Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Abstract

Bij de mens zijn chromosoom segregatie fouten in eicellen verantwoordelijk voor de meeste miskramen en aangeboren afwijkingen. Bovendien, als vrouwen ouder, staat hun risico van concipiëren dat een aneuploid foetus stijgt dramatisch en dit verschijnsel bekend als de maternale leeftijd effect. Een van de vereisten voor nauwkeurige chromosoom segregatie tijdens de Meiotische divisies is onderhoud van zuster chromatide cohesie in de uitgebreide profase periode dat eicellen ervaring. Cytologische aanwijzingen bij zowel mensen als modelorganismen dat Meiotische cohesie tijdens het verouderingsproces verslechtert. Daarnaast segregatie fouten in menselijke eicellen zijn meest voorkomende tijdens de meiose I, consistent met de voortijdige verlies van samenhang van de arm. Het gebruik van modelorganismen is essentieel voor het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de leeftijd afhankelijk verlies van samenhang. Drosophila melanogaster biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van de verordening van Meiotische samenhang in de eicellen. Echter tot voor kort waren alleen genetische tests beschikbaar voor assay voor het verlies van samenhang van de arm in eicellen van verschillende genotypen of onder verschillende experimentele omstandigheden. Hier is een gedetailleerde protocol is voorwaarde voor het gebruik van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) direct visualiseren gebreken in arm cohesie in prometaphase ik en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Door het genereren van een sonde van de vis die hybridizes op de distale arm van het X -chromosoom en het verzamelen van de confocal Z stapels, een onderzoeker kan visualiseren het aantal individuele vis signalen in drie dimensies en bepalen of zuster chromatide armen zijn gescheiden. De procedure maakt het mogelijk te kwantificeren arm cohesie gebreken in honderden Drosophila eicellen. Deze methode is als zodanig een belangrijk instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die bijdragen tot cohesie onderhoud, alsmede de factoren die tot zijn nalating tijdens het verouderingsproces leiden.

Introduction

Juiste segregatie van chromosomen tijdens de mitose en meiose vereist dat zuster chromatide cohesie worden vastgesteld, onderhouden en uitgebracht in een gecoördineerde wijze1,2. Cohesie is opgericht tijdens de S-fase en is bemiddeld door het cohesin complex, die vormen van fysieke verbanden die houden van de zuster chromatiden samen. In meiose, cohesie distale naar een crossover ook functies om recombinante homologen bij elkaar te houden en deze fysieke vereniging helpt ervoor te zorgen de juiste stand van het tweewaardig op de metafase ik spindel (Figuur 1)3,4, 5. Release van arm samenhang op anafase ik kunt het homologen te scheiden naar tegenovergestelde Polen van de spindel. Als echter arm cohesie is voortijdig, verloren recombinante homologen zal verliezen hun fysieke verbinding en scheiden willekeurig, hetgeen kan leiden tot aneuploid gameten (Figuur 1).

In menselijke eicellen, fouten in chromosoom segregatie zijn de belangrijkste oorzaak van miskramen en aangeboren afwijkingen, zoals Down syndroom6, en de frequentie ervan exponentieel toeneemt met maternale leeftijd7. Zuster chromatide cohesie is opgericht in de foetale oöcyten en Meiotische recombinatie is voltooid vóór de geboorte. Eicellen dan arresteren in Mid profase ik tot ovulatie en tijdens deze arrestatie, de aanhoudende fysieke vereniging van recombinante homologen afhankelijk van zuster chromatide cohesie. Daarom vereisen nauwkeurige segregatie tijdens meiose en normale zwangerschap resultaten dat cohesie voor maximaal vijf decennia intact blijven.

Voortijdige verlies van samenhang tijdens de langdurige Meiotische arrestatie van menselijke eicellen heeft voorgesteld om bij te dragen aan het effect van de maternale leeftijd en meerdere tekstregels bewijs ondersteunen deze hypothese8,9. Echter, gezien de uitdagingen van het bestuderen van Meiotische cohesie in menselijke eicellen, veel van ons begrip van dit verschijnsel is afhankelijk van het gebruik van model organismen5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster eicellen bieden tal van voordelen voor de studie van Meiotische cohesie en chromosoom segregatie. Een eenvoudige genetische bepaling maakt het mogelijk om te herstellen van de nakomelingen van aneuploid gameten en meten van de betrouwbaarheid van X-chromosoom segregatie op een grote schaal11,16,17. Bovendien kan men ook bepalen of chromosoom segregatie fouten ontstaan omdat de recombinante homologen missegregate tijdens de meiose I, een fenotype die strookt met de voortijdige verlies van arm cohesie11,18, 19. Directe observatie van de Braziliaanse deelstaat Meiotische cohesie in Drosophila eicellen is ook mogelijk met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Hoewel fluorescerende oligonucleotides die aan repetitieve satelliet sequenties kruisen zijn gebruikt voor meer dan een decennium te controleren pericentromeric cohesie in volwassen Drosophila eicellen4,20, analyse van de arm cohesie is veel uitdagender. Visualisatie van de toestand van arm cohesie vereist een sonde die een groot gebied van één exemplaar beslaat sequenties en is helder genoeg om te resulteren in zichtbare signalen voor individuele zuster chromatiden wanneer arm cohesie afwezig is. Bovendien, moeten de oöcyt fixatie voorwaarden en de grootte van de gelabelde Ani vergemakkelijken penetratie21 in de grote volwassen Drosophila oöcyt (200 µm breed door 500 µm lang). Onlangs, een arm sonde werd met succes gebruikt om te visualiseren van Drosophila oöcyt chromatiden tijdens anafase ik, maar de auteurs verklaard dat zij niet een signaal in prometaphase detecteren kon of metafase ik eicellen22gearresteerd. Hier voorzien wij een gedetailleerd protocol voor de generatie van de X-chromosoom arm vis sondes en oöcyt voorbereiding voorwaarden die hebben ons toegelaten om te assay voor het voortijdige verlies van zuster chromatide cohesie in prometaphase ik en metafase ik eicellen. Deze technieken, waardoor ons te identificeren genproducten die vereist voor het behoud van Meiotische cohesie zijn, zal toestaan dat anderen te assay voor zuster chromatide cohesie gebreken in volwassen Drosophila eicellen van verschillende genotypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Oplossingen voor te bereiden voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Alle oplossingen met behulp van ultrazuiver water voor te bereiden.
    1. 5 x bewerkt Robb buffer bereiden: 275 mM Kaliumacetaat Natriumacetaat 200 mM, 500 mM sacharose, 50 mM glucose, 6 mM magnesiumchloride, calciumchloride 5 mM, 500 mM HEPES pH = 7.4. Breng de pH aan met behulp van 10 N NaOH 7.4. Filter steriliseren en opgeslagen bij-20 ° C. Ontdooien en Verdun tot 1 x zo nodig en op te slaan van 1 x aliquots bij-20 ° C.
    2. 10 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van 1.3 M NaCl, 70 mM nb2HPO4, 30 mM NaH2PO4voor te bereiden. 7.0 met behulp van 10 N NaOH brengen pH. Steriliseren in autoclaaf of filter sterilisatie.
  2. Bereiden van poly-L-Lysine coverslips een dag voordat nodig.
    1. Pipetteer 70% ethanol met 1%-zoutzuur op het oppervlak van een dekglaasje aan van 18 x 18 mm #1.5 en 5 min. gebruik vacuüm aspiratie om vloeistof uit te broeden. Herhaal met steriele ultrazuiver water. Dekking oppervlakte van dekglaasje aan met 0,1 mg/mL poly-L-lysine en incubeer gedurende 10 min.
    2. Gecombineerd om vloeistof afzuigen en droog zijn voor 10 min. winkel coverslips poly-L-lysine kant naar boven in een plastic container met een deksel strak om te voorkomen dat de stof lucht.
  3. Bereiden getrokken Pasteur pipetten vloeibare oplossingen verwijderen zonder het verwijderen van de eicellen. Verwarm in een vlam Bunsenbrander, het midden van een lange glazen pipet van Pasteur terwijl zachtjes trekken op elk uiteinde totdat het glas smelt en uit elkaar trekt.

2. productie van Arm sonde voor vis

Opmerking: Alle stappen van de centrifuge op ~ 16.000-21.000 x g (maximumsnelheid op meeste tafelblad microcentrifuges) worden uitgevoerd. Korte centrifuge draaiingen geven spinnen voor 5-15 s. Vortex vortexing voor ~ 15 geeft s bij max snelheid tenzij anders vermeld.

Opmerking: BACs voor arm sondes kunnen worden verkregen uit BAC PAC middelen. Met deze methode zijn twee X chromosoom euchromatique arm sondes met succes gebruikt. Een arm sonde werd gecomponeerd voor zes BAC klonen overeenkomt om cytologische bands 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). De andere arm sonde bestond uit zes BAC klonen overeenkomt aan cytologische bands 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs aan andere Drosophila chromosoom regio's kunnen worden gebladerd op: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Met deze methode zijn twee pericentric-sondes die de 359 bp satelliet herhaling van het X -chromosoom herkent met succes gebruikt. Een 22 nucleotide sonde heeft veelvuldig gebruikt en werkt goed (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Een sonde 28 nucleotide is onlangs getest en werkte ook goed (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC),24. HPLC gezuiverd oligonucleotides 5' gemarkeerd met een specifieke fluorophore werden besteld uit een commerciële bron (bijvoorbeeldgeïntegreerde DNA-technologieën).

  1. Prep BAC kloon DNA kit instructies zoals aangegeven in de Tabel van materialen. Resuspendeer de pellet van de DNA verkregen uit 100 mL van de cultuur in 200 µL TE; de eindconcentratie van DNA moet variëren tussen 5-40 ng/µL afhankelijk van de BAC-kloon.
  2. Versterking van DNA voor elke BAC met behulp van de amplificatie kit, zoals aangegeven in de tabel van materialen, en het volgende protocol uitvoeren. Verwerken BAC DNA individueel voor elke kloon. Het gebruik van enzymen en buffers geleverd met de kit in stappen 2.2.1 via 2.2.3.
    1. Willekeurige versnippering van BAC DNA: voor elke BAC, TE gebruiken om te bereiden 10 µL van een 1 ng/µL DNA oplossing in een buis van 200 µL PCR. Voeg 1 µL van 10 X fragmentatie Buffer. Plaats de buis in een PCR machine bij 95 ° C gedurende precies 4 min. onmiddellijk koel het monster in ijswater en kort centrifugeren. De incubatietijd is tijdgevoelig en elke afwijking resultaten kan wijzigen.
    2. Voorbereiding van de bibliotheek
      Opmerking: Deze methode maakt gebruik van willekeurige inleidingen voor het genereren van een bibliotheek van amplifiable fragmenten.
      1. Aan de buis die het DNA bevat de volgende toevoegen: 2 µL 1 x bibliotheek voorbereiding Buffer, 1 µL van bibliotheek stabilisatie oplossing. Meng door vortexing, kort, centrifugeren en plaats de buis in de PCR-machine bij 95 ° C gedurende 2 min. onmiddellijk koel het monster in ijswater en kort centrifugeren.
      2. Voeg 1 µL van bibliotheek voorbereiding enzym kort toe aan de PCR buis, de mix en de centrifuge. Plaats PCR tube in de PCR-machine en incubeer als volgt: 16 ° C gedurende 20 min, 24 ° C gedurende 20 minuten, 37 ° C gedurende 20 minuten, 75 ° C gedurende 5 min, houd vervolgens bij 4 ° C.
      3. Verwijder monsters uit de PCR-machine en kort centrifugeren. Monsters kunnen worden versterkt onmiddellijk of opgeslagen bij-20 ° C voor maximaal drie dagen.
    3. Versterking van BAC DNA bibliotheek
      1. De volgende reagentia toevoegen aan de gehele 15 µL willekeurig fragment reactie: 7,5 µL 10 x amplificatie Master Mix, 47.5 µL Nuclease gratis Water, 5 µL WGA Polymerase van DNA. Meng door vortexing en kort centrifugeren.
      2. Plaats PCR tube in de PCR-machine en incubeer als volgt: eerste denaturatie 95 ° C gedurende 3 min, 14 cycli van denaturatie bij 94 ° C voor 15 s, gevolgd door gloeien/extensie bij 65 ° C gedurende 5 min, houd vervolgens bij 4 ° C.
      3. Na het fietsen is voltooid, assay de DNA-concentratie. De concentratie van DNA moet ten minste 800 ng / µL. Houd monsters bij 4 ° C of opslag bij-20 ° C tot klaar voor de spijsvertering. Optioneel, het beoordelen van DNA fragment grootte door het uitvoeren van 400 ng van DNA op een 2% agarose gel. Fragmenten moeten variëren van 200 bp tot 3 kb (Figuur 2).
  3. Restrictie-enzym vertering van versterkte DNA
    1. Plaats 20 µg versterkte DNA uit het vorige onderdeel in een 1,5 mL microfuge buis. Voeg 20 eenheden van Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, BfuCl, 0,5 µL 100 x BSA, 5 µL 10 x restrictie-enzym spijsvertering buffer-25 eenheden, en draai volume om 50 µL door toevoeging van de juiste hoeveelheid ultrazuiver H2O.
    2. Incubeer de digest's nachts bij 37 ° C in een broedstoof om condensatie op het deksel te voorkomen. Ethanol neerslag het verteerd DNA. Toevoegen aan de digest: 1 µL glycogeen, 1/10 volume 3M Natriumacetaat, 2.5 volumes moleculaire grade 100% ethanol. Incubeer bij-80 ° C gedurende 1 uur of 's nachts.
    3. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Wassen DNA pellet met 1 deel kamer temp 70% ethanol en spin voor 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en laat van het DNA pellet droge lucht of zachtjes droog met een gestage stroom van lucht.
    4. Resuspendeer de pellet DNA in 36 µL steriele ultrazuiver H2O en gebruik 1 µL van DNA om te assay de DNA-concentratie, die ongeveer 285 moet ng / µL. Bewaar het DNA bij-20 ° C.
    5. Optioneel beoordelen DNA fragment grootte met 400 ng van DNA op een 2% agarose gel. Meeste fragmenten moeten variëren van 100-200-bp, met een zwakker signaal tot 500 bp (Figuur 2).
  4. 3' residuvijvers reactie
    1. Het denatureren van de verteerd DNA bij 100 ° C gedurende 1 min. in een blok van de warmte. Onmiddellijk chill in ijswater. Aan de 35 µL van DNA, voeg het volgende toe: 50 µL 400 mM natrium cacodylate 1 µL van 10 mM DTT en vortex goed. Voeg 4 µL 25 mM-CoCl2, 2,5 µL 2 mM 5.-(3-aminoallyl)-dUTP van ARES labeling kit als omschreven in de tabel van materialen, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL 5 x TdT buffer, en 1 µL terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U / µL. Vortex en centrifuge kort.
      Let op: De CoCl2 is giftig, adequate bescherming dragen.
    2. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een broedstoof om condensatie te voorkomen. Voeg 1 µL van 250 mM EDTA om te stoppen met de reactie en de vortex kort te mengen. Ethanol precipiteren de staart DNA zoals hierboven (stappen 2.3.2 - 2.3.4) beschreven. Resuspendeer de gedroogde DNA pellet in 10 µL steriele ultrazuiver H2O. winkel het DNA bij-20 ° C tot klaar om door te gaan.
  5. Het gedrag van fluorescente kleurstof conjugatie met behulp van het DNA labeling kit zoals aangegeven in de tabel van de materialen.
    Opmerking: Zodra kleurstof wordt toegevoegd monsters in het donker houden.
    1. Het denatureren van de staart DNA bij 95 ° C gedurende 5 minuten in een blok van de warmte. Onmiddellijk koel DNA in ijswater en centrifuge kort. Bereiden van labeling buffer volgens de instructies van de kit en 6 µL toevoegen aan elk DNA-monster. Resuspendeer elke buis van kleurstof in 4 µL van DMSO uit de kit. Vortex en centrifuge kort.
    2. Gebruik één tube van kleurstof voor elke labeling reactie. De kleurstof oplossing kort aan het DNA, vortex en centrifuge toevoegen. Incubeer de labeling reactie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker. Voeg 3 µL van 3M hydroxylamine om te stoppen met de reactie gevolgd door 77 µL van de nuclease-vrije H2O uit de kit. Vortex en centrifuge kort.
  6. Verwijder niet-geconjugeerde kleurstof met behulp van de PCR zuivering kit zoals aangegeven in de tabel van materialen. Volg de instructies van de fabrikant. Elueer DNA uit de kolom twee keer met 40 µL van elutie buffer telkens.
  7. Ethanol neerslag het gelabelde DNA zoals eerder beschreven (stappen 2.3.2 - 2.3.4). Resuspendeer de pellet DNA gedroogde in 10 µL elutie buffer.
  8. Sonde mengsel te bereiden
    1. Bepaal de concentratie van de fluorescerende kleurstof in pmol/µL voor gelabelde DNA. De concentratie van de fluorophore kan variëren van 30-100 pmol/µL, afhankelijk van de BAC. De DNA-concentratie kan variëren van 300-800 ng/µL.
      Opmerking: De instelling van microarray werkt goed op een microvolume spectrofotometer, zoals opgegeven in de tabel van materialen. In het venster microarray DNA-50 selecteren en geef de fluorescerende.
    2. Maak een master mix door het combineren van mengsel bedragen (pmol fluor) van elk van de BAC-sondes. Vortex 30 s voordat combineren. Om te voorkomen dat de vorst/dooi cycli, bereiden aliquots van de master mix, paraffine film van toepassing op de buizen te voorkomen van verdamping, en op te slaan in het donker bij-20 ° C.
      Opmerking: Een mastermix met 250 pmol van elk van de 6 individuele BAC sondes in een totaal volume van 30-50 µL werken goed. Een aliquoot gedeelte met 25 pmol (fluor) voor elke BAC zal volstaan voor twee 40 µL hybridisatie reacties, met een concentratie van de uiteindelijke sonde van 0.31 pmol fluor/µL voor elke BAC.

3. dissectie en fixatie van eicellen

  1. Verzamelen 30 volwassen vrouwtjes van de Maagd van de passende genotype. Houden om te verrijken voor late stadium eicellen, vrouwtjes zonder mannetjes in een flesje met vliegen eten en droge gist voor 3-5 dagen vóór de dissectie25. Eergisteren dissectie, de vrouwtjes zonder gas overbrengen in een verse flacon met gist.
  2. De dissectie uitvoeren
    Opmerking: Zie Figuur 3 voor de hulpmiddelen die nodig zijn. Oplossingen worden verwijderd met behulp van een getrokken Pipet van Pasteur, tenzij anders vermeld. Bij het overbrengen van eierstokken altijd bekleed gebruik een pipet tip met een 10% BSA oplossing.
    1. In een ondiepe ontleden schotel met bewerkt Robb buffer, gebruik pincet voor het verwijderen van de eierstokken van een enkele vrouw. Gebruik pincet of een naald wolfraam zachtjes splay iedere eierstok, waardoor de oplossing voor het contacteren van innerlijke ovarioles. Het paar van gespreide eierstokken overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis met 1 mL gemodificeerde Robb buffer.
    2. Herhaal stap 3.2.1 te accumuleren eierstokken van 20-25 koeien in de 1,5 mL microfuge buis. Afwerking ontledingen van de vrouwtjes van de 20-25 binnen 10 min.
  3. Fixatie als volgt uitvoeren.
    1. Met een getrokken Pipet van Pasteur, verwijder de vloeistof in de microfuge buis, een P1000 gebruik snel toevoegen van 500 µL van 37 ° C-fix-oplossing aan de eierstokken en vervolgens onmiddellijk vergroten met 500 µL van kamertemperatuur heptaan de eierstokken.
    2. Shake microfuge buis te mengen en plaats op een nutator voor 3 min. de microfuge buis uit de nutator en de plaats in een buis rek voor 1 min om de eicellen te vestigen aan de onderkant verwijderen. De totale fixatie tijd is 4 min.
      Let op: Fix oplossing en heptaan zijn giftig, adequate bescherming dragen.
    3. De fix-oplossing verwijderen en spoel de eierstokken 3 keer in 500 µL van PBS met 0,5% BSA en 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Herhaal voor resterende genotypen.

4. de verwijdering van Chorions en Vitelline vliezen

Opmerking: Zie Figuur 3 voor de hulpmiddelen die nodig zijn.

  1. Aparte laat stadium eicellen
    1. 1 mL PBSBTx toevoegen aan een ondiepe ontleden schotel. Gebruik een P200 met een gecoate tip van BSA vaste eierstokken (in ~ 150 µL) overbrengen naar de ondiepe schotel. Pipetteer eierstokken omhoog en omlaag met de BSA gecoate Pipetteer tip te verjagen van de rijpe eicellen van de minder rijpe eicellen.
    2. Wanneer laat stadium eicellen voldoende gescheiden zijn, overbrengen in alle het weefsel een 500 µL microfuge buis. Verwijderen van de overtollige vloeistof met een getrokken Pipet van Pasteur, verlaten over 150-200 µL in de buis. Herhaal punt 4.1 voor resterende genotypen.
  2. Voorbereiden voor rollen
    1. Vooraf NAT een diep goed schotel met 200 µL PBSBTx. Cover en zet opzij. 3 matglas dia's en set dia #3 opzij te verkrijgen. Wrijf zachtjes de matglas regio's van de dia's #1 en #2 samen. Spoel ze af in gedeïoniseerd water te verwijderen elke glasscherven en drogen met een disposable doekje.
    2. Coat de berijpte regio's van de dia's #1 en #2 met PBSBTx door 50 µL van PBSBTx aan een dia toe te voegen en deze regio met de andere dia te wrijven. Vloeistof met een disposable doekje te verwijderen.
    3. Plaats de dia's onder een Microscoop ontleden in de configuratie wordt weergegeven in figuur 4A. Blijven de berijpte regio's van de dia's #1 en #2 in contact, met dia #3 steunen dia #2.
  3. Roll eicellen; Zorg ervoor dat de richting van de rollen altijd in een rechte lijn en nooit een cirkelbeweging.
    1. Prewet een P200 pipette uiteinde in PBSBTx en verspreiden van de eicellen in de microfuge buis door pipetteren omhoog en omlaag. Breng 50 µL van vloeibare met eicellen naar het midden van het matglas deel van dia #1. Til dia #2 om dit te doen.
    2. Langzaam lager dia #2 totdat de oppervlaktespanning van de vloeistof zorgt voor een afdichting tussen de twee regio's van de matglas. Moet er voldoende vloeistof om de berijpte gebied bestrijken maar geen moet worden sijpelt uit. Als vloeistof is vol, gebruikt u een getrokken Pipet van Pasteur te verwijderen van de overtollige vloeistof.
    3. De onderkant dia (#1) op zijn plaats met één hand te houden en anderzijds met de bovenste dia (#2) heen en weer bewegen in horizontale richting, houden van dia #2 niveau en ondersteunde op dia #3. Uitvoeren onder een Microscoop voor eenvoudige visualisatie van de bewegingen van de oöcyt en vooruitgang.
      Opmerking: Deze beweging zal genereren van wrijving en veroorzaken de eicellen te "rollen" en hun chorions verliezen. Minimale druk moet worden gebruikt en bewegingen moet kort en snel.
    4. Na een paar bewegingen in horizontale richting, iets veranderen de hoek van de beweging (figuur 4B). In meerdere stappen, geleidelijk verhogen deze hoek 90° tot verkeer van de bovenste dia (#2) loodrecht op de startende (figuur 4B). Merk op dat de lege chorions zichtbaar in de vloeistof zijn zal en eicellen ontbreekt chorions langer en dunner verschijnt.
    5. Herhaal de stappen 4.3.3 - 4.3.4 ongeveer 7 - 10 keer de oplossing weer enigszins troebel wordt. Stoppen met rollen als de meerderheid van de eicellen (75-85%) lijken te hebben verloren hun vitelline membranen.
      Opmerking: Een onderscheidende puntige einde is vaak zichtbaar op eicellen ontbreekt vitelline membranen. Vitelline membranen zijn moeilijker te verwijderen dan chorions. Lichte druk kan worden toegepast op de bovenste dia (dia #2) terwijl de rollen om verwijdering van vitelline membranen. Probeert te verwijderen van vitelline membranen van alle de eicellen leidt vaak tot vernietiging van andere eicellen.
    6. Til voorzichtig de bovenste dia (#2), een van de hoeken te slepen naar het midden van de berijpte regio van de bodem dia (#1) zodat gerold eicellen ophopen in het midden van de berijpte regio. Spoel eicellen uit beide dia's met PBSBTx in de diep goed schotel met PBSBTx.
    7. Dia's #1 en #2 met ultrazuiver water, droog met een disposable doekje, reinigen en opnieuw ingesteld. Herhaal stap 4.3.1 - 4.3.6 totdat alle eicellen dezelfde genotype hebben uitgerold. Dit vereist meestal 3-4 rondes van rollend per genotype.
  4. Verwijderen van puin na het walsen
    1. 1 mL PBSBTx aan een conische tube van 15 mL toevoegen. Swirl de vloeistof om de jas van de zijden van de buis.
    2. Met behulp van een PBSBTx gecoat P1000 pipette uiteinde, overdracht de warmgewalste eicellen uit het diepe schotel goed aan de conische buis met 1 mL PBSBTx. toevoegen een extra 2 mL van PBSBTx aan de conische buis met de eicellen.
    3. Laat de eicellen beginnen te regelen naar de bodem, verwijder dan de top 2 mL oplossing met puin (chorions, vitellines, enz.) met een P1000 en negeren. Indien nodig, houd de conische buis tegen een donkere achtergrond te zien van de ondoorzichtige eicellen als ze zinken.
    4. Toevoegen van een extra 2 mL van PBSBTx aan de eicellen, en herhaalt u stap 4.4.3. 4.4.3 herhalen voor een totaal van 3 rondes van puin verwijderen.
    5. Met behulp van een PBSBTx gecoat P1000 pipette uiteinde, overdracht eicellen terug naar de oorspronkelijke 500 µL microfuge buis. 20 - 25 vrouwen moeten ongeveer 50 µL van warmgewalste rijpe eicellen opleveren.
  5. Herhaal punt 4 voor de resterende genotypen gebruik van verse berijpte glijbanen, een schoon diep goed schotel, en een nieuwe conische buis voor elk genotype.
  6. Als opslag nodig is, brengen eicellen naar 1 x PBS met 0,1% TritionX-100 en winkel overnacht bij 4 ° C. Langdurige opslag wordt niet aanbevolen omdat formaldehyde crosslinking kan worden teruggedraaid door de niet-ionogene detergentia.

5. VISSEN

Opmerking: Alle wasbeurten worden uitgevoerd op een nutator bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Eicellen die hebben uitgerold duren langer om te regelen naar de onderkant van de microfuge buis, met name in oplossingen die formamide bevatten. Het is belangrijk om geduldig bij het wisselen van oplossingen, zodat de eicellen niet verloren in het proces. Hiervoor kunnen 5-15 min wachten te laten eicellen regelen na gespoeld en wast. Merk ook op dat eicellen in formamide minder dekkend zijn.

  1. Extractie en RNAse behandeling
    1. Spoel van eicellen met 500 µL van PBS, met 1% Triton X-100 (PBSTx). Verwijder de vloeistof en voeg 500 µL extractie Buffer (PBSTx met RNAse). Incubeer op nutator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  2. Pre kruising wasbeurten
    1. Spoel eicellen 3 keer met 500 µL 2 x Saline Natriumcitraat met tween-20 (SSCT). Verwarm een aliquoot gedeelte (~ 500 µL/genotype) van 2 x SSCT + 50% formamide tot 37 ° C.
      Let op: formamide is giftig, adequate bescherming dragen.
    2. Wassen van de eicellen 3 keer voor elke 10 min in 500 µL 2 x SSCT. Wassen eicellen gedurende 10 minuten in 500 µL 2 x SSCT + 20% formamide. Wassen eicellen gedurende 10 minuten in 500 µL 2 x SSCT + 40% formamide. Wassen eicellen gedurende 10 minuten in 500 µL 2 x SSCT + 50% formamide.
    3. Vloeistof afzuigen en voeg 500 µL van 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide van stap 5.2.1 Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C met rotatie te proeven.
      Opmerking: Een kruising oven uitgerust met een rotator werkt goed voor dit. Een schuim microfuge buis "float" gekoppeld aan de rotator kan worden gebruikt om de buizen veilig te stellen.
  3. Denaturatie en kruising
    1. Gebruik voor elke buis van eicellen, 40 µL van 1 x kruising buffer met 2,5 ng/µL centromeric sonde en 0.31 pmol fluor/µL van elke sonde BAC. Bereid een oplossing voor probe in kruising buffer voldoende voor alle de genotypen. Vortex sonde mix 30 s alvorens toe te voegen.
    2. Met behulp van een BSA beklede P200 pipette uiteinde, overbrengen in eicellen een buis van 200 µL PCR. Houden van de monsters bij 37 ° C en laat eicellen regelen naar de bodem, en gebruik vervolgens een getrokken Pipet van Pasteur te verwijderen zo veel vloeistof mogelijk.
    3. Voeg 40 µL hybridisatie oplossing met sonde (bereid in sectie 2) aan de eicellen. Plaats de buis van de PCR met eicellen in de PCR-machine en incubeer als volgt: 37 ° C gedurende 5 minuten, 92 ° C gedurende 3 minuten, dan 37 ° C's nachts. Nadat de sonde wordt toegevoegd aan de eicellen, houd ze in het donker zoveel mogelijk.
  4. Na kruising wasbeurten
    1. Verwarm de 2 x SSCT + 50% formamide tot 37 ° C en bewaar deze in de kruising incubator. Bekleed met een BSA P200 tip Pipetteer 100 µL van 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide toevoegen aan de PCR-buis met de eicellen en de eicellen overbrengen in een nieuwe 500 µL microfuge buis.
    2. Voeg een extra 400 µL van 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide tot dezelfde buis en laat die de eicellen bij 37 ° C in de incubator regelen.
      Opmerking: Vaak afwikkeling duurt langer bij deze stap. Het is niet ongebruikelijk om te nemen 15 min of langer. Een gebrek aan geduld zal resulteren in verlies van eicellen.
    3. Wassen van de eicellen 3 keer voor elke 20 min in 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide bij 37 ° C met rotatie. Eicellen bij 37 ° C houden, terwijl ze zich vestigen.
    4. Het wassen van de eicellen 3 keer voor elke 10 min in 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide bij 37 ° C met rotatie. Eicellen bij 37 ° C houden, terwijl ze zich vestigen.
    5. Wassen bij kamertemperatuur, de eicellen gedurende 10 minuten in 500 µL 2 x SSCT + 40% formamide op een nutator. Het wassen van de eicellen gedurende 10 minuten in 500 µL 2 x SSCT + 20% formamide. Wassen van de eicellen gedurende 10 minuten in 500 µL 2 x SSCT.
  5. Vlek met DAPI
    Let op: De DAPI is giftig, adequate bescherming dragen.
    1. Wassen van de eicellen gedurende 20 minuten in 500 µL DAPI oplossing (1 µg/ml) in 2 x SSCT op de nutator. Spoel de eicellen 3 keer in 500 µL 2 x SSCT. Wassen van de eicellen 2 keer voor elke 10 min in 500 µL 2 x SSCT op de nutator. Monsters kunnen worden opgeslagen voor tot 4 uur bij kamertemperatuur in het donker totdat ze zijn klaar om te monteren op coverslips.
  6. Montage
    Opmerking: Zie Figuur 3 voor de hulpmiddelen die nodig zijn.
    1. Plaats een poly-L-lysine gecoate dekglaasje aan onder de Microscoop ontleden. Vloeistof uit de tube van oöcyten, aanpassing van het totale volume ongeveer 150 µL verwijderen. Bekleed met een BSA P200 pipette uiteinde, Pipetteer omhoog en omlaag worden eicellen in de oplossing, en vervolgens 40 µL van de eicellen/oplossing overbrengen in een poly-L-lysine gecoate dekglaasje aan.
    2. Verwijder enkele van de vloeistof uit het dekglaasje aan met behulp van een getrokken Pipet van Pasteur, totdat de eicellen vasthouden aan het dekglaasje aan maar nog steeds door vloeistof omgeven zijn. Met een tang, houdt u de slip van de cover aan de ene kant en gebruik een wolfraam naald om zachtjes distantiëren bosjes van eicellen, verplaatsen naar één laag van eicellen niet-overlappende bereiken.
    3. Verwijder de rest van de vloeistof rond de eicellen met een getrokken Pipet van Pasteur. Neem een schone glasplaatje en gebruik van samengeperst gas naar het afblazen van stof. Voeg 22 µL media (bijvoorbeeldProlong-GOLD) naar het midden van de dia te monteren. Langzaam lager het afglijden naar het dekglaasje aan, met de montage media geconfronteerd met het monster, totdat de media het monster raakt. Oppervlaktespanning zal leiden tot het dekglaasje aan zich te houden aan de dia.
    4. Plaats de dia's in een plastic container met een strakke deksel met een laag van verse droogmiddel (bijvoorbeeld, drierite). Laat dia's droog zijn voor 3-5 dagen in het donker voor imaging. Droogtijd kan variëren afhankelijk van de vochtigheid van de kamer.

6. imaging

  1. Bij het verwijderen van droge dia's uit het vak van droogmiddel, schone hen als u wilt verwijderen van alle stofdeeltjes. Afdichting coverslips met nagellak. Verzegelde dia's kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij-20 ° C.
  2. Verwerven van laser scannen confocal beelden met behulp van een hoge numerieke diafragma 40 X olie doelstelling met 6 X digitale zoom.
    Nota: in het ideale geval systeemsoftware zal toestaan te zoeken en de X-en Y-locatie van Meiotische chromosomen voor meerdere eicellen markeren terwijl u ze bekijkt met behulp van epifluorescence. Hierdoor bespaart u tijd tijdens een sessie van de beeldvorming. Snelle bleken met een hoge numerieke diafragma 60 X doelstelling gemaakt het gebruik ongeschikt zijn met het gekozen confocal systeem, maar het kan werken voor andere systemen.
  3. Vastleggen van een Z-serie voor elke oöcyt, instellen van de boven- en onderkant van de serie die met behulp van de DAPI-signaal.
    Opmerking: Gain, compensatie, en laser macht zal moeten worden bepaald empirisch met behulp van een subset van eicellen. Zodra geschikt parameters zijn gevonden, moeten alleen kleine aanpassingen worden gemaakt.
    Als gewijzigd overname instellingen zijn verplicht, de eerder verzamelde afbeeldingsstapel gebruiken voor het schatten van de noodzakelijke veranderingen. Om te voorkomen dat bleken, onthouden imaging vooraf de arm sonde voor het vastleggen van de Z-serie. Met een stap grootte van 0,25 µm, Z-serie meestal variëren van 25 tot 30 stappen afhankelijk van de oriëntatie en de plaatsing van de chromosomen. Iemands vermogen om te beoordelen of twee vis plekken worden gescheiden in de axiale dimensie, maar er een trade-off met de benodigde tijd is voor het vangen van kleinere stappen en verlies van signaal intensiteit als gevolg van verbleking, een kleinere stap-grootte kan verbeteren. Een 40 X objectief met 6 X digitale zoom en een 1024 x 512 afbeeldingsveld produceert beelden met een pixelgrootte van 0,05 µm.

7. image analyse en scoren voor cohesie gebreken

  1. De Z-serie voor het optimaliseren van de signaal / ruisverhouding voor elk oöcyt19deconvolve.
    Opmerking: Een softwarepakket zoals opgegeven in de Tabel van de materialen maakt het mogelijk om deconvolve met behulp van integratieve restauratie, evenals bijsnijden en contrast-verbetering van afbeeldingen. Nog belangrijker is, is het noodzakelijk dat een softwarepakket waarmee een view-afbeeldingen en score voor cohesie gebreken in drie dimensies.
  2. Tabulate voor elke oöcyt, het aantal arm en centromeric foci die colocalize met de DAPI-signaal. Verlies van samenhang resulteert in drie of vier afzonderlijke en gescheiden signalen voor een specifieke sonde. Het is niet ongewoon om twee foci die zijn verbonden door een dunne draad observeren. Door de meest strenge criteria, deze foci zou niet worden beschouwd als "gescheiden".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 5 geeft beelden verkregen met een arm-sonde die hybridizes naar cytologische regio 6E-7B op het X -chromosoom. De resultaten van dit onderzoek in een signaal dat samen met die van de DAPI, lokaliseert is gemakkelijk te onderscheiden van de achtergrond, en met succes te kwantificeren arm cohesie defecten in verschillende genotypen19is gebruikt. Kwantificering van cohesie gebreken was beperkt tot prometaphase ik en metafase stadia ik; eicellen voorafgaand aan de nucleaire envelop verdeling werden uitgesloten van analyse19. Een intact nucleaire envelop is duidelijk bij het scannen in de DAPI kanaal omdat de oöcyt chromosomen wordt omringd door een discrete cirkelvormige zone die donkerder is dan de omringende cytoplasma.

Figuur 5B toont maximumlichtsterkte projecties van individuele Z-serie na verbetering deconvolutie en contrast. Kwantificering van cohesie gebreken vereist bepalen voor elke sonde dat het aantal vissen dat overlapping met het signaal van de DAPI signalen. Voor een dergelijke analyse is visualisatie van de samengevoegde afbeeldingen in drie dimensies absoluut noodzakelijk. Alleen vis locaties die duidelijk gekoppeld aan het signaal van de DAPI in alle drie de dimensies zijn moeten worden opgenomen in de analyse.

Intact zus chromatide samenhang blijkt als twee vissen plaatsen voor zowel de arm en pericentric sondes (figuur 5B, links). Eicellen met drie of vier gescheiden vis plekken voor beide sonde worden beschouwd als cohesie afwijkingen vertonen (figuur 5B, rechts). Om te worden ingedeeld als de individuele plekken, moeten de twee signalen van de vissen minimaal in alle drie de dimensies van een afstand die overeenkomt met de diameter van de kleinste plek worden gescheiden. Dunne vaag draden aansluiten van twee vissen plaatsen zijn niet ongebruikelijk. Deze signalen worden niet als volledig gescheiden beschouwd en worden daarom niet meegeteld als instanties van cohesie gebreken.

Met de 6E-7B arm hybridisatie sonde was ongeveer 15-20% van de eicellen beeld volledig ontbrak signaal of het signaal te zwak te vertrouwen scoren. Bovendien, ongeveer 5% van de eicellen beeld tentoongesteld een groot gebied van diffuse chromosomale signaal en deze werden verwijderd uit de analyse. Daarentegen was het zeldzaam eicellen waarvoor het signaal van de kruising pericentric ontbreekt of te diffuus naar score was tegenkomen.

De 6E-7B arm sonde is gebruikt uitgebreid te kwantificeren arm cohesie defecten in prometaphase en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen van verschillende genotypen19. Wanneer de cohesin-subunit SMC3 werd neergehaald tijdens halverwege profase, 16,3% van de rijpe eicellen geanalyseerd die groter is dan twee plekken, indicatieve van voortijdige verlies van samenhang van de arm arm. Daarentegen zien we gescheiden arm plekken in slechts 5,1% van eicellen die normale niveaus van SMC319. Interessant, hoewel de frequentie van de arm cohesie gebreken werd verheven in meerdere vechtpartij genotypen, zuster chromatiden zelden in hun regio's pericentric19 gescheiden werden.

Figure 1
Figuur 1: leeftijd afhankelijk verlies van samenhang tijdens de uitgebreide profase ik arresteren van vrouwelijke meiose kan resulteren in fouten in chromosoom segregatie en aneuploïdie in het ei. Samenhang wordt vertegenwoordigd door zwarte balken tussen de zuster chromatiden. Arm cohesie functioneert om recombinante homologen bijeenhouden en is vereist voor nauwkeurige segregatie op anafase ik. Als arm cohesie voortijdig verloren is, kan chromosoom missegregation optreden, wat resulteert in een aneuploid ei. Dit cijfer werd aangepast van referentie19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: grootte van DNA moleculen na BAC fragmentatie en versterking (links) en na (rechts) het beperkingsenzym spijsvertering voor drie verschillende BACs. 400 ng van versterkte DNA producten staan in de eerste drie rijstroken. De laatste drie rijstroken Toon DNA-fragmenten na de overnachting beperking digest. De versterkte DNA producten variëren van 200 bp tot 3 kb. Na de beperking digest, meeste fragmenten varieerde van 100-200-bp, maar grotere fragmenten (maximaal 500 bp) zichtbaar waren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: cytologie tools. Instrumenten die worden gebruikt in protocol: (1) paar pincet (#5 Dumont); (2) wolfraam naald; (3) diepe put schotel met cover; (4) ondiep glazen ontrafeling van schotel; (5) getrokken Pipet van Pasteur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Regeling en verkeer van dia's voor rollen van oöcyten. (A) Diagram van de dia ingesteld voor rollen van oöcyten, zoals beschreven in het protocol. Het donkere gebied duidt het matglas deel van de dia. (B) richting van beweging vectoren voor dia #2 tijdens oöcyt rollen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. VIS assay resultaten. (A) schema toont de Drosophila X -chromosoom en de twee sondes (elk 6 BACs) arm waarbij de 22 oligonucleotide pericentromeric sonde beschreven in het protocol te vermengen. Voor de eenvoud, de 6E-7B sonde heet 7B en heet de sonde 2F - 3C 3C. (B) representatieve beelden van vis resultaten (6E-7B sonde) voor intact arm samenhang (twee arm sonde locaties, één per homolog) en verstoorde arm samenhang (drie tot vier arm sonde locaties). DNA is blauw, de arm sonde signaal is geel en de pericentric sonde signaal is rood. Beelden komen overeen met de prognoses van de maximumlichtsterkte van de Z-serie na deconvolutie en contrast enhancement. Schaal bar = 2 µm. Dit cijfer werd aangepast van referentie19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gebruik van vis sondes te beoordelen van de toestand van arm cohesie in prometaphase ik en metafase ik Drosophila eicellen is een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van Drosophila meiose. Historisch, zijn Drosophila onderzoekers beperkt tot genetische tests afleiden van voortijdige verlies van samenhang van de arm in de rijpe eicellen11,18,19. Nu, met de methoden die hier gepresenteerd, de toestand van arm cohesie kan worden vehiculumcontrolegroep rechtstreeks met behulp van vis. De mogelijkheid om fysiek bewijs voor voortijdige verlies van arm cohesie sterk breidt het repertoire van benaderingen ter studie van de mechanismen die tot voortijdige verlies van de cohesie en chromosoom missegregation arm in Drosophila eicellen leiden.

Kritische stappen
Hoewel we hebben een systematische analyse van kritische parameters nodig voor succesvolle visualisatie van een fluorescente sonde die hybridizes naar één exemplaar sequenties langs de arm van chromosoom in volwassen Drosophila eicellen niet uitgevoerd, wij bieden de volgende lijst van factoren die kan hebben bijgedragen tot het succes van deze techniek. Voor het genereren van de arm-sonde, gebruikten we een combinatie van zes overlappende BAC sondes die betrekking hebben op een interval van ongeveer 0.8 Mb op het X-chromosoom arm. Onze eerste pogingen met behulp van minder BACs die overspannen van een kleinere regio waren niet succesvol. Daarnaast hebben we een methode fragment te vergroten van het DNA van de BAC vóór einde-labeling met Alexa-647 gebruikt. De meerderheid van de beperkingsfragmenten die waren gelabeld werden 100-200 bp lange (Figuur 2), die het ermee eens goed het doelformaat van 150 nucleotiden die nodig is voor de efficiënte verspreiding via dikke weefsels21. Fixatie voorwaarden die morfologie van de grote Drosophila oöcyt behouden, maar ook toestaan sonde penetratie zijn essentieel. We hebben onze eerder gebruikte fixatie methode23 gewijzigd door kamertemperatuur heptaan toe te voegen aan een oplossing van de moeilijke situatie voorverwarmd tot 37 ° C. Voor ons is het mogelijk dat zowel de toevoeging van heptaan toe penetratie door het vitelline membraan evenals de verlaagde temperatuur voor fixatie aan de succesvolle fixatie voorwaarden voor visualisatie van de samenhang van de arm bijgedragen.

Wanneer de keuring voor het voortijdige verlies van samenhang, vereist een steekproefgrootte waarmee kwantificering van gebreken die aanwezig zijn bij lage tot gematigde niveaus. Met het oog op een groot aantal rijpe eicellen, hebben anderen gebruikt blender verstoring van volwassen vrouwtjes gecombineerd met zeven van de 26,27. Hier beschrijven we een methode bij de hand ontleden eierstokken van 20-25 koeien, met handmatige scheiding van late etappe eicellen door pipetteren. Terwijl de blender/zeven methode ook moeten met dit protocol werken zou, is een voordeel van hand dissectie dat zonder de zeven stap, eicellen minder tijd doorbrengen in de buffer voordat fixatie, dat de kans op anafase vermindert ik begin als gevolg van kunstmatige ei activering. Bovendien, deze methode vereist minder vrouwen als grondstof gebruikt kleinere volumes van reagentia en heeft een eenvoudiger workflow, die allemaal vergemakkelijken verwerking van meerdere genotypen.

Hand dissectie en handleiding scheiding van rijpe eicellen voldoende hoeveelheden van eicellen te "rollen" voorziet chorion en vitelline membraan verwijdering en resulteert in ongeveer 75-150 eicellen aan het einde van de kruising wast. Een truc om te maximaliseren van het rendement van metafase ik gearresteerd eicellen is om te houden van virgin vrouwtjes in uitgegist flesjes bij gebrek aan mannetjes voordat dissectie25. Oöcyt rollen om chorions en vitelline membranen te verwijderen moet worden uitgevoerd met een zachte aanraking om te voorkomen vernietiging van eicellen. Echter het verwijderen van chorions en vitelline membranen van 100% van de eicellen is niet een realistisch doel en buitensporige rollen alleen resulteert in verlies van eicellen. Dus, elke voortschrijdende cyclus moet worden gestopt wanneer ongeveer 75-85% van de eicellen ontbreken chorions en vitelline membranen.

Beperkingen
Ondanks onze succes bij het genereren en het gebruik van arm sondes te controleren van de status van cohesie in volwassen Drosophila eicellen, lijdt de procedure nog steeds aan beperkingen. Terwijl wij niet zelden een signaal voor de pericentromeric-sonde te detecteren, het signaal van de sonde arm was zwak of afwezig in ongeveer 15-20% van de eicellen dat we beeld. Een bijdragende factor mogelijk differentiële penetratie van de pericentric oligonucleotide sonde (22-28 nucleotiden) versus de grotere arm sonde (100-200 nucleotiden). Bovendien is de grote terugkerende sequentie erkend door de pericentric sonde resultaten in een signaal dat is lichter dan die voor de arm-sonde. De oriëntatie van de oöcyt en plaatsing van Meiotische chromosomen binnen de oöcyt vormen ook een uitdaging als imaging. Hoewel de Meiotische chromosomen relatief dicht bij de cortex van de cel zijn, is het onmogelijk om de oriëntatie van de oöcyt waneer montage op het dekglaasje aan. Dus, in een deel van de eicellen, de Meiotische chromosomen kunnen 100-200 µm van het dekglaasje aan en de signaalsterkte en kwaliteit kan negatief worden beïnvloed wanneer het proberen om het imago door middel van het grootste deel van de oöcyt. Deze beperkingen betekenen dat het aantal eicellen die zijn opgenomen in de uiteindelijke analyse van de kwantitatieve aanzienlijk lager dan het aantal eicellen verwerkt in het protocol is. Vaststelling van de staat van de arm samenhang in 100 eicellen vergt waarschijnlijk twee onafhankelijke preparaten. Een extra beperkende factor in het kwantificeren van gebreken van de samenhang met behulp van een laser confocal microscoop scannen is de tijd die nodig is om vast te leggen van een typisch Z-serie (ongeveer 5 min), zelfs wanneer het veroverde gebied is beperkt tot 1024 x 512 pixels. Dit betekent dat vergelijking van samenhang in de controle- en experimentele genotypen (van elke 100 eicellen) ongeveer 16u afbeelding collectie tijd zal vergen.

Wijzigingen en probleemoplossing
Heeft men kunnen controleren van de toestand van arm samenhang met behulp van een sonde die door het X -chromosoom op cytologische positie 6E-7B19wordt herkend. Een sonde die hybridizes naar een meer distale locatie op het X -chromosoom kan meer wenselijk zijn voor het opsporen van het falen van Chiasme onderhoud. Andere onderzoekers wil bovendien analyseren arm cohesie op andere chromosomen. Terwijl we hebben niet geprobeerd om sonde van de autosomes, blijkt de voorlopige gegevens dat een sonde die de 2F - 3C regio van het X -chromosoom ook herkent tot een opspoorbaar signaal leidt. Op basis van beperkte voorlopige gegevens, kan het signaal van de sonde 2F - 3C echter minder "compact" dan die voor de 6E-7B-sonde. Hoewel de vis-signalen strak en helder voor sommige oöcyt chromosomen zijn, is het signaal van de kruising van de chromosomen van andere eicellen aanzienlijk meer diffuus. Deze verschillen in signaal weerspiegelen echte verschillen in morfologie van chromosoom tussen de twee cytologische locaties, variabiliteit in de efficiëntie van de kruising van de twee sondes of gewoon stochastische variabiliteit tussen verschillende eicellen zal een grondiger analyse vereist.

Nog belangrijker is, zelfs voor de 6E-7B sonde, we een diffuse chromosomale signaal in sommige eicellen, waargenomen en dit vaak noodzakelijk hun uitsluiting van de analyse. Daarnaast hebben we gemerkt variatie in signaalkwaliteit en helderheid tussen verschillende preparaten van de 6E-7B sonde en dit vereist dat imaging parameters dienovereenkomstig worden aangepast. Het verhogen van de temperatuur van de kruising tot 42 ° C, heeft het aantal eicellen met diffuse signaal niet verminderen, maar het systeemprestaties aanzienlijk het signaal voor de pericentric oligonucleotide sonde. In een poging om beter behouden chromosoom morfologie24, wij ook geprobeerd een langere denaturatie stap bij een lagere temperatuur (80 ° C), maar dat deze behandeling steeg de signaalsterkte noch het aantal eicellen met diffuse verminderde gevonden chromosomale vis signaal. We ook geprobeerd om een helderder signaal van de arm met behulp van de 12 overlappende BACs overeenkomt met ongeveer 1,5 Mb interval dat overspannen cytologische regio 5E-7B. Bij het gebruik van een 12 BAC sonde, was de mate van variatie in de signaalsterkte en het percentage van oöcyten ontbreekt signaal het niet anders dan toen zes BACs werden gebruikt om de arm-sonde. Het was ook meer uitdagende te scoren voor cohesie gebreken toen met behulp van de 12 BAC sonde omdat de signalen van de vissen groter waren, waardoor het moeilijker om op te lossen vlekken overeenkomt met individuele chromatiden. In gevallen waar geen signaal wordt verkregen met een nieuw bereid sonde, onderzoekers moeten controleren of de grootte van de versterkte en beperking verteerd BAC DNA om te bevestigen dat de fragmenten gebruikt voor het labelen van einde voornamelijk binnen het bereik van 100-200 bp zijn. Dit is waarschijnlijk een van de meest kritische factoren voor succesvolle sonde voorbereiding.

Toekomstige richtingen
Toekomstige werkzaamheden ter verbetering van Beeldacquisitie, alsmede de aanpassing van het protocol tot immunokleuring zou belangrijke verbeteringen die kunnen van andere onderzoekers profiteren zouden. Tijdens de foto-collectie zou het verzamelen van een groter aantal beelden in de axiale dimensie, alsmede sneller Beeldacquisitie voordelig voor het kwantificeren van gebreken van de cohesie. In het optimaliseren van de imaging parameters voor de laser confocal scannen, vonden we dat 0,25 µm de kleinste stap-grootte die kan worden gebruikt voor de Z-serie was om te voorkomen dat aanzienlijke bleken voor de vissen signalen. Echter voor vis-signalen die worden gescheiden door minder dan 0,25 µm in de Z-stack, deze stap-grootte kan resulteren in falen te vangen van de "ruimte" tussen de foci en kan daarom onderschatten het aantal defecten van de cohesie. De snellere beeldsnelheid voor verwerving van een draaiende schijf confocal kunnen kleinere stap zonder signaal bleken worden gebruikt. Dit zou bieden nauwkeuriger beeld wederopbouw in de axiale dimensie, alsmede grotere aantal eicellen te analyseren voor cohesie gebreken toelaten. Daarnaast zou de mogelijkheid om het combineren van immunokleuring met vis visualisatie van de staat van de arm samenhang aanzienlijk vergroten het protocol. Voor een aantal preparaten wilden we spindel immunokleuring na de kruising-procedure uitvoeren. Robuuste spindel kleuring was echter zichtbaar in slechts een klein deel van de eicellen. Bovendien, om redenen die niet duidelijk, hogere niveaus van valse signalen van de vissen omgeven de Meiotische chromosomen wanneer vis en immunokleuring werden gecombineerd. Het vermogen van deze techniek zou sterk worden vergroot door verdere werkzaamheden voor het optimaliseren van het protocol zodat immunokleuring vóór of na de vis-procedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH Grant GM59354 toegekend aan Sharon E. Bickel. Wij danken Huy Q. Nguyen voor hulp bij de ontwikkeling van het protocol voor het genereren van fluorescerende arm sondes, Ann Lavanway voor hulp bij confocale microscopie, en J. Emiliano Reed voor technische bijstand. Wij danken ook talrijke collega's in de Gemeenschap van de Drosophila voor nuttige discussies en advies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 130 Drosophila meiose oöcyt zuster chromatide cohesie en samenhang van de arm fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)
Met behulp van fluorescentie <em>In Situ</em> hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik <em>Drosophila</em> eicellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter