Summary
Çevresel organoklorin pestisitlerinin (OKP) hepatositlerde mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisinin anlaşılması metabolik bozukluklara neden olan OKP'lerin mekanizmasının araştırılmasında önemlidir. Bu yazıda hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması nda ayrıntılı yöntemler yer alıyor.
Abstract
Bu yazı, hepatositlerde çevresel organoklorin pestisitlerinin (OCP) neden olduğu metabolik bozuklukların nedenini daha iyi anlamak için hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması için ayrıntılı yöntemler sunmaktadır. HepG2 hücreleri β-heksaklorosiklohekza (β-HCH) 24 saat boyunca genel popülasyonda eşdeğer bir iç maruziyet dozuyla maruz kaldı. Hepatositlerde ultrayapı iletim elektron mikroskobu (TEM) tarafından incelendi ve mitokondrinin hasarını gösterdi. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5'-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mitokondriyal yeşil floresan sonda ile lekelendikten sonra mitokondri floresan yoğunluğu floresan mikroskopi ile gözlendi. ATP düzeylerini belirlemek için luciferin-luciferase reaksiyonu kullanıldı. MMP katyonik boya JC-1 tarafından tespit edildi ve akış sitometrisi altında analiz edildi. OCR hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü. Özetle, bu protokoller hepatositlerde mitokondriyal fonksiyonun saptanmasında ve mitokondri hasarlarının araştırılmasında kullanılmıştır.
Introduction
Organoklorin pestisitlerinin (OKS) sağlık üzerindeki etkileri, örneğin üreme paraziti, immünolojik toksisite, metabolik değişiklikler daha önce incelenmiştir1,2,3. Hücresel metabolizmayı saptamak ve mitokondriyal disfonksiyon bulmak için yöntemler bilim adamları mitokondriyal fonksiyonun rolünü anlamak için etkin(yani., mitokondriyal STAT3 düzeyleri, laktat, pirüvat, laktat-pirüvat oranı, koenzim Q10, mitokondriyal proton sızıntısı, biyoenerjit, biyogenez ve dinamikler) yaşlanma gibi alanlarda, obezite, diyabet, kardiyovasküler fonksiyon, kanser, ve güvenlik toksisitesi4,5,6,7. Bu yazıda OKP'lerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyonudeğerlendirme yöntemleri ni açıklanmıştır.
HepG2 hücrelerini, insan iç maruziyetine eşdeğer bir dozda 24 saat boyunca, bir temsilci OKP olan β-heksaklorosikloheksan (β-HCH) maruz bıraktık. Öncelikle, TEM nükleus, mitokondri ve endoplazmik retikulum 8 gibi hepatositlerin8ultrayapısını gözlemlemek için uygulanmıştır. Tem, sıradan mikroskoplarla karşılaştırıldığında, hücre ve hücre bileşenlerinin (hücre hatları veya doku), morfolojisi, kimyasal bileşimi ve modern bilim ve teknolojide önemli bir rol oynayan doğal veya yapay malzemelerin işlevinin 2D ve 3Boyutlu ultra yapısını keşfetmeyi mümkün kılmıştır. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon daha fazla mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5'-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mito-tracker yeşil canlı hücre mitokondri-spesifik floresan boyama için kullanılabilecek bir mitokondri yeşil floresan sonda. Hepatositlerde mitokondri mito-izci yeşil çözeltisi ile boyandı ve mitokondriyal floresan yoğunluğu, sayısı ve paterni konfokal mikroskopi ile gözlendi9. Mitokondriyal yeşil floresan sonda canlı hücreleri lekelemek için kullanılabilir. Rhodamine 123 veya JC-1 ile karşılaştırıldığında, mitokondriyal yeşil floresan prob mitokondriyal boyama için mitokondriyal membran potansiyeline bağlı değildir. ATP düzeyleri luciferase-luciferin kiti ile belirlendi ve protein konsantrasyonu ile normalleştirildi. ATP tsay kiti ortak çözümler, hücreler veya dokularda ATP düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir. Bu kit floresan oluşturmak için floresan tarafından katalize firefly luciferase dayanmaktadır, ATP enerji sağlamak için gerekli olduğunda. Ateş böceği luciferase ve floresan aşırı olduğunda, belirli bir konsantrasyon aralığında, floresan üretimi ATP konsantrasyonu ile orantılıdır. Buna ek olarak, bu kit özel ATP kemilüminesans optimize etmek için tasarlanmıştır. ATP, en önemli enerji molekülleri olarak, hücrelerin çeşitli fizyolojik veya patolojik süreçlerinde önemli bir rol oynar. ATP düzeylerindeki değişiklikler hücre fonksiyonundaki kusurları, özellikle mitokondriyal enerji üretimini yansıtabilir. Genellikle apoptoz altında, nekroz veya bazı toksik durumda, hücresel ATP düzeyleri azaltılmış 10. JC-1'li MP'ler teşp kiti, hücreleri, dokuları veya saflaştırılmış MDP'leri hızlı ve hassas bir şekilde tespit etmek için JC-1'i floresan sonda olarak kullanan bir kittir. Apoptozun erken teşhisi için kullanılabilir. Katyonik boya JC-1, yeşil ve kırmızı floresan oranı değişiklikleri ile gösterilen akış sitometrisi altında analiz edilebilen MMP'yi tespit etmek için kullanılan bir floresan sondadır. MMP yüksek olduğunda, JC-1 kırmızı floresan üreten bir polimer (J-agregalar) oluşturmak için mitokondri matris toplanır. MMP düşük olduğunda, JC-1 birikemez ve yeşil floresan11üreten monomer oluşturur. Yani kırmızı ve yeşil floresan oranı MMP düzeyini yansıtabilir. Hücrelerin OCR normal hücresel fonksiyonun önemli bir göstergesidir12. Mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için bir parametre olarak kabul edilir. Hücre mito stres test kiti mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerini analiz etmek için kararlı bir yöntem sağlar. Kit, hücre mitokondriyal stres testi yapmak için standart bir yöntemin yanı sıra kalite kontrol ve prediktif reaktifler sağlar. Birincil hücreler, hücre hatları, askıda hücreler ve adacıklar, nematodlar, mayalar ve izole mitokondriler de dahil olmak üzere tüm hücre türlerini tespit etmek için kullanılabilir.
OCR ölçümü, hücrelerin fizyolojik durumu veya değişiklikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Solunum taban çizgisi, proton sızıntısı, maksimal solunum, ATP cirosu ve rezerv kapasitesini saptamak için hücre dışı akı analizörü ile belirlendi. Kısacası, OCR'nin bazal ölçümlerinden sonra, ocr ardışık olarak oligomisin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriyal oksidatif fosforilasyon uncoupler) ve antimisin A/rotenone (oksijen tüketiminin inhibitörü) ekolarak eklendikten sonra saptandı.
Hepatositlerde in vitro olarak mitokondriyal fonksiyonun saptanması için daha spesifik protokolün geliştirilmesini kolaylaştırmak amacıyla, burada TEM, konfokal mikroskopi, luminometre, akış sitometrisi ve hücre dışı akı analizörü ile mitokondri hasarına bağlı yan etkilerin incelenmesinde ileride uygulama ile deneyler sokuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ve deney protokolleri ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi ve Nanjing Tıp Üniversitesi Yerel Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. TEM tarafından Mitokondriyal ultrayapı
- HepG2 hücrelerinin toplanması
- 100 mm'lik tabaklarda Tohum HepG2 hücreleri. 37 °C ve %5 CO2'desaklayın.
- 1,5 mLEP tüpte %0,25 EDTA içeren hücreleri sindirin.
- Oda sıcaklığında (RT) 3 dk için 1000 x g santrifüj. Supernatant atın.
- 4-6 x 105 HepG2 hücreleri toplayın.
- 1 mL%5 glutaraldehit (Solvent: çift distile su) pipetlerle ve 4°C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- 1 mL fosfat tamponunun 4 mL'lik değişikliklerini ekleyin ve yıkayın (Na2HPO4, KH2PO4, NaCl ve KCl, pH 7.4), her biri 15 dk. Pipetlerle fosfat tamponu em.
- 200 μm% 1 osmiyum (Solvent: çift distile su) ekleyin ve 4 °C'de 2 saat siyah numune için kuluçka.
Dikkat: Osmiyum son derece zehirli ve uçucu bir maddedir. İlaç dolabında dikkatle çalıştırılmalıdır. - 1 mL fosfat tamponu 2 değişiklik ekleyin ve yıkayın, her biri 5 dakika. Fosfat tamponu em.
- 2 saat boyunca 1,5 mL EP tüpte %2 uranyl asetat çözeltisinde (Çözücü: çift distile su ve asetik asit) leke.
- Dehydrate ve% 50 aseton,% 70 aseton, 90% aseton (Solvent: çift distile su), mutlak aseton 2 değişiklik, 15 dakika her yoluyla batırın.
- RT'de 1,5 saat için 2 damla aseton (%100)/gömme maddesi (1:1) nüfuz edin. Epon812 gömme ajan, tarifi aşağıdaki gibidir: A: Epon812, 62 mL ve DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL ve MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, kışın), A:B=1:9 (v:v, yazın). Katıştırma kalıplarına gömme (Damalı ızgaralı yumuşak plastik plaka).
- 37 °C'de 12 saat, 45 °C'de 12 saat, 60 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
- Ultraince kesitler (en büyük alan 0,5 mm × 0,3 mm'yi geçemez) ultraince kesitler makinesi ve TEM (2 μm ve 500 nm) ile hazırlayın ve gözlemleyin.
2. Mitokondriyal floresan yoğunluk tespiti
- Tohum 2x 104 HepG2 hücreleri 6-iyi plakalar içinde. Β-HCH'yi 24 saat ekleyebilirsiniz.
- 1 mM mitokondriyal yeşil floresan prob son konsantrasyonu formüle etmek için susuz DMSO ekleyin.
- 6 kuyulu plakaların her kuyusuna 1 mL mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisi (son konsantrasyon: 200 nM) ekleyin, 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisini çıkarın ve görüntülemeden önce 37 °C'de taze hazırlanmış hücre kültürü ortamını (DMEM) ekleyin.
- Bir floresan mikroskobu (10x) ile mitokondriyal yeşil floresan gözlemleyin. Algılamada maksimum uyarma dalga boyu 490 nm, maksimum emisyon dalga boyu 516 nm'dir.
3. Hücresel ATP düzeylerinin tsay
- Tohum HepG2 hücreleri 6-iyi plakalar. Β-HCH'yi 24 saat ekleyebilirsiniz.
- Luciferase-luciferin ATP isp kitinden 6 kuyunun her kuyuya 200 μL lysis tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dk için 12.000 x g centrifuge, yeni tüpler içine pipetler ile supernatant toplamak.
- ATP algılama arabelleği olarak ATP seyreltme oranı ile ATP algılama reaktifini 1: 5 oranında seyreltin.
- Standart eğri tayinini hazırlayın: 0,5 mM ATP standart çözeltisini ATP lisis tamponları ile 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM'ye seyreltin.
- RT'de 5 dakika boyunca 96 kuyulu bir plakaya 100 μL ATP algılama tamponu ekleyin ve bir luminometre (kemilüminesans dedektörü) tarafından tespit edilen 100 μL'lik hücre süpernatantını ekleyin. Standart eğri olmasına rağmen ATP konsantrasyonu (nmol/L) hesaplayın.
- Çok modlu okuyucu ile bca protein ispon kiti ile protein konsantrasyonunu sapta.
- Standart eğri tayininin hazırlanması: Protein standardı çözeltinin 5 mg/mL'sini 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ve 0,5 mg/mL'lik protein standart çözeltisini çift distile su ile seyreltin.
- 96 kuyulu bir tabağa 1 μL'lik süpernatant hücre ekleyin ve 19 μL çift distile su ekleyin.
- Her kuyu için 200 μL BCA algılama çözümleri ekleyin. 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın. 562 nm ile çok modlu bir okuyucu tarafından OD (optik yoğunluk) değerini algıla. Standart eğriolsa da protein konsantrasyonu (mg/mL) hesaplayın.
- Mg protein konsantrasyonu başına ATP içeriğini düzeltin (ünite: ATP konsantrasyonu/protein konsantrasyonu, nmol/mg).
4. JC-1 tarafından mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) değerlendirmesi
- 6 kuyu plakaları tohumlu HepG2 hücreleri toplamak. 1,5 mL EP tüpte %0,25 EDTA ile hücreleri sindirin, 1000 x g'de 3 dk santrifüj, süpernatantı atın ve hücreleri toplayın.
- Girdap ve karıştırmak için 8 mL distile su 50 μL JC-1 (200X) ekleyin. JC-1 algılama çözeltisi olarak 2 mL JC-1 (5X) boyama tamponu ekleyin.
- 37 °C'de 20 dk için 0,5 mL hücre kültürü orta ve 0,5 mL JC-1 algılama çözeltisi karışımı ile inkübat hücreleri.
- Santrifüj 600 x g için 3 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
- 1 mL JC-1 (1X) boyama tamponu, santrifüj 600 x g'de 4 °C'de 3 dk'da 2 mL'lik 2 değişiklikle durulayın. Ve supernatant atın.
- JC-1 (1X) boyama tampon0,5 mL hücreleri askıya, yeşil ve kırmızı floresan tespit etmek için akış sitometri ile analiz. JC-1 polimeri algılandığında, uyarma ışığını 490 nm'ye, emisyon ışığını ise 530 nm'ye ayarlayın. JC-1 polimeri algılandığında, uyarma ışığını 525 nm'ye, emisyon ışığını ise 590 nm'ye ayarlayın.
5. Oksijen tüketim oranları (OCR) ölçümleri
- Tohum HepG2 hücreleri hücre kültürü mikroplakaları 96-iyi bir yoğunlukta 4500 hücre/100 μL başına. 24 saat sonra her kuyu ile kaplı hücreleri emin olun.
- Önceki literatüre göre, hazırlanan reaktiflerin uygun hacimli uygun enjeksiyon portu içine ekleyin13. Port A: 25 μL 1 μM oligomisin (ATP Coupler); Port B: 25 μL 0.75 μM FCCP (Elektronik Gaz Kontrolü, ETC Hızlandırıcı); Port C: 25 μL 0.5 μM antimisin A/rotenone (mitokondriyal inhibitör A ve mitokondriyal inhibitör B).
- Kartuşu kullanıma hazır olana kadar CO2 olmadan 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde saklayın.
- Çalışan ortamı her kuyudan çıkarıp yeni DMEM'e ekleyerek hücre plakasını orta bir şekilde değiştirin. Her kuyu için son hacim 180 μL'dir.
- Hücre plakasını 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde, tramadan önce 1 saat boyunca CO2 olmadan saklayın.
- OCR'yi yazılımla otomatik olarak kaydedin.
- OCR yazılımını açın.
- Uygulamalar açılır menüsünden Hücre Mito Stres Test Kiti'ni seçin.
- Uygulamayı Başlat düğmesini tıklatın.
- Stres Testini Çalıştır düğmesini tıklatın. Hücre Vurgutesti Kurulum ekranı görüntülenir.
- Aşağıdaki adımları yapın:
- Hücre tohumlama # kutusuna iyi başına tohumlanmış hücre sayısını girin.
- Ortalama bazal OCR kutusuna ortalama OCR girin.
- Her reaktif için son çalışma konsantrasyonu girin ve reaktifler enjekte.
NOT: Hücre tohumlama konsantrasyonu için optimizasyon yaparken optimizasyon tahtını çalıştırmadan önce hücre için ortalama bazal OCR değeri tespit edilmelidir. - İleri düğmesini tıklatın. Grup bilgi ekranı görüntülenir.
- Bir renk seçerek ve bir ad vererek ve uygun kuyuları tıklatarak atanmamış kuyulara bir grup atayın.
NOT: Hücre Mito Stres Testi'nin çalıştırılması öncesinde farklı gruplar farklı tedaviler olarak tanımlanır. Stres testi yapıldığında mikroplakaların tüm kuyuları aynı reaktif enjeksiyonları alırsınız. - İleri düğmesini tıklatın. Stres Testi Enjeksiyon Düzeni ekranı görüntülenir.
- Başlat'ı tıklatın. Stres Testi artık Analyzer'da çalıştırılır. Çalıştırma bittiğinde, yazılımdaki noktayı takip edin, kartuş ve hücre plakasını çıkarın ve atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinin mitokondri cristae'si belirgin şekilde hasar görmüştür. Dağınık mitokondri ler belirgin bir şekilde genişletildi, düzensiz şekilli ydi ve mitokondriyal sırt nispeten anormal mitokondriyal mimari ile kayboldu(Şekil 1).
Mitokondriyi temsil eden ortalama mitokondriyal yeşil floresan yoğunluğu β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinde(Şekil 2),atp düzeylerinde de azalmıştır (Şekil 3). Floresan yoğunluğu ve ATP seviyesi artan maruzkalma konsantrasyonları ile giderek azaldı. Potansiyel olarak, mitokondri sayısındaki azalma veya hasarlı mitokondri, gözlenen mitokondriyal floresan yoğunluğuna ve dolayısıyla ATP üretiminin azalmasına neden oldu.
Akış sitometrisi sonuçları β-HCH grubunda kırmızı/yeşil JC-1 floresan oranlarının kontroldekinden anlamlı olarak düşük olduğunu göstermiştir(Şekil 4). Hepatit HCH maruziyetinden sonra HepG2 hücrelerinin OCR'si doza bağlı olarak azaltıldı. Β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bazal solunum oranları, proton sızıntısı, maksimal solunum kapasitesi ve ATP cirosu önemli ölçüde azalmıştır(Şekil 5). Bu sonuçlar β-HCH maruziyetinden sonra mitokondriyal fonksiyonun bozulduğunu göstermiştir.
Bu deneylerde kullanılan tüm aletler Ek Şekil 1'degösterilebistir.
Şekil 1: Β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinin temsili TEM mikrografları (A: 6000×, B: 25000×). Tipik hasarlar hafif genişlemiş mitokondri (M), elektron lucent matrisler, hasarlı cristae ve gevşek organel boşlukları gösterdi. M: mitokondri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Β-HCH13ile tedavi edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal floresan saptanması. Mitokondri miktarı, konumu ve floresan yoğunluğu (A) floresan mikroskobik görüntülerde gösterildi ve mitokondriyal floresan yoğunluğunun nicel düzeyleri hücre başına mitokondriyal yeşil floresan (B)dayanıyordu. *: P < 0.05, ***: P < 0.001 kontrol ile karşılaştırıldığında. Her veri noktası üç ayrı deneyden ortalama ± SEM idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HepG2 hücrelerindeki ATP düzeyleri13. ***: P < 0.001 kontrole göre, ##: P < 0.01 ile karşılaştırıldığında 10 ng/mL β-HCH.Data üç ayrı deneyin ortalama SEM'si olarak sunuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: JC-1 boyama ve akış sitometrisi tarafından MMP üzerindeki etkileri13. (A) Akış sitometri parselleri. Y ekseni kırmızının yeşil floresan oranına oranını gösterdi. PE: Kırmızı floresan, FITC: Yeşil floresan. (B).**: P < 0.01 kontrol ile karşılaştırıldığında. Her veri noktası üç ayrı deneyden ortalama ± SEM idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücresel oksijen tüketim hızının (OCR) saptanması. (A) Β-HCH'nin hücresel OCR üzerindeki etkisi hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü. Dört dönem hücresel bazal solunum oranını, ATP-synthase-inhibe oranını, maksimal uncoupled oranını ve rotenone veya antimisin-A-inhibe oranını temsil emzdir. (B) Bazal, proton kaçağı, maksimal solunum kapasitesi, ATP cirosu ve rezerv kapasitesi için OCR sonuçlarının kantitatif histogramları. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 kontrol ile karşılaştırıldığında. Her veri noktası üç ayrı deneyden ortalama ± SEM idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Protokollerde kullanılan tüm aletler. (A) İletim elektron mikroskobu. (B) Lazer tarama konfokal mikroskop. (C) Luminometre. (D) Çok modlu okuyucu. (E) Akış sitometrisi. (F) Hücre dışı akı analizörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algılama protokolünün başarısı için kritik olan, fenotipten mekanizmaya kadar çalışma kapsamında yer alan çeşitli deneysel yöntemlerin kullanılmasıdır. Bu çalışmada DMEM'de HepG2 hücreleri penisilin ve streptomisin ve %10 fetal sığır serumu ile kültürlendi. Hücreler %40-50 birleştiğinde β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) eklenmiş ve 24 saat kuluçkaya yatırıldı. İlk olarak, temsilci OKP'lerin neden olduğu hepatositteki ultrastrüktürel değişiklikleri gösteren TEM'i kullandık, β-HCH, mitokondri yapısının bozulmasını gösterdi (Şekil 1). Ayrıca, yaygın olarak mitokondri disfonksiyonlarını değerlendiren floresan boyama testi (Şekil 2), luciferase-luciferin ATP testi (Şekil 3), JC-1 testi (Şekil 4) ve hücre mito stres testi testi (Şekil5)yapıldı. Bu sonuçlar, altta yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasıiçin temel teşkil etmektedir.
Yukarıdaki yöntemlerde, müfettişler bazı adımlarda önlemlere dikkat etmelidir. Örneğin, elektron mikroskobu hücresinin hazırlanmasında, çok büyük doku veya hücre bloğunun neden olduğu kötü fiksasyonu önlemek için hücre sayısına dikkat edilmelidir. % 5 glutaraldehit bir fiksatif olarak davranır, bu algılama başarısızlığını önlemek için yarım yıldan fazla saklamak için daha iyidir. Sabit numuneler bir sonraki adımdan önce 24 saat veya 1 ay kadar 4 °C'ye yerleştirilir. Mitokondriyal yeşil floresan boya söndürmek kolaydır, ve ışık floresan söndürme yavaşlatmak için kaçınılmalıdır. Hücresel ATP düzeyleri teşbiğinde, kemilüminesansalgısını algılayabilen çok fonksiyonlu bir luminometre kullanılırken, opak tahta veya beyaz tahta 96-iyi plakalar bitişik delikler arasında karşılıklı paraziti önlemek için kullanılmalıdır. ATP, numunedeki ATP'nin özellikle dekoltesi oda sıcaklığında sabit değildir ve deney 4 °C'de veya buz üzerinde çalıştırılmalıdır. ATP buz üzerinde 6 saate kadar stabil olabilir. JC-1 algılama çözeltisinin hazırlanmasında JC-1 boyama tamponu (5X) JC-1 (200X) iyice çözülüp ultra saf su ile karıştırıldıktan sonra eklenebilir, böylece JC-1 algılama çözeltisi tamamen çözülmesi kolay olur. JC-1 probu 30 dakika içinde yüklenmeli ve yıkanmalı ve takip testini tamamlamak için 4 °C veya buz da kaydedilmelidir. OCR ölçümlerinde, hücre tohumlama konsantrasyonu için optimizasyon yaparken, en optimizasyon tahkikatından önce hücre için ortalama bazal OCR değeri tespit edilmelidir.
Bu yöntemlerin bazı sınırlamaları vardır. Hücre dışı akı analizörü ile OCR ölçümü hücre deneyleri ile sınırlıdır. Mitokondriyal fonksiyonun saptanması, hepatositlerde TCA döngülerinde yağ asitleri ve metabolitlerinin ölçülmesi gibi metabolik ürünler ölçülmediğinden yeterince derin değildir. Ayrıca, hepatik yağ asidi sentezi ve bozulması ile ilgili gen ve proteinlerin ekspresyonu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ve batı leke ile tespit edilebilir, hangi daha fazla yağ asitleri metabolizması ve mitokondriyal disfonksiyon moleküler bozuklukları teyit edebilir13. Mitokondrinin dijital görüntüleri konfokal mikroskopi altındaki canlı hücrelerde yakalanabilir ve form faktörü (FF) ve en boy oranı (AR) değerlerine dayalı mitokondriyal morfolojideğişiklikleri için analiz edilebilir. Mitokondrinin metabolik fonksiyonu da ekstrasellüler asitleşme hızı (ECAR) biyoenerjik analizör kullanılarak ölçülerek değerlendirildi14. Bazı mitokondriyal marker antikorlar (sitokrom c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA ve STAT3) batı leke4,15,,16,17ile ölçülebilir. Mitokondriyal fonksiyon ve trikarboksilik asit (TCA) döngüsüne saygı gösteren enzimlerin malikdehidrogenaz, süksinat dehidrogenaz, sitrat synthetase, ATPase, isokitrat dehidrogenaz ve α-ketoglutarate dehidrogenaz gibi aktiviteleri kanıtlanmaktadır18. Hücrelerde ve izole karaciğer mitokondrisinde elektron taşıma zincirinin fonksiyonu yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak tespit edilir19.
Protokollerimiz mitokondriyal morfoloji, yapı, konum, miktar, kapasite, membran potansiyeli ve solunum zinciri fonksiyonunun saptanması üzerine odaklanır. Bunlar temelde farklı yönlerden mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek edebiliyoruz. Dahası, bu yöntemler basit ve kullanımı kolaydır. Mitokondriyal fonksiyon çalışmaları yaygın karaciğer20gibi farklı alanlarda yapılmıştır, bağırsak mikrobiyota21, pluripotent kök hücreler22, ve bazı yaygın hastalıklarda, tip 2 diyabet23gibi , Parkinson hastalığı24 ve inflamatuar barsak hastalığı25. Mitokondri ile ilişkili daha fazla hastalık olabilir ve protokollerimiz ilgili mekanizmaların araştırılmasında yararlı olabilir. Buna ek olarak, daha deneysel yöntemlerle bu etkilerin kapsamlı ve derinlemesine ölçeği üzerinde daha fazla ampirik çalışma da gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81573174, 81570574) tarafından desteklenmiştir; Jiangsu Eyaleti Üstün Gençlik Fonu (SBK2014010296); Çin Eğitim Bakanlığı Araştırma Projesi (213015A); Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (PAPD) Öncelikli Akademik Program Gelişimi, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Önemli Gelişimi; ve Devlet Kilit Çevre Kimyası ve Ekotoksikoloji Laboratuvarı Açık Proje Programı (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
