigt dra den smala änden av en 20 µL eller 200 µL steril mikropipett spets, beroende på önskad scratch bredd. Håll spetsen vinkelrätt mot kultur ytan att maximera gap homogenitet.
- Placera kultur plattorna över en mörk yta att tydligt övervaka den cell enskiktslager. Utför två vinkelräta repor (korsformade) på varje brunn för att studera upp till 4 migration områden vid behov.
- Tvätta fristående celler genom att försiktigt avlägsna odlingsmedium och försiktigt lägga färska serumfritt medium. Upprepa två gånger, eller tills mest obundna celler har tagits bort.
- Arbetar i en steril miljö, repa den kultur enskiktslager genom att stadigt dra den smala änden av en 20 µL eller 200 µL steril mikropipett spets, beroende på önskad scratch bredd. Håll spetsen vinkelrätt mot kultur ytan att maximera gap homogenitet.
- Experimentell förfarande och datainsamling
- Ta upp till 4 förbehandling referensbilder centrerad på scratch gap från varje brunn med hjälp av en inverterad faskontrastmikroskop som införlivar en CCD-kamera. Välj intresseområden genom att rikta in kanten av mikroskopfält intill korsningen mellan repor.
Obs: Vanligtvis bilder förvärvas med hjälp av en 10 x förstoring och en 1,280 x 1,024 pixel bildstorlek. Att välja intresseområden som beskrivs ovan hjälper för enkel lokalisering och validering av upp till 4 mätningar per brunn. - När alla bilder är förvärvat, utse behandling brunnar; utbyta mediet i brunnarna med färska medium som innehåller valda behandlingar.
Obs: Alternativt för kemikalier eller föreningar som inte stör odlingsmedium homogenitet, behandlingar kan ympas direkt i odlingsmediet. - Inkubera repad plattan (37 ° C med kontrollerad atmosfär som innehåller 5% CO2) tills villkoren enligt observation reach 90% scratch gap stängning. Undvik full stängning.
Obs: Totalt gap stängning upphäver efterbehandling bildsamling som referens områden är inte upptäckas och tid som referens för gap stängning inte kan fastställas. När det gäller Mv1Lu eller HaCaT celler krävs 16-19 h för att nå 90% sammanflödet. - Stoppa cellmigration genom att fastställa cellerna; försiktigt ersätta experimentella odlingssubstratet med 1 mL 4% formalin i PBS. Inkubera i 15 min på RT.
- Tvätta cellerna för att ta bort överflödig formalin; försiktigt ersätta lösningen i brunnarna med färska PBS. Upprepa minst två gånger.
Obs: I det här skedet efter tätning, plattor kan lagras vid 4 ° C på obestämd tid. - Ta efter behandling referensbilder av varje brunn från ursprungliga referens områden fångat efter repor. Använda samma utrustning (inverterad optiska faskontrastmikroskop införliva en CCD-kamera) och matchande bildinställningar (förstoring och digital upplösning/täthet).
Obs: För celler som migrerar individuellt och fylla gapet oberoende av bildandet av en sammanhängande front (t.ex., MDA-MB-231 mänskliga bröstcancerceller), tidsförlopp bilderna kan beräkningen av enskild cell migration hastigheter.
- Ta upp till 4 förbehandling referensbilder centrerad på scratch gap från varje brunn med hjälp av en inverterad faskontrastmikroskop som införlivar en CCD-kamera. Välj intresseområden genom att rikta in kanten av mikroskopfält intill korsningen mellan repor.
- Bildanalys och kvantifiering av migration
- Använda bildbehandlingsprogram (t.ex., ImageJ), definiera scratch gap gränser och bestämma gap ytan för upp till fyra mätningar i förbehandling bilder. Registrera data som ”förbehandling gap yta” (PREGAP). Upprepa samma procedur för efterbehandling bilder. Registrera data som ”efterbehandling gap yta” (POSTGAP).
- Öppna inspelade bilden med ImageJ. I menyn ”bild”, ange bildtypen till 8 bitar. I menyn ”process”, gå till ”filter” undermeny och tillämpa ”avvikelse” filtrering.
- Ange i menyn ”bild”, ”justera” undermeny och inställd tröskel till svart och vitt (B & W), kontrollera ”mörk bakgrund” inte är markerad. I menyn ”process”, gå till ”binär” undermeny och välj ”Fyll hål”.
- I menyn ”analysera”, Välj ”Ange mått” och aktivera ”område”. Rita sedan det mätbara området efter migrera kanten konturen därmed avgränsar klyftan.
- I menyn ”analysera”, Välj ”analysera partiklar” och ”totala area”-värden för dragna området ytan.
- Införa PREGAP och POSTGAP totala areal värden i ett kalkylblad att kvantifiera absoluta migration för varje uppsättning enskilda prover som skillnaden mellan gap yta mätningar: GÖMT − POSTGAP [godtyckliga enheter]. Dessutom kan normalisera absoluta migreringsdata för varje villkor att kontrollprover: (prov / kontroll) * 100 [%].
Obs: För celler som migrerar individuellt och fylla gapet oberoende av bildandet av en sammanhängande front, (t.ex., MDA-MB-231 mänskliga bröstcancerceller), absoluta migreringen kan beräknas genom att räkna celler som invaderar en central remsa antingen i kontrollen eller de behandlade proverna. - Rita kvantifiering utgångar (se figur 1). Utföra statistiska analyser vid behov.
- Använda bildbehandlingsprogram (t.ex., ImageJ), definiera scratch gap gränser och bestämma gap ytan för upp till fyra mätningar i förbehandling bilder. Registrera data som ”förbehandling gap yta” (PREGAP). Upprepa samma procedur för efterbehandling bilder. Registrera data som ”efterbehandling gap yta” (POSTGAP).
2. konstgjorda Migration främre Assay för topografiska studier
- Cell enskiktslager förberedelse
- Arbetar i sterila förhållanden, placera ett skikt av steriliserad runda coverslips i tomma kultur plattor tills plattans yta är helt täckt.
Obs: Upp till 12 och 33 coverslips passar på 5 cm och 10 cm diameter plattor, respektive. - På kultur plattan, försiktigt frö en lämplig volym av celler vid en koncentration som gör 100% sammanflödet efter 2 eller 3 dagar. Kontrollera att inga täckglas överlappar intilliggande coverslips och förhindra coverslips från flytande genom att tillämpa mild tryck med en steril mikropipett spets. Uppdatera mediet varje 24-48 h.
Obs: Varje cellinje måste analyseras noggrant för att avgöra cellkoncentrationen och timing som krävs för att nå full konfluens. Typiskt för Mv1Lu eller HaCaT celler, är 2-3 x 106 eller 2,5-4 x 106 celler/10 cm-diameter tallrik, respektive seedade. För mindre tallrikar, måste cell nummer skalas. - När cellerna når sammanflödet, ta serum-kompletteras medium och ersätta med färsk serumfritt medium. Hålla cellerna i serumfritt medium för 24 h innan konstgjorda såret utförs.
Obs: Mv1Lu eller HaCaT celler inte har speciella substrat krav; dock för cellinjer tillgodogöras du lossar spontant i serumfritt villkor, bör före beläggning av kultur ytan med hjälp av en poly-L-lysin lösning övervägas10.
- Arbetar i sterila förhållanden, placera ett skikt av steriliserad runda coverslips i tomma kultur plattor tills plattans yta är helt täckt.
- Enskiktslager såra
- Med hjälp av steril pincett, försiktigt flytta ett täckglas till en ren 10 cm platta som innehåller färska serumfritt medium. Undvika att skada enskiktslager genom att hålla täckglaset i periferin med pincett. Undvik överdrivet tryck som kan resultera i täckglas brott.
- Skapa konstgjorda sår genom att dra en steriliserad rakblad i en tvärgående linje över mitten på coverslips. Dra 3-4 mm och tillbaka, för att helt ta bort den centrala enskiktslager remsan. Kontrollera att inga cellfragment sitter kvar på sårade kanterna.
Obs: på en 12-mm diameter runda täckglas, snittet läggs på i mitten av täckglaset. Se till att lämna en strimma av celler mittemot viktigaste fronten tillräckligt stor (minst 2 mm bred) att undvika vippning av täckglaset i följande steg. - Överföra sårade coverslips med celler uppåt, till en ren 6-väl tallrik innehållande minst 2 mL färsk serumfritt medium. Passa upp till 4 sårade coverslips per brunn.
- Försiktigt tvätta två gånger med färska serumfritt medium att avlägsna fristående celler.
- Experimentell förfarande och provtagning
- Försiktigt utbyta mediet i brunnarna med färska medium som innehåller valda behandlingar.
Obs: Alternativt för kemikalier eller föreningar som inte stör odlingsmedium homogenitet, behandlingar kan ympas direkt i odlingsmediet. Fortsätt med försiktighet för att undvika eventuella potentiella cellen avlossning. - Hålla plattan inuti en cell inkubator (37 ° C, 5% CO2) för önskad experimentella tidpunkten.
- Stoppa cellmigration genom att fastställa cellerna; försiktigt ersätta experimentella odlingssubstratet med 1 mL 4% formalin i PBS. Inkubera i 15 min på RT.
Anmärkning: För gången kurs experimenterar, ta proverna från kultur plattan och fixa dem i en separat tallrik för att undvika formalin ångor som påverkar de andra, pågående experimentella förhållandena. - Tvätta cellerna för att ta bort överflödig formalin; försiktigt ersätta lösningen i brunnarna med färska PBS. Upprepa minst två gånger.
Obs: I det här skedet efter tätning, plattor kan lagras vid 4 ° C på obestämd tid.
- Försiktigt utbyta mediet i brunnarna med färska medium som innehåller valda behandlingar.
- Immunofluorescens (om) och topologisk analys
- Utför om färgning och imaging på enskilda coverslips som beskrivs på andra ställen3,4,11.
- Permeabilize för 10 min av nedsänkning coverslips i en lösning med 0,3% Triton x-100 i PBS.
- Block för 30 min med hjälp av följande blockerande lösning: 0,3% bovint serumalbumin; 10% fetalt bovint Serum; 5% lättmjölk; 0,3% Triton x-100 lösning i PBS.
Obs: Blockera lösning utan mjölk kan förberedas i förväg och förvaras vid-20 ° C. - Inkubera i 1 h i rumstemperatur i en fuktig kammare, med primär antikropp utspätt i mjölkfri blockerande lösning. Placera coverslips uppochner i 15 µL antikropp lösningen att säkerställa korrekt fördelning.
Obs: Antikropp arbetsutspädningen varierar och beror på antikroppen i användning. Den kanin-anti-c-Jun-antikroppen kräver exempelvis en 1/100 utspädning. - Tvätta tre gånger genom att doppa coverslips i en i lösning 0,1% Triton x-100 i PBS.
- Inkubera i coverslips i sekundär antikropp utspätt i mjölkfri blockerande buffert för 30 min.
Obs: Antikropp arbetsutspädningen varierar och beror på antikroppen i användning. Get-anti-kanin (488) kräver till exempel en 1/400 utspädning för optimal upplösning. Annan märkning reagens såsom phalloidin och Hoechst-33258 kan läggas till inkubation bufferten i detta skede. - Tvätta tre gånger genom att doppa coverslips i lösning 0,1% Triton x-100 i PBS.
- Montera coverslips uppochner i en 10 µL montering media droppe (t.ex., Vectashield) placeras på ett objektglas. Lämna bilder i mörker vid rumstemperatur över natten för montering medium härdning. Därefter förvaras vid 4 ° C i mörker på obestämd tid.
- Skaffa antingen epifluorescence eller konfokalmikroskopi bilder av strukturella förändringar som sker i Migrera framkant.
Obs: Topologisk studier kan utföras av plattsättning bilder framifrån migrerar till den inre enskiktslager. Semikvantitativ studier är möjligt genom mjukvara baserad analys på lokala fluorescens stödnivåer.
- Utför om färgning och imaging på enskilda coverslips som beskrivs på andra ställen3,4,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstgjorda såret Scratch test för kvantitativa studier: bedömning av Epidermal Growth Factor (EGF) främjande av Migration:
EGF är en känd inducerare av epitelceller spridning och migration, och därmed en positiv kontroll för att kvantifiera migration främjande. Mv1Lu och HaCaT celler enskiktslager användes i såret scratch analyserna och förbehandling bilder erhölls. Efter inokulering med 10 ng/mL EGF inkuberades celler för 19 h före fixering och efterbehandling bilder. Spridning hölls till ett minimum genom att bibehålla serum svält villkor. De centrala gap områdena bestämdes och både före och efter behandling uppsättningar av bilder analyserades med hjälp av ImageJ. Försöket kördes i två exemplar, registrera fyra mätningar för varje brunn. Kvantifiering av absoluta migreringen har beräknats som skillnaden mellan ytor: (GÖMT − POSTGAP). Det fanns en större flyttande potential i stimulerad Mv1Lu celler (figur 1A) jämfört med de stimulera HaCaT cellerna (figur 1B). Skillnaderna förklaras av cell källor, att slemhinnan epitelceller och hudens keratinocyter, respektive.
Konstgjorda Migration främre Assay för topografiska studier: variationer i Cytoskeletal konformation och rumsliga uttryck för C-Jun:
Cellmigration innebär kontinuerlig och djupa förändringar av cytoskelettet struktur för att upprätthålla cell förskjutning. HaCaT celler enskiktslager användes i migration främre analyserna under kontroll- och stimulering. Behandling med EGF potentierar den cytoskeletal dynamik, som följs av IF och laser scanning mikroskopi (LSM; Figur 2A). EGF behandling resulterar också i robust Mitogen-Activated Protein (karta) kinaser signalering och c-JUN överuttryck. Plattsättning LSM bilder tillåter konfiguration av geografiska mönster. Ökat uttryck av c-JUN på celler intill migrerar framsidan kan lätt avslöjas av programvara bildanalys; här, genomfört vi en rainbow skala för den gröna kanalen, som motsvarar c-JUN märkning (figur 2B).
Figur 1. Främjande av migration av fonden i Mv1Lu och HaCaT celler. Faskontrast mikroskopi bilder av det skadade området av Mv1Lu (A) och (B) HaCaT celler togs kontroll villkor och jämfört med bilder av celler behandlas med 10 ng/mL EGF för 19 h i serumfritt villkor. Representativ micrographs Visa omfattningen av scratch gap och stängning erhålls efter skadade med 20 µL mikropipett spets. Förstoringen = 10 x; Skalstapeln = 100 µm. Cell migration var kvantifieras och representerade som variant av området skillnaderna mellan behandlingar och kontrollprover för varje analys (godtyckliga enheter; AU). Tomten är representativt av åtta oberoende mätningar för varje villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Aktin filament och c-JUN uttryck förändringar främjas av fonden i Migrera HaCaT celler. (A), övernattning 10 ng/mL EGF behandling främjar djupgående förändringar i konformation av aktin filament i Migrera HaCaT celler. Celler framtill migration på kontroll villkor skildra en hårt strukturerade aktin filament cytoskelettet, medan celler behandlas med EGF Visa dålig aktin filament organisation framtill migration. Förstoringen = 63 x; Skalstapeln = 20 µm. F-aktin är färgkodade röd och Hoechst representeras av en blå färg. (B) när immuno-fluorescens används i kombination med LSM imaging för att studera c-JUN uttryck efter 10 ng/mL EGF behandling på migrera HaCaT celler, plattsättning kompositioner avslöja rumsliga uttrycksmönster. Bilder av c-Jun fluorescens (grön) omvandlades till pseudo färg visar intensiteten i c-Jun färgning. Rainbow färgskalan representerar fluorescensintensiteten för c-Jun, motsvarande färgkartor på de högra panelerna för fonden och kontroll. Co färgning med phalloidin (röd) och Hoechst-33258 (blå) användes för att Visa cellstruktur och kärnor, respektive. Bilder togs av confocal Mikroskop. Observera de ökande uttrycksnivåerna för nukleära c-Jun i områden som närmar sig migrerar framsidan. Skalstapeln = 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På hud eller slemhinna störningar återställas barriärfunktion med åtgärderna i många celltyper, däribland fibroblaster eller epitelial och immuna celler. Conjointly, dessa celler genomgår en komplex process som involverar apoptos, proliferation, differentiering och ännu viktigare, fibroblast- och epitelial cell migration, som är den ultimata mekanismen som svarar för restaurering av störd vävnaden och stängningen av ytliga epitelial gap1,12 således studera cellmigration hjälper just beskriva fysiologiska uppförandet av epitelceller, samtidigt också fastställa immunmodulerande potential av behandlingar för sår helande.
Utföra konstgjord sår på olika forskning djurmodeller möjliggör replikering av denna komplexa process i nära fysiologiska förhållanden2, och därmed bedömningen av vissa sjukdomstillstånd eller effekterna av läkemedel behandlingar13. Dock leder detta synsätt ofta till kostsamma och komplicerade logistik samt betungande experimentella procedurer som kan generera data i en fördröjd mode13. Tvärtom, ger i vitro cellkultur en bekvämare ram för forska uppförandet av celler som är involverade i sårläkningsprocessen. Medan primär cellkultur av epitelceller utgör ett alternativ, kan det vara svårt att skaffa och hantera cellerna, vilket kan komplicera datainsamling. Till exempel, Förutom typiska låg-passage begränsningen av primära kulturer måste primära mänskliga keratinocyter en fibroblast utfodring lager för tillväxt i vitro3. Tvärtom, utgör väletablerade epitelial cell kultur linjer, som Mv1Lu eller HaCaT, en hinderfri forskning modell som funktioner beteende och egenskaper som de i primärkulturen celler3,4, 14,15. Exakt, för studien av sårläkning behålla dessa två cellinjer kritiska drag i deras förmåga att migrera och stoppa spridning på grund av cell-till-cell kontakt hämning vid sammanflödet16,17.
Scratch analyserna är en pålitlig och mångsidig metod för kvantifiering av flyttande funktionerna i olika celltyper, särskilt epitelial och cancerceller. För fallet av cancerceller, har metoden scratch föreslagits för bedömning av invasiv potential. Dock faller detta tillvägagångssätt kort som en indikator för invasivt jämfört med mer specifika metoder förlitar sig på uttrycket av metalloproteaser behövs för genomträngande extracellulärmatrix18,19. Tvärtom, finns scratch analyser tillförlitliga för bedömningen av flyttande av epitelceller och effekten av olika behandlingar på detta drag. I motsats till cancer celler linjer, som visar ofta dålig sammanhållning och förmåga att växa på flera lager, Mv1Lu, HaCaT och andra epitelceller linjer form tätt associerade ”tillväxt öar”, som utvidgar sina marginaler i en process beroende på båda spridning, men mer viktigt på cellmigration. Följaktligen, glesa eller sub konfluenta cell densiteten villkor används konventionellt för att studera effekterna av olika behandlingar på flyttande fysiologi; särskilt när efterföljande molekylärbiologiska tekniker tillämpas, som denna cell minimerar miljö kontakt hämning medan maximera förhållandet mellan aktivt migrerar celler. Men för epitelceller utgör icke-konfluenta villkor risken för exklusive viktig befintlig kontakt hämning influenser, till exempel i form av epigenetisk reglering. Således, för att studera sårläkning, konfluenta villkor medför ökad trohet av modellen.
För att erhålla exakta uppskattningar, bör samtidig faktorer som påverkar konformation av lagrets epitelial cell eller bidrar till migration behandlas. Medan sammanflödet önskas, är det viktigt att undvika överdriven cell densiteten eller multilayered kulturer, eftersom dessa tillstånd kan påverka negativt. Därför spridning kontrolleras ofta av svält i serumfritt media eller genom tillsats av kemikalier som Mitomycin C, som irreversibelt arrestera cell spridning av DNA crosslinking3,20, 21. användningen av ena eller andra är beroende av beteendet hos viss cell linjer; Mitomycin C indikeras särskilt när sänkte serum tillskott krävs för att undvika massiva cell avlossning. Som är fallet för HEK-293T celler, där före beläggning kultur ytan med hjälp av poly-L-lysin är en bra alternativ för att undvika Mytomycin C-behandling. Frisättningen av inflammatoriska faktorer som kan förändra migration måste också åtgärdas. Olika strategier har använts, huvudsakligen baserat på silikon skär att efterlikna störningar av epitelial yta uppnås med scratch test22. Medan skär generera befintliga luckor som tillåter cellmigration efter borttagning silikon lappa, bygger scratch metoden direkt på att ta bort några av de epiteliala enskiktslager att generera klyftan. Önskemål på hur till generera klyftan bygger på skär förmåga att skydda kultur ytbeläggningen (dvs, kultur plattan eller poly-L-lysin) från skador under avlysningen, samtidigt också minimera utsläpp av faktorer från skadade celler som kan äventyra den cell kultur beteende23. Även om dessa kännetecken kan vara användbara för vissa experimentella inställningar, dvs bedömning av cancerceller förmåga att migrera, vår erfarenhet hittade vi betydande nackdelar för att använda skär i sårläkning studier. Mv1Lu celler är kapabla att fästa till silikon infoga utsida, vilket resulterar i oavsiktligt slita av den cell enskiktslager efter borttagning av silikon bitar. Också, även om HaCaT celler inte fäst silikon, Vi hittade en minskad förmåga för dessa celler att migrera in i Infoga-genererade klyftor. Som omfattning, inflammation och migration är tätt associerad svaren, och dessa verkar vara kritisk grupp i samband med sårläkning i HaCaT celler. Dessutom eftersom tillämpa en plastspets för repa kultur har inga uppenbara konsekvenser på cellernas förmåga att återbefolka klyftan, när det gäller HaCaT celler, tyder sådant beteende på att extracellulärmatrix resterna i mellanrummet kan vägleda migration i ett liknande sätt som dermis i ett naturliga sår.Den huvudsakliga källan av variation förblir dock själva skrapa förfarandet, som användning av en plastspets att göra såret inte återger alltid samma storlek klyftan. Vi har observerat variationer upp till 20% bland olika prover, på grund av inkonsekvens av tryck och position av spetsen på tiden av scratch. Dessa variationer kan åtgärdas genom att såra enskiktslager med ett styvare objekt. dock skulle någon repa på plastytan äventyra den fria rörligheten för cellerna. Så, variationer i den första grunden måste beaktas att beräkna migration. vanligtvis genom att öka antalet mätning per tillstånd.
Utöver kvantifiering, kan skadade granskningsåtgärder tillsammans med klassiska om tekniker kvalitativt bedöma de molekylära processerna av cellmigration. Epitelceller förmåga att växa på coverslips är välkända; tidigare varianter av scratch analyser inblandade cellerna migrerar på coverslips utsätts för olika förhållanden följt av fastställande och färgning för jämförelse inom sår-scratch experiment24. Vi hittade här, att skapa stora kunskapsluckor enskiktslager växer på coverslips tillåter för att utvidga den experimentella tid kurser3,4,7. Dessutom i dessa experiment, om ökar detektionskapaciteten av förfarandet att eventuellt studera någon exakt cellulär och subcellulär mekanismer involverade, och det är endast begränsad av tillgången på antikroppar som är lämplig för denna teknik och de celler av intresse. Prover på den coverslips används för IF är monterade på objektglas, som möjliggör utökade bevarande. Detta underlättar tillämpningen av försöksuppställningar som kräver långa studieperioder, liknar de ”plattsättning” metoderna utställningsmonter här och annorstädes3,4,7. Medan ”plattsättning” strategin integrerar rumsliga mönster med tidsdata för att rekonstruera mekanismerna som är involverade i flyttning, kan genomförandet av programvara analysverktyg ge semikvantitativt bedömningar baserade på lokala fluorescens intensitet, och ytterligare berika kvaliteten på den information som erhålls. Vår erfarenhet erbjuder plattsättning också möjligheten att studera cell-positionell information för uttrycket av proteiner i denna typ av analys. Detta positionell information har visat sig vara avgörande för att förstå och bättre översätta effekterna av olika agenter på cellmigration, särskilt i uppställningar där placeringen av epitelceller är mycket viktigt att bestämma dess flyttande beteende3 ,4,14,15.
Båda metoderna visar stor bekvämlighet av okomplicerad genomförande, samt producerar kvalitetsdata. Således dessa metoder som är baserade på mikroskopi studier, erbjuder en unik och kraftfull ram för att studera både dynamik och morfologiska förändringar som förekommer i epitelceller beteende och svar på behandlingar under sårläkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi vill ge tack vare äldre medlemmar i labbet som hjälper till att förbättra och förfina dessa tekniker till dess faktiska tillstånd: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Cañada och Dr. Antonia Alcaraz-García. Vi står i skuld till den Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca för att starkt stödja utvecklingen av dessa tekniker. Även Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planera Estatal jag + D + jag och Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER ”Una manera de hacer Europa”. Vi tackar också Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca och FFIS för administrativt stöd och hjälp. Slutligen vill vi ge ett särskilt tack till Dr Isabel Martínez-Argudo och den Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla-la Mancha, Toledo för deras vänliga stöd i villigt avgivit den Biomedicin och bioteknik laboratorium för att möjliggöra den filmade delen av denna uppsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
