Summary
הבנת ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) על תפקוד המיטוכונדריאלי בהפטוציטים חשוב לחקור את המנגנון של OCPs גורם להפרעות מטבוליות. נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי פונקציית המיטוכונדריה הכבד.
Abstract
נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי תפקוד המיטוכונדריאלי הכבד להבנה טובה יותר של הגורם להפרעות מטבוליות הנגרמות על ידי חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) בהפטוציטים. תאי HepG2 נחשפו β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) במשך 24 שעות במינון שווה ערך של חשיפה פנימית באוכלוסייה הכללית. Ultrastructure בהפטוציטים נבדק על ידי מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM) כדי להראות את הנזק של המיטוכונדריה. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5'-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP) בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. עוצמת המיטוכונדריה פלואורסצנטית לאחר מוכתם על ידי בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי נצפתה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תגובת לוציפרין-לוציפראז שימשה לקביעת רמות ATP. MMP זוהה על ידי צבע cationic JC-1 וניתח תחת ציתימת זרימה. OCR נמדד עם מנתח שטף extracellular. לסיכום, פרוטוקולים אלה שימשו לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים עם לחקור נזקי המיטוכונדריה.
Introduction
ההשפעות של חומרי הדברה אורגנוכלורין (OCPs) על בריאות, למשל התערבות הרבייה, רעילות חיסונית, שינויים מטבולייםנחקרו בעבר 1,,2,3. השיטות לזיהוי חילוף חומרים תאי ולגלות תפקוד מיטוכונדריאלי אפשרו למדענים להבין את התפקיד של תפקוד המיטוכונדריה (כלומר.רמות STAT3 מיטוכונדריאלי, לקטאט, pyruvate, יחס לקטר-pyruvate, קואנזים Q10, דליפת פרוטון מיטוכונדריאלי, bioenergetics, biogenesis, ודינמיקה) בתחומים כגון הזדקנות, השמנת יתר, סוכרת, תפקוד לב וכלי דם,סרטן, רעילותבטיחות 4,5,6,7. בעיתון זה, אנו מתארים את השיטות על הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי שנגרם על ידי OCPs.
חשפנו תאי HepG2 β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), OCPs נציג אחד, במשך 24 שעות במינון שווה ערך לחשיפה פנימית של אדם. ראשית, TEM הוחל כדי לצפות במבנה האולטרה של hepatocytes, כגון גרעין, מיטוכונדריה ו אנדופלסמי רטיטולום8. בהשוואה למיקרוסקופים רגילים, TEM מאפשר לחקור את מבנה האולטרה-תלת-מידי והתלת-מיויד של תאים ורכיבי תאים (קווי תאים או רקמה), מורפולוגיה, הרכב כימי, כמו גם פונקציה של חומרים טבעיים או מלאכותיים המגללים תפקיד מרכזי במדע ובטכנולוגיה המודרניים. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5'-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP)בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. ירוק מיטו-גשש הוא בדיקה פלורסנט ירוק המיטוכונדריה שיכול לשמש כתמי פלואורסצנט מיטוכונדריאלי ספציפי תא חי. המיטוכונדריה בהפטוציטים הוכתמה על ידי תמיסה ירוקה מיטו-גשש ועוצמת פלואורסצסצנציה מיטוכונדריאלית, מספר ודפוס נצפו עם מיקרוסקופ confocal9. בדיקה מיטוכונדריאלית ירוקה פלורסנט יכול לשמש כדי להכתים תאים חיים. בהשוואה לרודמין 123 או JC-1, בדיקה פלואורסצנטית ירוקה מיטוכונדריאלית אינה תלויה בפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי לכתמים מיטוכונדריאליים. רמות ATP נקבעו על ידי ערכת לוציפראז-לוציפרין ומנורמל על ידי ריכוז חלבון. ערכת אחסון ATP יכול לשמש כדי לזהות רמות ATP בפתרונות נפוצים, תאים או רקמות. ערכה זו מבוססת על גחלילית לוציפראז נבליזה על ידי פלואורסצן כדי ליצור פלואורסצנט, כאשר ATP נדרש לספק אנרגיה. כאשר לוציפראז גחלילית ופלואורסצ'ין הם מוגזמים, בטווח ריכוז מסוים, דור הפלואורסצנט הוא פרופורציונלי לריכוז של ATP. בנוסף, ערכה זו תוכננה במיוחד כדי לייעל את הכימותרפיה של ATP. ATP, כמו מולקולות האנרגיה החשובות ביותר, ממלא תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים של תאים. שינויים ברמות ATP יכול לשקף פגמים בתפקוד התא, במיוחד ייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית. בדרך כלל תחת אפופטוזיס, נמק או במצב רעיל כלשהו, רמות ATP הסלולר מופחת 10. ערכת אסאי MMPs עם JC-1 היא ערכה המשתמשת JC-1 כבדיקה פלורסנט כדי לזהות תאים, רקמות או MMPs מטוהר במהירות וברגישות. זה יכול לשמש לגילוי מוקדם של אפופטוזיס. הצבע cationic JC-1 הוא גשושית פלורסנט המשמשת לזיהוי MMP אשר ניתן לנתח תחת ציתימת זרימה המצוינת על ידי שינויים של יחס פלואורסצנטי ירוק ואדום. כאשר ה-MMP גבוה, JC-1 נצבר במטריצה של המיטוכונדריה כדי ליצור פולימר (אגרגטים J), המייצר פלואורסצנס אדום. כאשר MMP נמוך, JC-1 אינו יכול לצבור, ויוצר מונומר המייצר פלואורסצנס ירוק11. אז היחס של פלואורסץ אדום וירוק יכול לשקף את הרמה של MMP. OCR של תאים הוא אינדיקטור מכריע של תפקוד תאי נורמלי12. הוא נחשב כפרמטר למחקר פונקציה מיטוכונדריאלית. ערכת בדיקת מיטו של התא מספקת שיטה יציבה לניתוח פרמטרים מרכזיים של פונקציית מיטוכונדריאלי. הערכה מספקת בקרת איכות ריגנטים חזוי, כמו גם שיטה סטנדרטית לביצוע בדיקת מיטוכונדריה של תאים. זה יכול לשמש כדי לזהות את כל סוגי התאים, כולל תאים ראשיים, קווי תאים, תאים מושעים, וגם עבור איונים, נמטודות, שמרים ומיטוכונדריה מבודדת.
מדידת OCR יכולה לספק תובנה חשובה לגבי המצב הפיזיולוגי או שינויים של תאים. זה נקבע עם מנתח שטף תות-תאי כדי לזהות בסיס נשימה, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלית, מחזור ATP וקיבולת מילואים. בקצרה, לאחר מדידות בסיסיות של OCR, OCR זוהה לאחר הוספה רציפה אוליגומיצין (ATP מינר), FCCP (מיטוכונדריאלי חמצון phosphorylation uncoupler) ואנטימיצין A / rotenone (מעכב של צריכת חמצן)לכל טוב.
במאמץ להקל על הפיתוח של פרוטוקול ספציפי יותר לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים במבחנה, אנו מציגים כאן ניסויים על ידי TEM, מיקרוסקופיה קונפוקלית, luminometer, ציטומטריה זרימה ומנתח שטף חוץ-תאי עם יישום עתידי בחקר תוצאות שליליות הקשורות נזק המיטוכונדריה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים ופרוטוקולי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות ואושרו על ידי הוועדה האתית המקומית של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג.
1. מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי על ידי TEM
- איסוף תאי HepG2
- זרע HepG2 תאים ב 100 מ"מ כלים. לאחסן ב- 37 °C ו- 5% CO2.
- תאי עיכול עם 0.25% EDTA בצינור 1.5 mLEP.
- צנטריפוגה ב 1000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT). זרוק את הסופרנטנט.
- לאסוף 4-6 x 105 תאי HepG2.
- להוסיף 1 מ"ל של 5% גלוטרלדהייד (ממס: מים מזוקקים כפולים) עם פיפטות דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
- הוסף ושטוף ב-4 שינויים של מאגר פוספט של 1 מ"ל (המכיל את Na2HPO4, KH2PO4, NaCl ו-KCl, pH 7.4), 15 דקות כל אחד. לשאוב את מאגר הפוספט עם פיפט.
- להוסיף 200 μm של 1% osmium (ממס: מים מזוקקים כפול) דגירה ב 4 ° C עבור 2 שעות לדגימה שחורה.
שים למקום: אוסמיום הוא חומר רעיל מאוד והפכפך. זה צריך להיות מופעל בקבינט התרופות בזהירות. - מוסיפים ושוטפים 2 שינויים של מאגר פוספט של 1 מ"ל, 5 דקות כל אחד. לשאוב חוצץ פוספט.
- כתם בתמיסת אצטט אורניל 2% (ממס: מים מזוקקים כפולים וחומצה אצטית) ב 1.5 מ"ל EP שפופרת עבור 2 שעות.
- להתייבש ולשקוע דרך 50% אצטון, 70% אצטון, 90% אצטון (ממס: מים מזוקקים כפול), 2 שינויים של אצטון מוחלט, 15 דקות כל אחד.
- לחדור ב 2 טיפות אצטון (100%)/הטבעה סוכן (1:1) עבור 1.5 שעות ב RT. Epon812 הטבעה סוכן, המתכון הוא כדלקמן: A: Epon812, 62 מ"ל ו DDSA, 100 מ"ל; ב: Epon812, 100 מ"ל ו-MNA 89 מ"ל. א:ב=2:8 (v:v, בחורף), א:ב=1:9 (v:v, בקיץ). הטבעה בתבניות הטבעה (צלחת פלסטיק רכה עם רשת משומנת).
- דגירה רצף ב 37 ° C עבור 12 שעות, 45 ° C עבור 12 שעות, ולאחר מכן 60 ° C עבור 48 שעות.
- הכן וצפה במקטעים דקים במיוחד (האזור הגדול ביותר אינו יכול לחרוג מ- 0.5 מ"מ × 0.3 מ"מ) על-ידי מכונת מקטעים דקים במיוחד ו- TEM (2 μm ו- 500 ננ"מ).
2. זיהוי עוצמת פלואורסצט מיטוכונדריאלי
- זרע 2x 104 HepG2 תאים ב 6-well צלחות. הוסף β-HCH למשך 24 שעות.
- להוסיף DMSO anhydrous לגבש ריכוז סופי של 1 mM מיטוכונדריאלי ירוק פלורסנט בדיקה.
- הוסף 1 מ"ל מיטוכונדריאל ירוק פלורסנט בדיקה פתרון (ריכוז סופי: 200 nM) לכל באר של 6-באר צלחות, דגירה ב 37 ° C במשך 45 דקות.
- הסר את תמיסת הבדיקה הפלואורסצנטית הירוקה המיטוכונדריאלית והוסף מדיום תרבות תאים טרי (DMEM) ב- 37°C לפני ההדמיה.
- צפה פלואורסצנציה ירוקה מיטוכונדריאלי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנה (10x). אורך הגל המרבי של העירור בזיהוי הוא 490 00 00 00 00:00:00,000 --& אורך הגל המרבי של הפליטה הוא 516 00 00 00:00:00,000 --&00:00,000 --& 00
3. תסיסה של רמות ATP הסלולר
- זרע HepG2 תאים ב 6-well צלחות. הוסף β-HCH למשך 24 שעות.
- להוסיף 200 μL של מאגרי lysis מתוך ערכת סיס ATP לוציפראז-לוציפרין לכל באר של 6-well צלחות. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C, לאסוף את supernatant עם pipettes לתוך צינורות חדשים.
- תדלל את ריגנט זיהוי ATP עם דילול ATP ביחס של 1: 5, כמאגר זיהוי ATP.
- הכן קביעת עקומה סטנדרטית: תדלל את הפתרון הסטנדרטי של 0.5 mM של ATP ל- 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 μM על-ידי מאגרי ATP lysis.
- להוסיף 100 μL של מאגר זיהוי ATP בצלחת 96-באר במשך 5 דקות ב RT, ולהוסיף 100 μL של supernatant של תא, לזהות על ידי luminometer (גלאי chemiluminescence). חשב ריכוז ATP (nmol / L) למרות העקומה הסטנדרטית.
- זהה ריכוז חלבון על ידי ערכת אסאי חלבון BCA עם קורא multimode.
- היכונו לקביעת עקומה סטנדרטית: לדלל את 5 מ"ג/מ"ל של פתרון סטנדרטי חלבון ל- 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ו- 0.5 מ"ג/מ"ל על ידי מים מזוקקים כפולים.
- להוסיף 1 μL של supernatant של תא בצלחת 96-באר ולהוסיף 19 μL של מים מזוקקים כפול.
- הוסף 200 μL של פתרונות זיהוי BCA עבור כל באר. דגירה ב 37 ° C במשך 30 דקות. זהה ערך OD (צפיפות אופטית) על-ידי קורא מרובה מצבים עם 562 דפים לשעה. לחשב את ריכוז החלבון (מ"ג/מ"ל) למרות העקומה הסטנדרטית.
- תקן את תכולת ה-ATP לכל ריכוז חלבון מ"ג (יחידה: ריכוז ATP/ריכוז חלבון, nmol/מ"ג).
4. הערכת פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP) על ידי JC-1
- לאסוף תאי HepG2 נזרעו 6-well צלחות. תאי עיכול עם 0.25% EDTA ב 1.5 מ"ל EP שפופרת, צנטריפוגה ב 1000 x g במשך 3 דקות, להשליך את supernatant ולאסוף תאים.
- להוסיף 50 μL של JC-1 (200X) כדי 8 מ"ל של מים מזוקקים למערבולת ולערבב. הוסף 2 מ"ל של מאגר צביעת כתמים JC-1 (5X) כפתרון זיהוי JC-1.
- דגירה תאים עם תערובת של 0.5 מ"ל של תא תרבות בינונית 0.5 מ"ל של פתרון זיהוי JC-1 במשך 20 דקות ב 37 ° C.
- צנטריפוגה ב-600 x g ל-3 דקות ב-4°C. זרוק את הסופרנטנט.
- לשטוף ב 2 שינויים של 1 מ"ל של JC-1 (1X) מאגר צביעה, צנטריפוגה ב 600 x g במשך 3 דקות ב 4 ° C. ולזרוק את הסופרנטנט.
- להשעות תאים ב 0.5 מ"ל של JC-1 (1X) צביעה מאגר, לנתח באמצעות ציתימטריה זרימה כדי לזהות פלואורסצנס ירוק ואדום. כאשר הפולימר JC-1 מזוהה, הגדר את אור העירור ל- 490 00 00 00 00:00,000,000,000-&, ואור הפליטה ל- 530 00 00 00:00.00.00.00,000.00 00:00,000 00: כאשר זוהה הפולימר JC-1, הגדר את אור העירור ל- 525 00 00 00:00,000,000-&, ואת אור הפליטה ל- 590 00 00 00:00.00.00.00.00,000.00 00:00,000 00:0
5. מדידות צריכת חמצן (OCR)
- זרע HepG2 תאים במיקרו-לוחיות של 96-גם בצפיפות של 4500 תאים/ 100 μL לכל באר. ודא תאים מכוסים עם כל באר לאחר 24 שעות.
- הוסף את הנפח המתאים של reagents מוכן לתוך יציאת ההזרקה המתאימה, על פי ספרותקודמת 13. יציאה A: 25 μL 1 μM של אוליגומיצין (מסוף ATP); יציאה ב': 25 μL 0.75 μM של FCCP (בקרת מצערת אלקטרונית, מאיץ ETC); יציאה C: 25 μL 0.5 של אנטימיצין μM A/rotenone (מעכב מיטוכונדריאלי A ומעכב מיטוכונדריאלי B).
- אחסן מחסנית באינקובטור של 37°C ללא CO2 עד שיהיה מוכן לשימוש.
- בצע שינוי בינוני של לוח התא באמצעות הסרת המדיום הפועל מכל באר והוספת DMEM החדש. כרך סופי עבור כל באר הוא 180 μL.
- לאחסן את לוחית התא באינקובטור 37 °C ללא CO2 עבור 1 שעות לפני ההתאסה.
- הקלט OCR באופן אוטומטי על-ידי תוכנה.
- פתח את תוכנת OCR.
- בחר ערכת בדיקת מתח מיטו תא בתפריט הנפתח Apps.
- לחץ על לחצן התחל אפליקציה.
- לחץ על לחצן הפעל בדיקת מלחץ. מופיע המסך 'הגדרת בדיקת מתח של התא'.
- ביצוע השלבים הבאים:
- הזן את מספר התאים שנזרעו לבאר בתיבה מספר זריעת תאים.
- הזן את ה- OCR הממוצע בתיבה OCR בסיס ממוצע.
- הזן את ריכוז העבודה הסופי עבור כל reagent ולהזריק את reagents.
הערה: ערך OCR בסיס ממוצע עבור התא היה צריך להיות מזוהה לפני הפעלת הודעה אופטימיזציה בעת אופטימיזציה עבור ריכוז זריעת תאים. - לחץ על לחצן הבא. מסך פרטי הקבוצה מופיע.
- הקצה קבוצה לבארות שלא הוקצו באמצעות בחירת צבע ומתן שם ולאחר מכן לחיצה על בארות המתאימות.
הערה: הקבוצות השונות מוגדרות כטיפולים שונים לפני הפעלת בדיקת הלחץ של התא מיטו. כל הבארים של microplates יקבלו את אותן זריקות reagent כאשר בדיקת הלחץ היא לרוץ. - לחץ על לחצן הבא. מופיע המסך פריסת הזרקת בדיקת מלחץ.
- לחץ על התחל. בדיקת הלחץ פועלת כעת על המנתח. כאשר הריצה נגמרת, בצע את הנקודה s בתוכנה, הסר ובטל את המחסנית ואת לוח התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המיטוכונדריה cristae של תאי HepG2 שנחשפו β-HCH נפגעו במידה ניכרת. המיטוכונדריה המפוזרת התרחבה במתינות, בצורה לא סדירה, ורכס המיטוכונדריה נעלם עם ארכיטקטורה מיטוכונדריאלית חריגה יחסית (איור 1).
עוצמת הפלואורסצנס הירוקה הממוצעת, המייצגת את המיטוכונדריה, ירדה בתאי HepG2 החשופים ל-β-HCH(איור 2), כמו גםברמות ATP(איור 3). עוצמת הפלואורסץ ורימת ה-ATP ירדו בהדרגה עם הגדלת ריכוזי החשיפה. פוטנציאל, הירידה במספר המיטוכונדריה, או מיטוכונדריה פגומה, גרם לעוצמת הפלואורסצנט המיטוכונדריה שנצפתה, וכתוצאה מכך הייצור המופחת של ATP.
התוצאות של ציתימת זרימה הראו כי היחס של פלואורסצסצנת JC-1 אדום/ירוק בקבוצת β-HCH היו נמוכים באופן משמעותי מאשר בפקד(איור 4). OCR של תאי HepG2 צומצם באופן תלוי מינון לאחר חשיפה β-HCH. בהשוואה לקבוצת הביקורת, שיעורי נשימה בזל, דליפת פרוטון, קיבולת נשימה מקסימלית, ותחלופת ATP ירדו באופן משמעותי בתאי HepG2 שנחשפו β-HCH (איור 5). תוצאות אלה הצביעו על כך שתפקוד המיטוכונדריאלי נפגע לאחר חשיפה β-HCH.
כל המכשירים המשמשים בניסויים אלה הוצגו בדמות משלימה 1.
איור 1: מיקרוגרפים מייצגים של תאי HepG2 החשופים ל- β-HCH (A: 6000×, B: 25000×). נזקים אופייניים הראו מיטוכונדריה מוגדלת במתינות (M), מטריצות אלקטרונים-lucent, כריסטה פגום ופערים organelle רופף. מ: מיטוכונדריה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זיהוי פלואורסצנט מיטוכונדריאלי בתאי HepG2 שטופלו ב- β-HCH13. כמות, מיקום ועוצמת פלואורסצנטיות של המיטוכונדריה (A) הראו תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות ורמות כמותיות של עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי התבססו על פלואורסצנט ירוק מיטוכונדריאלי לכל תא (ב). *: P < 0.05, ***: P < 0.001 בהשוואה לבקרה. כל נקודת נתונים הייתה ה- MEAN ± SEM משלושה ניסויים נפרדים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: רמות ATP בתאי HepG213. P לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: השפעות על MMP על ידי ציטומיה כתמים וזרימה JC-113. (א) זרימה של חלקות ציתומיה. ציר ה-Y הראה את היחס בין פלואורסץ אדום לירוק. PE: פלואורסצנציה אדומה, FITC: פלואורסצנס ירוק. (ב).**: P < 0.01 בהשוואה לפקד. כל נקודת נתונים הייתה ה- MEAN ± SEM משלושה ניסויים נפרדים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: זיהוי קצב צריכת חמצן תאי (OCR). (א) ההשפעה של β-HCH על OCR הסלולרי נמדדה על ידי מנתח השטף ה extracellular. ארבע התקופות מייצגות קצב הנשימה הסלולית, קצב מעכב ATP-סינתאז, קצב לא מרוסן מקסימלי, וקצב רוטנון או אנטימיצין-A-מעוכב. (ב) היסטוגרמות כמותיות של תוצאות OCR עבור בסיס, דליפת פרוטון, קיבולת נשימה מקסימלית, קיבולת מחזור ATP andreserve. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 בהשוואה לפקד. כל נקודת נתונים הייתה ה- MEAN ± SEM משלושה ניסויים נפרדים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: כל המכשירים המשמשים בפרוטוקולים. (א) מיקרוסקופאלקטרונים שידור. (ב) מיקרוסקופ מיקרוסקופ מיקרוסקופ מיקרוסקופי סורק לייזר. (ג) לומינומטר. (ד) קורא מרובה מצבים. (ה) ציתום זרימה. (ו) מנתח שטף extracellular. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קריטי להצלחת פרוטוקול הזיהוי הוא השימוש במגוון שיטות ניסיוניות כיסו את המחקר מפנוטיפ למנגנון. במחקר זה, תאי HepG2 היו תרבותיים DMEM עם פניצילין וסטרפטומיצין ו 10% סרום של פר העובר. כאשר תאים הגיעו 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) נוספו ותווספו במשך 24 שעות. השתמשנו לראשונה TEM אשר הראה את השינויים ultrastructural hepatocyte הנגרמת על ידי OCPs נציג, β-HCH, מראה את הפגיעה של מבנה המיטוכונדריה (איור 1). יתר על כן,הסתערות פלורסנט (איור 2)), לוציפראז-לוציפרין ATP (תסיסה (איור3)), JC-1 תסה (איור 4) ואסאמבחן מיטו תא (איור 5), אשר בדרך כלללהעריךתפקוד מיטוכונדריה לקוי, בוצעו. תוצאות אלה משמשות בסיס לחקירה של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים.
בשיטות הנ"ל, החוקרים צריכים לשים לב לאמצעי זהירות בשלבים מסוימים. לדוגמה, בהכנת תא מיקרוסקופאלקטרונים, יש לשים לב למספר התאים, כדי למנוע קיבעון לקוי שנגרם על ידי רקמה גדולה מדי או בלוק תא. 5% גלוטראלדהייד פועל כמתקן, עדיף לא לאחסן יותר מחצי שנה כדי למנוע כישלון של זיהוי. דגימות קבועות ממוקמות ב- 4 °C למשך 24 שעות או עד חודש לפני השלב הבא. קל להרשבת צבע פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי, ויש להימנע מהאור כדי להאט את הפלואורסצנטי. ברמות ATP הסלולרי תבחילה, בעת שימוש luminometer רב תכליתי שיכול לזהות chemiluminescence, לוח אטום או לוחות 96-באר הלוח יש להשתמש כדי למנוע הפרעה הדדית בין חורים סמוכים. ATP, במיוחד מחשוף של ATP בדגימה אינו יציב בטמפרטורת החדר, ואת הניסיון צריך להיות מופעל ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח. ATP יכול להיות יציב על קרח עד 6 שעות. בהכנת פתרון זיהוי JC-1, ניתן להוסיף מאגר צביעה מכתים JC-1 (5X) לאחר JC-1 (200X) הוא מומס ביסודיות מעורבב עם המים אולטרה פורה, כך פתרון זיהוי JC-1 יהיה קל להתמוסס לחלוטין. יש לטעון את גשושית JC-1 ולשטוף אותה תוך 30 דקות ולהיות שמורה ב-4°C או בקרח כדי להשלים את בדיקת המעקב. במדידות OCR, ערך OCR בסיס הממוצע עבור התא יש לזהות לפני edsay אופטימיזציה, בעת אופטימיזציה עבור ריכוז זריעת תאים.
קיימות כמה מגבלות של שיטות אלה. מדידת OCR על ידי מנתח שטף חוץ-תאי מוגבלת לניסויים בתאים. הגילוי של תפקוד מיטוכונדריאלי אינו עמוק מספיק מאז המוצרים חילוף החומרים על ידי המיטוכונדריה אינם נמדדים, כגון מדידת חומצות שומן ומטבוליטים במחזורי TCA בהפטוציטים. יתר על כן, הביטוי של גנים וחלבונים לגבי סינתזת חומצת שומן הכבד והשפלה יכול להתגלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת כתם מערבי, אשר יכול לאשר עוד יותר את ההפרעות המולקולריות של חילוף החומרים של חומצות שומן ותפקוד מיטוכונדריאלי13. ניתן לכדו תמונות דיגיטליות של מיטוכונדריה בתאים חיים תחת מיקרוסקופית קונפוקלית וניתחו אותם לשינויים של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית המבוססת על ערכי גורם צורה (FF) ויחס גובה-רוחב (AR). הפונקציה המטבולית של המיטוכונדריה הוערכה גם על ידי מדידת קצב חומציות extracellular (ECAR) באמצעות מנתח ביו-אנרגיטי14. ניתן למדוד כמה נוגדנים סמן מיטוכונדריאלי (ציטוכרום c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA ו STAT3) ניתן למדוד על ידי כתםמערבי 4,15,16,17. הפעילות של אנזימים המכבדים את תפקוד המיטוכונדריה ואת מחזור חומצה tricarboxylic (TCA), כגון דהידג'נאז מאליק, דהידג'נאז תמציתי, סינתזה ציטראט, ATPase, איזוסיטרט דהידג'נאז ו α-ketoglutarate דהידג'נאזהם עדות 18. פונקציה של שרשרת תחבורת אלקטרונים בתאים במיטוכונדריה כבד מבודד מזוהה באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה19.
הפרוטוקולים שלנו מתמקדים באיתור מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, מבנה, מיקום, כמות, קיבולת, פוטנציאל קרום ותפקוד שרשרת נשימה. אלה בעצם מסוגלים להעריך פונקציה מיטוכונדריאלי מהיבטים שונים. יתר על כן, שיטות אלה הן פשוטות וקלות לתפעול. מחקרי תפקוד מיטוכונדריאלי נערכו באופן נרחב בתחומיםשונים, כגון כבד 20, microbiotaמעיים 21, תאי גזעפלורופוטנטיים 22, ובמחלות נפוצות מסוימות, כגון סוכרת סוג2 23, מחלתפרקינסון 24 ומחלת מעידלקתית 25. ייתכנו מחלות נוספות הקשורות למיטוכונדריה, והפרוטוקולים שלנו יכולים להיות מועילים בחקירת המנגנונים הרלוונטיים. בנוסף, נדרשת עבודה אמפירית נוספת גם בקנה מידה מקיף ועמיק של תופעות אלה עם שיטות ניסיוניות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס' 81573174, 81570574); קרן הנוער המצטיינים של מחוז ג'יאנגסו (SBK2014010296); פרויקט המחקר של משרד החינוך הסיני (213015A); פיתוח התוכנית האקדמית עדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו (PAPD), פיתוח מרכזי הדגל של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו; ותכנית הפרויקט הפתוח של המעבדה לכימיה סביבתית ואקוטוקסיקולוגיה (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
