Summary
Das Verständnis des Einflusses von Umweltorganochlor-Pestiziden (OCPs) auf die mitochondriale Funktion in Hepatozyten ist wichtig bei der Erforschung des Mechanismus von OCPs, die Stoffwechselstörungen verursachen. In diesem Beitrag werden detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion beschrieben.
Abstract
Dieses Papier stellt detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion vor, um die Ursache von Stoffwechselstörungen, die durch Organischechlorpestizide (OCPs) in Hepatozyten verursacht werden, besser zu verstehen. HepG2-Zellen wurden 24 h lang bei einer äquivalenten Dosis interner Exposition in der allgemeinen Population einem Hexachlorcyclohexan (-HCH) ausgesetzt. Die Ultrastruktur in Hepatozyten wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, um die Schäden von Mitochondrien aufzuzeigen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5'-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Die Mitochondrienfluoreszenzintensität nach der Färbung durch mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde wurde mit einer Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Die Luziferin-Luziferase-Reaktion wurde verwendet, um ATP-Spiegel zu bestimmen. Das MMP wurde vom kationischen Farbstoff JC-1 nachgewiesen und unter Strömungszytometrie analysiert. OCR wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Zusammenfassend wurden diese Protokolle verwendet, um mitochondriale Funktion in Hepatozyten mit zur Untersuchung von Mitochondrienschäden zu untersuchen.
Introduction
Die Auswirkungen von Organochlor-Pestiziden (OCPs) auf die Gesundheit, z. B. reproduktive Interferenzen, immunologische Toxizität, metabolische Veränderungen wurden zuvor untersucht1,2,3. Die Methoden, um zellulären Stoffwechsel zu erkennen und herauszufinden, mitochondriale Dysfunktion haben Wissenschaftler in die Lage, die Rolle der mitochondrialen Funktion zu verstehen(d.h., mitochondriale STAT3-Spiegel, Laktat, Pyruvat, Laktat-Zu-Pyruvat-Verhältnis, Coenzym Q10, mitochondriales Protonenleck, Bioenergetik, Biogenese und Dynamik) in Bereichen wie Alterung, Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Funktion, Krebs und Sicherheitstoxizität4,5,6,7. In diesem Beitrag beschreiben wir die Methoden zur Bewertung der durch OCPs verursachten mitochondrialen Dysfunktion.
Wir setzten HepG2-Zellen 24 h in einer Dosis, die der inneren Exposition des Menschen entspricht, einem repräsentativen OCPs (Hexachlorcyclohexan) aus. Erstens wurde TEM angewendet, um die Ultrastruktur von Hepatozyten wie Kernen, Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum8zu beobachten. Im Vergleich zu gewöhnlichen Mikroskopen ermöglicht TEM die Untersuchung der 2D- und 3D-Ultrastruktur von Zellen und Zellkomponenten (Zelllinien oder Gewebe), der Morphologie, der chemischen Zusammensetzung sowie der Funktion natürlicher oder künstlicher Materialien, die in der modernen Wissenschaft und Technologie eine zentrale Rolle spielen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5'-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Mito-tracker grün ist eine mitochondriengrüne Fluoreszenzsonde, die für lebende Zellmitochondrial-spezifische fluoreszierende Färbung verwendet werden kann. Die Mitochondrien in Hepatozyten wurden durch mito-tracker grüne Lösung und mitochondriale Fluoreszenzintensität, Anzahl und Muster wurden mit einer konfokalen Mikroskopie9beobachtet. Mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde kann verwendet werden, um lebende Zellen zu färben. Im Vergleich zu Rhodamin 123 oder JC-1 hängt die mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde nicht vom mitochondrialen Membranpotenzial für mitochondriale Färbung ab. ATP-Spiegel wurden durch ein Luziferase-Luziferin-Kit bestimmt und durch Proteinkonzentration normalisiert. ATP Assay Kit kann verwendet werden, um ATP-Spiegel in gängigen Lösungen, Zellen oder Geweben zu erkennen. Dieses Kit basiert auf Glögfliegen-Luziferase, die durch Fluorescein katalysiert werden, um Fluoreszenz zu erzeugen, wenn ATP zur Energiebereitstellung benötigt wird. Wenn die Galleife und Fluorescein in einem bestimmten Konzentrationsbereich exzessiv sind, ist die Erzeugung von Fluoreszenz proportional zur ATP-Konzentration. Darüber hinaus wurde dieses Kit speziell entwickelt, um die Chemilumineszenz von ATP zu optimieren. ATP als wichtigste Energiemoleküle spielt eine wichtige Rolle in den verschiedenen physiologischen oder pathologischen Prozessen der Zellen. Veränderungen der ATP-Spiegel können Defekte in der Zellfunktion widerspiegeln, insbesondere die mitochondriale Energieerzeugung. In der Regel unter Apoptose, Nekrose oder in einem toxischen Zustand, zelluläre ATP-Spiegel reduziert 10. MMPs Assay Kit mit JC-1 ist ein Kit, das JC-1 als Fluoreszenzsonde verwendet, um Zellen, Gewebe oder gereinigte MMPs schnell und empfindlich zu erkennen. Es kann zur Früherkennung von Apoptose verwendet werden. Der kationische Farbstoff JC-1 ist eine fluoreszierende Sonde, die verwendet wird, um das MMP zu detektieren, das unter Durchflusszytometrie analysiert werden kann, die durch Veränderungen des grünen und roten Fluoreszenzverhältnisses angezeigt wird. Wenn das MMP hoch ist, wird JC-1 in der Matrix der Mitochondrien zu einem Polymer (J-Aggregate) aggregiert, das rote Fluoreszenz erzeugt. Wenn das MMP niedrig ist, kann JC-1 nicht akkumulieren und bildet Monomer, das grüne Fluoreszenz11erzeugt. Das Verhältnis von roter und grüner Fluoreszenz kann also das MMP-Niveau widerspiegeln. Die OCR von Zellen ist ein entscheidender Indikator für die normale zelluläre Funktion12. Es gilt als Parameter für die Forschung mitochondriale Funktion. Das Cell Mito Stress Test Kit bietet eine stabile Methode zur Analyse wichtiger Parameter der mitochondrialen Funktion. Das Kit bietet Qualitätskontrolle und prädiktive Reagenzien sowie eine Standardmethode für die Durchführung von Zellmitochondrialen Stresstests. Es kann verwendet werden, um alle Zelltypen zu erkennen, einschließlich Primärzellen, Zelllinien, suspendierte Zellen, und auch für Inselchen, Nematoden, Hefen und isolierte Mitochondrien.
OCR-Messungen können wertvolle Einblicke in den physiologischen Zustand oder Veränderungen von Zellen geben. Es wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator bestimmt, um Atembasislinie, Protonenleck, maximale Atemwege, ATP-Umsatz und Reservekapazität zu erkennen. Kurz gesagt, nach Basismessungen von OCR, OCR wurde nach sequenzieller Zugabe zu Oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitochondrialoxide oxidative Phosphorylierung Entkoppler) und Antimycin A/Roton (ein Inhibitor des Sauerstoffverbrauchs) pro Brunnen nachgewiesen.
In dem Bestreben, die Entwicklung eines spezifischeren Protokolls zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten in vitro zu erleichtern, präsentieren wir hier Experimente von TEM, konfokale Mikroskopie, Luminometer, Durchflusszytometrie und extrazelluläre Flussanalysatoren mit zukünftiger Anwendung bei der Untersuchung von Mitochondrien, die mit negativen Ergebnissen zusammenhängen.
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Protocol
Alle Experimente und die Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Medizinischen Universität Nanjing genehmigt.
1. Mitochondriale Ultrastruktur von TEM
- Sammeln von HepG2-Zellen
- Seed HepG2 Zellen in 100 mm Geschirr. Bei 37 °C und 5% CO2lagern.
- Verdauungszellen mit 0,25% EDTA in 1,5 mLEP-Röhre.
- Zentrifuge bei 1000 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand.
- Sammeln Sie 4-6 x 105 HepG2-Zellen.
- 1 ml 5% Glutaraldehyd (Lösungsmittel: doppeldestilliertes Wasser) mit Pipetten hinzufügen und bei 4°C für 2 h inkubieren.
- In 4 Wechseln von 1 ml Phosphatpuffer (mit Na2HPO4, KH2PO4, NaCl und KCl, pH 7,4) hinzufügen und waschen), jeweils 15 min. Phosphatpuffer mit Pipetten aussaugen.
- 200 m Osmium (Lösungsmittel: doppelt destilliertes Wasser) hinzufügen und bei 4 °C für 2 h bis schwarze Probe inkubieren.
Achtung: Osmium ist eine hochgiftige und flüchtige Substanz. Es sollte im Drogenschrank sorgfältig betrieben werden. - Fügen Sie in 2 Veränderungen von 1 ml Phosphatpuffer, jeweils 5 min. Saugen Sie Phosphatpuffer aus.
- Stain in 2% Uranylacetatlösung (Lösungsmittel: doppeldestilliertes Wasser und Essigsäure) in 1,5 ml EP-Rohr für 2 h.
- Dehydrieren und untertauchen durch 50% Aceton, 70% Aceton, 90% Aceton (Lösungsmittel: doppelt destilliertes Wasser), 2 Veränderungen des absoluten Acetons, je 15 min.
- In 2 Tropfen Aceton (100%)/Einbettungsmittel (1:1) für 1,5 h bei RT eindringen. Epon812 Einbettungsmittel, das Rezept ist wie folgt: A: Epon812, 62 ml und DDSA, 100 ml; B: Epon812, 100 ml und MNA 89 ml. A:B=2:8 (v:v, im Winter), A:B=1:9 (v:v, im Sommer). Einbettung in Einbettformen (weiche Kunststoffplatte mit kariertem Gitter).
- Nacheinander bei 37 °C für 12 h, 45 °C für 12 h und dann 60 °C für 48 h inkubieren.
- Vorbereiten und beobachten Sie ultradünne Abschnitte (die größte Fläche darf 0,5 mm x 0,3 mm überschreiten) durch ultradünne Abschnitte Maschine und TEM (2 m und 500 nm).
2. Mitochondriale Fluoreszenzintensitätsdetektion
- Samen 2x 104 HepG2-Zellen in 6-Well-Platten. Fügen Sie die Datei für 24 h hinzu.
- Fügen Sie wasserfreies DMSO hinzu, um eine Endkonzentration von 1 mM mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde zu formulieren.
- 1 ml mitochondriale grüne fluoreszierende Sondenlösung (Endkonzentration: 200 nM) zu jedem Brunnen von 6-Well-Platten geben, bei 37 °C für 45 min inkubieren.
- Entfernen Sie die mitochondriale grüne Fluoreszenzsondenlösung und fügen Sie vor der Bildgebung ein frisch zubereitetes Zellkulturmedium (DMEM) bei 37 °C hinzu.
- Beobachten Sie die mitochondriale grüne Fluoreszenz durch ein Fluoreszenzmikroskop (10x). Die maximale Anregungswellenlänge bei der Detektion beträgt 490 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 516 nm.
3. Assay der zellulären ATP-Spiegel
- Seed HepG2-Zellen in 6-Well-Platten. Fügen Sie die Datei für 24 h hinzu.
- Fügen Sie 200 L Lysepuffer aus dem luziferase-luzifferin ATP Assay Kit zu jedem Brunnen von 6-Well-Platten. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C, den Überstand mit Pipetten in neue Schläuche einsammeln.
- Verdünnen Sie das ATP-Detektionsreagenz mit der ATP-Verdünnung im Verhältnis 1:5 als ATP-Erkennungspuffer.
- Vorbereiten der Standardkurvenbestimmung: Verdünnen Sie die 0,5 mM ATP-Standardlösung auf 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 m durch ATP-Lysepuffer.
- Fügen Sie 100 L ATP-Erkennungspuffer in eine 96-Well-Platte für 5 min bei RT, und fügen Sie 100 L Überstand der Zelle, durch ein Luminometer (Chemilumineszenzdetektor) zu erkennen. Berechnen Sie die ATP-Konzentration (nmol/L) über die Standardkurve.
- Erkennen Sie die Proteinkonzentration durch ein BCA Protein Assay Kit mit Multimode-Reader.
- Vorbereitung der Standardkurvenbestimmung: Verdünnen Sie die 5 mg/ml Proteinstandardlösung auf 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mg/ml durch doppelt destilliertes Wasser.
- Fügen Sie 1 L Desobtant der Zelle in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 19 l doppelt destilliertes Wasser hinzu.
- Fügen Sie für jeden Brunnen 200 L BCA-Erkennungslösungen hinzu. Bei 37 °C für 30 min inkubieren. Erkennen Sie den OD-Wert (optische Dichte) durch einen Multimode-Reader mit 562 nm. Berechnen Sie die Proteinkonzentration (mg/ml) über die Standardkurve.
- Korrigieren Sie den ATP-Gehalt pro mg-Proteinkonzentration (Einheit: ATP-Konzentration/Proteinkonzentration, nmol/mg).
4. Mitochondriale Membranpotenzial (MMP) Bewertung durch JC-1
- Sammeln Sie HepG2-Zellen, die in 6-Well-Platten gesät sind. Verdauungszellen mit 0,25% EDTA in 1,5 ml EP-Rohr, Zentrifuge bei 1000 x g für 3 min, verwerfen den Überstand und sammeln Zellen.
- 50 L JC-1 (200X) zu 8 ml destilliertem Wasser in den Wirbel geben und mischen. Fügen Sie als JC-1-Erkennungslösung 2 ml JC-1 (5X) Färbepuffer hinzu.
- Inkubieren Sie Zellen mit einer Mischung aus 0,5 ml Zellkulturmedium und 0,5 ml JC-1-Detektionslösung für 20 min bei 37 °C.
- Zentrifuge bei 600 x g für 3 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
- In 2 Veränderungen von 1 ml JC-1 (1X) Färbepuffer abspülen, Zentrifuge bei 600 x g für 3 min bei 4 °C. Und verwerfen Sie den Überstand.
- Suspend Zellen in 0,5 ml JC-1 (1X) Färbepuffer, analysieren über Durchflusszytometrie, um grüne und rote Fluoreszenz zu erkennen. Wenn das JC-1-Polymer erkannt wird, stellen Sie das Anregungslicht auf 490 nm und das Emissionslicht auf 530 nm ein. Wenn das JC-1-Polymer erkannt wird, stellen Sie das Anregungslicht auf 525 nm und das Emissionslicht auf 590 nm ein.
5. Messungen des Sauerstoffverbrauchs (OCR)
- Saat-HepG2-Zellen in Zellkultur-Mikroplatten von 96-Well mit einer Dichte von 4500 Zellen/100 l pro Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nach 24 h mit jedem Gut bedeckt sind.
- Fügen Sie das entsprechende Volumen der vorbereiteten Reagenzien in den entsprechenden Injektionsanschluss, nach vorheriger Literatur13. Port A: 25 L 1 M Oligomycin (ATP Coupler); Anschluss B: 25 l 0,75 m FCCP (Electronic Throttle Control, ETC Accelerator); Port C: 25 l 0,5 des Antimycins A/Roton (mitochondrialer Inhibitor A und mitochondrialer Inhibitor B).
- Kartusche in einem 37 °C-Inkubator ohne CO2 lagern, bis sie einsatzbereit ist.
- Machen Sie einen mittleren Wechsel der Zellplatte, indem Sie das laufmittlere Medium aus jedem Brunnen entfernen und das neue DMEM ergänzen. Das Endvolumen für jeden Bohrwert beträgt 180 l.
- Bewahren Sie die Zellplatte in einem 37 °C-Inkubator ohneCO2 1 h vor dem Test auf.
- Nehmen Sie OCR automatisch per Software auf.
- Öffnen Sie die OCR-Software.
- Wählen Sie Cell Mito Stress Test Kit im Dropdown-Menü Apps aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche App starten.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Stresstest ausführen. Der Bildschirm "Zellenstresstest-Setup" wird angezeigt.
- Gehen Sie wie folgt vor:
- Geben Sie die Anzahl der Zellen, die pro Bohrung gesät werden, in das Feld Zellsaat - ein.
- Geben Sie die durchschnittliche OCR in das Feld Durchschnittliche Basal-OCR ein.
- Geben Sie die endgültige Arbeitskonzentration für jedes Reagenz ein und injizieren Sie die Reagenzien.
HINWEIS: Der durchschnittliche Basal-OCR-Wert für die Zelle sollte vor dem Ausführen des Optimierungstestes bei der Optimierung der Zellsaatkonzentration erkannt worden sein. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Der Gruppeninfo-Bildschirm wird angezeigt.
- Weisen Sie den nicht zugewiesenen Brunnen eine Gruppe zu, indem Sie eine Farbe auswählen und einen Namen geben und dann auf die entsprechenden Brunnen klicken.
HINWEIS: Die verschiedenen Gruppen werden vor dem Ausführen des Cell Mito Stress Tests als verschiedene Behandlungen definiert. Alle Brunnen von Mikroplatten erhalten die gleichen Reagenzinjektionen, wenn der Stresstest durchgeführt wird. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Der Bildschirm "Stresstest-Injektionslayout" wird angezeigt.
- Klicken Sie auf Start. Der Stresstest wird jetzt auf dem Analyzer ausgeführt. Wenn der Lauf beendet ist, folgen Sie dem Punkt s in der Software, entfernen und entsorgen Sie die Patrone und die Zellplatte.
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Representative Results
Die Mitochondrien-Cristae der HepG2-Zellen, die dem HCH ausgesetzt waren, wurden deutlich beschädigt. Zerstreute Mitochondrien waren leicht bis deutlich erweitert, unregelmäßig geformt, und mitochondriale Grat verschwand mit relativ abnormaler mitochondrialer Architektur (Abbildung 1).
Die durchschnittliche mitochondriale grüne Fluoreszenzintensität, die die Mitochondrien darstellt, verringerte sich in HepG2-Zellen, die dem HCH ausgesetzt waren (Abbildung 2), sowie in ATP-Spiegeln (Abbildung 3). Die Fluoreszenzintensität und der ATP-Spiegel verringerten sich mit zunehmenden Expositionskonzentrationen allmählich. Potenziell verursachte die Verringerung der Mitochondrienzahl oder der beschädigten Mitochondrien die beobachtete mitochondriale Fluoreszenzintensität und damit die reduzierte Produktion von ATP.
Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass die Verhältnisse der rot/grünen JC-1-Fluoreszenz in der HCH-Gruppe signifikant niedriger waren als bei der Kontrolle (Abbildung 4). Die OCR der HepG2-Zellen wurde nach der Exposition durch die Dosis dosisabhängig reduziert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurden die Basalatmungsraten, das Protonenleck, die maximale Atemkapazität und der ATP-Umsatz in Denep-2-Zellen, die dem "-HCH" ausgesetzt waren, signifikant verringert(Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigten, dass die mitochondriale Funktion nach der Exposition bei der A-HCH beeinträchtigt war.
Alle in diesen Experimenten verwendeten Instrumente wurden in der ergänzenden Abbildung 1dargestellt.
Abbildung 1: Repräsentative TEM-Mikrographiken von HepG2-Zellen, die dem HCH ausgesetzt sind (A: 6000, B: 25000 " ). Typische Schäden zeigten leicht vergrößerte Mitochondrien (M), elektronenlucente Matrizen, beschädigte Cristae und lose Organellenlücken. M: Mitochondrien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nachweis der mitochondrialen Fluoreszenz in HepG2-Zellen,die mit dem HCH13behandelt wurden. Die Menge, Lage und Fluoreszenzintensität der Mitochondrien (A) wurden in fluoreszenzmikroskopischen Bildern und quantitativen Konzentrationen der mitochondrialen Fluoreszenzintensität auf der Grundlage mitochondrialer grüner Fluoreszenz pro Zelle (B)gezeigt. *: P < 0.05, ***: P < 0.001 im Vergleich zum Steuerelement. Jeder Datenpunkt war der Mittelwert von sem aus drei separaten Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:ATP-Werte in HepG2-Zellen13. ***: P < 0,001 im Vergleich zur Steuerung, n: P < 0,01 im Vergleich zu 10 ng/mL -HCH.Daten wurden als Mittelwert von drei separaten Experimenten dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Auswirkungen auf MMP durch JC-1-Färbung und Durchflusszytometrie13. (A) Flusszytometrie-Plots. Die Y-Achse zeigte das Verhältnis von roter zu grüner Fluoreszenz. PE: Rote Fluoreszenz, FITC: Grüne Fluoreszenz. (B).**: P < 0,01 im Vergleich zum Steuerelement. Jeder Datenpunkt war der Mittelwert von sem aus drei separaten Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Nachweis der Zellsauerstoffverbrauchsrate (OCR). (A) Die Wirkung von '-HCH auf die zelluläre OCR wurde mit dem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Die vier Perioden stellen die zelluläre Basalatmungsrate, die ATP-Synthase-hemmende Rate, die maximale entkoppelte Rate und die Roton- oder Antimycin-A-hemmte Rate dar. (B) Quantitative Histogramme der OCR-Ergebnisse für Ausgangswerte, Protonenleck, maximale Atemkapazität, ATP-Umsatz und Reservekapazität. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 im Vergleich zum Steuerelement. Jeder Datenpunkt war der Mittelwert von sem aus drei separaten Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1:Alle in Protokollen verwendeten Instrumente. (A) Transmissionselektronenmikroskopie. (B) Laserscanning konfokales Mikroskop. (C) Luminometer. (D) Multimode-Reader. (E) Durchflusszytometrie. (F) Extrazellulärer Flussanalysator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Entscheidend für den Erfolg des Nachweisprotokolls ist die Verwendung einer Vielzahl experimenteller Methoden, die in der Studie vom Phänotyp bis zum Mechanismus behandelt wurden. In dieser Studie wurden HepG2-Zellen in DMEM mit Penicillin und Streptomycin und 10% fetalem Rinderserum kultiviert. Wenn die Zellen 40-50% Zusammenfluss erreichten, wurden die Zellen (0, 10, 100 ng/mL) zugesetzt und für 24 h inkubiert. Wir verwendeten zunächst TEM, das die ultrastrukturellen Veränderungen in Hepatozyten zeigte, die durch die repräsentativen OCPs, HCH, verursacht wurden, die die Beeinträchtigung der Mitochondrienstruktur zeigten (Abbildung 1). Darüber hinaus wurden fluoreszierender Färbetest (Abbildung 2), Luziferase-Luziferin ATP-Assay (Abbildung 3),JC-1-Assay (Abbildung 4) und Zellmito-Stresstest (Abbildung 5)durchgeführt, die häufig die Mitochondrien-Dysfunktion bewerten. Diese Ergebnisse dienen als Grundlage für die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.
Bei den oben genannten Methoden sollten die Ermittler in einigen Schritten auf Vorsichtsmaßnahmen achten. Beispielsweise sollte bei der Herstellung von Elektronenmikroskopiezellen auf die Anzahl der Zellen geachtet werden, um eine schlechte Fixierung durch zu großes Gewebe oder Zellblock zu vermeiden. 5% Glutaraldehyd wirkt als Fixierung, es ist besser, nicht mehr als ein halbes Jahr zu speichern, um einen Ausfall der Erkennung zu vermeiden. Feste Proben werden bei 4 °C für 24 h oder bis zu 1 Monat vor dem nächsten Schritt platziert. Mitochondriale grüne Fluoreszenzfarbstoff ist leicht zu löschen, und Licht sollte vermieden werden, um die Fluoreszenz-Abschreckung zu verlangsamen. Bei der Verwendung eines multifunktionalen Luminometers, das Chemilumineszenz erkennen kann, sollten undurchsichtige Tafel- oder Whiteboard-96-Well-Platten verwendet werden, um gegenseitige Interferenzen zwischen benachbarten Löchern zu vermeiden. ATP, speziell die Spaltung von ATP in der Probe, ist bei Raumtemperatur nicht stabil, und das Experiment muss bei 4 °C oder auf Eis betrieben werden. ATP kann auf Eis bis zu 6 h stabil sein. Bei der Herstellung der JC-1-Detektionslösung kann der JC-1 Färbepuffer (5X) hinzugefügt werden, nachdem der JC-1 (200X) gründlich gelöst und mit dem Reinstwasser vermischt wurde, so dass die JC-1-Detektionslösung leicht vollständig aufzulösen ist. JC-1-Sonde sollte innerhalb von 30 Minuten geladen und gewaschen und bei 4 °C oder Eis gespeichert werden, um den Folgetest abzuschließen. Bei OCR-Messungen sollte der durchschnittliche Basal-OCR-Wert für die Zelle vor dem Optimierungstest erkannt werden, wenn die Zellsaatkonzentration optimiert wird.
Es gibt einige Einschränkungen dieser Methoden. Die OCR-Messung durch einen extrazellulären Flussanalysator ist auf Zellexperimente beschränkt. Der Nachweis der mitochondrialen Funktion ist nicht tief genug, da die Stoffwechselprodukte durch Mitochondrien nicht gemessen werden, wie die Messung von Fettsäuren und Metaboliten in TCA-Zyklen in Hepatozyten. Darüber hinaus könnte die Expression von Genen und Proteinen in Bezug auf die Leberfettsäuresynthese und -degradation durch Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und Western-Blot nachgewiesen werden, was die molekularen Störungen des Fettsäurenstoffwechsels und der mitochondrialen Dysfunktion weiter bestätigen kann13. Digitale Bilder von Mitochondrien können in lebenden Zellen unter konfokaler Mikroskopie erfasst und auf Veränderungen der mitochondrialen Morphologie basierend auf Formfaktor- (FF) und Seitenverhältniswerten (AR) analysiert werden. Die metabolische Funktion von Mitochondrien wurde auch durch Messung der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) mit einem bioenergetischen Analysator14bewertet. Einige mitochondriale Marker-Antikörper (Cytochrom c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA und STAT3) können mit Western Blot4,15,16,17gemessen werden. Die Aktivitäten von Enzymen, die die mitochondriale Funktion und den Tricarbonsäurezyklus (TCA) respektieren, wie malische Dehydrogenase, Succinatdehydrogenase, Citratsynthetase, ATPase, Isocitrate-Dehydrogenase und -ketoglutarat-Dehydrogenase sind18nachgewiesen. Die Funktion der Elektronentransportkette in Zellen und in isolierten Lebermitochondrien wird mittels hochauflösender Beatmung simoniert19.
Unsere Protokolle konzentrieren sich auf den Nachweis der mitochondrialen Morphologie, Struktur, Lage, Menge, Kapazität, Membranpotenzial und Atmungskettenfunktion. Diese sind grundsätzlich in der Lage, die mitochondriale Funktion aus verschiedenen Aspekten zu bewerten. Darüber hinaus sind diese Methoden einfach und einfach zu bedienen. Mitochondriale Funktionsstudien wurden in verschiedenen Bereichen durchgeführt, wie Leber20, Darm-Mikrobiota21, pluripotente Stammzellen22, und in einigen häufigen Krankheiten, wie Typ-2-Diabetes23, Parkinson-Krankheit24 und entzündliche Darmerkrankung25. Es kann mehr Krankheiten im Zusammenhang mit Mitochondrien sein, und unsere Protokolle können bei der Untersuchung relevanter Mechanismen hilfreich sein. Darüber hinaus sind weitere empirische Arbeiten über den umfassenden und tiefgehenden Umfang dieser Effekte mit experimentelleren Methoden erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant-Nr. 81573174, 81570574); den Herausragenden Jugendfonds der Provinz Jiangsu (SBK2014010296); das Forschungsprojekt des chinesischen Bildungsministeriums (213015A); die vorrangige Entwicklung des Akademischen Programms der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (PAPD), der wichtigsten Entwicklung der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen; und das Open Project Program des State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
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