Summary
간세포에서 미토콘드리아 기능에 대한 환경 유기염소농약(OCP)의 영향을 이해하는 것은 대사 장애를 일으키는 OCP의 메커니즘을 탐구하는 데 중요합니다. 이 논문은 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다.
Abstract
이 논문은 간세포에서 환경 유기염소 살충제 (OCP)로 인한 대사 장애의 원인을 더 잘 이해하기 위해 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다. HepG2 세포는 β-헥사클로로시클로헥산(β-HCH)에 24시간 동안 일반 집단에서 내부 노출의 동등한 용량으로 노출되었다. 간세포내의 초구조는 미토콘드리아의 손상을 나타내기 위해 전염 전자 현미경 검사(TEM)에 의해 검사되었다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 추가적으로 평가되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브에 의해 염색된 후 미토콘드리아 형광 강도는 형광 현미경검사로 관찰되었다. 루시페린 루시파라제 반응은 ATP 수준을 결정하는 데 사용되었다. MMP는 양이온염 JC-1에 의해 검출되고 유동 세포측정하에 분석되었다. OCR은 세포외 플럭스 분석기로 측정되었다. 요약하자면, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 손상을 조사하기 위해 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하는 데 사용되었습니다.
Introduction
생식 간섭, 면역 독성, 대사 변화 등 건강에 대한 유기염소살충제(OCP)의 효과는 이전에1,,2,,3을연구하였다. 세포 대사를 감지하고 미토콘드리아 기능 장애를 알아내는 방법은 과학자들이 미토콘드리아기능(즉)역할을 이해할 수 있게 해 주었다. , 미토콘드리아 STAT3 수준, 젖산, 피루바테, 젖산염-피루바테 비율, 코엔자임 Q10, 미토콘드리아 양성자 누출, 생체 에너지, 생체 발생, 심혈관 기능, 암 및 안전 독성4,,55,6,,7. 이 논문에서는 OCP에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법을 설명합니다.
우리는 HepG2 세포를 β-헥사클로로클로헥산(β-HCH)에 노출시켰다( β-HCH), 하나의 대표적인 OCP, 24h는 인간의 내부 노출에 상응하는 용량으로. 먼저, TEM은 핵, 미토콘드리아 및 내피 성 망상8과같은 간세포의 초구조를 관찰하도록 적용되었다. 일반적인 현미경과 비교하여, TEM은 세포 및 세포 성분 (세포주 또는 조직), 형태학, 화학 조성뿐만 아니라 현대 과학 및 기술에서 중추적 인 역할을하는 천연 또는 인공 물질의 기능을 2D 및 3D 초구조를 탐구 할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 더욱 평가되었다. 미토 트래커 그린은 미토콘드리아 그린 형광 프로브로, 살아있는 세포 미토콘드리아 특이적 형광 염색에 사용할 수 있다. 간세포내의 미토콘드리아는 미토트래커 그린 용액과 미토콘드리아 형광 강도, 수 및 패턴에 의해 염색되어 공초점 현미경9로관찰되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 살아있는 세포를 얼룩지게 하는 데 사용할 수 있습니다. 로다민 123 또는 JC-1과 비교하여 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 미토콘드리아 염색을 위한 미토콘드리아 막 잠재력에 의존하지 않습니다. ATP 수준은 루시파아제-루시페린 키트에 의해 결정되었고 단백질 농도에 의해 정상화되었다. ATP 분석 키트는 일반적인 해결책, 세포 또는 조직에서 ATP 수준을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 키트는 ATP가 에너지를 제공해야 할 때 형광을 생성하기 위해 형광에 의해 촉매된 반딧불 루시파아제를 기반으로 합니다. 반딧불이 루시파라제와 형광이 과도한 경우, 특정 농도 범위에서, 형광의 생성은 ATP의 농도에 비례한다. 또한 이 키트는 ATP의 화학 발광을 최적화하기 위해 특별히 설계되었습니다. ATP는 가장 중요한 에너지 분자로서 세포의 다양한 생리학적 또는 병리학 적 과정에 중요한 역할을합니다. ATP 수준에 있는 변경은 세포 기능에 있는 결점을 반영할 수 있습니다, 특히 미토콘드리아 에너지 생산. 일반적으로 세포 사멸, 괴사 또는 일부 독성 상태에서, 세포 ATP 수준은 10감소. JC-1을 사용한 MmPs 분석 키트는 JC-1을 형광 프로브로 사용하여 세포, 조직 또는 정제된 MmP를 빠르고 민감하게 감지하는 키트입니다. 그것은 apoptosis의 조기 검출을 위해 사용될 수 있습니다. 양이온염액 JC-1은 녹색 및 적색 형광비의 변화에 의해 표시된 유동 세포측정하에서 분석될 수 있는 MMP를 검출하는 데 사용되는 형광 프로브이다. MMP가 높을 때, JC-1은 적색 형광을 생성하는 중합체(J-aggregates)를 형성하기 위해 미토콘드리아의 매트릭스에 응집된다. MMP가 낮으면 JC-1이 축적될 수 없으며 녹색형광(11)을생성하는 단조량체를 형성한다. 따라서 적색 및 녹색 형광의 비율은 MMP의 수준을 반영할 수 있습니다. 세포의 OCR은 정상적인 세포기능(12)의중요한 지표이다. 미토콘드리아 기능을 연구하기 위한 매개변수로 간주됩니다. 세포 미토 스트레스 테스트 키트는 미토콘드리아 기능의 주요 파라미터를 분석하는 안정적인 방법을 제공합니다. 이 키트는 품질 관리 및 예측 시약뿐만 아니라 세포 미토콘드리아 응력 테스트를 수행하는 표준 방법을 제공합니다. 그것은 1 차세포, 세포주, 중단된 세포를 포함하여 모든 세포 모형을 검출하기 위하여 이용될 수 있고, 또한 섬, 선충, 효모 및 고립된 미토콘드리아를 위해 이용될 수 있습니다.
OCR 측정은 세포의 생리적 상태 또는 변경에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 호흡 기준선, 양성자 누출, 최대 호흡, ATP 회전율 및 예비 용량을 검출하기 위해 세포외 플럭스 분석기로 결정되었습니다. 간단히 말해서, OCR의 기준선 측정 후, OCR은 올리고마이신(ATP 커플러), FCCP(미토콘드리아 산화 인산화 비커플기) 및 항마이신 A/로테네톤(산소 소비 억제제)에 순차적으로 첨가한 후 검출되었다.
시험관내 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 보다 구체적인 프로토콜의 개발을 용이하게 하기 위해, 우리는 미토콘드리아 손상 관련 불리한 결과를 연구하는 향후 응용 프로그램과 함께 TEM, 공초점 현미경, 발광계, 유동 세포측정및 세포외 플럭스 분석기의 실험을 여기에 제시한다.
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Protocol
모든 실험과 실험 프로토콜은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 난징 의과 대학의 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. TEM에 의한 미토콘드리아 초구조
- HepG2 세포 수집
- 100mm 접시에 씨앗 HepG2 세포. 37 °C 및 5 % CO2에저장합니다.
- 1.5 mLEP 튜브에서 0.25 % EDTA로 세포를 소화합니다.
- 실온(RT)에서 3분 동안 1000 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
- 4-6 x 105 HepG2 셀을 수집합니다.
- 파이펫과 함께 5% 글루타랄데히드(용매: 이중 증류수)의 1mL을 넣고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 인산염 완충제 1mL의 4가지 변경 사항(Na2HPO4,KH2PO4,NaCl 및 KCl, pH 7.4 포함), 각각 15분으로 세척합니다. 파이펫으로 인산염 버퍼를 빨아.
- 1% 오스뮴 (용매 : 이중 증류수)의 200 μm을 추가하고 검은 색 샘플에 대한 2 시간 4 ° C에서 배양.
주의 사항: 오스뮴은 매우 독성이 높고 휘발성 물질입니다. 그것은 신중하게 약물 캐비닛에서 작동해야합니다. - 인산염 완충제 1mL의 2개 변경 내용으로 넣고 세척합니다. 인산염 버퍼를 빨아.
- 2h에 대한 1.5 mL EP 튜브에서 2 % 우란 아세테이트 용액 (용매 : 이중 증류수 및 아세트산)에 스테인.
- 탈수하고 50% 아세톤, 70% 아세톤, 90% 아세톤(용매: 이중 증류수), 절대 아세톤 2개, 각 15분으로 물에 잠급됩니다.
- RT에서 1.5h에 2방울 아세톤(100%)/임베딩 제(1:1)로 침투합니다. Epon812 포함 제, 조리법은 다음과 같습니다 : Epon812, 62 mL 및 DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL 및 MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, 겨울), A:B=1:9 (v:v, 여름). 포함 금형에 포함 (체크 그리드부드러운 플라스틱 플레이트).
- 12h용 37°C, 12h용 45°C, 48h의 경우 60°C로 순차적으로 배양한다.
- 초박형 단면(가장 큰 면적은 0.5mm × 0.3mm)을 초과할 수 없음을 초박한 단면 기계 및 TEM(2 μm 및 500 nm)에 의해 준비하고 관찰합니다.
2. 미토콘드리아 형광 강도 검출
- 종자 2x 104 HepG2 셀 6 웰 플레이트. 24h에 β-HCH를 추가합니다.
- 1 mM 미토콘드리아 녹색 형광 프로브의 최종 농도를 공식화하는 무수 DMSO를 추가합니다.
- 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액(최종 농도: 200 nM)을 추가하고, 45분 동안 37°C에서 배양합니다.
- 미토콘드리아 녹색 형광 프로브 용액을 제거하고 이미징 전에 37°C에서 갓 준비된 세포 배양 배지(DMEM)를 추가합니다.
- 형광 현미경 (10x)에 의해 미토콘드리아 녹색 형광을 관찰한다. 검출 시 최대 흥분 파장은 490nm이고 최대 방출 파장은 516nm이다.
3. 셀룰러 ATP 수준의 분석
- 6웰 플레이트에 종자 HepG2 세포. 24h에 β-HCH를 추가합니다.
- 루시파아제-루시페린 ATP 분석 키트에서 200 μL의 용해 버퍼를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 12,000 x g의 원심분리기는 파이펫으로 새로운 튜브로 상류물을 수집합니다.
- ATP 검출 버퍼로 ATP 검출 시약을 1: 5의 비율로 희석합니다.
- 표준 곡선 결정 준비: ATP 표준 솔루션의 0.5 mM을 ATP 표준 솔루션의 0.5 mM을 ATP 리시스 버퍼에 의해 10, 5, 1, 0.5, 0.5, 0.01 μM로 희석합니다.
- RT에서 5분 동안 96웰 플레이트에 ATP 검출 버퍼 100μL을 추가하고, 발광계(화학발광 검출기)에 의해 감지되는 100μL의 셀 을 추가합니다. 표준 곡선을 사용하지만 ATP 농도(nmol/L)를 계산합니다.
- 멀티 모드 리더와 BCA 단백질 분석 키트에 의해 단백질 농도를 감지합니다.
- 표준 곡선 측정 준비: 단백질 표준 용액 5 mg/mL을 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mg/mL에 이중 증류수로 희석합니다.
- 96웰 플레이트에 셀 의 상체 1 μL을 추가하고 이중 증류수 19 μL을 추가합니다.
- 각 웰에 대해 200 μL의 BCA 검출 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 562nm의 멀티 모드 판독기에서 OD(광학 밀도) 값을 감지합니다. 표준 곡선을 사용하지만 단백질 농도(mg/mL)를 계산합니다.
- mg 단백질 농도당 ATP 함량을 수정합니다(단위: ATP 농도/단백질 농도, nmol/mg).
4. JC-1에 의한 미토콘드리아 막 전위(MMP) 평가
- 6웰 플레이트에 시드된 HepG2 세포를 수집합니다. 1.5mL EP 튜브에서 0.25% EDTA를 가진 세포를 소화하고, 원심분리기는 1000 x g에서 3분 동안, 상체를 버리고 세포를 수집한다.
- JC-1(200X)의 50μL을 증류수 8mL에 넣고 소용돌이와 혼합합니다. JC-1 검출 솔루션으로 염색 염색 버퍼의 2mL을 추가합니다.
- 세포 배양 배지의 0.5mL 및 JC-1 검출 용액의 0.5 mL의 혼합물로 세포를 37°C에서 20분 동안 배양한다.
- 4°C에서 3분 동안 600 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
- JC-1(1X) 염색 버퍼의 1mL의 2가지 변화에서 헹구고, 원심분리기는 600 x g에서 4°C에서 3분 동안 헹구는다. 그리고 상체를 폐기하십시오.
- JC-1 (1X) 염색 버퍼의 0.5 mL에서 세포를 중단하고, 흐름 세포측정을 통해 분석하여 녹색 및 적색 형광을 감지합니다. JC-1 폴리머가 검출되면, 발산 광을 490 nm로 설정하고 방출 광을 530 nm로 설정합니다. JC-1 폴리머가 검출되면, 발산광을 525nm로 설정하고 방출광을 590nm로 설정한다.
5. 산소 소비율(OCR) 측정
- 종자 HepG2 세포는 잘 당 4500 세포/100 μL의 밀도에서 96-well의 세포 배양 마이크로 플레이트에 있습니다. 24시간 이후에 각 셀이 잘 덮여 있는지 확인합니다.
- 이전문헌(13)에따라 준비된 시약의 적절한 부피를 적절한 사출 포트에 첨가한다. 포트 A: 올리고마이신의 25 μL 1 μM (ATP 커플러); 포트 B: FCCP의 25 μL 0.75 μM (전자 스로틀 제어, ETC 가속기); 포트 C: 25 μL 0.5 의 μM 항마이신 A/로테네론(미토콘드리아 억제제 A 및 미토콘드리아 억제제 B).
- 사용할 준비가 될 때까지 CO2가없는 37 ° C 인큐베이터에 카트리지를 저장합니다.
- 각 웰에서 실행 매체를 제거하고 새로운 DMEM에 추가하여 세포 판의 중간 변화를 만듭니다. 각 우물의 최종 부피는 180 μL입니다.
- 세포판은 분석 전에 1시간 동안 CO2가 없는 37°C 인큐베이터에 보관한다.
- 소프트웨어로 OCR을 자동으로 기록합니다.
- OCR 소프트웨어를 엽니다.
- 앱 드롭다운 메뉴에서 셀 미토 스트레스 테스트 키트를 선택합니다.
- 앱 시작 버튼을 클릭합니다.
- 스트레스 실행 테스트 버튼을 클릭합니다. 셀 스트레스 테스트 설정 화면이 나타납니다.
- 다음 단계를 수행합니다.
- 셀 시드 # 상자에 잘 시드된 셀 수를 입력합니다.
- 평균 기초 OCR 상자에 평균 OCR을 입력합니다.
- 각 시약에 대한 최종 작업 농도를 입력하고 시약을 주입합니다.
참고: 세포 파종 농도에 최적화할 때 최적화 분석서를 실행하기 전에 셀의 평균 기초 OCR 값이 검출되어야 합니다. - 다음 단추를 클릭합니다. 그룹 정보 화면이 나타납니다.
- 색상을 선택하고 이름을 지정한 다음 적절한 우물을 클릭하여 할당되지 않은 우물에 그룹을 할당합니다.
참고: 다른 그룹은 세포 미토 스트레스 테스트를 실행하기 전에 다른 치료법으로 정의됩니다. 마이크로 플레이트의 모든 우물은 스트레스 테스트가 실행될 때 동일한 시약 주사를 받게됩니다. - 다음 단추를 클릭합니다. 스트레스 테스트 사출 레이아웃 화면이 나타납니다.
- 시작을 클릭합니다. 이제 분석기에서 스트레스 테스트가 실행됩니다. 실행이 끝나면 소프트웨어의 점 s를 따라 카트리지와 셀 플레이트를 제거하고 버립니다.
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Representative Results
β-HCH에 노출된 HepG2 세포의 미토콘드리아 크리스테가 현저하게 손상되었다. 산란된 미토콘드리아는 약간 팽창하여 불규칙한 모양으로, 미토콘드리아 능선은 비교적 비정상적인 미토콘드리아아키텍처(도 1)로사라졌다.
미토콘드리아를 나타내는 평균 미토콘드리아 녹색 형광 강도는 β-HCH(도2)에노출된 HepG2 세포뿐만 아니라 ATP 수준(도3)에서감소하였다. 형광 강도와 ATP 수준은 노출 농도가 증가함에 따라 서서히 감소했습니다. 잠재적으로, 미토콘드리아 수의 감소, 또는 손상된 미토콘드리아, 관찰된 미토콘드리아 형광 강도를 일으키고, 결과적으로 ATP의 생산이 감소되었다.
유동 세포측정의 결과는 β-HCH 군에서 적색/녹색 JC-1 형광의 비율이 대조군(도4)보다현저히 낮았다는 것을 입증하였다. HepG2 세포의 OCR은 β-HCH 노출 후 투여 의존성 방식으로 감소하였다. 대조군에 비해 기저 호흡률, 양성자 누출, 최대 호흡 용량 및 ATP 회전율은 β-HCH에 노출된 HepG2 세포에서 현저히 감소하였다(그림5). 이러한 결과는 β-HCH 노출 후에 미토콘드리아 기능이 손상되었다는 것을 표시했습니다.
이 실험에 사용된 모든 계측기는 보충도 도 1에표시되었다.
그림 1: β-HCH에 노출된 HepG2 세포의 대표적인 TEM 현미경 사진(A: 6000×, B: 25000×). 일반적인 손상은 약간 확대 된 미토콘드리아 (M), 전자 루센트 행렬, 손상된 cristae 및 느슨한 세포구 간격을 보였다. M: 미토콘드리아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: β-HCH 13으로 처리된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광검출.13 미토콘드리아(A)의 양, 위치 및 형광 강도는 형광 현미경 영상 및 미토콘드리아 형광 강도의 정량적 수준에서 나타났으며 세포당 미토콘드리아 녹색 형광(B)을 기반으로 하였다. (B) *: P P&05, ***: P< 0.001 대조군과 비교. 각 데이터 포인트는 세 개의 별도 실험에서 평균 ±SEM이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HepG2 세포의 ATP 수준13. *** *** . *** : P & 0.001 대조군과 비교하여 ###: P < 0.01에 비해 10 ng /mL β-HCH.Data는 3 개의 별도 실험의 평균 ±SEM으로 제시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: JC-1 염색 및 흐름세포측정제(13)에의한 MMP에 미치는영향. (A) 흐름 세포 측정 플롯. Y축은 빨간색대 녹색 형광의 비율을 나타냈다. PE: 적색 형광, FITC: 녹색 형광. (B).**: P< 0.01 대조군과 비교. 각 데이터 포인트는 세 개의 별도 실험에서 평균 ±SEM이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포 산소 소비율 (OCR)의 검출. (A) 세포 외 플럭스 분석기에 의해 세포 외 플럭스 분석기로 β-HCH의 효과를 측정하였다. 4개의 기간은 세포 기초 호흡 속도, ATP-synthase 억제 속도, 최대 결합되지 않은 비율 및 로테톤 또는 항마이신-A-억제율을 나타낸다. (B) 기준선, 양성자 누출, 최대 호흡 용량, ATP 회전율 및 예비 용량에 대한 OCR 결과의 정량적 히스토그램. *: P P&05, **: P< 0.01, ***: P< 0.001 대조군과 비교. P 각 데이터 포인트는 세 개의 별도 실험에서 평균 ±SEM이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 프로토콜에 사용되는 모든 계측기. (A) 전송 전자 현미경 검사법. (B) 레이저 스캐닝 공초점 현미경. (C) 광미계. (D) 멀티 모드 리더. (E) 유동 세포측정. (F) 세포외 플럭스 분석기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
검출 프로토콜의 성공에 중요한 것은 표현형에서 메커니즘에 이르는 연구를 다루어온 다양한 실험 적 방법의 사용입니다. 이 연구에서, HepG2 세포는 페니실린과 연쇄상 구균 및 10% 태아 소 혈청으로 DMEM에서 배양되었습니다. 세포가 40-50% 합류에 도달하면 β-HCH(0, 10, 100 ng/mL)를 24시간 동안 첨가하고 배양하였다. 먼저 대표적인 OCP, β-HCH에 의한 간세포의 초구조적 변화를 보여 미토콘드리아 구조의 손상을 나타내는 TEM을 사용했다(도1)). 더욱이, 형광 염색 분석서(도2),루시파아료-루시페린 ATPFigure 2 (분석(도 3)), JC-1 (분석(도4) 및 세포 미토 스트레스 시험 분석(도5)이통상적으로 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 것으로 수행되었다.Figure 5 이 결과는 근본적인 분자 기계장치의 조사를 위한 기초역할을 합니다.
위의 방법에서, 조사관은 몇 가지 단계에서 예방 조치에주의를 기울여야한다. 예를 들어, 전자 현미경 세포의 제조에서, 세포의 수는 너무 큰 조직 또는 세포 블록에 기인하는 가난한 고정을 피하기 위하여 주의를 기울여야 합니다. 5% 글루타랄데히드는 고정 작용으로 작용하며, 검출 실패를 피하기 위해 반년 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다. 고정 된 샘플은 다음 단계 전에 24 시간 또는 최대 1 개월 동안 4 °C로 배치됩니다. 미토콘드리아 녹색 형광염은 담금질이 용이하며, 빛을 피하여 형광 담금질을 늦추는 것을 피해야 한다. 셀룰러 ATP 수준 분석에서, 화학 발광을 감지 할 수있는 다기능 발광계를 사용하는 경우, 불투명 칠판 또는 화이트 보드 96 웰 플레이트는 인접한 구멍 사이의 상호 간섭을 피하기 위해 사용되어야한다. ATP, 특히 샘플에서 ATP의 골짜기는 실온에서 안정적이지 않으며, 실험은 4°C 또는 얼음에서 작동되어야 한다. ATP는 최대 6시간 동안 얼음에서 안정될 수 있습니다. JC-1 검출 용액의 제조에서 JC-1 염색 버퍼(5X)를 JC-1(200X)이 철저히 용해하고 초순수와 혼합한 후 추가될 수 있어 JC-1 검출 용액이 완전히 용해될 수 있다. JC-1 프로브는 30분 이내에 적재하고 세척하고 4°C 또는 얼음에서 저장하여 후속 테스트를 완료해야 합니다. OCR 측정에서, 세포에 대한 평균 기초 OCR 값은 세포 파종 농도에 최적화할 때 최적화 분석 전에 검출되어야 한다.
이러한 방법에는 몇 가지 제한이 있습니다. 세포외 플럭스 분석기의 OCR 측정은 세포 실험으로 제한됩니다. 미토콘드리아에 의한 대사 산물이 측정되지 않기 때문에 미토콘드리아 기능의 검출은 간세포에서 TCA 주기에서 지방산 및 대사 산물을 측정하는 것과 같이 충분히 깊지 않다. 더욱이, 간 지방산 합성 및 분해에 관한 유전자 및 단백질의 발현은 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 및 서부 블롯에 의해 검출될 수 있으며, 이는 지방산 대사 및 미토콘드리아 기능 장애의 분자 장애를 더욱 확인할 수 있다13. 미토콘드리아의 디지털 이미지는 공초점 현미경 검사의 밑에 살아있는 세포에서 포착되고 양식 인자 (FF) 및 종횡비 (AR) 값에 근거하여 미토콘드리아 형태학의 변경을 위해 분석될 수 있습니다. 미토콘드리아의 대사 기능은 또한 생체에너지분석기(14)를이용하여 세포외산성화율(ECAR)을 측정하여 평가하였다. 일부 미토콘드리아 마커 항체(시토크롬 c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA 및 STAT3)는 서부 블로트4,,15,,16,,17로측정할 수 있다. 미토콘드리아 기능 및 트리카박실산(TCA) 주기, 예: 영양 탈수소효소, 수치네이트 탈수소효소, 구연산 합성제, ATPase, 이소염 탈수소효소 및 α-케토글루타레이트 탈수소효소를 아끼는 효소의 활동은18의증거이다. 세포 및 고립된 간 미토콘드리아에서 전자 수송 사슬의 기능은 고해상도호흡법(19)을사용하여 검출된다.
우리의 프로토콜은 미토콘드리아 형태, 구조, 위치, 양, 용량, 멤브레인 잠재력 및 호흡기 사슬 기능의 검출에 중점을 둡니다. 이들은 기본적으로 다른 양상에서 미토콘드리아 기능을 평가할 수 있습니다. 또한 이러한 방법은 간단하고 작동하기 쉽습니다. 미토콘드리아 기능 연구는 간20,장 내미생물(21),다능성줄기세포(22)등 다양한 분야에서 널리 수행되었으며, 제2형당뇨병(23)및파킨슨병(24) 및 염증성장질환(25)과같은 일부 일반적인 질환에서 널리 수행되고 있다. 미토콘드리아와 관련된 질병이 더 있을 수 있으며, 우리의 프로토콜은 관련 메커니즘의 조사에 도움이 될 수 있습니다. 또한, 더 많은 실험적 방법으로 이러한 효과의 포괄적이고 심층적인 규모에 대한 추가 경험적 작업이 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 Nos. 81573174, 81570574)에 의해 지원되었다; 장쑤성 우수 청년기금(SBK2014010296); 중국 교육부 연구 프로젝트 (213015A); 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학술 프로그램 개발 (PAPD), 강서 고등 교육 기관의 주력 주요 개발; 및 환경 화학 및 생태 독성학의 국가 핵심 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
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