Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Eksperimentell protokoll for å oppdage mitokondriefunksjon i hepatocytter utsatt for organochlorine plantevernmidler

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/56800

Summary

Å forstå påvirkningen av miljøorganochlorine plantevernmidler (OCPs) på mitokondriefunksjon i hepatocytter er viktig for å utforske mekanismen for OCPs forårsaker metabolske forstyrrelser. Dette papiret presenterer detaljerte metoder for å oppdage lever mitokondriefunksjon.

Abstract

Dette papiret presenterer detaljerte metoder for å oppdage lever mitokondriefunksjon for en bedre forståelse av årsaken til metabolske forstyrrelser forårsaket av miljøorganochlorine plantevernmidler (OCPs) i hepatocytter. HepG2-celler ble eksponert for β-heksakloklosstan (β-HCH) i 24 timer ved tilsvarende dose intern eksponering i den generelle populasjonen. Ultrastruktur i hepatocytter ble undersøkt ved overføring av elektronmikroskopi (TEM) for å vise skade på mitokondrier. Mitokondriefunksjonen ble ytterligere evaluert av mitokondriefluorescensintensitet, adenosin 5'-trifosfat (ATP) nivåer, oksygenforbruk (OCR) og mitokondriemembran potensial (MMP) i HepG2 celler inkubert med β-HCH. Mitokondrienes fluorescensintensitet etter farget av mitokondriegrønn fluorescerende sonde ble observert med fluorescensmikroskopi. Luciferin-luciferase reaksjonen ble brukt til å bestemme ATP nivåer. MMP ble oppdaget av kationiske fargestoff JC-1 og analysert under strømningscytometri. OCR ble målt med en ekstracellulær fluksaysator. Oppsummert ble disse protokollene brukt til å oppdage mitokondriefunksjon i hepatocytter med for å undersøke mitokondriskader.

Introduction

Effekten av organochlorine plantevernmidler (OCPs) på helse, f.eks reproduktive forstyrrelser, immunologisk toksisitet, metabolske endringer har tidligere blitt studert1,2,3. Metodene for å oppdage cellulær metabolisme og finne ut mitokondriedysfunksjon har gjort det mulig for forskere å forstå rollen som mitokondriefunksjon (det vil si., mitokondrie-STAT3-nivåer, laktat, pyruvat, laktat-til-pyruvatforhold, koenzym Q10, mitokondrieprotonlekkasje, bioenergetika, biogenese og dynamikk) på områder som aldring, fedme, diabetes, kardiovaskulær funksjon, kreft og sikkerhetstoksisitet4,5,,6,,7., I dette papiret beskriver vi metodene for å vurdere mitokondriedysfunksjon forårsaket av OCPer.

Vi eksponerte HepG2-celler for β-heksaklokloheksan (β-HCH), en representativ OCPs, i 24 timer ved en dose tilsvarende intern eksponering av mennesker. For det første ble TEM brukt til å observere ultrastrukturen av hepatocytter, som kjerner, mitokondrier og endoplasmaisk retikuulum8. Sammenlignet med vanlige mikroskoper, gjør TEM det mulig å utforske 2D og 3D ultra-struktur av celler og cellekomponenter (cellelinjer eller vev), morfologi, kjemisk sammensetning, samt funksjon av naturlige eller kunstige materialer som spiller en avgjørende rolle i moderne vitenskap og teknologi. Mitokondriefunksjonen ble videre evaluert av mitokondriefluorescensintensitet, adenosin 5'-trifosfat (ATP) nivåer, oksygenforbruk (OCR) og mitokondriemembran potensial (MMP) i HepG2 celler inkubert med β-HCH. Mito-tracker grønn er en mitokondrier grønn fluorescerende sonde som kan brukes til levende celle mitokondrie-spesifikke fluorescerende farging. Mitokondriene i hepatocytter ble farget av mito-tracker grønn løsning og mitokondriefluorescensintensitet, antall og mønster ble observert med en konfokal mikroskopi9. Mitokondriegrønn fluorescerende sonde kan brukes til å flekke levende celler. Sammenlignet med rhodamin 123 eller JC-1, er mitokondriegrønn fluorescerende sonde ikke avhengig av mitokondriemembran potensial for mitokondriefarging. ATP-nivåene ble bestemt av et luciferase-luciferin-sett og normalisert ved proteinkonsentrasjon. ATP analyse kit kan brukes til å oppdage ATP nivåer i vanlige løsninger, celler eller vev. Dette settet er basert på firefly luciferase katalysert av fluorescein for å generere fluorescens, når ATP er nødvendig for å gi energi. Når firefly luciferase og fluorescein er overdreven, i et visst konsentrasjonsområde, er generering av fluorescens proporsjonal med konsentrasjonen av ATP. I tillegg har dette settet blitt spesielt designet for å optimalisere chemiluminescensen til ATP. ATP, som de viktigste energimolekylene, spiller en viktig rolle i de ulike fysiologiske eller patologiske prosessene i celler. Endringer i ATP-nivåer kan gjenspeile feil i cellefunksjonen, spesielt mitokondrieenergiproduksjon. Vanligvis under apoptose, nekrose eller i noen giftig tilstand, reduserte cellulære ATP-nivåer 10. MMPs analyse kit med JC-1 er et sett som bruker JC-1 som en fluorescerende sonde for å oppdage celler, vev eller renset MMPs raskt og følsomt. Den kan brukes til tidlig påvisning av apoptose. Den kationiske fargestoff JC-1 er en fluorescerende sonde som brukes til å oppdage MMP som kan analyseres under strømningscytometri indikert av endringer i grønt og rødt fluorescensforhold. Når MMP er høy, er JC-1 aggregert i matrisen av mitokondriene for å danne en polymer (J-aggregater), som produserer rød fluorescens. Når MMP er lav, jc-1 kan ikke akkumuleres, og danner monomer som produserer grønn fluorescens11. Så forholdet mellom rød og grønn fluorescens kan gjenspeile nivået av MMP. OCR av celler er en avgjørende indikator på normal cellulær funksjon12. Det regnes som en parameter for forskning mitokondriefunksjon. Cellemito stress testsett gir en stabil metode for å analysere viktige parametere for mitokondriefunksjon. Settet gir kvalitetskontroll og prediktive reagenser samt en standard metode for å utføre celle mitokondriestresstest. Den kan brukes til å oppdage alle celletyper, inkludert primære celler, cellelinjer, suspenderte celler, og også for holmer, nematoder, gjær og isolerte mitokondrier.

OCR-måling kan gi verdifull innsikt i den fysiologiske statusen eller endringene i cellene. Det ble bestemt med en ekstracellulær fluxanalysator for å oppdage puste baseline, protonlekkasje, maksimal respiratorisk, ATP-omsetning og reservekapasitet. Kort sagt, etter baseline målinger av OCR, ble OCR oppdaget etter sekvensielt å legge til oligomycin (ATP-kobling), FCCP (mitokondrieoksidativ fosforyler) og antimycin A / rotenon (en hemmer av oksygenforbruk) per brønn.

I et forsøk på å lette utviklingen av mer spesifikk protokoll for å oppdage mitokondriefunksjon i hepatocytter in vitro, presenterer vi her eksperimenter av TEM, konfokal mikroskopi, luminometer, strømningscytometri og ekstracellulær fluksaysator med fremtidig anvendelse i å studere mitokondrier skaderelaterte uønskede resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter og eksperimentprotokollene ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter og godkjent av den lokale etiske komiteen ved Nanjing Medical University.

1. Mitokondrie ultrastruktur av TEM

  1. Samle HepG2 celler
    1. Seed HepG2 celler i 100 mm retter. Oppbevares ved 37 °C og 5 % CO2.
    2. Fordøy celler med 0,25% EDTA i 1,5 mLEP rør.
    3. Sentrifuge ved 1000 x g i 3 min ved romtemperatur (RT). Kast det overnaturlige.
    4. Samle 4-6 x 105 HepG2 celler.
  2. Tilsett 1 ml 5 % glutaraldehyd (Oppløsningsvæske: dobbelt destillert vann) med pipetter og inkuber ved 4 °C i 2 timer.
  3. Legg til og vask i 4 endringer av 1 ml fosfatbuffer (som inneholder Na2HPO4,KH2PO4,NaCl og KCl, pH 7.4), 15 min hver. Sug ut fosfatbuffer med pipetter.
  4. Tilsett 200 μm μm 1 % osmium (oppløsningsvæske: dobbelt destillert vann) og inkuber ved 4 °C i 2 timer til svart prøve.
    Forsiktig: Osmium er svært giftig og flyktig stoff. Det skal opereres forsiktig i legemiddelskapet.
  5. Tilsett og vask i 2 endringer av 1 ml fosfatbuffer, 5 min hver. Sug ut fosfatbufferen.
  6. Beis i 2 % uranylacetatoppløsning (Oppløsningsvæske: dobbeltdestillert vann og eddiksyre) i 1,5 ml EP-rør i 2 timer.
  7. Dehydrer og senk gjennom 50% aceton, 70% aceton, 90% aceton (Løsemiddel: dobbelt destillert vann), 2 endringer av absolutt aceton, 15 min hver.
  8. Tren inn i 2 dråper aceton (100%)/innebyggingsmiddel (1:1) i 1,5 timer ved RT. Epon812 innebyggingsmiddel, oppskriften er som følger: A: Epon812, 62 ml og DDSA, 100 ml; B: Epon812, 100 ml og MNA 89 ml. A: B = 2:8 (v: v, om vinteren), A: B = 1:9 (v: v, om sommeren). Innebygging i innebyggingsformer (Myk plastplate med rutete rutenett).
  9. Inkuber sekvensielt ved 37 °C i 12 timer, 45 °C i 12 timer og deretter 60 °C i 48 timer.
  10. Forbered og observer ultratynne seksjoner (det største området kan ikke overstige 0,5 mm × 0,3 mm) ved ultratynne seksjoner maskin og TEM (2 μm og 500 nm).

2. Deteksjon av mitokondriefluorescensintensitet

  1. Frø 2x 104 HepG2 celler i 6-brønners plater. Tilsett β-HCH for 24 timer.
  2. Tilsett vannfri DMSO for å formulere en endelig konsentrasjon på 1 mitokondriegrønn fluorescerende sonde.
  3. Tilsett 1 ml mitokondriegrønn fluorescerende probeløsning (endelig konsentrasjon: 200 nM) i hver brønn på 6-brønnsplater, inkuber ved 37 °C i 45 min.
  4. Fjern mitokondriegrønn fluorescerende sondeløsning og tilsett nylaget cellekulturmedium (DMEM) ved 37 °C før bildebehandling.
  5. Vær oppmerksom på mitokondriegrønn fluorescens ved fluorescensmikroskop (10x). Maksimal eksitasjonsbølgelengde ved deteksjon er 490 nm og maksimal utslippsbølgelengde er 516 nm.

3. Analyse av de cellulære ATP-nivåene

  1. Seed HepG2 celler i 6-brønner plater. Tilsett β-HCH for 24 timer.
  2. Tilsett 200 μL lysisbuffere fra luciferase-luciferin ATP-analysesettet til hver brønn på 6-brønnsplater. Sentrifuge ved 12 000 x g i 5 min ved 4 °C, samle supernatanten med pipetter i nye rør.
  3. Fortynn ATP-deteksjonsreagensen med ATP-fortynningen i forholdet 1: 5, som ATP-deteksjonsbuffer.
  4. Klargjør standard kurvebestemmelse: fortynne 0,5 mM atp-standardløsningen til 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM av ATP lysisbuffere.
  5. Tilsett 100 μL ATP-deteksjonsbuffer i en 96-brønns plate i 5 min ved RT, og tilsett 100 μL med supernatant celle, detekter av et luminometer (chemiluminescence detektor). Beregn ATP-konsentrasjon (nmol/l) gjennom standardkurven.
  6. Påvis proteinkonsentrasjon av et BCA Protein Assay Kit med multimodeleser.
    1. Klargjør standard kurvebestemmelse: fortynne 5 mg/ml proteinstandardløsning til 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 mg/ml med dobbelt destillert vann.
    2. Tilsett 1 μL med supernatant celle i en 96-brønnsplate og tilsett 19 μL dobbelt destillert vann.
    3. Tilsett 200 μL BCA-deteksjonsløsninger for hver brønn. Inkuber ved 37 °C i 30 min. Oppdag OD-verdien (optisk tetthet) av en flermodusleser med 562 nm. Beregn proteinkonsentrasjonen (mg/ml) selv om standardkurven.
  7. Korriger ATP-innholdet per mg proteinkonsentrasjon (enhet: KONSENTRASJON/protein, nmol/mg).

4. Mitokondriemembranpotensial (MMP) vurdering av JC-1

  1. Samle HepG2 celler seeded i 6-brønn plater. Fordøy celler med 0,25 % EDTA i 1,5 ml EP-rør, sentrifuge ved 1000 x g i 3 min, kast supernatant og samle celler.
  2. Tilsett 50 μL JC-1 (200X) til 8 ml destillert vann til virvel og bland. Legg til 2 ml JC-1 (5X) fargingsbuffer som JC-1-deteksjonsløsning.
  3. Inkuber celler med en blanding av 0,5 ml cellekulturmedium og 0,5 ml JC-1 deteksjonsløsning i 20 min ved 37 °C.
  4. Sentrifuge ved 600 x g i 3 min ved 4 °C. Kast det overnaturlige.
  5. Skyll i 2 endringer på 1 ml JC-1 (1X) fargingsbuffer, sentrifuge ved 600 x g i 3 min ved 4 °C. Og kast det overnaturlige.
  6. Suspender celler i 0,5 ml JC-1 (1X) fargingsbuffer, analyser via strømningscytometri for å oppdage grønn og rød fluorescens. Når JC-1 polymer oppdages, sett eksitasjonslyset til 490 nm, og utslippslyset til 530 nm. Når JC-1 polymer oppdages, sett eksitasjonslyset til 525 nm, og utslippslyset til 590 nm.

5. Oksygenforbruk (OCR) målinger

  1. Seed HepG2 celler i cellekultur mikroplater av 96-brønn med en tetthet på 4500 celler / 100 μL per brønn. Sørg for at cellene dekkes med hver brønn etter 24 timer.
  2. Tilsett riktig volum av de tilberedte reagensene i riktig injeksjonsport, i henhold til tidligere litteratur13. Port A: 25 μL 1 μM oligomycin (ATP- coupler); Port B: 25 μL 0,75 μM FCCP (elektronisk gasskontroll, ETC-akselerator); Port C: 25 μL 0,5 av μM antimycin A/rotenon (mitokondriehemmer A og mitokondriehemmer B).
  3. Oppbevar sylinderampullen i en 37 °C inkubator uten CO2 før den er klar til bruk.
  4. Gjør en middels endring av celleplaten gjennom å fjerne løpemediet fra hver brønn og legge til den nye DMEM. Endelig volum for hver brønn er 180 μL.
  5. Oppbevar celleplaten i en 37 °C inkubator uten CO2 i 1 time før analysen.
  6. Ta opp OCR automatisk etter programvare.
    1. Åpne OCR-programvaren.
    2. Velg Cell Mito Stress Test Kit i Rullegardinmenyen Apper.
    3. Klikk Start app-knappen.
    4. Klikk på Kjør stresstest-knappen. Skjermbildet Oppsett av cellestresstest vises.
    5. Gjør følgende:
      1. Skriv inn antall celler seeded per brønn i Cell seeding # boksen.
      2. Skriv inn gjennomsnittlig OCR i boksen Gjennomsnittlig basal OCR.
      3. Angi den endelige arbeidskonsentrasjonen for hver reagens og injiser reagensene.
        MERK: Den gjennomsnittlige basale OCR-verdien for cellen skal ha blitt oppdaget før du kjører optimaliseringsanalysen når du optimaliserer for cellesåingkonsentrasjon.
      4. Klikk på Neste-knappen. Skjermbildet for gruppeinformasjon vises.
      5. Tilordne en gruppe til de ikke-tilordnede brønnene ved å velge en farge og gi et navn, og deretter klikke på de aktuelle brønnene.
        MERK: De ulike gruppene er definert som ulike behandlinger før du kjører av Cell Mito Stress Test. Alle brønner av mikroplater vil få de samme reagensinjeksjonene når stresstesten kjøres.
      6. Klikk på Neste-knappen. Skjermbildet Oppsett for stresstestinjeksjon vises.
      7. Klikk Start. Stresstesten kjøres nå på analysatoren. Når kjøringen er over, følger du punktene i programvaren, fjerner og kaster kassetten og celleplaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mitokondriene av HepG2-celler eksponert for β-HCH ble markert skadet. Spredte mitokondrier var mildt til markert utvidet, uregelmessig formet, og mitokondrieryggen forsvant med relativt unormal mitokondriearkitektur (figur 1).

Gjennomsnittlig mitokondriegrønn fluorescensintensitet, som representerer mitokondriene, redusert i HepG2-celler eksponert for β-HCH (figur 2), samt i ATP-nivåer (figur 3). Fluorescensintensiteten og ATP-nivået ble gradvis redusert med økende eksponeringskonsentrasjoner. Potensielt forårsaket reduksjonen i mitokondrier, eller skadet mitokondrier, den observerte mitokondriefluorescensintensiteten, og dermed redusert produksjon av ATP.

Resultatene av strømningscytometri viste at forholdet mellom rød/grønn JC-1 fluorescens i β-HCH-gruppen var signifikant lavere enn i kontrollen (figur 4). OCR av HepG2-celler ble redusert på doseavhengig måte etter β-HCH-eksponering. Sammenlignet med kontrollgruppen ble basal respirasjonsrater, protonlekkasje, maksimal respiratorisk kapasitet og ATP-omsetning signifikant redusert i HepG2-celler eksponert for β-HCH (figur 5). Disse resultatene indikerte at mitokondriefunksjonen ble svekket etter β-HCH-eksponering.

Alle instrumentene som ble brukt i disse eksperimentene var vist i supplerende figur 1.

Figure 1
Figur 1: Representative TEM mikrografer av HepG2-celler eksponert for β-HCH (A: 6000×, B: 25000×). Typiske skader viste mildt forstørrede mitokondrier (M), elektron-lucent matriser, skadet cristae og løse organelle hull. M: mitokondrier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Påvisning av mitokondriefluorescens i HepG2-celler behandlet med β-HCH13. Mengden, plasseringen og fluorescensintensiteten til mitokondrier (A) ble vist i fluorescensmikroskopiske bilder og kvantitative nivåer av mitokondriefluorescensintensitet var basert på mitokondriegrønn fluorescerende per celle (B). *: P < 0,05, ***: P < 0,001 sammenlignet med kontrollen. Hvert datapunkt var gjennomsnittet ± SEM fra tre separate eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: ATP-nivåer i HepG2-celler13. ***: P < 0,001 sammenlignet med kontrollen, ##: P < 0,01 sammenlignet med 10 ng/ml β-HCH.Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre separate eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Effekter på MMP av JC-1 farging og strømningscytometri13. (A) Flow cytometri tomter. Y-aksen viste forholdet mellom rød og grønn fluorescens. RØD fluorescens, FITC: Grønn fluorescens. (B).**: P < 0,01 sammenlignet med kontrollen. Hvert datapunkt var gjennomsnittet ± SEM fra tre separate eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Påvisning av cellulær oksygenforbruk (OCR). (A) Effekten av β-HCH på cellulær OCR ble målt ved den ekstracellulære fluksalysatoren. De fire periodene representerer cellulær basal respirasjonshastighet, ATP-syntasehemmt hastighet, maksimal koblet hastighet og rotenon- eller antimycin-A-hemmet hastighet. (B) Kvantitative histogrammer av OCR-resultater for baseline, protonlekkasje, maksimal respiratorisk kapasitet, ATP-omsetning og reservekapasitet. *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001 sammenlignet med kontrollen. Hvert datapunkt var gjennomsnittet ± SEM fra tre separate eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplemental Figure 1
Tilleggs figur 1: Alle instrumentene som brukes i protokoller.  (A) Transmisjonselektronmikroskopi. (B) Laserskanning konfokal mikroskop. (C) Luminometer. (D) Multimode-leser. (E) Strømningscytometri. (F) Ekstracellulær fluksanalysator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritisk til suksessen til deteksjonsprotokollen er bruken av en rekke eksperimentelle metoder som er dekket studien fra fenotype til mekanisme. I denne studien ble HepG2-celler dyrket i DMEM med penicillin og streptomycin og 10% føtal storfeserum. Når cellene nådde 40-50% samløpet, ble β-HCH (0, 10, 100 ng/ml) lagt til og inkubert i 24 timer. Vi brukte først TEM som viste de ultrastrukturelle endringene i hepatocytter forårsaket av de representative OCPs, β-HCH, som viser svekkelse av mitokondristruktur (figur 1). Videre ble fluorescerende fargingsanalyse (figur 2), luciferase-luciferin ATP-analyse (figur 3), JC-1-analyse (figur 4) og cellemitostresstestanalyse (figur 5), som vanligvis vurderer mitokondrier dysfunksjon, utført. Disse resultatene tjener som grunnlag for undersøkelse av de underliggende molekylære mekanismene.

I de ovennevnte metodene bør etterforskerne ta hensyn til forholdsregler i noen trinn. For eksempel, i utarbeidelsen av elektronmikroskopicelle, bør antall celler tas hensyn til, for å unngå dårlig fiksering forårsaket av for stort vev eller celleblokk. 5% glutaraldehyd fungerer som et fikseringsmiddel, det er bedre å ikke lagre mer enn et halvt år for å unngå feil på deteksjon. Faste prøver plasseres ved 4 °C i 24 timer eller opptil 1 måned før neste trinn. Mitokondriegrønn fluorescerende fargestoff er lett å slukke, og lys bør unngås for å bremse fluorescensslukkingen. I cellulære ATP nivåer analyse, når du bruker en multifunksjonell luminometer som kan oppdage chemiluminescence, ugjennomsiktig tavle eller tavle 96-brønnplater bør brukes til å unngå gjensidig interferens mellom tilstøtende hull. ATP, spesielt spalting av ATP i prøven er ikke stabil ved romtemperatur, og erfaringen må betjenes ved 4 °C eller på is. ATP kan være stabil på is i opptil 6 timer. I utarbeidelsen av JC-1 deteksjonsløsning, JC-1 farging farging buffer (5X) kan legges etter JC-1 (200X) er grundig oppløst og blandet med ultrapure vann, slik at JC-1 deteksjon løsning vil være lett å oppløse helt. JC-1-sonde skal lastes og vaskes innen 30 minutter og lagres ved 4 °C eller is for å fullføre oppfølgingstesten. I OCR-målinger bør den gjennomsnittlige basale OCR-verdien for cellen oppdages før optimaliseringsanalysen, når den optimaliseres for cellesåingkonsentrasjon.

Det er noen begrensninger av disse metodene. OCR-måling av en ekstracellulær fluksaysator er begrenset til celleeksperimenter. Påvisning av mitokondriefunksjon er ikke dyp nok siden metabolske produkter av mitokondrier ikke måles, for eksempel måling av fettsyrer og metabolitter i TCA-sykluser i hepatocytter. Videre kan uttrykket av gener og proteiner med hensyn til leverfettsyresyntese og nedbrytning oppdages ved sanntidpolymerasekjedereaksjon og vestlig flekk, som ytterligere kan bekrefte molekylære lidelser i fettsyrer metabolisme og mitokondriedysfunksjon13. Digitale bilder av mitokondrier kan fanges i levende celler under konfokal mikroskopi og analyseres for endringer av mitokondriemorfologi basert på formfaktor (FF) og størrelsesforhold (AR) verdier. Den metabolske funksjonen til mitokondrier ble også vurdert ved å måle ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) ved hjelp av en bioenergetisk analysator14. Noen mitokondriemarkørantistoffer (cytokrom c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA og STAT3) kan måles ved vestlig flekk4,,15,,16,,17. Aktivitetene til enzymer som respekterer mitokondriefunksjon og trikarboksylsyresyklusen (TCA), som malisk dehydrogenase, succinate dehydrogenase, citrate synthetase, ATPase, isocitrate dehydrogenase og α-ketoglutarate dehydrogenase er dokumentert18. Funksjonen til elektrontransportkjeden i celler og i isolerte lever mitokondrier oppdages ved hjelp av høyoppløselig respirometry19.

Våre protokoller fokuserer på påvisning av mitokondriemorfologi, struktur, plassering, mengde, kapasitet, membranpotensial og respiratorisk kjedefunksjon. Disse er i utgangspunktet i stand til å evaluere mitokondriefunksjon fra forskjellige aspekter. I tillegg er disse metodene enkle og enkle å betjene. Mitokondriefunksjonsstudier har blitt mye utført på forskjellige områder, for eksempel lever20,tarmmikrobiota21, pluripotente stamceller22, og i noen vanlige sykdommer, som type 2 diabetes23, Parkinsons sykdom24 og inflammatorisk tarmsykdom25. Det kan være flere sykdommer forbundet med mitokondrier, og våre protokoller kan være nyttige i undersøkelsen av relevante mekanismer. I tillegg er det også behov for ytterligere empirisk arbeid på den omfattende og grundige skalaen av disse effektene med mer eksperimentelle metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); Det utestående ungdomsfondet i Jiangsu-provinsen (SBK2014010296); Forskningsprosjektet til det kinesiske utdanningsdepartementet (213015A); Prioritert akademisk programutvikling av Jiangsu higher education institutions (PAPD), flaggskipet stor utvikling av Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner; og open project-programmet for State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope  FEI Tecnai G2 Spirit Bio TWIN High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green Beyotime C1048 Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope Zeiss 700B The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit Beyotime S0027 Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer Berthold Centro LB 960 Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit Beyotime P0012 BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader TECAN InfiniteM200 Multimode reader be used to detect protein consentration.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
  3. Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
  4. Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  5. Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
  6. Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
  7. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
  8. Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
  9. Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
  10. Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  11. Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
  12. Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
  13. Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
  14. Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
  15. Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
  16. Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
  17. Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
  18. Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
  19. Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
  20. Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
  21. Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
  22. Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
  23. Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
  24. Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  25. Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).

Tags

Miljøvitenskap utgave 163 Mitokondriefunksjon mitokondrie ultrastruktur mitokondriefluorescensintensitet adenosintrifosfat mitokondriemembran potensial oksygenforbruk rate
Eksperimentell protokoll for å oppdage mitokondriefunksjon i hepatocytter utsatt for organochlorine plantevernmidler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Q., Jiang, Z., Gu, A.More

Liu, Q., Jiang, Z., Gu, A. Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides. J. Vis. Exp. (163), e56800, doi:10.3791/56800 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter