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Developmental Biology

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Abstract

Negli esseri umani, gli errori di segregazione del cromosoma in ovociti sono responsabili della maggior parte di aborti e malformazioni congenite. Inoltre, come le donne invecchiano, il loro rischio di concepire che un feto aneuploide aumenta notevolmente e questo fenomeno è noto come l'effetto dell'età materna. È un requisito per la segregazione del cromosoma accurata durante le divisioni meiotiche manutenzione della sorella coesione tra cromatidi fratelli durante il periodo di profase estesa esperienza di ovociti. Prova citologica in entrambi esseri umani e gli organismi modello suggerisce che coesione meiotica si deteriora durante il processo di invecchiamento. Inoltre, gli errori di segregazione in ovociti umani sono più prevalenti durante la meiosi I, coerente con la perdita prematura di coesione di braccio. L'uso di organismi modello è fondamentale per dipanare i meccanismi che sottendono la perdita età-dipendente di coesione. Drosophila melanogaster offre diversi vantaggi per studiare il regolamento di meiotic coesione negli ovociti. Tuttavia, fino a poco tempo, solo i test genetici erano disponibili test per la perdita di coesione del braccio in ovociti di genotipi diversi o in diverse condizioni sperimentali. Qui, un protocollo dettagliato è fornito per l'utilizzo di fluorescenza in situ ibridazione (pesce) per visualizzare direttamente difetti nella coesione del braccio in prometafase io e metafase sono arrestato ovociti di Drosophila . Generando una sonda di pesce che ibridizza con il braccio distale del cromosoma X e raccogliendo gli stack Z confocale, un ricercatore può visualizzare il numero di singoli segnali di pesce in tre dimensioni e determinare se sorella cromatidio braccia sono separati. La procedura descritta permette di quantificare i difetti di coesione braccio in centinaia di Drosophila ovociti. Come tale, questo metodo fornisce un importante strumento per indagare i meccanismi che contribuiscono alla coesione manutenzione, nonché i fattori che portano alla sua scomparsa durante il processo di invecchiamento.

Introduction

Corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e meiosi richiede che la sorella cromatidio coesione essere stabilito, mantenuto e rilasciato in un modo coordinato1,2. Coesione è stabilito durante la fase S ed è mediato dalla coesina complessa, che forma legami fisici che tengono la sorella cromatidi insieme. Nella meiosi, coesione distale di un crossover funziona anche per tenere insieme gli omologhi ricombinanti e questa associazione fisica contribuisce a garantire il corretto orientamento di bivalente su metafase mandrino (Figura 1)3,4, 5. Rilascio del braccio coesione a anafase permette l'omologhi segregare ai poli opposti del mandrino. Tuttavia, se la coesione del braccio è perso prematuramente, ricombinanti omologhi perderanno loro connessione fisica e segregare in modo casuale, che può provocare gameti aneuploid (Figura 1).

In ovociti umani, errori nella segregazione del cromosoma sono la principale causa di aborti e malformazioni alla nascita, come la sindrome di Down6, e la loro incidenza aumenta esponenzialmente con l'età materna7. Coesione di cromatidio della sorella è stabilito negli ovociti fetali e ricombinazione meiotic viene completata prima della nascita. Ovociti quindi arrestare in Mid-Profase I fino a quando l'ovulazione e durante questo periodo di arresto, l'associazione fisica costante degli omologhi ricombinanti si basa sulla sorella coesione tra cromatidi fratelli. Di conseguenza, accurata segregazione durante la meiosi e gli esiti di gravidanza normale richiedono che coesione rimangono intatti per fino a cinque decenni.

La perdita prematura di coesione durante l'arresto prolungato meiotic di ovociti umani è stata proposta per contribuire all'effetto dell'età materna e linee multiple di prova supportano questa ipotesi8,9. Tuttavia, date le sfide di studiare meiotica coesione in ovociti umani, gran parte della nostra comprensione di questo fenomeno si basa sull'uso di modello organismi5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster ovociti offrono numerosi vantaggi per lo studio della coesione e cromosoma meiotic di segregazione. Una semplice analisi genetica permette di recuperare la progenie da gameti aneuploid e misurare la fedeltà di X-segregazione cromosomica su una larga scala11,16,17. Inoltre, si può anche determinare se gli errori di segregazione del cromosoma sorgono perché missegregate ricombinanti omologhi durante la meiosi I, un fenotipo che è coerenza con la perdita prematura di braccio coesione11,18, 19. diretta osservazione dello stato di coesione meiotica in ovociti di Drosophila è anche possibile mediante ibridazione in situ di fluorescenza (pesce). Anche se oligonucleotidi fluorescenti che ibridano a sequenze ripetitive satellite sono stati utilizzati per oltre un decennio per monitorare pericentromeric coesione maturo Drosophila ovociti4,20, analisi del braccio coesione è stato molto più difficile. Visualizzazione dello stato di coesione braccio richiede una sonda che si estende su una vasta regione di copia singola sequenze ed è abbastanza luminosa per provocare segnali visibili per singolo sorella cromatidi quando braccio coesione è assente. Inoltre, il condizioni di fissazione degli ovociti e le dimensioni delle autorità nazionali designate con etichettate deve facilitare la penetrazione21 nell'ovocita maturo grande di Drosophila (200 µm larga di 500 µm lungo). Recentemente, una sonda di braccio è stato correttamente utilizzato per prevedere i cromatidi oocita di Drosophila durante l'anafase io, ma gli autori ha dichiarato che potrebbe non rilevare un segnale in prometafase o metafase sono arrestato ovociti22. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la generazione di X-braccio del cromosoma FISH sonde e le condizioni di preparazione degli ovociti che ci hanno permesso di analizzare per la perdita prematura della sorella coesione cromatidio in prometafase io e metafase ho ovociti. Queste tecniche, che hanno permesso di identificare prodotti genici che sono necessari per il mantenimento della coesione meiotica, permetterà ad altri di dosaggio per sorella coesione cromatidio difetti in ovociti maturi di Drosophila di genotipi differenti.

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Protocol

1. preparati

  1. Preparare le soluzioni per ibridazione in situ di fluorescenza (pesce). Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua ultrapura.
    1. Preparare per volta Robb buffer 5x: acetato di potassio di 275 mM, 200 millimetri di acetato di sodio, saccarosio 500mm, glucosio di 50 mM, 6 mM di cloruro di magnesio, cloruro di calcio di 5 mM, 500 mM HEPES pH = 7,4. Portare il pH a 7.4 utilizzo 10 N NaOH. Filtro sterilizzare e conservare a-20 ° C. Scongelare e diluire a 1x come necessario e conservare 1 x aliquote a-20 ° C.
    2. Preparare 10 x tamponato fosfato salino (PBS) utilizzando 1,3 M di NaCl, 70mm Na2HPO4, 30mm NaH2PO4. Portare il pH a 7.0 utilizzando 10 N NaOH. Sterilizzare con la sterilizzazione in autoclave o filtro.
  2. Preparare vetrini coprioggetti poli-L-lisina un giorno prima necessario.
    1. Pipettare 70% etanolo contenente 1% di acido cloridrico sulla superficie di un vetrino coprioggetto 18 x 18 mm #1.5 e incubare 5 min aspirazione sottovuoto uso per rimuovere il liquido. Ripetere l'operazione con acqua ultrapura sterile. Coprire la superficie del vetrino coprioggetto con 0,1 mg/mL poli-L-lisina e incubare per 10 min.
    2. Aspirare per rimuovere il liquido e aria secca per 10 min. lato archivio vetrini coprioggetti poli-L-lisina fino in un contenitore di plastica con un coperchio a chiusura ermetica per evitare la polvere.
  3. Preparare tirato Pasteur pipette per rimuovere soluzioni liquide senza rimuovere gli ovociti. Sopra una fiamma di bruciatore di Bunsen, riscaldare il mezzo di un pipetta Pasteur di vetro lunghe tirando delicatamente su ciascuna estremità fino a quando il vetro si scioglie e tira a pezzi.

2. generazione della sonda di braccio per pesce

Nota: Tutte le fasi di centrifuga vengono eseguite a ~ 16.000-21.000 x g (velocità massima sulla maggior parte dei piano tavolo Microcentrifughe). Giri di centrifuga breve, indicare la filatura per Vortex s. 5-15 indica nel Vortex per ~ 15 s a max velocità se non specificato diversamente.

Nota: BACs per braccio sonde possono essere ottenute dalle BAC PAC risorse. Due sonde di euchromatic del braccio del cromosoma di X sono state usate con successo con questo metodo. Una sonda di braccio è stata composta di sei cloni BAC corrispondente a citologico bande 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). L'altra sonda braccio ha consistito di sei cloni BAC corrispondente a bande citologico 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs per altro cromosoma di Drosophila regioni possono essere sfogliate a: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Due sonde di pericentric che riconoscono la ripetizione di satellitare bp 359 del cromosoma X sono stati usati con successo con questo metodo. Una sonda del 22 nucleotide è stato ampiamente utilizzata e funziona bene (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Una sonda 28 del nucleotide è stato recentemente testata e ha anche lavorato bene (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC purificato oligonucleotidi 5' etichettati con un fluoroforo specifico sono state ordinate da una fonte commerciale (ad es., Integrated DNA Technologies).

  1. Preparazione del DNA di clone BAC seguendo le istruzioni del kit come specificato nella Tabella materiali. Risospendere il pellet di DNA ottenuto da 100 mL di coltura in 200 µ l di TE; la concentrazione di DNA finale deve essere compreso tra 5-40 ng / µ l a seconda il clone BAC.
  2. Eseguire l'amplificazione del DNA per ogni BAC utilizzando il kit di amplificazione, come specificato nella tabella dei materiali e il seguente protocollo. Processo del DNA di BAC per ogni clone individualmente. Utilizzare enzimi e buffer fornito con il kit in passaggi 2.2.1 attraverso 2.2.3.
    1. La frammentazione casuale del DNA di BAC: per ogni BAC, usare TE per preparare 10 µ l di una soluzione di DNA 1 ng / µ l in un tubo PCR di 200 µ l. Aggiungere 1 µ l di tampone di frammentazione X 10. Posizionare il tubo in una macchina PCR a 95 ° C per esattamente 4 min immediatamente raffreddare il campione in acqua con ghiaccio e centrifugare brevemente. L'incubazione è ora sensibile e qualsiasi deviazione può alterare i risultati.
    2. Preparazione di biblioteca
      Nota: Questo metodo utilizza gli iniettori casuali per generare una libreria di frammenti amplificabile.
      1. Nella provetta contenente il DNA aggiungere quanto segue: 2 µ l di libreria preparazione 1x, 1 µ l di soluzione di stabilizzazione della libreria. Mescolare nel Vortex, centrifugare brevemente e posizionare il tubo nella macchina PCR a 95 ° C per 2 min immediatamente raffreddare il campione in acqua con ghiaccio e centrifugare brevemente.
      2. Aggiungere 1 µ l di enzima preparazione libreria alla provetta PCR, mix e centrifugare brevemente. Posto PCR tubo nella macchina PCR e incubare come segue: 16 ° C per 20 min, 24 ° C per 20 min, 37 ° C per 20 min, 75 ° C per 5 min, quindi tenere a 4 ° C.
      3. Rimuovere i campioni dalla macchina PCR e centrifugare. I campioni possono essere amplificati immediatamente o conservati a-20 ° C fino a tre giorni.
    3. Amplificazione della libreria del DNA di BAC
      1. Aggiungere i seguenti reagenti per l'intera reazione casuale frammento 15 µ l: 7,5 µ l 10 x amplificazione Master Mix, 47,5 µ l acqua gratuita di nucleasi, 5 µ l della polimerasi di DNA di WGA. Mescolare nel vortex e centrifugare.
      2. Posto PCR tubo nella macchina PCR e incubare come segue: iniziale denaturazione 95 ° C per 3 min, 14 cicli di denaturazione a 94 ° C per 15 s, seguito da ricottura/estensione a 65 ° C per 5 min, quindi tenere a 4 ° C.
      3. Dopo il ciclismo è completo, dosaggio della concentrazione di DNA. La concentrazione del DNA dovrebbe essere almeno 800 ng / µ l. conservare i campioni a 4 ° C o conservare a-20 ° C fino al pronto per la digestione. Facoltativamente, valutare la dimensione del frammento di DNA eseguendo 400 ng di DNA su un gel di agarosio al 2%. Frammenti dovrebbero variare da 200 bp a 3 kb (Figura 2).
  3. Digestione degli enzimi di restrizione del DNA amplificato
    1. Posto 20 µ g di DNA amplificato dalla sezione precedente in una provetta da 1,5 mL microfuge. Aggiungere 20 unità di Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 unità di BfuCl, 0,5 µ l 100 x BSA, 5 µ l 10 x buffer di digestione degli enzimi di limitazione e regolare il volume a 50 µ l aggiungendo la quantità appropriata di ultrapura H2O.
    2. Incubare il digest durante la notte a 37 ° C in un incubatore per evitare la condensa sul coperchio. Etanolo precipitare il DNA digerito. Aggiungere il digest: 1 glicogeno µ l, 1/10 di volume 3M sodio acetato, etanolo 100% grado molecolare 2.5 volumi. Incubare a-80 ° C per 1 h o durante la notte.
    3. Centrifuga per 30 min a 4 ° C. Pellet di DNA lavare con 1 volume di etanolo al 70% temp camera e spin per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e lasciare che il DNA a pellet aria secca o asciugare delicatamente con un flusso costante di aria.
    4. Risospendere il pellet di DNA in 36 µ l sterile ultrapura H2O e utilizzare 1 µ l di DNA per analizzare la concentrazione di DNA, che dovrebbe essere circa 285 ng / µ l. conservare il DNA a-20 ° C.
    5. Eventualmente valutare la dimensione del frammento di DNA in esecuzione 400 ng di DNA su un gel di agarosio al 2%. Maggior parte dei frammenti dovrebbero variare da 100-200 bp, con un segnale più debole fino a 500 bp (Figura 2).
  4. 3' tailing reazione
    1. Denaturare il DNA digerito a 100 ° C per 1 min in un blocco di calore. Raffreddare immediatamente in acqua ghiacciata. Per i 35 µ l di DNA, aggiungere la seguente: 50 µ l 400 mM sodio cacodilato, 1 µ l 10 mM DTT e vortice bene. Aggiungere 4 µ l 25 mM CoCl2, 2,5 µ l 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP da ARES etichettatura kit come specificato nella tabella dei materiali, 5 µ l 1 mM dTTP, 18 µ l 5 x TdT buffer e transferasi terminale di deoxynucleotidyl 1 µ l (TdT) 400 U / µ l. Vortex e centrifugare brevemente.
      Attenzione: CoCl2 tossici, indossare una protezione appropriata.
    2. Incubare per 2 ore a 37 ° C in un incubatore per evitare la condensazione. Aggiungere 1 µ l di 250 mM EDTA per fermare la reazione e il vortice brevemente per mescolare. Etanolo precipitare il DNA munito, come descritto in precedenza (punti 2.3.2 - 2.3.4). Risospendere il pellet di DNA secco in 10 µ l sterile ultrapura H2O. Store il DNA a-20 ° C fino al momento di continuare.
  5. Condurre la coniugazione di tintura fluorescente utilizzando il kit etichettatura del DNA come specificato nella tabella materiali.
    Nota: Una volta che il colorante viene aggiunto conservare campioni al buio.
    1. Denaturare il DNA dalla coda a 95 ° C per 5 min in un blocco di calore. Raffreddare immediatamente DNA in acqua ghiacciata e centrifugare brevemente. Preparare il tampone d'etichettatura secondo le istruzioni del kit e aggiungere 6 µ l di ciascun campione di DNA. Risospendere ciascun tubo di tintura in 4 µ l di DMSO da kit. Vortex e centrifugare brevemente.
    2. Utilizzare un tubo di tintura per ogni reazione d'etichettatura. Aggiungere la soluzione colorante per il DNA, vortex e centrifugare brevemente. Incubare la reazione d'etichettatura a temperatura ambiente per 2 h al buio. 3 µ l di idrossilammina 3M per arrestare la reazione seguita da 77 µ l di nucleasi-free H2O dal kit. Vortex e centrifugare brevemente.
  6. Rimuovere il colorante non coniugato utilizzando il kit di purificazione di PCR come specificato nella tabella dei materiali. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire il DNA dalla colonna due volte utilizzando 40 µ l di tampone di eluizione ogni volta.
  7. Etanolo precipitare il DNA etichettato come descritto in precedenza (punti 2.3.2 - 2.3.4). Risospendere il pellet di DNA secco in 10 µ l di tampone di eluizione.
  8. Preparare la miscela della sonda
    1. Per il DNA con etichettato, determinare la concentrazione della tintura fluorocromo in pmol / µ l. La concentrazione di fluorophore può variare da 30-100 pmol / µ l, a seconda della BAC. La concentrazione di DNA può variare da 300-800 ng / µ l.
      Nota: L'impostazione di microarray funziona bene su uno spettrofotometro di microvolume, come specificato nella tabella dei materiali. Nella finestra di microarray, selezionare DNA-50 e specificare il fluorocromo.
    2. Creare un mix master combinando quantità equimolare (pmol fluor) di ciascuna delle sonde BAC. Vortice 30 s prima della combinazione. Per evitare cicli di gelo/disgelo, preparare aliquote di mix master, applicare strato di paraffina per i tubi per evitare l'evaporazione e conservare al buio a-20 ° C.
      Nota: Un mastermix contenente 250 pmol di ciascuno dei 6 singoli BAC sonde in un volume totale di 30-50 µ l funziona bene. Un'aliquota contenente 25 pmol (fluor) per ogni BAC sarà sufficiente per le reazioni di ibridazione di due 40 µ l, con una concentrazione finale di sonda di 0,31 pmol fluor / µ l per ogni BAC.

3. la dissezione e la fissazione degli ovociti

  1. Raccogliere 30 femmine adulte Vergine del genotipo appropriato. Per arricchire per ovociti fase tarda, tenere le femmine senza maschi in un flaconcino con alimento e lievito secco per 3-5 giorni prima della dissezione25. Il giorno prima della dissezione, trasferire le femmine senza gas per un flaconcino fresco con il lievito.
  2. Eseguire la dissezione.
    Nota: Vedere la Figura 3 per gli strumenti necessari. Soluzioni vengono rimossi utilizzando una pipetta di Pasteur tirata se non specificato diversamente. Quando si trasferiscono le ovaie sempre utilizzare un puntale rivestito con una soluzione di 10% BSA.
    1. In un piatto piano di dissezione contenente tampone di Robb per volta, utilizzare pinze per rimuovere le ovaie di una donna sola. Uso di forcipe o un ago di tungsteno a strombo delicatamente ogni ovaia, permettendo la soluzione contattare ovarioles interiore. Trasferire la coppia delle ovaie strombate in una provetta di microfuge 1,5 mL contenente tampone di 1 mL per volta Robb.
    2. Ripetere il punto 3.2.1 per accumulare le ovaie da 20-25 femmine nel tubo microfuge 1,5 mL. Finire le dissezioni delle femmine 20-25 entro 10 min.
  3. Eseguire il fissaggio come indicato di seguito.
    1. Con una pipetta Pasteur tirata, rimuovere il liquido nel tubo microfuge, utilizzare un P1000 rapidamente aggiungere 500 µ l di soluzione di 37 ° C alle ovaie e quindi immediatamente aggiungere 500 µ l di eptano temperatura alle ovaie.
    2. Tubo microfuge agitare per mescolare e mettere su un nutator per 3 min. rimuovere il tubo di microfuge dal nutator e posto in una cremagliera del tubo per 1 min consentire gli ovociti per depositarsi sul fondo. La data di fissazione totale è di 4 min.
      Attenzione: Soluzione di correzione ed eptano sono tossici, indossare una protezione appropriata.
    3. Rimuovere la soluzione di fix e risciacquare le ovaie 3 volte in 500 µ l di PBS contenente 0.5% di BSA e 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Ripetere per i restanti genotipi.

4. rimozione di Chorions e membrana vitellina

Nota: Vedere la Figura 3 per gli strumenti necessari.

  1. Ovociti di fase tardo separata
    1. Aggiungere 1 mL PBSBTx per un piatto poco profondo per dissezione. Utilizzare un P200 con una punta rivestita di BSA per trasferire fisse ovaie (in ~ 150 µ l) nel piatto poco profondo. Pipetta ovaie su e giù con la punta della pipetta rivestito di BSA per sloggiare gli ovociti maturi da ovociti meno maturi.
    2. Quando gli ovociti fase tardiva sono sufficientemente separati, è possibile trasferire tutto il tessuto in una provetta di microfuge 500 µ l. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta Pasteur tirato, lasciando circa 150-200 µ l nella provetta. Ripetere sezione 4.1 per i restanti genotipi.
  2. Preparare per la laminazione
    1. Pre-bagnato un pozzo profondo piatto con 200 µ l di PBSBTx. coperchio e mettere da parte. Ottenere 3 lastre di vetro satinato e lucido set #3 da parte. Strofinare delicatamente le regioni di vetro smerigliato di diapositive #1 e #2 insieme. Sciacquare in acqua deionizzata per rimuovere eventuali schegge di vetro e asciugare con un panno monouso.
    2. Rivestire le regioni glassate di diapositive #1 e #2 con PBSBTx aggiungendo 50 µ l di PBSBTx a una diapositiva e sfregamento questa regione con le altre diapositive. Rimuovere il liquido con un panno monouso.
    3. Porre i vetrini con un microscopio per dissezione nella configurazione illustrata nella Figura 4A. Mantenere le regioni glassate di diapositive #1 e #2 in contatto, con scivolo #3 supporto diapositiva #2.
  3. Rotolo di ovociti; Assicurarsi che la direzione di laminazione sia sempre in linea retta e mai un movimento circolare.
    1. Prewet un P200 pipetta punta in PBSBTx e disperdere gli ovociti nel tubo microfuge pipettando su e giù. Trasferire 50 µ l di liquidi contenenti ovociti al centro della parte di vetro glassato della diapositiva #1. Sollevare il vetrino #2 per farlo.
    2. Abbassare lentamente il vetrino #2 fino a quando la tensione superficiale del liquido crea una tenuta tra le due regioni di vetro smerigliato. Ci dovrebbe essere abbastanza liquido per coprire l'area glassato ma nessuno dovrebbe essere che filtra fuori. Se il liquido è straripante, è possibile utilizzare una pipetta Pasteur tirata per eliminare il liquido in eccesso.
    3. Tenere la diapositiva di fondo (#1) in posizione con una mano e usare l'altra mano per spostare la slitta superiore (#2) avanti e indietro in direzione orizzontale, mantenendo lucido #2 livello e supportati su diapositiva #3. Eseguire sotto un microscopio per una visualizzazione semplice dei movimenti degli ovociti e progresso.
      Nota: Questo movimento genera attrito e causare gli ovociti "roll" e perdere la loro chorions. Pressione minima dovrebbe essere usata e movimenti dovrebbero essere breve e veloce.
    4. Dopo pochi movimenti in direzione orizzontale, è necessario modificare leggermente l'angolo di movimento (Figura 4B). Incrementi di più, aumentare gradualmente questo angolo a 90° fino a quando il movimento della slitta superiore (#2) è perpendicolare alla direzione di partenza (Figura 4B). Si noti che chorions vuoto sarà visibile nel liquido e ovociti privi chorions apparirà più lungo e sottile.
    5. Ripetere i passaggi 4.3.3 - 4.3.4 circa 7 - 10 volte fino a quando la soluzione diventa leggermente torbida. Smettere di rotolamento quando la maggior parte degli ovociti (75-85%) sembra aver perso la loro membrana vitellina.
      Nota: Un'estremità appuntita distintiva è spesso visibile su ovociti privi di membrana vitellina. Membrana vitellina è più difficili da rimuovere che chorions. Leggera pressione può essere applicata alla diapositiva superiore (diapositiva #2) durante il rotolamento per ottenere la rimozione della membrana vitellina. Cercando di rimuovere la membrana vitellina da tutti gli ovociti provoca spesso la distruzione di altri ovociti.
    6. Sollevare delicatamente il vetrino superiore (#2), trascinando uno dei suoi angoli al centro della regione glassato della slitta inferiore (#1) che l'annullamento di ovociti si accumulano nel centro della regione smerigliato. Risciacquare gli ovociti da entrambi diapositive con PBSBTx nel pozzo profondo piatto contenente PBSBTx.
    7. Pulire diapositive #1 e #2 con acqua ultrapura, asciugare con un panno monouso e reset. Ripetere i passaggi 4.3.1 - 4.3.6 fino a quando tutti gli ovociti dello stesso genotipo hanno stati rotolati. Questo di solito richiede 3-4 giri di rotolamento al genotipo.
  4. Rimuovere i detriti dopo la laminazione
    1. Aggiungere 1 mL PBSBTx a una provetta conica da 15 mL. Agitare il liquido per rivestire i lati del tubo.
    2. Utilizzando un PBSBTx rivestito P1000 puntale, trasferimento gli ovociti laminati dal profondo ben piatto nella provetta conica contenente 1 mL di PBSBTx. Aggiungi un ulteriore 2 mL di PBSBTx nella provetta conica contenente gli ovociti.
    3. Lasciate che gli ovociti iniziano a depositarsi sul fondo, quindi rimuovere la parte superiore 2 mL di soluzione contenente detriti (chorions, vitellines, ecc.) con un P1000 e scartare. Se necessario, è possibile tenere la provetta conica contro uno sfondo scuro per vedere gli ovociti opachi come si affondano.
    4. Aggiungere un ulteriore 2 mL di PBSBTx gli ovociti e ripetere il punto 4.4.3. Ripetere 4.4.3. per un totale di 3 turni di rimozione detriti.
    5. Utilizzando un PBSBTx rivestito P1000 puntale, trasferimento ovociti torna al tubo originale di 500 µ l del microfuge. 20 - 25 femmine dovrebbero produrre circa 50 µ l di laminati ovociti maturi.
  5. Ripetere il punto 4 per i restanti genotipi utilizzando diapositive smerigliati freschi, un piatto pulito profondo bene e un nuovo tubo conico per ciascun genotipo.
  6. Se è necessaria la conservazione, trasferire gli ovociti a 1X PBS con 0,1% TritionX-100 e store durante la notte a 4 ° C. Stoccaggio a lungo termine non è raccomandato perché la reticolazione di formaldeide può essere invertita con detergenti non ionici.

5. PESCE

Nota: Tutti i lavaggi vengono eseguiti su un nutator a temperatura ambiente, se non specificato diversamente. Gli ovociti che hanno stati rotolati richiedono più tempo per depositano alla parte inferiore del tubo microfuge, soprattutto nelle soluzioni che contengono formammide. È importante essere pazienti quando si cambia soluzioni affinché gli ovociti non vengono persi nel processo. Ciò può richiedere in attesa di 5-15 min per lasciare gli ovociti stabilirsi dopo risciacqui e lavaggi. Si noti inoltre che gli ovociti in formammide sono meno opachi.

  1. Trattamento di estrazione e RNasi
    1. Risciacquare gli ovociti con 500 µ l di PBS contenente l'1% Triton X-100 (PBSTx). Rimuovere il liquido e aggiungere 500 µ l tampone di estrazione (PBSTx contenente RNasi). Incubare su nutator a temperatura ambiente per 2 h.
  2. Lavate di pre-ibridazione
    1. Risciacquare gli ovociti 3 volte con 500 µ l 2 x Saline citrato di sodio contenente Tween 20 (SSCT). Preriscaldare un'aliquota (~ 500 µ l/genotipo) di 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C.
      Attenzione: formammide è tossica, indossare una protezione appropriata.
    2. Lavare gli ovociti 3 volte per 10 minuti ciascuno, in 500 µ l 2 x SSCT. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 20% formammide. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 40% formammide. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 50% formammide.
    3. Rimuovere il liquido e aggiungere 500 µ l di 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide dal punto 5.2.1 al campione e incubare per 2 ore a 37 ° C con rotazione.
      Nota: Un forno di ibridazione dotato di un rotore funziona bene per questo. Un tubo di microfuge schiuma "galleggiante" attaccato al rotatore può essere utilizzato per fissare i tubi.
  3. Denaturazione e ibridazione
    1. Per ogni provetta di ovociti, utilizzare 40 µ l di tampone di ibridazione 1x contenente la sonda centromerica di 2,5 ng / µ l e 0,31 pmol fluor / µ l di ciascuna sonda BAC. Preparare una soluzione di sonda in tampone di ibridazione sufficiente per tutti i genotipi. Vortice sonda mix 30 s prima di aggiungere.
    2. Utilizzando una punta di pipetta rivestite con BSA P200, trasferire gli ovociti in una provetta PCR di 200 µ l. I campioni possono essere conservati a 37 ° C e lasciare ovociti settle alla parte inferiore, quindi utilizzare una pipetta Pasteur tirata per rimuovere quanto più liquido possibile.
    3. Aggiungere 40 µ l di soluzione di ibridazione contenente sonda (preparato nella sezione 2) per gli ovociti. Collocare la provetta PCR contenente gli ovociti nella macchina PCR e incubare come segue: 37 ° C per 5 min, 92 ° C per 3 min, poi 37 ° C durante la notte. Dopo aver aggiunto sonda gli ovociti, tenerli al buio per quanto possibile.
  4. Lavaggi post-ibridazione
    1. Preriscaldare il 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C e tenerlo in incubatrice ibridazione. Con un BSA rivestito P200 Pipettare suggerimento, aggiungere 100 µ l di 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide nella provetta PCR con gli ovociti e trasferire gli ovociti in una provetta di microfuge nuovo 500 µ l.
    2. Aggiungere un ulteriore 400 µ l di 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide al tubo stesso e lasciare che gli ovociti stabilirsi a 37 ° C nell'incubatore.
      Nota: Assestamento spesso richiede più tempo in questa fase. Non è insolito da prendere 15 min o più a lungo. Una mancanza di pazienza si tradurrà in una perdita significativa di ovociti.
    3. Lavare gli ovociti 3 volte per 20 minuti ciascuno, in 500 µ l 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C con rotazione. Mantenere gli ovociti a 37 ° C, mentre si depositano.
    4. Lavare gli ovociti 3 volte per 10 minuti ciascuno, in 500 µ l 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C con rotazione. Mantenere gli ovociti a 37 ° C, mentre si depositano.
    5. A temperatura ambiente, lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 40% formammide su un nutator. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 20% formammide. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT.
  5. Macchiare con DAPI
    Attenzione: DAPI è tossico, indossare una protezione appropriata.
    1. Lavare gli ovociti per 20 min a 500 µ l di soluzione DAPI (1 µ g/ml) in 2 x SSCT sui nutator. Risciacquare gli ovociti 3 volte in 500 µ l 2 x SSCT. Lavare gli ovociti 2 volte per 10 minuti ciascuno, in 500 µ l 2 x SSCT sui nutator. Campioni possono essere conservati per fino a 4 h a temperatura ambiente al buio fino a quando non sono pronti a montare sulle lamelle.
  6. Montaggio
    Nota: Vedere la Figura 3 per gli strumenti necessari.
    1. Porre un coprivetrino rivestito di poli-L-lisina al microscopio per dissezione. Rimuovere il liquido dal tubo di ovociti, regolazione del volume totale di circa 150 µ l. Con un BSA rivestito P200 puntale, pipetta su e giù per disperdere gli ovociti in tutta la soluzione e poi trasferire 40 µ l di soluzione ed l'ovociti di una lamella rivestita di poli-L-lisina.
    2. Alcuni del liquido togliere il vetrino coprioggetto utilizzando una pipetta Pasteur tirata fino a quando gli ovociti bastone per il vetrino coprioggetto, ma sono ancora circondati da liquido. Con il forcipe, tenere premuto il vetrino coprioggetto su un lato e utilizzare un ago di tungsteno delicatamente dissociare ciuffi di ovociti, spostandoli per ottenere un singolo strato di ovociti non sovrapposte.
    3. Rimuovere il resto del liquido intorno gli ovociti con una pipetta Pasteur tirato. Prendere un vetrino pulito e utilizzare gas compresso per soffiare via la polvere. 22 µ l di montaggio supporti (ad es., prolungare-oro) al centro della diapositiva. Abbassare lentamente il vetrino verso il vetrino coprioggetto, con il supporto di montaggio rivolto verso il campione, fino a quando i media tocca il campione. Tensione superficiale causerà il coprioggetto di aderire alla diapositiva.
    4. Mettere i vetrini in un contenitore di plastica con un coperchio a chiusura ermetica che contiene uno strato di fresco essiccante (ad es., drierite). Lasciate che scivoli asciugare per 3-5 giorni al buio prima di formazione immagine. Tempo di asciugatura può variare a seconda dell'umidità della stanza.

6. imaging

  1. Rimozione di diapositive asciutti dalla casella di essiccante, pulirli per rimuovere eventuali particelle di polvere. Sigillare le lamelle con smalto. Sigillato vetrini possono essere conservati a tempo indeterminato a-20 ° C.
  2. Acquisire immagini confocal con un'apertura numerica elevata olio obiettivo 40x zoom digitale 6x di scansione laser.
    Nota: Idealmente, sistema software vi permetterà di trovare e contrassegnare la posizione X-Y dei cromosomi meiotici per più ovociti durante la visualizzazione di loro utilizzando epifluorescenza. Questa funzionalità consente di risparmiare tempo durante una sessione di imaging. Rapido imbianchimento con un obiettivo di apertura numerica elevata 60 X fatto suo uso inadatto con il sistema confocale scelto, ma può funzionare per altri sistemi.
  3. Acquisire una serie di Z per ogni ovocita, impostazione superiore e inferiore della serie utilizzando il segnale DAPI.
    Nota: Guadagno, offset, e potere del laser dovrà essere determinata empiricamente utilizzando un sottoinsieme degli ovociti. Una volta individuati i parametri adatti, solo piccoli aggiustamenti devono essere fatte.
    Se alterata acquisizione sono necessarie impostazioni, utilizzare la serie di immagini raccolte in precedenza per stimare le modifiche necessarie. Per evitare lo sbiancamento, astenersi da pre-imaging la sonda del braccio prima di catturare la serie Z. Con un passo di 0,25 µm, serie Z in genere vanno da 25 a 30 passi a seconda dell'orientamento e posizionamento dei cromosomi. Una dimensione di passaggio inferiore può migliorare la capacità di valutare se due macchie di pesce sono separati nella dimensione assiale, ma c'è un trade-off con il tempo necessario per catturare piccoli passaggi e perdita dell'intensità del segnale a causa di candeggio. Un obiettivo 40x con 6 X zoom digitale e un campo di immagine 1.024 x 512 genera immagini con una dimensione di pixel di 0,05 µm.

7. immagine analisi e segnando per difetti di coesione

  1. Deconvoluzione della serie Z per ottimizzare il rapporto segnale-rumore per ogni ovocita19.
    Nota: Un pacchetto di software come quello specificato nella Tabella dei materiali permette di deconvoluzione utilizzando restauro integrativo, nonché ritagliare e contrasto-migliorare le immagini. D'importanza, un pacchetto software che permette di visualizzare le immagini e il punteggio per i difetti di coesione in tre dimensioni è imperativo.
  2. Per ogni ovocita, catalogare il numero del braccio e i fuochi centromerici che colocalize con il segnale DAPI. Perdita di coesione comporta tre o quattro segnali distinti e separati per una sonda specifica. Non è raro osservare due fuochi che sono collegati da un filo sottile. Secondo i criteri più severi, questi fuochi non sarebbero considerati "separato".

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Representative Results

Figura 5 presenta le immagini ottenute con una sonda di braccio che ibridizza con citologico regione 6E-7B sul cromosoma X . Questo risultati di sonda in un segnale che co-localizza con quello di DAPI, è facilmente distinguibile dallo sfondo ed è stato usato con successo per quantificare i difetti di coesione del braccio in diversi genotipi19. Quantificazione dei difetti di coesione è stata limitata a prometafase io e metafase tappe; ovociti prima ripartizione busta nucleare sono stati esclusi dall'analisi19. Una busta nucleare intatta è evidente quando si acquisiscono nel canale DAPI perché i cromosomi degli ovociti saranno circondati da una discreta area circolare che è più scura del citoplasma circostante.

Figura 5B Mostra proiezioni di intensità massima delle singole serie Z dopo deconvoluzione e contrasto di potenziamento. Quantificazione dei difetti di coesione richiede determinazione per ogni sonda che il numero di pesci che si sovrappongono i segnali con il segnale DAPI. Per tale analisi, la visualizzazione delle immagini unite in tre dimensioni è imperativo. Solo macchie di pesce che sono chiaramente associati con il segnale DAPI in tutte e tre le dimensioni dovrebbero essere inclusi nell'analisi.

Sorella intatta coesione cromatidio è evidenziato come due punti di pesce per il braccio e la pericentric sonde (figura 5B, sinistra). Gli ovociti che contengono tre o quattro punti di pesce separati per ogni sonda sono considerati di avere difetti di coesione (figura 5B, destra). Per essere classificato come singoli punti, due segnali di pesce devono essere separati come minimo in tutte le tre dimensioni di una distanza corrispondente al diametro del più piccolo posto. Sottili fili debole collegamento due macchie di pesce non sono infrequenti. Tali segnali non sono considerati completamente separati e pertanto non vengono conteggiati come istanze di difetti di coesione.

Con la sonda di ibridazione del braccio 6E-7B, circa 15-20% degli ovociti imaged completamente difettavano del segnale o il segnale era troppo debole per segnare con fiducia. Inoltre, circa il 5% degli ovociti imaged ha esibito una vasta area di diffusa del segnale cromosomica e questi sono stati scartati dall'analisi. Al contrario, era raro da incontrare gli ovociti per il quale il segnale di ibridazione pericentric è assente o troppo diffuso al punteggio.

La sonda di braccio 6E-7B è stato ampiamente utilizzata per quantificare i difetti di coesione del braccio in prometafase e metafase sono arrestato Drosophila ovociti di differenti genotipi19. Quando la subunità coesina SMC3 è stata abbattuta durante mid-profase, 16,3% degli ovociti maturi analizzati contenuta maggiore di due punti, indicativi della prematura perdita di coesione del braccio del braccio. Al contrario, abbiamo osservato separata braccio macchie in solo il 5,1% degli ovociti che hanno contenuto i livelli normali di SMC319. È interessante notare che, sebbene la frequenza di coesione braccio difetti è stato elevato in più genotipi atterramento, sorella cromatidi raramente sono stati separati nelle loro regioni di pericentric19.

Figure 1
Figura 1: perdita età-dipendente di coesione durante la profase prolungato arresto della meiosi femminile può provocare errori nella segregazione del cromosoma e aneuploidia nell'uovo. Coesione è rappresentato da barre nere tra la sorella cromatidi. Braccio coesione funzioni per tenere insieme gli omologhi ricombinanti ed è richiesto per accurata segregazione all'anafase I. Se braccio coesione è perso prematuramente, malsegregazione cromosoma può verificarsi, con conseguente un uovo aneuploide. Questa figura è stata adattata da riferimento19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: dimensioni delle molecole del DNA dopo la frammentazione di BAC e amplificazione (a sinistra) e dopo la digestione degli enzimi di limitazione (a destra) per tre diversi BACs. 400 ng di prodotti di DNA amplificati sono mostrati nelle prime tre corsie. Le ultime tre corsie mostrano frammenti di DNA dopo la raccolta di limitazione durante la notte. I prodotti amplificati del DNA vanno da 200 bp fino a 3 kb. Dopo la raccolta di limitazione, maggior parte dei frammenti hanno variati da 100-200 bp, ma frammenti più grandi (fino a 500 bp) erano visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: strumenti di citologia. Strumenti utilizzati nel protocollo: (1) paio di pinze (Dumont n. 5); (2) ago di tungsteno; (3) pozzo profondo piatto con coperchio; (4) vetro poco profonda dissezione piatto; (5) tirato pipetta Pasteur. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Disposizione e movimento di diapositive per il rotolamento ovociti. (A) schema della diapositiva è impostato per rotolamento degli ovociti, come descritto nel protocollo. La zona più scura indica la parte di vetro glassato della diapositiva. (B) in direzione dei vettori di movimento per slide #2 durante ovocita rotolamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. PESCE di analisi risultati. (A) schema raffigura il cromosoma di X di Drosophila e dove le due sonde (6 BACs ogni) del braccio e la sonda di pericentromeric 22 oligonucleotide descritta nel protocollo ibridare. Per semplicità, la sonda 6E-7B è denominata 7B e la sonda 2F - 3C 3 C. (B) immagini rappresentative di risultati FISH (6E-7B sonda) per coesione braccio intatto (braccio due sonda macchie, uno per ogni omologo) e per la coesione braccio perturbato (macchie di tre o quattro braccio sonda). Il DNA è blu, il segnale di sonda di braccio è giallo, e il segnale di sonda pericentric è rosso. Immagini corrispondono alle proiezioni di intensità massima di serie Z dopo il miglioramento di deconvoluzione e contrasto. Barra della scala = 2 µm. Questa figura è stata adattata da riferimento19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'uso di pesce sonde per valutare lo stato di coesione braccio in prometafase io e metafase ho Drosophila ovociti è un progresso significativo nel campo della drosofila meiosi. Storicamente, i ricercatori della Drosophila sono stati limitati a test genetici per dedurre la perdita prematura di coesione braccio in ovociti maturi11,18,19. Ora, con i metodi qui presentati, lo stato di coesione del braccio può essere analizzato usando direttamente i pesci. La capacità di ottenere prove fisiche per la prematura perdita di coesione braccio notevolmente amplia il repertorio degli approcci disponibili per studiare i meccanismi che portano alla perdita prematura di malsegregazione di coesione e del cromosoma di braccio in ovociti di Drosophila .

Fasi critiche
Anche se non abbiamo effettuato un'analisi sistematica dei parametri critici necessari per la visualizzazione di successo di una sonda fluorescente che ibridizza con sequenze di copia singola lungo il braccio del cromosoma in ovociti maturi di Drosophila , offriamo la seguente elenco di fattori che possono aver contribuito al successo di questa tecnica. Per generare la sonda di braccio, abbiamo usato una combinazione di sei sovrapposizione sonde BAC che coprono un intervallo di circa 0,8 Mb sulla X-braccio del cromosoma. I nostri tentativi iniziali utilizzando meno BACs che attraversava una regione più piccola non ebbero successo. Inoltre, abbiamo utilizzato un metodo di frammentare e amplificare il DNA di BAC prima d'etichettatura con Alexa-647. La maggior parte dei frammenti di restrizione che sono stati etichettati era 100-200 bp lungo (Figura 2), che ben si accorda con le dimensioni di destinazione di 150 nucleotidi che è necessaria per la diffusione efficiente attraverso tessuti spessi21. Condizioni di fissazione che conservano la morfologia dell'ovocita Drosophila grande ma anche consentono la penetrazione della sonda sono essenziali. Abbiamo modificato il nostro metodo di fissazione utilizzato in precedenza23 aggiungendo eptano temperatura ambiente ad una soluzione di correzione preriscaldata a 37 ° C. Riteniamo che sia possibile che sia l'aggiunta di eptano per aumentare la penetrazione attraverso la membrana vitellina, nonché la temperatura abbassata per fissazione contribuito alla condizioni di successo di fissazione per la visualizzazione di coesione di braccio.

Quando analizzando per la perdita prematura di coesione, uno richiede una dimensione di esempio che consente la quantificazione dei difetti che sono presenti a livelli moderati-basse. Per ottenere un numero elevato di ovociti maturi, altri hanno utilizzato rottura frullatore di femmine adulte combinato con setacciatura 26,27. Qui descriviamo un metodo a portata di mano sezionare le ovaie da 20-25 femmine, con separazione manuale del tardo stadio ovociti di pipettaggio. Mentre il frullatore/setacciatura metodo dovrebbe funzionare anche con questo protocollo, uno dei vantaggi di dissezione di mano è che senza il passaggio di setacciamento, ovociti trascorrere meno tempo nel buffer prima della fissazione, che riduce la possibilità di anafase I inizio dovuto artificiale dell'uovo attivazione. Inoltre, questo metodo richiede meno femmine come materiale di partenza, utilizza più piccoli volumi dei reagenti e ha un flusso di lavoro più semplice, i quali facilitare l'elaborazione più genotipi.

Separazione di dissezione e manuale di mano di ovociti maturi fornisce una quantità sufficiente di ovociti di "roll" per la rimozione della membrana corion e vitellina e si traduce in circa il 75-150 ovociti alla fine dell'ibridazione. Un trucco per massimizzare la resa di metafase sono arrestato ovociti è quello di tenere le femmine vergini in flaconcini lievitati in assenza di maschi prima di dissezione25. Ovocita rotolamento per rimuovere chorions e membrane vitellina dovrà avvenire con un tocco delicato al fine di evitare di distruggere gli ovociti. Tuttavia, la rimozione di chorions e membrane vitellina dal 100% degli ovociti non è un obiettivo realistico e rotolamento eccessivo solo si traduce in perdita di ovociti. Di conseguenza, ogni ciclo di rotolamento deve essere interrotto quando circa il 75-85% di ovociti mancanza chorions e membrana vitellina.

Limitazioni
Nonostante il nostro successo a generazione e l'utilizzo di sonde di braccio per monitorare lo stato di coesione in ovociti maturi di Drosophila , la procedura si soffre ancora di limitazioni. Mentre raramente non siamo riusciti a rilevare un segnale per la sonda pericentromeric, il segnale di sonda braccio era debole o assente in circa 15-20% degli ovociti che abbiamo ripreso. Un fattore che contribuisce può essere differenziale penetrazione della sonda oligonucleotide pericentric (22-28 nucleotidi) contro la più grande sonda di braccio (100-200 nucleotidi). Inoltre, la grande sequenza ripetitiva riconosciuta tramite i risultati della sonda di pericentric in un segnale che è più luminoso di quello per la sonda di braccio. L'orientamento della ovocita e il posizionamento dei cromosomi meiotici entro l'ovocita presentano anche una sfida quando imaging. Anche se i cromosomi meiotici sono relativamente vicini alla corteccia di cella, è Impossibile controllare l'orientamento dell'ovocita durante il montaggio il coprivetrino. Pertanto, in alcune frazioni di ovociti, i cromosomi meiotici possono essere 100-200 µm dal vetrino coprioggetto e l'intensità del segnale e qualità potrebbe risentirne negativamente quando cercando di immagini attraverso la maggior parte dell'ovocita. Queste limitazioni significano che il numero di ovociti incluso nell'analisi quantitativa finale è considerevolmente inferiore rispetto al numero di ovociti trattati nel protocollo. Determinazione dello stato di coesione braccio in 100 ovociti richiederà probabilmente due preparazioni indipendente. Un ulteriore fattore limitante nel quantificare i difetti di coesione utilizzando un microscopio confocale di scansione laser è il tempo necessario per acquisire una tipica serie Z (circa 5 min), anche quando l'area acquisita è limitata a 1.024 x 512 pixel. Questo significa che confronto della coesione in controllo e sperimentali genotipi (100 ovociti ogni) richiederà circa 16 h di tempo di raccolta di immagini.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
Siamo stati in grado di monitorare lo stato di coesione braccio usando una sonda che riconosce il cromosoma di X citologico posizione 6E-7B19. Una sonda che ibridizza con una posizione più distale del cromosoma X può essere più desiderabile per rilevare il fallimento della manutenzione del chiasma. Inoltre, altri ricercatori potrebbero voler analizzare braccio coesione su altri cromosomi. Mentre non abbiamo tentato di sondare gli autosomi, i dati preliminari indicano che una sonda che riconosce anche la regione di 2F - 3C del cromosoma X si traduce in un segnale rilevabile. Tuttavia, basato su dati preliminari limitati, il segnale della sonda 2F - 3C potrebbe essere meno "compatto" rispetto a quella per la sonda di 6E-7B. Anche se i segnali di pesce sono stretti e croccante per alcuni cromosomi degli ovociti, il segnale di ibridazione sui cromosomi di altri ovociti è notevolmente più diffuso. Se queste differenze di segnale riflettono differenze genuine nella morfologia di cromosoma tra le due posizioni citologiche, variabilità dell'efficienza di ibridazione delle due sonde, o appena stocastica variabilità tra diversi ovociti richiedono un'analisi più approfondita.

Cosa importante, anche per la sonda di 6E-7B, abbiamo osservato un segnale cromosomico diffuso in alcuni ovociti, e questo spesso reso necessario la loro esclusione dall'analisi. Inoltre, abbiamo notato variazione nella qualità del segnale e la luminosità tra diverse preparazioni della sonda 6E-7B e questo ha richiesto che la formazione immagine parametri adeguati di conseguenza. Innalzamento della temperatura di ibridazione a 42 ° C non ha ridotto il numero di ovociti con diffusa del segnale, ma influire in modo significativo il segnale per la sonda di oligonucleotide pericentric. Nel tentativo di preservare meglio di morfologia del cromosoma24, abbiamo anche provato un passo più lungo di denaturazione ad una temperatura inferiore (80 ° C), ma trovato che questo trattamento non ha aumentato l'intensità del segnale, né ha ridotto il numero di ovociti con diffusa cromosomiche pesce segnale. Abbiamo anche tentato di ottenere un segnale luminoso di braccio utilizzando 12 BACs sovrapposti, corrispondente a un intervallo di circa 1,5 Mb che attraversava la regione citologico 5E-7B. Quando si utilizza una sonda BAC 12, il grado di variazione nell'intensità del segnale, così come la percentuale di ovociti manca segnale non era diversa rispetto a quando sei BACs furono usati per fare la sonda di braccio. E ' stato anche più impegnativo di segnare per coesione difetti quando si utilizza la sonda BAC 12 perché i segnali di pesce erano più grandi, rendendo più difficile risolvere i punti corrispondenti ai singoli cromatidi. Nei casi in cui nessun segnale è ottenuto con una sonda appena preparata, i ricercatori dovrebbero controllare le dimensioni dell'amplificato e digerito di restrizione del DNA di BAC per confermare che i frammenti utilizzati per l'etichettatura di fine sono principalmente all'interno della gamma di bp di 100-200. Questo rischia di essere uno dei fattori più critici nella preparazione della sonda successo.

Direzioni future
Lavoro futuro per migliorare l'acquisizione delle immagini, così come adattare il protocollo per includere immunostaining sarebbe importanti miglioramenti che potrebbero trarre vantaggio altri ricercatori. Durante la raccolta di immagini, raccogliendo un numero maggiore di immagini in dimensione assiale, nonché di acquisizione di immagini più veloce sarebbe vantaggioso per quantificare i difetti di coesione. Ottimizzare i parametri di imaging per la scansione confocale laser, abbiamo trovato che segnali di 0.25 µm era il più piccolo passo che potrebbe essere utilizzato per la serie Z per evitare apprezzabile sbiancamento dei pesci. Tuttavia, per i segnali di pesce che sono separati da meno di 0.25 µm nello stack Z, questa dimensione di passaggio può provocare la mancata cattura lo "spazio" tra i fuochi e pertanto può sottostimare il numero di difetti di coesione. La velocità di acquisizione di immagine più veloce di un disco che gira confocale può consentire dimensioni inferiori di passaggio utilizzabile senza segnale candeggio. Questo sarebbe fornire più accurata ricostruzione dell'immagine nella dimensione assiale, nonché permettere più grande numero di ovociti da analizzare per i difetti di coesione. In più, la capacità di combinare immunostaining con visualizzazione di pesce dello stato di coesione braccio aumenterebbe significativamente il protocollo. Per un certo numero di preparati, abbiamo cercato di eseguire mandrino immunostaining seguendo la procedura di ibridazione. Tuttavia, robusto mandrino macchiatura era visibile solo una piccola frazione degli ovociti. Inoltre, per ragioni che non sono chiare, i livelli elevati di segnali spuri pesce circondato i cromosomi meiotici quando pesce e immunostaining sono stati combinati. Ulteriore lavoro per ottimizzare il protocollo per consentire immunostaining prima o dopo la procedura di pesce sarebbe espandere notevolmente la capacità di questa tecnica.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant GM59354 assegnato a Sharon E. Bickel. Ringraziamo Huy d. Nguyen per assistenza nello sviluppo del protocollo per la generazione di sonde fluorescenti braccio, Ann Lavanway per aiuto con microscopia confocale e J. Emiliano Reed per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche numerosi colleghi nella comunità della drosofila per utili discussioni e consigli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

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References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

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Biologia dello sviluppo problema 130 Drosophila meiosi ovocita sorella cromatidio della coesione la coesione di braccio ibridazione in situ di fluorescenza (pesce)
Mediante ibridazione <em>In Situ</em> di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di <em>Drosophila</em>
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Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

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