Summary
Förstå påverkan av miljöorganoklorin bekämpningsmedel (OCPs) på mitokondriell funktion i hepatocyter är viktigt att utforska mekanismen för OCPs orsakar metabola sjukdomar. Detta dokument presenterar detaljerade metoder på att upptäcka hepatic mitokondriell funktion.
Abstract
Detta dokument presenterar detaljerade metoder på att upptäcka hepatic mitokondriell funktion för en bättre förståelse av orsaken till metabola sjukdomar som orsakas av miljöorganoklorin bekämpningsmedel (OCPs) i hepatocyter. HepG2-celler exponerades för β- hexaklorokyclohexan (β- HCH) för 24 h vid en ekvivalent dos av intern exponering i den allmänna populationen. Ultrastructure i hepatocytes undersöktes av överföring elektronmikroskopi (TEM) att visa skador av mitokondrier. Mitokondriell funktion utvärderades ytterligare av mitokondriell fluorescensintensitet, adenosin 5'-triphosphate (ATP) nivåer, syreförbrukningshastighet (OCR) och mitokondriell membranpotential (MMP) i HepG2-celler inkuberade med β-HCH. Mitokondrierna fluorescens intensitet efter färgas av mitokondriellt gröna fluorescerande sond observerades med en fluorescens mikroskopi. Luciferin- luciferasreaktionen användes för att bestämma ATP-nivåer. MMP upptäcktes av katjoniska färgämnet JC-1 och analyseras under flödescytometri. OCR mättes med en extracellulär flux analysator. Sammanfattningsvis var dessa protokoll används för att upptäcka mitokondriell funktion i hepatocyter med att undersöka mitokondrier skadestånd.
Introduction
Effekterna av organiska klorbekämpningsmedel (OCPs) på hälsan, t ex reproduktionsstörningar, immunologisk toxicitet, metaboliska förändringar har tidigare studerats1,2,3. Metoderna för att upptäcka cellulär metabolism och ta reda på mitokondriell dysfunktion har gjort det möjligt för forskare att förstå rollen av mitokondriell funktion (dvs., mitokondriellt STAT3 nivåer, laktat, pyruvat, laktat-till-pyruvat förhållande, coenzym Q10, mitokondriell protonläcka, bioenergika, biogenes, och dynamik) inom områden som åldrande, fetma, diabetes, kardiovaskulär funktion, cancer, och säkerhet toxicitet4,5,6,7. I detta dokument beskriver vi metoderna på att bedöma mitokondriell dysfunktion orsakas av OCPs.
Vi exponerade HepG2-celler för β-hexaklorokyclohexane (β- HCH), en representativ OCPs, för 24 h vid en dos som motsvarar intern exponering av människa. För det första tillämpades TEM för att observera den ultrastruktur av hepatocyter, såsom kärnor, mitokondrier och endoplasmatisk reticulum8. Jämfört med vanliga mikroskop, TEM gör det möjligt att utforska 2D och 3D ultra-struktur av celler och cellkomponenter (cellinjer eller vävnad), morfologi, kemisk sammansättning, samt funktion av naturliga eller konstgjorda material som spelar en central roll i modern vetenskap och teknik. Mitokondriell funktion utvärderades ytterligare av mitokondriell fluorescensintensitet, adenosin 5'-triphosphate (ATP) nivåer, syreförbrukningshastighet (OCR) och mitokondriell membranpotential (MMP)i HepG2-celler inkuberade med β-HCH. Mito-tracker grön är en mitokondrierna grön fluorescerande sond som kan användas för levande cell mitokondriell-specifika fluorescerande färgning. Mitokondrierna i hepatocyter var färgas av mito-tracker grön lösning och mitokondriell fluorescens intensitet, antal och mönster observerades med en confocal mikroskopi9. Mitokondriellt grön fluorescerande sond kan användas för att färga levande celler. Jämfört med rhodamin 123 eller JC-1, mitokondriellt grön fluorescerande sond inte beroende av mitokondriellt membran potential för mitokondriellt färgning. ATP-nivåer fastställdes av en luciferas-luciferin kit och normaliseras av protein koncentration. ATP-analyssats kan användas för att detektera ATP-nivåer i vanliga lösningar, celler eller vävnader. Detta kit är baserat på firefly luciferase katalyseras av fluorescein för att generera fluorescens, när ATP krävs för att ge energi. När firefly luciferas och fluorescein är överdriven, i ett visst koncentrationsområde, är generering av fluorescens proportionell mot koncentrationen av ATP. Dessutom har detta kit speciellt utformats för att optimera chemiluminescens av ATP. ATP, som de viktigaste energimolekylerna, spelar en viktig roll i cellernas olika fysiologiska eller patologiska processer. Förändringar i ATP-nivåer kan återspegla defekter i cellfunktion, särskilt mitokondriell energiproduktion. Vanligtvis under apoptos, nekros eller i något giftigt tillstånd, cellulära ATP-nivåer minskat 10. MMPs-assay kit med JC-1 är ett kit som använder JC-1 som en fluorescerande sond för att upptäcka celler, vävnader eller renas MMPs snabbt och känsligt. Det kan användas för tidig upptäckt av apoptos. Det katjoniska färgämnet JC-1 är en fluorescerande sond som används för att upptäcka MMP som kan analyseras under flödescytometri indikeras av förändringar av grön och röd fluorescensförhållande. När MMP är hög, JC-1 aggregeras i matrisen av mitokondrierna att bilda en polymer (J-aggregat), som producerar röda fluorescens. När MMP är låg, JC-1 kan inte ackumuleras, och bildar monomer som producerar grön fluorescens11. Så förhållandet mellan rött och grönt fluorescens kan återspegla nivån på MMP. Cellernas OCR är en avgörande indikator på normal cellulär funktion12. Det betraktas som en parameter till forskning mitokondriefunktion. Cells mito stresstestsats ger en stabil metod för att analysera nyckelparametrar av mitokondriell funktion. Satsen ger kvalitetskontroll och prediktiva reagenser samt en standardmetod för att utföra cellmitokondriellt stresstest. Det kan användas för att upptäcka alla celltyper, inklusive primära celler, cellinjer, upphängda celler, och även för holmar, nematoder, jäst och isolerade mitokondrier.
OCR-mätning kan ge värdefull insikt i cellernas fysiologiska status eller ombyggnader. det fastställdes med en extracellulära flux analysator för att upptäcka andning baslinjen, proton läcka, maximal luftvägarna, ATP omsättning och reserv kapacitet. I korthet, efter baslinjemätningar av OCR, upptäcktes OCR efter att sekventiellt lägga till oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriellt oxidativ phosphorylation uncoupler) och antimycin A/rotenone (en hämmare av syreförbrukning)per brunn.
I ett försök att underlätta utvecklingen av mer specifika protokoll för att upptäcka mitokondriell funktion i hepatocyter in vitro, presenterar vi här experiment av TEM, confocal mikroskopi, luminometer, flödescytometri och extracellulära flux analysator med framtida tillämpning i att studera mitokondrierna skada relaterade negativa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment och experimentprotokollen utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter och godkändes av den lokala etiska kommittén vid Nanjing Medical University.
1. Mitokondriell ultrastruktur av TEM
- Samla HepG2-celler
- Frö HepG2 celler i 100 mm rätter. Förvaras vid 37 °C och 5 % CO2.
- Digest celler med 0,25% EDTA i 1,5 mLEP rör.
- Centrifugera vid 1000 x g i 3 min vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten.
- Samla 4-6 x 105 HepG2 celler.
- Tillsätt 1 mL av 5% glutaraldehyd (Lösningsmedel: dubbelt destillerat vatten) med pipetter och inkubera vid 4°C i 2 h.
- Tillsätt och tvätta i 4 byten på 1 mL fosfatbuffert (innehållande Na2HPO4, KH2PO4, NaCl och KCl, pH 7.4), 15 min vardera. Sug ut fosfatbuffert med pipetter.
- Tillsätt 200 μm av 1% osmium (Lösningsmedel: dubbelt destillerat vatten) och inkubera vid 4 °C i 2 h till svart prov.
Var försiktig: Osmium är mycket giftigt och flyktigt ämne. Det bör drivas i läkemedelsskåpet noggrant. - Tillsätt och tvätta i 2 byten på 1 mL fosfatbuffert, 5 min vardera. Sug ut fosfatbuffert.
- Fläck i 2% uranylacetatlösning (Lösningsmedel: dubbelt destillerat vatten och ättiksyra) i 1,5 mL EP-rör för 2 h.
- Dehydrate och dränka genom 50% aceton, 70% aceton, 90% aceton (Lösningsmedel: dubbelt destillerat vatten), 2 ändringar av absolut aceton, 15 min vardera.
- Penetrera i 2 droppar aceton (100%)/inbäddningsmedel (1:1) för 1,5 h vid RT. Epon812 inbäddningsmedel, receptet är följande: A: Epon812, 62 mL och DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL och MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, på vintern), A:B=1:9 (v:v, på sommaren). Inbäddning i inbäddningsformar (Mjuk plastplatta med rutat galler).
- Inkubera sekventiellt vid 37 °C i 12 h, 45 °C i 12 h, och därefter 60 °C i 48 h.
- Förbered och observera ultratunna sektioner (det största området kan inte överstiga 0,5 mm × 0,3 mm) med ultratunna sektioner maskin och TEM (2 μm och 500 nm).
2. Mitokondriell fluorescens intensitet upptäckt
- Frö 2x 104 HepG2 celler i 6-brunnsplattor. Tillsätt β-HCH i 24 h.
- Tillsätt vattenfri DMSO för att formulera en slutkoncentration på 1 mM mitokondriell grön fluorescerande sond.
- Tillsätt 1 mL mitokondriell grön fluorescerande sondlösning (slutkoncentration: 200 nM) till varje brunn av 6-brunnsplattor, inkubera vid 37 °C i 45 min.
- Ta bort den mitokondriella gröna sondens lösning för fluorescerande och tillsätt nyberedda cellodlingsmedium (DMEM) vid 37 °C före avbildning.
- Observera mitokondriellt grön fluorescens med fluorescensmikroskop (10x). Den maximala excitation våglängd vid detektering är 490 nm och den maximala utsläpp våglängd är 516 nm.
3. Analys av de cellulära ATP-nivåerna
- Seed HepG2 celler i 6-brunns plattor. Tillsätt β-HCH i 24 h.
- Tillsätt 200 μL lysbuffertar från luciferas-luciferin ATP-analyssatsen till varje brunn av 6-brunnsplattor. Centrifugera vid 12 000 x g i 5 min vid 4 °C, samla supernatanten med pipetter i nya rör.
- Späd ut ATP-detektionsreagensen med ATP-utspädningen vid förhållandet 1: 5, som ATP-detektionsbuffert.
- Förbered standardkurvbestämning: späd 0,5 mM atp-standardlösningen till 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM genom ATP-lysbuffertar.
- Tillsätt 100 μL ATP-detektionsbuffert i en 96-brunnsplatta i 5 min vid RT, och tillsätt 100 μL supernatant av cell, detektera med en luminometer (chemiluminescence detektor). Beräkna ATP-koncentration (nmol/L) fast standardkurvan.
- Detektera proteinkoncentration av en BCA Protein Assay Kit med multimode-läsare.
- Preparering av standardkurvbestämning: späd 5 mg/mL av proteinstandardlösning till 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 och 0,5 mg/mL genom dubbelt destillerat vatten.
- Tillsätt 1 μL supernatant av cell i en 96-brunnsplatta och tillsätt 19 μL dubbeldestillerat vatten.
- Tillsätt 200 μL BCA-detektionslösningar för varje brunn. Inkubera vid 37 °C i 30 min. Detektera OD (optisk densitet) värde av en multimode-läsare med 562 nm. Beräkna proteinkoncentrationen (mg/mL) fast standardkurvan.
- Korrigera ATP-halten per mg proteinkoncentration (enhet: ATP-koncentration/proteinkoncentration, nmol/mg).
4. Mitokondriell membranpotential (MMP) bedömning av JC-1
- Samla HepG2 celler seedade i 6-brunns plattor. Digest celler med 0,25% EDTA i 1,5 mL EP-röret, centrifug vid 1000 x g i 3 min, kassera supernatanten och samla in celler.
- Tillsätt 50 μL JC-1 (200X) till 8 mL destillerat vatten till virvel och blanda. Tillsätt 2 mL av JC-1 (5X) färgning färgningsbuffert som JC-1 detektionslösning.
- Inkubera celler med en blandning av 0,5 mL cellodlingsmedium och 0,5 mL av JC-1 detektionslösning i 20 min vid 37 °C.
- Centrifugera vid 600 x g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Skölj i 2 byten på 1 mL jc-1 (1X) färgningsbuffert, centrifug vid 600 x g i 3 min vid 4 °C. Och kasta supernatanten.
- Suspend celler i 0,5 mL av JC-1 (1X) färgning buffert, analysera via flödescytometri för att upptäcka grön och röd fluorescens. När JC-1-polymeren detekteras, ställ excitationsljuset på 490 nm, och utsläppsljuset till 530 nm. När JC-1-polymeren detekteras, ställ excitationsljuset på 525 nm, och utsläppsljuset till 590 nm.
5. Mätningar för syreförbrukning (OCR)
- Frö HepG2 celler i cellodling mikroplattor av 96-brunn vid en densitet av 4500 celler/100 μL per brunn. Se till celler som täcks med varje väl efter 24 h.
- Tillsätt lämplig volym av de beredda reagenserna i lämplig injektionsport, enligt tidigare litteratur13. Port A: 25 μL 1 μM av oligomycin (ATP Coupler); Port B: 25 μL 0,75 μM av FCCP (Elektronisk gasreglage, ETC Accelerator); Port C: 25 μL 0,5 av μM antimycin A/rotenon (mitokondriell hämmare A och mitokondriell hämmare B).
- Förvara patron i en 37 °C-inkubator utan CO2 tills den är klar att användas.
- Gör en medelstor förändring av cellplattan genom att ta bort det löpande mediet från varje brunn och lägga till den nya DMEM. Slutlig volym för varje brunn är 180 μL.
- Förvara cellplattan i en 37 °C-inkubator utan CO2 i 1 h före analysen.
- Spela in OCR automatiskt av programvara.
- Öppna OCR-programvaran.
- Välj Cell Mito Stress Test Kit i den nedrullningsgardna menyn Appar.
- Klicka på knappen Starta app.
- Klicka på knappen Kör stresstest. Skärmen Installationsprogrammet för cellstresstest visas.
- Gör följande steg:
- Ange antalet celler sådd per brunn i rutan Cell-sådd # .
- Ange medelvärdet OCR i rutan Genomsnittlig basal OCR.
- Ange den slutliga arbetskoncentrationen för varje reagens och injicera reagenserna.
OBS: Det genomsnittliga basala OCR-värdet för cellen borde ha upptäckts innan optimeringsanalysen körs vid optimering för cellsåddkoncentration. - Klicka på knappen Nästa. Skärmen med gruppinfo visas.
- Tilldela en grupp till de ej tilldelade brunnarna genom att välja en färg och ge ett namn och klicka sedan på lämpliga brunnar.
OBS: De olika grupperna definieras som olika behandlingar före körning av Cell Mito Stress Test. Alla brunnar av mikroplattor kommer att få samma reagensinjektioner när stresstestet körs. - Klicka på knappen Nästa. Skärmen Stresstest injektionslayout visas.
- Klicka på Start. Stresstestet körs nu på Analysatorn. När körningen är över, följ punkten s i programvaran, ta bort och kasta patronen och cellplattan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondrierna cristae av HepG2 celler som utsätts för β-HCH var markant skadade. Spridda mitokondrierna var milt till markant expanderade, oregelbundet formade, och mitokondriell ås försvann med relativt onormal mitokondriell arkitektur (Figur 1).
Genomsnittlig mitokondriell grön fluorescensintensitet, som representerar mitokondrierna, minskade i HepG2-celler som exponerades för β-HCH (Figur 2), samt i ATP-nivåer (figur 3). Fluorescensintensiteten och ATP-nivån minskade gradvis med ökande exponeringskoncentrationer. Potentiellt orsakade minskningen av mitokondrierna antal, eller skadade mitokondrierna, den observerade mitokondriell fluorescens intensitet, och följaktligen den minskade produktionen av ATP.
Resultaten av flödescytometri visade att kvoterna för röd/grön JC-1 fluorescens i β- HCH-gruppen var betydligt lägre än i kontrollen (Figur 4). OCR av HepG2-celler reducerades på ett dosberoende sätt efter β- HCH-exponering. Jämfört med kontrollgrupp minskade basal respirationshastighet, protonläckage, maximal luftvägskapacitet, och ATP-omsättning signifikant i HepG2-celler som exponerades för β-HCH (figur 5). Dessa resultat indikerade att mitokondriell funktion var nedsatt efter β- HCH exponering.
Alla instrument som används i dessa experiment visades i kompletterande figur 1.
Figur 1: Representativa TEM-mikrografer av HepG2-celler som exponeras för β-HCH (A: 6000×, B: 25000×). Typiska skadestånd visade milt utvidgade mitokondrierna (M), elektron-lucent matriser, skadade cristae och lös organelle luckor. M: mitokondrierna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Påvisande av mitokondriell fluorescens i HepG2-celler som behandlats med β-HCH13. Mängden, plats och fluorescens intensitet mitokondrierna (A) visades i fluorescens mikroskopiska bilder och kvantitativa nivåer av mitokondriell fluorescens intensitet baserades på mitokondriellt gröna fluorescerande per cell (B). *: P < 0,05, ***: P < 0,001 jämfört med kontrollen. Varje datapunkt var medelvärdet ± SEM från tre separata experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: ATP-nivåer i HepG2-celler13. ***: P < 0.001 jämfört med kontrollen, ##: P < 0,01 jämfört med 10 ng/mL β-HCH.Data presenterades som medelvärde ± SEM av tre separata experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Effekter på MMP genom JC-1-färgning och flödescytometri13. (A) Flödescytometritoms. Y-axeln visade förhållandet mellan rött och grönt fluorescens. PE: Röd fluorescens, FITC: Grön fluorescens. (B).**: P < 0,01 jämfört med kontrollen. Varje datapunkt var medelvärdet ± SEM från tre separata experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Påvisande av cellulär syreförbrukningshastighet (OCR). (A) Effekten av β-HCH på cellulära OCR mättes av extracellulära flux analysatorn. De fyra perioderna representerar cellulära basala respirationshastighet, ATP-syntas-hämmad hastighet, maximal frikopplad hastighet, och rotenon-eller antimycin-A-hämmad hastighet. (B) Kvantitativa histogram av OCR resultat för baslinjen, protonläcka, maximal luftvägskapacitet, ATP omsättning ochreservkapacitet. *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001 jämfört med kontrollen. Varje datapunkt var medelvärdet ± SEM från tre separata experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Alla instrument som används i protokoll. (A) Transmissionselektronmikroskopi. (B) Konfokalmikroskop med laserscanning. (C) Luminometer. (D) Multimode läsare. (E) Flödescytometri. (F) Extracellulär fluxanalysator. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avgörande för att detektionsprotokollet ska lyckas är användningen av en mängd experimentella metoder som har täckts studien från fenotyp till mekanism. I denna studie, HepG2 celler odlades i DMEM med penicillin och streptomycin och 10% fetala nötkreatur serum. När celler nådde 40-50% sammanflödet, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) tillsattes och inkuberas i 24 h. Vi använde först TEM som visade de ultrastrukturella förändringar i hepatocyte orsakas av den representativa OCPs, β-HCH, som visar nedskrivningar av mitokondrierna struktur (Figur 1). Vidare utfördes fluorescerande infärgningsanalys (figur 2), luciferas-luciferin ATP-analys (Figur 3), JC-1-analys (Figur 4) och cellmito stresstest assay (Figur 5), som vanligen bedömer mitokondrier dysfunktion. Dessa resultat tjänar som underlag för utredning av de underliggande molekylära mekanismerna.
I ovanstående metoder, utredare bör vara uppmärksamma på försiktighetsåtgärder i vissa steg. Till exempel, vid framställning av elektronmikroskopicell, bör antalet celler uppmärksammas, för att undvika dålig fixering orsakad av för stor vävnad eller cellblock. 5% glutaraldehyd fungerar som en fixativ, är det bättre att inte lagra mer än halvår för att undvika fel på upptäckt. Fasta prover placeras vid 4 °C i 24 h eller upp till 1 månad före nästa steg. Mitokondriellt grönt fluorescerande färgämne är lätt att släcka, och ljus bör undvikas för att bromsa fluorescenssläckning. I cellulära ATP nivåer analys, när du använder en multifunktionell luminometer som kan upptäcka chemiluminescence, ogenomskinlig svarta tavlan eller whiteboard 96-brunns plattor bör användas för att undvika ömsesidig inblandning mellan intilliggande hål. ATP, specifikt klyvning av ATP i provet är inte stabilt vid rumstemperatur, och theexperiment behöver drivas vid 4 °C eller på is. ATP kan vara stabilt på is i upp till 6 h. Vid beredningen av JC-1-detektionslösning kan JC-1 färgningsfärgningsbuffert (5X) tillsättas efter att JC-1 (200X) är ordentligt upplöst och blandat med det ultrarena vattnet, så att JC-1-detektionslösningen blir lätt att lösa upp helt. JC-1-sonden ska laddas och tvättas inom 30 minuter och sparas vid 4 °C eller is för att slutföra uppföljningstestet. I OCR-mätningar ska det genomsnittliga basala OCR-värdet för cellen detekteras före optimeringsanalysen, vid optimering för cellsåddkoncentration.
Det finns vissa begränsningar av dessa metoder. OCR-mätning av en extracellulär fluxanalysator är begränsad till cellexperiment. Detektion av mitokondriell funktion är inte tillräckligt djup eftersom de metaboliska produkterna genom mitokondrier inte mäts, såsom mätning av fettsyror och metaboliter i TCA-cykler i hepatocyter. Vidare skulle uttrycket av gener och proteiner med avseende på leverfettsyrasyntes och nedbrytning kunna detekteras genom realtidsmodekedjereaktion och western blot, som ytterligare kan bekräfta de molekylära störningarna hos fettsyrornas ämnesomsättning och mitokondriedysfunktion13. Digitala bilder av mitokondrierna kan fångas i levande celler under konfokalmikroskopi och analyseras för förändringar av mitokondriell morfologi baserat på formfaktor (FF) och proportioner (AR) värden. Mitokondriernas metaboliska funktion bedömdes också genom att mäta extracellulär försurningsgrad (ECAR) med hjälp av en bioenergetiska analysator14. Vissa mitokondriella markörantikroppar (cytokrom c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA och STAT3) kan mätas med Western blot4,15,16,17. Verksamhet enzymer respektera mitokondriell funktion och trikarboxylsyra (TCA) cykel, såsom malisk dehydrogenas, succinat dehydrogenas, citrat synthetase, ATPase, isocitrat dehydrogenas och α-ketoglutarate dehydrogenas är evidenced18. Funktion av elektron transportkedjan i celler och i isolerade levern mitokondrierna detekteras med hjälp av högupplöst respirometry19.
Våra protokoll fokuserar på detektion av mitokondriell morfologi, struktur, plats, kvantitet, kapacitet, membranpotential och andningskedjas funktion. Dessa är i grunden kunna utvärdera mitokondriell funktion från olika aspekter. Vad mer, dessa metoder är enkla och lätta att använda. Mitokondriell funktion studier har genomförts i stor utsträckning i olika områden, såsom lever20, gut mikrobiota21, pluripotenta stamceller22, och i vissa vanliga sjukdomar, såsom typ 2 diabetes23, Parkinsons sjukdom24 och inflammatorisk tarmsjukdom25. det kan finnas fler sjukdomar som är associerade med mitokondrierna, och våra protokoll kan vara till hjälp vid undersökningen av relevanta mekanismer. Dessutom behövs ytterligare empiriskt arbete även på den omfattande och djupgående skalan av dessa effekter med mer experimentella metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); den utestående ungdomsfonden i provinsen Jiangsu (SBK2014010296); det kinesiska utbildningsministeriets forskningsprojekt (213015A); Jiangsu-högskolornas (PAPD) prioriterade akademiska programutveckling, flaggskeppet större utveckling av Jiangsu-högskolor, och det öppna projektprogrammet för statens nyckellaboratorium för miljökemi och ekotoxikologi (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
