Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/56801
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים את הדמיה אופטית של עכברים נגועים עם שחפת Mycobacterium (מ. שחפת) באמצעות כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט). פרוטוקול זה מאפשר את זיהוי רגיש וספציפי של מ. שחפת במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים למחקר פתוגנזה, therapeutics וחיסון.

Abstract

כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) מנצל סובסטרטים ספציפיות עבור אנזימים המצויים אורגניזמים היעד עניין לדימות או זיהוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית או ביולומינסנציה. אנו מנצלים BlaC, אנזים צורונים לידי כל זני מ. שחפת . REF מאפשר כימות מהירה של חיידקים בריאות של עכברים נגועים. לאותה הקבוצה של עכברים יכולים לדימות בנקודות זמן רבים, הפחתת עלויות, ספירת חיידקים מהר יותר, ומאפשר תצפיות הרומן באינטראקציות פתוגן-פונדקאי ו הגברת עוצמה סטטיסטית, מאז יותר חיות לכל קבוצה נשמרים בקלות מאוד . שופט הוא רגיש בשל אופיו קטליטי של הכתב אנזימטי BlaC מאוד מסוים עקב העברת האנרגיה של תהודה flourescence מותאם אישית (סריג) או fluorogenic סובסטרטים בשימוש. שופט אינו דורש זנים רקומביננטי, הבטחת אינטראקציות פתוגן-פונדקאי נורמלי. אנו מתארים ההדמיה של מ. שחפת זיהום באמצעות מצע סריג עם פליטות מקסימלי 800 ננומטר. אורך הגל של המצע מאפשר הדמיה רקמות עמוק רגיש אצל יונקים. אנחנו מתאר תרסיס זיהום של עכברים עם מ. שחפת, הרדמה של עכברים, הניהול של המצע REF, וכן הדמיה אופטית. שיטה זו הוחלה בהצלחה על הערכת פתוגן-פונדקאי אינטראקציות והיעילות של אנטיביוטיקה מיקוד מ. שחפת.

Introduction

שיעור הצמיחה האיטית של מ. שחפת נמצא מחסום מרכזי אבחון מהיר של שחפת-1,-2,-3. בעוד תרבות לפי האבחנה לוקח שבועות כדי להפיק תוצאות, השמצות acid-fast יש מגבלות האבחון4 ילדים5 ו חולים שנדבקו במשותף עם וירוס הכשל החיסוני האנושי6,7. טכנולוגיות הדמיה אופטית הוכרו לאחרונה כחלופה מסורתיים שיטות אבחון עבור שחפת8,9. קרינה פלואורסצנטית ו ביולומינסנציה יכול לשמש כדי שטיחות תמונה מ. שחפת בבעלי חיים בזמן אמת10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. דימות אופטי יש את היתרון של הערכה מהירה, מדויקת של זיהום עם מ. שחפת20,21,22.

אנחנו חלוקה לרמות פרטים עבור הדמיה אופטית של מ. שחפת בעכברים בשידור חי באמצעות מספר סידורי. שיטה זו היא רגישה וספציפית ביותר23,24 , בדומה לשיטות אחרות אופטי, הוא פחות יקר מאשר שיטות אחרות של שחפת (TB) הדמיה25, לרבות טומוגרפיה (CT)26, מגנטי תהודה הדמיה (MRI)27, סי-טי טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET/CT F-FDG) F-fluorodeoxyglucose28. REF מנצל סובסטרטים או זוהרים פלורסנט מותאם אישית אשר בעת ביקוע על ידי אנזים בקטריאלי, לייצר את המוצר פלורסנט8,29. לפיכך, יש את היתרון של שאינם דורשים30,זן רקומביננטי כתב mycobacterial31. המצע סריג תיאר מורכבת fluorochrome כ'חטיף המחוברים באמצעות טבעת β-לקטם hydrolyzed מאת BlaC (β לקטמאז), באופן טבעי צורונים לידי מורכבת שחפת Mycobacterium8, 32. החיידק לייצר ישירות אות עקב פעילות קטליטית REF המאפשר הגברה על ידי רבים סדרי גודל, זיהוי רגיש של מ. שחפת.

המצע REF השתמשו במחקר זה יש חדירה מעולה רקמה בבעלי חיים, מופחתת רקע בשל אורך גל ארוך שלה. עם סובסטרט זה ארוך באורך הגל זה אפשרי להשיג את הסף של זיהוי עבור מ. שחפת של כמעט 100 מושבת יחידות (CFU) במבחנה , < 1000 CFU בריאות של עכברים ויוו (כל בעלי חיים)8, 33. שופט יכול לשמש ככלי אבחון עבור ברוק, חומרים קליני, אפילו ישירות בחולים עם מיקרו מערכות אנדוסקופי16,32,33,34 בשל רגישות גבוהה וספציפיות שלה. REF ניתן ליישם כל זן קליני של שחפת, כי היא משתמשת אנזים בקטריאלי המיוצר באופן טבעי, BlaC, לצורך זיהוי נוכח כל זני. מאפיינים אלו REF הדמיה כלי רב ערך במחקרים קליניים שחפת באופן כללי כדי להקל על טיפולית, חיסון הערכה, כמו גם ניתוח של פתוגנזה, אך ניתן להחיל גם בסופו של דבר את האבחנה של שחפת מטופלים.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה של טקסס A & ז אוניברסיטת. סקירה ואישור הממונה על הבטיחות הביולוגי או ועדה במוסד שלך עשוי להידרש.

שים לב: כל ההליכים דורשים BSL3 הבלימה. אנשי נדרשים ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת. כל המניפולציות מבוצעים בפנים אבטחה הקבינט (BSC) ואת כל שרפ יושלכו בצורה במיכלים שרפ. משטחי עבודה, BSC מנוקים עם אתנול פנול ו- 70% במאגר לפני ביצוע העבודה, אחרי העבודה. הליכים בדרך כלל ייעשה ברמה אבטחה 3 עם שחפת Mycobacterium, אך עבור איור ומטרות הצילומים, המחברים מדגימים הליכים אלה ברמת אבטחה 2 עם חיידקים פחות ארסית.

1. זנים, תרבות תנאים

הערה: מ. שחפת זן CDC1551 נעשה שימוש במחקר זה, אך כל זן מ. שחפת יכול לשמש באופן זהה.

  1. לגדל את החיידקים ב- M-OADC-TW (7 שעות 9 מרק בתוספת גליצרול 0.5%, 10% חומצה אולאית דקסטרוז מורכבים ללא קטלאז, 0.05% Tween-80) בינוני שעומדים 37 ° C עד יתר600 של 0.5 (~ 0.2 x 107 CFU).
  2. לדלל את התרבות ב- M-OADC-TW (סדרה של 1:10 דילולים של החיידק). לוחית רישוי של דילולים של החיידקים (105, 106, 107, 108) דולר על גבי צלחות 11 סלקטיבי של 7 שעות כדי לאפשר קביעת CFU.
  3. דגירה הצלחות במשך ארבעה שבועות ב 37 מעלות צלזיוס, או עד מושבות ניתן לספור במדויק.
  4. Centrifuge את inoculum חיידקי ב g x 8,534 במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 10 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) ו מחדש להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl).

2. תרסיס זיהום של עכברים באמצעות תא מדיסון

  1. לאפשר עכברים כדי להתאקלם הסביבה החדשה לשבוע.
  2. שוקלים העכברים לפני טעינת אותם אל החדר.
  3. לחבר מיתרי שלוש לתוך רצועת הכוח: הכוח בחלל המרכזי, את משאבת ואקום, מדחס אוויר, לפי הסדר הזה.
  4. בזהירות להתיר את צנצנת הזכוכית. להביא את צנצנת הזכוכית אבטחה ארון ולהוסיף את inoculum אתגר הושעו ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) כדי להשיג ~ 104 - 106 CFU של חיידקים בתוך הריאות.
  5. סגור את מכסה צנצנת הזכוכית ב אבטחה הקבינט. לצרף את הצנצנת יחידת מפוחים ולהתאים את צינור נירוסטה אנכי כך הקצה התחתון (צריכת) הוא כרבע סנטימטר מתחת לגובה של הנוזל בצנצנת.
  6. לטעון את כל החיות לצורך הניסוי (החדר יכול להחזיק עכברים עד 90) אל החדר וסגור את כל הבריחים בדלת.
  7. בדוק הראשי (חדר) מד זרימת אוויר. ודא כי במרכז הבמה (כדור) מפעילה כ 50 ליטר/דקה כפי שנמדד בסולם בצד השמאל.
  8. לחץ על כפתור התחל בלוח הבקרה של התא. הגדר את קצב זרימת האוויר דרך המונה זרימת האוויר מדחס (המונה קטן בפינה השמאלית) 4 L/min בסולם. בדוק חזותית כדי לוודא כי הוא להיות nebulized inoculum האתגר.
  9. לאחר 15 דקות, כאשר מופיע האור האדום בחזית של לוח הבקרה אות נשמע מציין את סוף המרוץ, לחץ לחצן איפוס בפינה הימנית התחתונה של החלונית ' בקרה ' כדי לאפס את הטיימרים.
  10. החזק את לחצן אדום קטן על הדלת של החדר כדי לשחרר את הואקום.
  11. פתח את הדלת קאמרית ולהסיר את החיות. הצב והעכברים בחזרה לתוך הכלובים.
  12. הסר את צנצנת הזכוכית מפוחים ומניחים במיכל אטום, עמיד בפני נזילה תחבורה. הכנס את המיכל בפנים הארון ביולוגית ולמחוק את המתלים אתגר לתוך מיכל פסולת המיועדת.
  13. מניחים את הצנצנת מפוחים בשימוש בתוך שקית חומרים מסוכנים, לסגור את השקית על התחבורה החיטוי.
  14. בסוף ההליך זיהום, לרסס הפנימי של החדר עם אתנול פנול ו- 70% במאגר ומאפשרים לתא לשבת 10 דקות.
  15. לאחר מכן, נגב את כל משטחי הפנים נגיש באופן יסודי ביותר. היפטרו מכל מגבות נייר מזוהמים, וכו '. בפח האשפה חומרים מסוכנים. אוטוקלב האשפה, פסולת מיכל ומשמשת מפוחים צנצנות.
  16. מקם את החיות בחדר ההכלה עד נקודת-הזמן הדמיה.
  17. ביום הדמיה, העברת החיות במיכל משני לחדר ההדמיה.

3. בעלי חיים הרדמה

  1. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין באמצעות מערכת אישית גז הרדמה.
  2. שוקלים כל אחד המיכל מסנן פחם שני הממוקמת על גבי יחידת הרדמה.
  3. החלף מיכל חדש אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי.
  4. בדוק את יחידת מכשיר אידוי כדי להבטיח איזופלוריין מספיק עבור ההליך.
  5. הצב בעל האף חרוט בתוך החדר הדמיה. מספר של הקונוסים האף הנדרש לקבלת ההליך, לסגור את הפתחים שנותרו עם חוסמי האף חרוט.
  6. להפעיל את אספקת החמצן מן הגליל בלחץ גבוה ולהגדיר אותו בבית 55 psi.
  7. תדליק את המשאבה פינוי ממוקם מול יחידת הרדמה ולהגדיר אותו 8 L/min.
  8. הפעל את דו-מצבי של חמצן ממוקם מול יחידת הרדמה.
  9. הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה יפעילו זרימת גז על 1.5 ליטר לדקה להפוך זרימת הגז.
  10. הפעל זרימת הגז לחדר ההדמיה יפעילו זרימת גז על 0.25 L לדקה להפוך זרימת הגז.
  11. הפעל את מכשיר אידוי איזופלוריין ולהגדיר אותו ב- 2-2.5%. התאם את רמת איזופלוריין בהתאם למספר ואת המשקל של חיות המשמשות את הניסוי על-ידי סיבוב החוגה על מכשיר אידוי איזופלוריין (2-2.5% לעכבר השוקל ~ 20 g; 4% עבור שפן במשקל של 300 גרם).
  12. מקום העכברים בבית הבליעה הרדמה, סגור את המכסה. הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה.
  13. יוצאים העכברים בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה למשך 5-10 דקות עד מורדם לחלוטין.
  14. ברגע העכברים הם מרדימים, להחיל משחה אופטי לעיניים כדי להגן עליהם תוך הדמיה.
  15. מקום העכברים recumbency הגחוני או בחזה ובצלעות כך אפם מוצבים בתוך אצטרובל האף כדי להקל על הרדמה של עכברים במהלך ההליך הדמיה.

4. כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) הדמיה

  1. להזריק את המצע (20 מיקרומטר, 2.5 µL/גר' משקל) על ידי הזרקת בקרום הבטן לתוך הנגועים, כמו גם בקרת עכברים. העכברים הם תחת הרדמה בתוך החדר הדמיה עבור פחות מ- 1 דקות.
  2. להפעיל את מערכת הדמיה.
  3. לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על אתחל. המתן עד הבר טמפרטורה הופך לירוק.
    הערה: תא הדמיה מורכבת פלטפורמה מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה בזמן ההדמיה.
  4. הדמיה רכישה הגדרה, בחר פלורסנט | טרנס-תאורה עבור כל החיה או אפינפרין-תאורה בשביל לרקמות ריאות, המבנה של כיסוי בלוח הבקרה רכישה.
  5. הגדר שדה ראייה B עבור עכבר אחת ורמת מנורה גבוהה.
  6. להגדיר זמן חשיפה אוטומטית, binning בינוני, 2-3 f/להפסיק, שיטות עירור במסנן ב nm 745 ומסננים פליטה 780 nm 840 ננומטר.
  7. עבור התקנת רצף, לחץ על רצף ההתקנה, בחר 9-12 נקודות הטרנס-תאורה באזור הריאה.
  8. לחץ על ייבוא עבור רכישת התמונה.
  9. הנח את העכבר בחזרה לתוך כלוב ההדמיה שלאחר.
  10. לפקח על העכברים עד החלים לחלוטין או להקריב עבור לכימות CFU אם הדמיה ב נקודת הזמן של הניסוי. לבצע ניקוד Karnofsky ששונה כדי לפקח לרווחתם של עכברים פוסט-הדמיה.

5. ניתוח של שופט הדמיה

  1. פתח את תוכנת הדמיה.
  2. לטעון קבצי תמונה על-ידי לחיצה על עיון סמל.
  3. עבור unmixing ספקטרלי, לחץ על הפירוק הספקטרלי Unmixing הצבעים כלי ולחץ על ספקטרום הנדרש כדי unmix. לחץ על התחל unmixing.
  4. שיקום משטח אופטי, לחץ על השטח הטופוגרפי.
  5. בחר כיוון כדי הגבי, בכפוף פרווה העכבר, לחץ על פני שטח של צור.
  6. לצייר תמונה חיתוך ולהגדיר סף תמונה עבור אזור של עניין. לחץ על בוצע.
  7. לרישום איברים, עבור אל הכרטיסיה רישום תלת-ממד בתפריט הנפתח כלים אופטי.
  8. הירשם איברים עניין באטלס איברים.
  9. התאם גודל איבר או מיקום הטופוגרפיה משטח שנוצרו באמצעות הכלי שינוי צורה/ביטול ממוקם על הכלים לוח רישום.
  10. ללכת טומוגרפיה פלורסנט (פליט) שחזור תלת-ממד, ולנתח בחר בכרטיסיית בחר את התמונות כדי להיכלל לניתוח, תמונה סוג ליעילות פלורסצנטיות שידור מנורמל (NTF), לחץ על התחל.
  11. לבדוק כל בחירה, לשחזר בכרטיסיה תצוגה מקדימה של נתונים.
  12. על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות, ללכת לכלים של אזור ריבית (ROI), להוסיף קוביה רועי האיבר עניין, להתאים את גודל הקוביה כדי לכסות את האיבר של עניין. לחץ על מדוד ROIs תלת-ממד.
  13. בחלון המידות רועי, ללכת למדידות רועי תלת-ממדיים, בחר סוג נתונים מקור יחידת voxels ומדידות pmolM-1ס מ-1.
  14. שמירה ו/או לייצא את התוצאה של פליט ניתוח שחזור תלת-ממד לקובץ נתונים או איור.

6. כימות של חיידקים על ידי CFU

  1. המתת חסד העכברים מאת בקרום הבטן הזרקת סודיום פנטוברביטל 0.1 מ"ל (390 מ"ג/מ"ל).
  2. בדוק אם פדלים רפלקס לוחצת את רפידות של כפות הרגליים של עכברים כדי להבטיח שאין תגובה רפלקס.
  3. Explant רקמת הריאה מן העכברים באמצעות מלקחיים סטרילי ומספריים. Homogenize רקמת הריאה ב 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
  4. להפוך דילולים טורי 10-fold של homogenate הריאה עקר 1 x PBS.
  5. עבור ציפוי, במקום שלוש aliquots של 20 µL כל של דילול בהתאמה על הצלחת אגר.
  6. דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C, צג לצמיחה בקטריאלי.
  7. ספירת מושבות בכל נקודה לאחר זמן הדגירה ולבטא כמו CFU / mL על-ידי תיקון עבור אמצעי אחסון ודילול באמצעות המשוואה הבאה:
    CFU / מ"ל = (C/V) x-M
    איפה C = המושבה ספירות לכל מקום, V = אמצעי אחסון מדגם מחוסן על כל צלחת (mL) ו- M = פקטור הכפלה (הדדיים של הדילול בשימוש).
    הערה: אם המושבות 11 נספרות במקום אחד עבור נפח דגימה של 0.002 מ"ל לדילול מדגם של 10-4, באמצעות המשוואה, הרוזן המושבה יחושבו כפי
    (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL

Representative Results

REF הדמיה של עכברים נגועים עם מ. שחפת יחד עם נגוע השליטה בעכבר מוצגות באיור איור 1א'. העכברים הנגועים המיוצר באופן משמעותי (P = 0.0057) אות גבוה יותר קרינה פלואורסצנטית מהריאות ב 6 שבועות לאחר הפגיעה לעומת שליטה על המצע המינהל. קורס טיפוסי זמן ללמוד את היעילות הטיפולית נגד מ. שחפת באמצעות שופט יכול להיות הדמיה בשבוע 1, 2, 4, 6, 15, 24 שעות לאחר הפגיעה. עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא לכמת באמצעות epi-תאורה בשביל לרקמות ריאות (איור 1B). האות באופן עקבי הולך וגדל משבוע 2 שבוע 6 בריאות של עכברים נגועים מציע REF זו בהצלחה יכול לזהות את מ. שחפת ויוו. ירידה האות רקע של בקרת עכברים בנקודת זמן מאוחרת יותר (איור 1B) ניתן לייחס את הגידול בגוף מסה ונפח של עכברים על פני תקופה של 6 שבועות, ובכך מקצר את החדירה גל עירור. שחזור תלת-ממד פליט של מקורות קרינה פלואורסצנטית עכברים נגועים מ. שחפת מיוצג באיור 2א. רצפי תמונות נרכשים בנקודות הטרנס-תאורה מרובים באמצעות עירור באותה סדרה של מסננים פליטת עכבר. רצפי תמונות אלה משמשים מכן שחזור תלת-ממד פליט להפצה פלורסנט מקור בתוך נושא בעלי חיים. איור 2 A-D מדגים לזרמים שונים (הפרונטליים, הווריד ו- transaxial) של העכבר טומוגרפיה עם ריאות איברים רישום. יעילות NTF מפות לבדיקת איכות שחזור מיוצגים איור 2E. NTF מאפשר הפחתה רקע זליגות אור הטרנס-תאורה תמונות באמצעות דימוי נוסף שנתפסו עם דחיסות נייטרלית מסנן. התמונה שצולמה עם המסנן עירור ספציפי (איור 2נמדד-E) הוא מנורמל לתמונה השידור נמדד עם פליטה באותו המסנן, מסנן פתוח עירור (איור 2E - מדומה) לתת האות המיוצר על ידי המצע לבד. דומה נמדד, מדומה NTF פרופיל יעילות הן אופקי (איור 2F) ופרופילים (איור 2G) אנכי עם כמעט 0% אחוז שגיאה (איור 2E-% שגיאה) מספק ראיות של שחזור תלת-ממד באיכות טובה עם חפצים מופחתת, אות משופרת לוקליזציה ורגישות.

Figure 1
איור 1 . הדמיה של מ. שחפת עם הפניה למעורר (א) אין ויוו הדמיה של עכברים uninfected, שנדבקו בשחפת מ - 2, 4 ו- 6 שבועות לאחר הפגיעה. סרגל הצבע מייצג את עוצמת האות פלורסנט בפוטונים לשניה לכל ס מ2 נמוך (צהוב) גבוהה (אדום). (ב) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית של עכברים נגועים עם מ. שחפת. קרינה פלואורסצנטית ערכים עבור שני פקד (שחור), נגוע (אדום) מוצגים יחד עם שגיאת התקן עבור כל נקודת זמן. המשמעות של תוצאות נקבע על ידי סטודנטים t-לבדוק, p ערכים של < 0.05 נחשבו משמעותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . שחזור תלת-ממד פליט של מקורות קרינה פלואורסצנטית עכברים נגועים בשחפת מ. טומוגרפיה העכבר ייצג לכיוונים שונים; א) הפרונטליים, ב) הווריד, ו- C) transaxial עם ריאות ד) איברים רישום. האזור תלת-ממד של הריבית (ROI) מיוצג קובייה אדומה בריאה למדידות מקור. (E) NTF יעילות מפות של נמדד, סימולציה לבדיקת איכות הבנייה מחדש. פרופיל יעילות NTF מדומה הסלסולים נמשל, לספק איכות טובה של שחזור תלת-ממד (דומה מדומה הסלסולים NTF יעילות). האות אנכי אופקי F) ו- G) פרופילים ייצוג נמדד (כחול), מדומה (אדום) NTF יעילות עיקול. הסורגים האדומים אופקיים ואנכיים מציינות את מיקום המקור. סרגל הצבע מייצג את עוצמת האות פלורסנט בפוטונים לשניה לכל ס מ2 נמוך (כחול) גבוהה (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעת שימוש בטכניקות דימות, כגון REF, יש מפתח אסטרטגיות המאפשרות יצירה של נתונים חזקים ועקביים. הדמיה אופטית מייצרת אור הפזורים ברקמות אשר יכולים להשפיע את עומק החדירה, מאז זה קשה ללכוד את האור הנפלטת מכל הכיוונים. שימוש של fluorophore ליד אינפרא-אדום (ניר) המצע עבור REF הדמיה שיש גל של עירור, פליטה Querange של 700-900 ננומטר מקלה על הספיגה מינימלית של האות פלורסנט מאת בתרבית של רקמות. המצע מעוצב מותאם אישית נבנה על-ידי קישור של ניר fluorophore, IRDye 800Cw כ'חטיף, IRDye QC-1, על ידי טבעת לקטם ומאפשר פלורסצנטיות תהודה אנרגיה מבוססת על העברת שכבתה. IRDye יש חדירה מצוינת רקמת אור פיזור המאפיינים ואת אין כל השפעה מזיקה ניכר על יונקים36, פינה ממחזור הדם, באיברים מאת h 24 פלורסצנטיות אות משמעותית מגדיל מתחיל 4 שעות לאחר המצע מינהל, להגיע מקסימלי רמות 6 שעות לאחר ניהול.

מינון זיהומית חיידקית, מצב של מינהל במינון זיהומיות ואת המצע, כמו גם בזמן נקודות של הדמיה פוסט זיהום על-ידי ביצוע מחקרים טייס צריך להיות מוגדר לפני היציאה ניסויים גדולים ומורכבים,. יכול לימודי טייס לצמצם במידה ניכרת של זמן ועלות כאשר הדמיה מספר גדול של בעלי חיים כי תהליך סטנדרטי ניתן למטב לפני הניסוי מפתח. המון חיידקים צריך להיות נחוש ברקמות/האיברים עניין בעקבות כל הגוף הדמיה באמצעות הטרנס-תאורה ו- ex-vivo ריאות הדמיה באמצעות epi-תאורה כדי לאמת את מקור האות, לקבוע את איכות המתאם עם מספרים חיידקי נוכח8. לימודי טייס יספקו תובנה הסף של זיהוי, טווח דינמי של הטכניקה, כמו גם קביעת התנאים ניסיוני אופטימלית עבור הדמיה.

היתרונות העיקריים של שימוש REF הדמיה כמו בהשוואה אסטרטגיות זוהרים פלורסנט אחרים הם שלה רגישות גבוהה ויכולת תמונה טבעית מ. שחפת זנים. REF הדמיה מנצל את האנזים catalytically חזקים BlaC זה כולו כל מבודד קלינית מ. שחפת , שחפת-מתחם זנים. הרגישות הגדולה של שופט הדמיה הוא שיעור קטליטי מהירה BlaC בשילוב עם השמירה של המוצר פלורסנט cleaved התא המארח. אות ללא הרף עולה ככל המצע זמין וכתוצאה מכך הצטברות כמעט בלתי מוגבל של האות בתוך תאים נגועים, רקמות. רגישות מוגברת זו של שופט הדמיה לעומת גישות אלטרנטיביות הדמיה מאפשר זיהוי ספציפי של מ. שחפת בשני במבחנה ויוו8,23,24, 29.

REF הדמיה ניתן לגילוי חיידקי בלי שינויים גנטיים המאפשרים יישומו ישירה לכל זיהום מודל, מעבדה חיות8,37 או חומרים קליני האדם29,38 . שופט יכול לשמש לשם זיהוי של תמונה מגוון רחב של פתוגנים39,40, מאז fluorogenic דיאלקטריים ניתנים לפיתוח עבור מטרות אנזימטיות רבות מלבד BlaC כגון פרוטאזות, kinases, ureases וβ-galactosidases. עם זאת, זהיר מחשבה צריך להינתן למטרה על מנת להבטיח הוא מציג מאפיינים אופטימלית עבור הדמיה. BlaC מייצג אנזים מודל טוב עבור מאפיינים שיבטיחו יישום מוצלח של אסטרטגיה זו. REF הדמיה מספקת read-out מיידית של במשלוח חיידקי מתנת בריאות במהלך זיהומים, אשר במידה רבה מהירויות של התקדמות במחקר של שחפת פתוגנזה, מאז קביעת מספרי חיידקי דורש בדרך כלל שלושה עד שישה שבועות, אבל אפילו יותר אורגניזמים בצמיחה מהירה, גישה זו תוכלו לחסוך הרבה מאוד זמן. שופט יכול לשמש גם כדי להפלות קרצינומות מ שחפת, בעיה מפתח באבחון של נגעים אקנה קשרי מטופלים41,42. REF משמש ככלי הרומן להאיץ שחפת translational הדמיה, אפילו ניתן להחיל על בני אדם, פוטנציאל המאפשר חיזוי מהירה של תוצאות טיפוליות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane VETONE 501027
CNIR800 Custom synthesized
Fatal Plus solution Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth BD 271310
OADC Middlebrook enrichment BD 212351
Sporcidin RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar BD 212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262
XGI-8-gas Anesthesia System Perkin Elmer
Living Imaging software Perkin Elmer
Transparent nose cones Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551 ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
  38. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. , 20150219653 A1 (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

Tags

אימונולוגיה גיליון 132 lactamase ריאתי אופטי חיסונים חייתיים הרפוי פתוגנזה
הדמיה <em>שחפת Mycobacterium</em> בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P.,… More

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J. Vis. Exp. (132), e56801, doi:10.3791/56801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter