Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.

Abstract

בבני אדם, כרומוזום סגרגציה שגיאות oocytes אחראים המכריע של הפלות, מומים מולדים. יתר על כן, נשים בגיל, הסיכון שלהם להריון שהעובר aneuploid גדל באופן דרמטי, תופעה זו נקראת השפעת גיל אימהי. אחד הדרישה כרומוזום מדויק סגרגציה במהלך לחטיבות meiotic הוא תחזוקה של אחותו כרומטידה לכידות במהלך התקופה המורחבת prophase oocytes להיתקל. ממצאים cytological בני אדם והן דגם אורגניזמים מעידים כי לכידות meiotic מתדרדר במהלך תהליך ההזדקנות. בנוסף, הפרדה בין שגיאות oocytes האנושי הם הנפוצות ביותר במהלך המיוזה אני, עקבי עם הפסד מוקדמת של הזרוע לכידות. השימוש של אורגניזמים מודל הוא קריטי עבור להתיר את המנגנונים העומדים בבסיס תלויי-גיל אובדן של לכידות. דרוזופילה melanogaster מציע מספר יתרונות לימוד ברגולציה של לכידות meiotic ב oocytes. עם זאת, עד לאחרונה, רק בדיקות גנטיות היו זמינות assay אובדן היד לכידות ב oocytes של אחרים שונים או בתנאים שונים ניסיוני. כאן, הוא פרוטוקול מפורט בתנאי לשימוש פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (דגים) ישירות להמחיש מפגמים הזרוע לכידות ב prometaphase מפה של עצרתי דרוזופילה oocytes ואני. על ידי יצירת בדיקה דגים זה hybridizes את הזרוע דיסטלי של כרומוזום ה- X ואיסוף קונאפוקלית ערימות Z, חוקר יכול להמחיש את מספר אותות נפרדים דגים בשלושה ממדים ו לקבוע אם אחותי כרומטידה הזרועות מופרדים. ההליך שתואר מאפשר לכמת פגמים לכידות הזרוע מאות דרוזופילה oocytes. ככזה, בשיטה זו מספק כלי חשוב לחקור את המנגנונים שתורמים לכידות תחזוקה, כמו גם את הגורמים שמובילים את מותו במהלך תהליך ההזדקנות.

Introduction

סגרגציה תקין של הכרומוזומים במהלך מיטוזה, מיוזה דורש האחות כרומטידה לכידות להיות הוקמה, ומתוחזק שפורסם אופנה מתואמת1,2. לכידות נוסדה במהלך שלב S ומתווך על ידי cohesin מורכבים, המהווה קישורים פיזיים להחזיק את האחות chromatids ביחד. מיוזה, לכידות דיסטלי להתהפכויות גם מתפקד להחזיק homologs רקומביננטי יחד, הקשר גופניות הזה מסייע להבטיח כיוון נכון של טרינארית על כל ציר אני (איור 1)3,4, 5. שחרורו של הזרוע לכידות-"אנאפאזה" אני מאפשר את homologs הפרדת כדי צירים ההפוכים. עם זאת, אם הזרוע לכידות פגים, homologs רקומביננטי לאבד את החיבור הפיזי שלהם גם של הפרדת באופן אקראי, אשר יכול לגרום aneuploid לגמטות (איור 1).

ב- oocytes האנושי, שגיאות בסגרגציה כרומוזום הגורם המוביל של הפלות, מומים מולדים, כגון תסמונת דאון6, השכיחות שלהם עולה אקספוננציאלית עם גיל7. כרומטידה אחות לכידות נוסדה בשנת oocytes עוברי, רקומבינציה meiotic הושלמה לפני הלידה. Oocytes ואז לעצור באמצע prophase אני עד הביוץ ובמהלך המעצר הזה, האגודה פיזי מתמשך של homologs רקומביננטי מסתמך על אחותי כרומטידה לכידות. לכן, הפרדה מדויקת במהלך המיוזה ותוצאות הריון נורמלי דורשים כי לכידות נשארים בעינם עד חמישה עשורים.

אובדן מוקדמת של לכידות במהלך מעצרו meiotic ממושך של האדם oocytes הוצע לתרום האפקט גיל אימהי, שורות מרובות של ראיות תומכות זו השערה8,9. עם זאת, לאור האתגרים של הלומדים לכידות meiotic ב oocytes האנושי, הרבה ההבנה שלנו של תופעה זו מסתמך על השימוש של מודל אורגניזמים5,10,11,12, 1314,,15.

דרוזופילה melanogaster oocytes מציעים יתרונות רבים עבור המחקר של סגרגציה לכידות והסכמה כרומוזום meiotic. Assay הגנטי פשוטות מאפשרת לשחזר רומא גמטות aneuploid ולמדוד את הנאמנות של X-הפרדה בין כרומוזום16,11,17בקנה מידה גדול. יתר על כן, אחד יכול גם לקבוע האם כרומוזום סגרגציה שגיאות מתעוררות כי homologs רקומביננטי missegregate במהלך המיוזה אני, הפנוטיפ עקבי עם אובדן היד לכידות11,18, מוקדמת 19. ישיר התבוננות המדינה של לכידות meiotic ב דרוזופילה oocytes אפשרי גם באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים). למרות oligonucleotides פלורסנט כי hybridize אל לווין חוזרות רצפים שימשו במשך יותר מעשור כדי לפקח על לכידות pericentromeric בוגרת דרוזופילה oocytes4,20, ניתוח של הזרוע לכידות כבר הרבה יותר מאתגר. ויזואליזציה של מצב היד לכידות דורש בדיקה המתפרס על אזור גדול של עותק בודד רצף בהיר מספיק את התוצאה גלוי אותות עבור אחותי בודדים chromatids כאשר היד לכידות נעדר. בנוסף, התנאים קיבוע oocyte והגודל של DNAs שכותרתו חייבת לאפשר חדירה21 לתוך גדול בוגר דרוזופילה oocyte (200 מיקרומטר רחב על ידי רב 500 מיקרומטר). לאחרונה, בדיקה הזרוע היה בהצלחה מנוצל כדי להמחיש דרוזופילה oocyte chromatids במהלך "אנאפאזה", אבל המחברים הצהיר כי הם לא היתה אפשרות לזהות אות ב- prometaphase או מפה של עצרתי oocytes22. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הדור של X-זרוע כרומוזום דגים רגשים ועל תנאים הכנה oocyte אפשרו לנו assay לירידה מוקדמת של אחותו כרומטידה לכידות ב- prometaphase ומפה של אני oocytes. שיטות אלה, אשר אפשרו לנו לזהות מוצרים גנים הדרושים לשם שמירה על לכידות meiotic, יאפשר לאחרים assay עבור אחותי כרומטידה לכידות מפגמים בוגרת דרוזופילה oocytes של אחרים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכשירים

  1. היכונו פתרונות פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (דגים). להכין את כל הפתרונות באמצעות הנדסה גנטית מים.
    1. להכין 5 x המאגר של שינוי Robb: 275 מ מ אשלגן אצטט, 200 מ"מ סודיום אצטט, 500 מ מ סוכרוז, גלוקוז 50 מ מ, 6 מ מ מגנזיום כלוריד, 5 מ מ סידן כלורי, 500 מ מ HEPES pH = 7.4. להביא את ה-pH 7.4 באמצעות 10 N NaOH. מסנן לחטא ולאחסן ב-20 ° C. הפשרת ולאחר לדלל כדי 1 x כנדרש ולאחסן aliquots x 1 ב-20 ° C.
    2. הכינו 10 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) באמצעות 1.3 M NaCl, 70 מ"מ נה2HPO4,2PO NaH 30 מ מ4. להביא pH 7.0 באמצעות 10 N NaOH. לחטא על ידי עיקור autoclaving או המסנן.
  2. להכין coverslips זכוכית אקרילית-L-ליזין יום אחד לפני הצורך.
    1. פיפטה אתנול 70% המכיל 1% חומצה הידרוכלורית על פני coverslip 18 מ"מ x 18 מ"מ #1.5, דגירה 5 דק שימוש השאיפה ואקום להסיר את הנוזל. חזור עם מים הנדסה גנטית סטרילי. לכסות את פני השטח של coverslip עם 0.1 מ"ג/מ"ל פולי-L-ליזין, תקופת דגירה של 10 דקות.
    2. האחות כדי להסיר את נוזל, אוויר יבש במשך 10 דקות החנות coverslips לצד פולי-L-ליזין למעלה בתוך מיכל פלסטיק עם מכסה ההדוקות כדי למנוע אבק.
  3. להכין פסטר משך פיפטות להסרת פתרונות נוזלי מבלי להסיר את oocytes. מעל להבה מבער בונזן, חום באמצע של כוס ארוכה פסטר פיפטה כשאתה מושך בעדינות בכל קצה עד הזכוכית נמס ומשיכה לגזרים.

2. דור של הזרוע בדיקה דגים

הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעות ב g x ~ 16,000-21,000 (מהירות מירבית על רוב microcentrifuges מלמעלה בטבלה). צנטריפוגה קצר ספינים לציין ספינינג על מערבולת ס' 5-15 מציין vortexing ~ 15 s-max מהירות אלא אם נכתב אחרת.

הערה: ניתן להשיג BACs עבור הזרוע הגששים ממשאבים PAC BAC. שני רגשים זרוע תהיה של כרומוזום X שימשו בהצלחה בשיטה זו. רגש בזרוע אחד היה מורכב של 6 שיבוטים BAC המתאים ל cytological להקות 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). החללית זרוע אחרת כללה 6 שיבוטים BAC המתאימים כדי להקות cytological 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs כדי אחרים כרומוזום דרוזופילה אזורים יכול להיות עיינת בשעות: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. שני רגשים pericentric מזהה חזור בלוויין bp 359 כרומוזום X שימשו בהצלחה בשיטה זו. בדיקה נוקלאוטיד 22 כבר בשימוש נרחב, ועובד טוב (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. בדיקה נוקלאוטיד 28 לאחרונה נבדקה והוכחה גם עבד טוב (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC טהור oligonucleotides 5' המסומנת fluorophore ספציפיים הורו ממקור מסחרי (למשל, טכנולוגיות DNA משולב).

  1. תכינו BAC לשכפול ה-DNA בעקבות הוראות ערכת כמפורט בטבלה של חומרים. Resuspend בגדר DNA המתקבל 100 מ של התרבות ב- 200 µL TE; ריכוז הדנ א הסופי צריך לנוע בין 5-40 ng/µL בהתאם השיבוט BAC.
  2. לבצע הגברה DNA עבור כל BAC באמצעות ערכת הגברה, כפי שצוין במקטע הטבלה של חומרים, והפרוטוקול הבאים. תהליך ה-DNA BAC עבור כל המשובטים בנפרד. להשתמש אנזימים מאגרי מסופק עם הקיט בשלבים 2.2.1 דרך 2.2.3.
    1. פיצול אקראי של ה-DNA BAC: עבור כל BAC, השתמש טה להכין 10 µL של פתרון ה-DNA 1 ng/µL בשפופרת PCR 200 µL. להוסיף 1 µL 10 X פיצול המאגר. במקום הצינור במכונת ה-PCR בגיל 95 ° C עבור בדיוק 4 דק מיד מגניב המדגם במי קרח, צנטריפוגה בקצרה. הדגירה היא זמן רגיש, כל סטייה עשוי לשנות את תוצאות.
    2. ספריית הכנה
      הערה: שיטה זו משתמשת תחל אקראי כדי ליצור ספריה של קטעים amplifiable.
      1. את הצינור המכיל את ה-DNA להוסיף את הקוד הבא: µL 2 1 x ספריית הכנת מאגר, µL 1 של ספריית מייצב פתרון. לערבב ביסודיות על ידי vortexing, צנטריפוגה בקצרה, מקום ברכבת התחתית המכונה PCR ב 95 ° C עבור 2 דק מיד מגניב המדגם במי קרח, צנטריפוגה בקצרה.
      2. להוסיף 1 µL של ספריית הכנה האנזים PCR שפופרת, מיקס, צנטריפוגה בקצרה. המקום PCR צינור המכונה PCR, דגירה כדלקמן: 16 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, 24 מעלות למשך 20 דקות, 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, 75 º C למשך 5 דקות, ואז תחזיק ב 4 º C.
      3. להסיר דגימות מן המכונה PCR, צנטריפוגה בקצרה. דוגמאות עשוי להיות מוגבר באופן מיידי או המאוחסנים ב-20 ° C עד שלושה ימים.
    3. הגברה של ספריית ה-DNA BAC
      1. להוסיף את ריאגנטים הבאים התגובה כל קטע אקראי 15 µL: 7.5 µL 10 x מיקס מאסטר הגברה, 47.5 µL נוקלאז מים חינם, 5 µL WGA DNA פולימראז. לערבב ביסודיות על ידי vortexing, צנטריפוגה בקצרה.
      2. המקום PCR צינור המכונה PCR, דגירה כדלקמן: הראשונית דנטורציה 95 ° C למשך 3 דקות, 14 מחזורים של דנטורציה ב 94 ° C 15 s, חישול/הסיומת-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז תחזיק ב 4 º C.
      3. בתום רכיבה על אופניים, assay את ריכוז הדנ א. ריכוז הדנ א צריך להיות לפחות 800 ng / µL. לשמור דגימות ב 4 ° C או חנות ב-20 ° C עד מוכן למערכת העיכול. באופן אופציונלי, להעריך את גודל מקטע DNA על-ידי הפעלת 400 ננוגרם של ה-DNA על ג'ל agarose 2%. שברי צריך לנוע בין 200 bp עד 3 kb (איור 2).
  3. אנזים הגבלה העיכול של DNA מוגבר
    1. מקום 20 µg של ה-DNA מוגבר מהסעיף הקודם צינור microfuge 1.5 mL. להוסיף 20 יחידות של Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 יחידות של BfuCl, 0.5 BSA 100 x µL, µL 5 10 x אנזים הגבלה עיכול מאגר, ולכוונן את העוצמה כדי 50 µL על-ידי הוספת את הכמות המתאימה של הנדסה גנטית H2O.
    2. דגירה לעכל את בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור למניעת עיבוי על המכסה. אתנול לזרז את ה-DNA מעוכל. להוסיף התקציר: 1 µL גליקוגן, כרך 1/10 3 מ' סודיום אצטט, כרכים 2.5 כיתה מולקולרית 100% אתנול. דגירה ב- 80 ° C 1 h או לילה.
    3. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 4 º C. צניפה DNA לשטוף עם נפח 1 חדר temp 70% אתנול וביו -ספין בשביל 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע ולתת את ה-DNA הצניפה אוויר יבש או יבש בעדינות עם זרם קבוע של אוויר.
    4. Resuspend בגדר דנ א 36 µL סטרילי הנדסה גנטית H2O ולהשתמש µL 1 של ה-DNA כדי assay את ריכוז הדנ א, אשר צריכה להיות כ 285 ng / µL. לאחסן את ה-DNA ב-20 ° C.
    5. לחלופין להעריך גודל מקטע דנ א פועל 400 ננוגרם של ה-DNA על ג'ל agarose 2%. שברי רוב צריך טווח מ- 100-200 bp, עם קליטה חלשה עד 500 bp (איור 2).
  4. 3' עוקבת. אחרי התגובה
    1. Denature ה-DNA מתעכל ב 100 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה בתוך גוש חום. מקררים מיד במי קרח. כדי µL 35 ה-DNA, להוסיף את הדברים הבאים: 50 µL 400 מ נתרן cacodylate, 1 µL 10 מ מ DTT ו מערבולת היטב. להוסיף 4 µL 25 מ מ CoCl2, 2.5 µL 2 מ מ 5-(3-aminoallyl)-dUTP מן ארס תיוג ערכת כפי שצוינו בטבלה של חומרים, 5 µL 1 מ dTTP, 18 µL 5 מאגר x TdT, ו 1 µL deoxynucleotidyl מסוף טרנספראז (TdT) 400 U / µL. מערבולת, צנטריפוגה בקצרה.
      התראה: CoCl2 הוא רעיל, לענוד הגנה הולמת.
    2. תקופת דגירה של 2 h ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור למניעת עיבוי. להוסיף 1 µL של 250 מ מ EDTA לעצור את התגובה ואת מערבולת בקצרה כדי לערבב. אתנול לזרז את ה-DNA זנב כמתואר לעיל (שלבים 2.3.2 - 2.3.4). Resuspend בגדר דנ א מיובשים 10 µL סטרילי הנדסה גנטית H2O. חנות ה-DNA ב-20 ° C עד מוכנים להמשיך.
  5. לנהל את ההטיה הפלורסנט באמצעות ערכת תיוג DNA כמפורט בטבלת חומרים.
    הערה: לאחר צבע יתווסף לשמור דגימות בחושך.
    1. Denature ה-DNA זנב ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך גוש חום. מיד מגניב DNA קרח מים, צנטריפוגה בקצרה. הכנת מאגר תיוג בהתאם להוראות ערכת ולהוסיף 6 µL כל מדגם ה-DNA. Resuspend כל שפופרת של צבע ב- 4 µL של דימתיל סולפוקסיד הערכה. מערבולת, צנטריפוגה בקצרה.
    2. להשתמש שפופרת אחת של צבע עבור כל תגובה תיוג. הוסף את הפתרון לצבוע אל ה-DNA, מערבולת, צנטריפוגה בקצרה. דגירה התגובה תיוג בטמפרטורת החדר במשך 2 h בחושך. להוסיף 3 µL של 3 מ' hydroxylamine כדי לעצור את התגובה ואחריה µL 77 של נוקלאז-חופשית H2O הערכה. מערבולת, צנטריפוגה בקצרה.
  6. הסרת צבע שאינו מצומדת באמצעות ערכת טיהור PCR כפי שמצוין בטבלה של חומרים. בצע את הוראות היצרן. Elute DNA מן העמודה פעמיים באמצעות 40 µL • תנאי המאגר בכל פעם.
  7. אתנול לזרז הדי שכותרתו כפי שתואר קודם לכן (שלבים 2.3.2 - 2.3.4). Resuspend בגדר דנ א מיובשים במאגר • תנאי µL 10.
  8. להכין תערובת בדיקה
    1. תווית ה-dna לקבוע ריכוז לצבוע fluorochrome ב pmol/µL. ריכוז fluorophore עשויים לנוע בין 30-100 pmol/µL, בהתאם BAC. ריכוז ה-DNA עשוי לנוע בין 300-800 ng/µL.
      הערה: ההגדרה microarray עובד גם על ספקטרופוטומטרים microvolume, כגון שצוינו בטבלה של חומרים. בחלון microarray, בחר את ה-DNA-50 וציין את fluorochrome.
    2. ליצור שילוב אב על-ידי שילוב כמויות equimolar (pmol עבור חיל הים) של כל אחד הגששים BAC. מערבולת 30 s לפני שילוב. כדי להימנע מחזורים ההקפאה/ההפשרה, הכנת aliquots של המיקס מאסטר, חלות פרפין הסרט הצינורות כדי למנוע אידוי, ולאחסן בחושך ב-20 ° C.
      הערה: mastermix המכילה 250 pmol של כל אחד BAC בודדים 6 רגשים ב הנפח הכולל של 30-50 µL עובד טוב. Aliquot המכיל 25 pmol (עבור חיל הים) עבור כל BAC יהיה מספיק לתגובות הכלאה 40 שני µL, עם ריכוז בדיקה סופית של 0.31 pmol עבור חיל הים/µL עבור כל BAC.

3. ניתוח של קיבוע של Oocytes

  1. לאסוף 30 הבוגרת הבתולה של גנוטיפ המתאים. כדי להעשיר עבור oocytes בשלב מאוחר, החזק נשים ללא גברים בבקבוקון עם אוכל לעוף, שמרים יבשים 3-5 ימים לפני ניתוח25. יום לפני ניתוח, להעביר הנקבות בלי גז בקבוקון טריים עם שמרים.
  2. לבצע את הקרע.
    הערה: ראה איור 3 כלים נדרשים. פתרונות מוסרות באמצעות פיפטה פסטר משך אלא אם נכתב אחרת. בעת העברת השחלות תמיד להשתמש טיפ פיפטה מצופה עם 10% הפתרון BSA.
    1. בקערה הרדודה ויבתר המכיל המאגר של שינוי Robb, להשתמש מלקחיים להסיר את השחלות נקבה יחידה. שימוש מלקחיים או מחט טונגסטן בעדינות לפעור כל השחלה, המאפשר את הפתרון לפנות ovarioles הפנימית. להעביר את הזוג של השחלות splayed צינור microfuge 1.5 mL המכיל המאגר של 1 מ"ל ששינה Robb.
    2. חזור על שלב 3.2.1 לצבור השחלות של 20-25 נקבות בצינור microfuge 1.5 mL. סיום והניתוחים של הנקבות 20-25 בתוך 10 דקות.
  3. לבצע קיבוע כדלקמן.
    1. עם פיפטה משך פסטר, להסיר את הנוזל בצינור microfuge, השתמש P1000 כדי להוסיף במהירות 500 µL של 37 ° C פתרון השחלות, ולאחר מכן להוסיף מיד µL 500 של טמפרטורת החדר heptane ב השחלות.
    2. צינור microfuge לנער כדי מערבבים ומניחים על nutator במשך 3 דקות להסיר את הצינור microfuge nutator ואת המקום בארון תקשורת צינור עבור 1 דקות לאפשר את oocytes ליישב את העניין. הזמן קיבוע מוחלט הוא 4 דקות.
      התראה: פתרון heptane ב הם רעילים, לענוד הגנה הולמת.
    3. הסר את הפתרון ולשטוף את השחלות 3 פעמים ב- 500 µL ל- PBS המכיל BSA 0.5% ו- 0.1% טריטון X-100 (PBSBTx)
  4. חזור על אחרים שנותרו.

4. הסרת Chorions וממברנות Vitelline

הערה: ראה איור 3 כלים נדרשים.

  1. נפרדים oocytes בשלב מאוחר
    1. להוסיף 1 מ"ל PBSBTx תבשיל ויבתר רדוד. השתמש P200 עם טיפ מצופה BSA להעביר השחלות קבוע (ב µL ~ 150) לתוך המנה רדוד. פיפטה השחלות למעלה ולמטה עם קצה פיפטה מצופה BSA לנתק את oocytes בוגר מ oocytes פחות בוגר.
    2. כאשר oocytes בשלב מאוחר מספיק מופרדים, להעביר את כל רקמת צינור microfuge 500 µL. להסיר את עודף נוזל עם פיפטה משך פסטר, עוזב על 150-200 µL בצינור. חזור על סעיף 4.1 אחרים שנותרו.
  2. להתכונן מתגלגל
    1. טרום רטוב מאכל טוב עמוק עם 200 µL של PBSBTx. לכסות, מניחים בצד. לקבל 3 שקופיות זכוכית חלבית, קבע שקופית #3 הצידה. יש לשפשף בעדינות את האזורים זכוכית חלבית של שקופיות #1 ו #2 ביחד. לשטוף אותם במים יונים כדי להסיר את כל רסיסי הזכוכית ויבש עם מגבון חד פעמיות.
    2. מעיל האזורים עמומה של שקופיות #1 ו #2 עם PBSBTx על-ידי הוספת µL 50 של PBSBTx שקופית אחת ומשפשף את האזור הזה כאשר השקופית אחרים. הסר את הנוזל עם מגבון חד פעמיות.
    3. מקם את השקופיות תחת מיקרוסקופ ויבתר בתצורה שמוצג באיור 4A. לשמור האזורים עמומה של שקופיות #1 ו #2 בקשר עם שקופית #3 תומכים שקופית #2.
  3. רול oocytes; ודא כי הכיוון של גלגול הוא תמיד קו ישר, לא תנועה מעגלית.
    1. Prewet P200 פיפטה עצה ב PBSBTx ומעוררים את oocytes בצינור microfuge על ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר 50 µL של oocytes המכילה נוזל במרכז החלק זכוכית חלבית של שקופית #1. הרם שקופית 2 # לעשות את זה.
    2. הורידו לאט שקופית #2 עד מתח הפנים של הנוזל יוצר חותם בין שני האיזורים זכוכית חלבית. צריך להיות מספיק נוזלים כדי לכסות את האזור חלבית אבל אף אחד לא צריך להיות מחלחל החוצה. אם הנוזל עולה על גדותיו, להשתמש פיפטה פסטר משך כדי להסיר עודפי נוזלים.
    3. להחזיק את השקופית התחתון (#1) במקום עם יד אחת, תשתמש ביד השנייה כדי להעביר את השקופית העליונה (#2) הלוך בכיוון אופקי, שמירה על שקופית #2 רמת והחלק הנתמכות ב- #3. לבצע תחת מיקרוסקופ להמחשת קל של תנועות oocyte והתקדמות.
      הערה: תנועה זו ליצור חיכוך של לגרום את oocytes "לגלגל" ולאבד את chorions שלהם. לחץ מינימלי צריך לשמש, התנועות צריכות להיות קצר ומהיר.
    4. אחרי כמה תנועות בכיוון אופקי, קצת לשנות את הזווית של התנועה (איור 4B). במרווחים מרובים, להגדיל בהדרגה את זווית 90 מעלות עד התנועה של השקופית העליונה (#2) ניצב לכיוון ההתחלה (איור 4B). שים לב chorions ריק יהיה גלוי בנוזל oocytes חסר chorions יופיע ארוכים ודקים.
    5. חזור על שלבים 4.3.3 - 4.3.4 כ 7 - 10 פעמים עד הפתרון הופך מעוננים מעט. תפסיק להתגלגל כאשר הרוב המכריע של oocytes (75-85%) מופיעים איבדו את הקרומים vitelline שלהם.
      הערה: קצה מחודד הבולט הוא לעתים קרובות גלוי על oocytes חסר ממברנות vitelline. ממברנות vitelline קשים יותר להסרה מאשר chorions. לחץ קל ניתן להחיל את השקופית העליונה (שקופית #2) תוך מתיחת להשגת הסרה של ממברנות vitelline. מנסה להסיר ממברנות vitelline מכל oocytes לעתים קרובות התוצאות הרס של אחרים oocytes.
    6. הרם בעדינות את השקופית העליונה (#2), גרירת אחת מפינותיו למרכז של האזור עמומה של השקופית התחתון (#1) כך התגלגל oocytes לצבור במרכז האזור עמומה. לשטוף oocytes של שתי שקופיות עם PBSBTx לתוך המנה עמוק טוב המכיל PBSBTx.
    7. לנקות שקופיות #1 ו #2 במים הנדסה גנטית, יבש עם מגבון חד פעמיות, ואפס. חזור על שלבים 4.3.1 - 4.3.6 ללא עד כל oocytes של גנוטיפ באותה כבר התגלגל. פעולה זו דורשת בדרך כלל 3-4 סיבובים של מתגלגלים לכל גן # מושגים בסיסיים.
  4. הסרת לכלוך לאחר מתגלגל
    1. להוסיף 1 מ"ל PBSBTx צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבולת הנוזל כדי להרגיע את צידי הצינור.
    2. שימוש PBSBTx מצופה P1000 פיפטה עצה, העברת oocytes התגלגל מן המצולות טוב צלחת צינור חרוטי המכיל 1 מ ל PBSBTx. הוספה mL 2 נוספים של PBSBTx אל הצינור חרוט המכיל את oocytes.
    3. תן את oocytes להתחיל ליישב את העניין, ואז להסיר את החלק העליון 2 מ"ל של פתרון המכיל פסולת (chorions, vitellines, וכו ') עם P1000 ולמחוק. אם יש צורך, להחזיק את הצינור חרוט על רקע כהה כדי לראות את oocytes אטום כפי הם שוקעים.
    4. להוסיף 2 אוטם נוסף של PBSBTx oocytes, וחזור על שלב 4.4.3. חזור על 4.4.3. סה"כ 3 סיבובים של הסרת פסולת.
    5. שימוש PBSBTx מצופה P1000 פיפטה עצה, העברה oocytes בחזרה אל הצינור המקורי µL 500 microfuge. 20 - 25 נקבות אמור להניב כ 50 µL של oocytes בוגרת מגולגל.
  5. חזור על סעיף 4 אחרים שנותרו באמצעות שקופיות קפואה טרייה, תבשיל טוב נקי עמוק, צינור חרוטי עבור כל גנוטיפ.
  6. אם נחוץ אחסון, העברה oocytes כדי PBS 1 x עם 0.1% TritionX-100 וחנות לילה ב 4 º C. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ כי פורמלדהיד crosslinking יכול להיות הפוך על ידי חומרי ניקוי ללא יונית.

5. דגים

הערה: כל שוטף מבוצעות על nutator בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. Oocytes זה כבר התגלגל להתארך להתיישב לתחתית הצינור microfuge, במיוחד בתחום פתרונות המכילים formamide. חשוב להיות סבלניים בעת שינוי פתרונות כך oocytes הם לא איבד את התהליך. זה עשוי לדרוש מחכה 5-15 דקות כדי לאפשר oocytes להתיישב לאחר שטיפות, שוטף. שימו לב גם כי oocytes ב formamide הם פחות אטום.

  1. חילוץ וטיפול RNAse
    1. לשטוף את oocytes עם µL 500 ל- PBS המכיל 1% טריטון X-100 (PBSTx). להסיר את הנוזל ולהוסיף 500 µL החילוץ מאגר (PBSTx המכיל RNAse). דגירה על nutator בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  2. הכלאה קדם שוטף
    1. לשטוף oocytes 3 פעמים עם 500 µL 2 x ציטראט נתרן מלוחים המכילים Tween 20 (SSCT). מחממים את aliquot (~ 500 גנוטיפ/µL) 2 x SSCT + 50% formamide ל- 37 מעלות צלזיוס.
      התראה: formamide הוא רעיל, ללבוש הגנה הולמת.
    2. לשטוף oocytes 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב- 500 µL 2 x SSCT. לשטוף oocytes 10 דקות ב- 500 µL 2 x SSCT + 20% formamide. לשטוף oocytes 10 דקות ב- 500 µL 2 x SSCT + 40% formamide. לשטוף oocytes 10 דקות ב- 500 µL 2 x SSCT + 50% formamide.
    3. להסיר את הנוזל ולהוסיף 500 µL של 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide מהשלב 5.2.1 לטעום, תקופת דגירה של 2 h ב 37 ° C עם סיבוב.
      הערה: תנור הכלאה מצויד rotator עובד עליו היטב. צינור microfuge קצף "לצוף" המצורפת מסובב יכול לשמש כדי לאבטח את הצינורות.
  3. דנטורציה של הכלאה
    1. לשימוש כל שפופרת של oocytes, µL 40 x 1 הכלאה מאגר המכיל 2.5 ng/µL centromeric החללית ואת 0.31 pmol עבור חיל הים/µL של כל בדיקה BAC. להכין פתרון של בדיקה במאגר הכלאה, מספיקים כל אחרים. מערבולת החללית s לערבב 30 לפני הוספת.
    2. באמצעות טיפ פיפטה P200 מצופים BSA, להעביר oocytes צינור PCR 200 µL. לשמור דגימות 37 ° C ו oocytes לתת ייחוס לתחתית ולאחר מכן השתמש על פיפטה פסטר משך כדי להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר.
    3. הוסף µL 40 של הכלאה לאודנום בדיקה (להכין בסעיף 2) כדי oocytes. למקם את הצינור PCR המכיל oocytes המכונה PCR, דגירה כדלקמן: 37 º C למשך 5 דקות, 92 º C למשך 3 דקות, ואז 37 º C למשך הלילה. לאחר בדיקה נוספת של oocytes, לשמור אותם בחושך ככל האפשר.
  4. פוסט-הכלאה שוטף
    1. מחממים את 2 x SSCT + 50% formamide ל- 37 ° C ולשמור אותו בחממה הכלאה. עם BSA מצופה P200 פיפטה עצה, להוסיף 100 µL של 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide ברכבת התחתית PCR עם oocytes, להעביר oocytes את צינור microfuge µL חדש 500.
    2. להוסיף את µL 400 נוספים של 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide אותו צינור ולתת ש-oocytes להתישב 37 ° C בחממה.
      הערה: ליישב בדרך כלל לוקח יותר זמן בשלב זה. זה לא חריג לקחת 15 דקות או יותר. חוסר סבלנות תגרום לאובדן משמעותי של oocytes.
    3. לשטוף את oocytes 3 פעמים במשך 20 דקות ב- 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide ב 37 ° C עם סיבוב. שמור oocytes ב 37 ° C ואילו הם. מתפשרים.
    4. לשטוף את oocytes 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב- 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide ב 37 ° C עם סיבוב. שמור oocytes ב 37 ° C ואילו הם. מתפשרים.
    5. בטמפרטורת החדר, לשטוף את oocytes 10 דקות ב- 500 µL 2 x SSCT + 40% formamide ב nutator. לשטוף את oocytes 10 דקות ב- 500 µL 2 x SSCT + 20% formamide. לשטוף את oocytes 10 דקות ב- 500 µL 2 x SSCT.
  5. כתם עם דאפי
    התראה: דאפי רעיל, לענוד הגנה הולמת.
    1. לשטוף oocytes עבור 20 דקות בתמיסה 500 µL דאפי (1 µg/ml) 2 x SSCT על nutator. יש לשטוף את oocytes 3 פעמים ב- 500 µL 2 x SSCT. לשטוף oocytes פי 2 עבור 10 דקות כל אחד ב- 500 µL 2 x SSCT על nutator. דוגמאות ניתן לאחסן עד 4 שעות בטמפרטורת החדר בחושך עד שיהיו מוכנים לעלות על coverslips.
  6. הרכבה
    הערה: ראה איור 3 כלים נדרשים.
    1. המקום פולי-L-ליזין מצופה coverslip תחת המיקרוסקופ ויבתר. הסר נוזל באמצעות הרכבת התחתית של oocytes, התאמת אמצעי האחסון הכולל כ-150 µL. עם BSA מצופה P200 פיפטה עצה, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפזר oocytes לאורך כל הפתרון ולאחר מכן להעביר µL 40 של הפתרון/oocytes coverslip מצופה פולי-L-ליזין.
    2. הסר מעט מהנוזל coverslip באמצעות פיפטה פסטר משך עד oocytes מקל coverslip אבל עדיין מוקפים בנוזל. עם מלקחיים, החזק את תלוש הכיסוי בצד אחד, שימוש במחט טונגסטן בעדינות מביצועם גושים של oocytes, להעביר אותם על מנת להשיג שכבה אחת של oocytes שאינם חופפים.
    3. הסר את שאר הנוזל סביב oocytes עם פיפטה משך פסטר. קח זכוכית נקייה ולהשתמש בגז דחוס לפוצץ את כל האבק. הוסף µL 22 של הרכבה מדיה (למשל, Prolong-זהב) לאמצע של השקופית. הורידו לאט את השקופית לכיוון coverslip, עם התקשורת הרכבה פונה המדגם, עד התקשורת נוגע המדגם. מתח תגרום את coverslip לדבוק השקופית.
    4. המקום שקופיות בתוך מיכל פלסטיק עם מכסה ההדוקות המכיל שכבה של טרי dessicant (למשל, drierite). תן שקופיות יבש 3-5 ימים בחושך לפני הדמיה. זמן הייבוש עשוי להשתנות בהתאם הלחות של החדר.

6. הדמיה

  1. בעת הסרת שקופיות יבש מהתיבה של dessicant, לנקות אותם כדי להסיר את כל חלקיקי אבק. חותם coverslips עם לק. ניתן לאחסן שקופיות אטום ללא הגבלת זמן ב-20 ° C.
  2. רוכשים את סריקת תמונות קונאפוקלית באמצעות מטרה שמן גבוהה מפתח נומרי X 40 עם 6 X זום דיגיטלי לייזר.
    הערה: באופן אידיאלי, תוכנת המערכת תאפשר אחד כדי למצוא ולסמן את מיקום X-Y של כרומוזומים meiotic עבור oocytes מרובים בעת הצגתם באמצעות epifluorescence. יכולת זו חוסכת זמן במהלך מפגש הדמיה. המהירה הלבנה עם יעד מפתח נומרי גבוהה 60 X עשה את השימוש בו אינו מתאים עם מערכת קונאפוקלית שבחרת, אבל זה יפעלו עבור מערכות אחרות.
  3. לכידת סידרה Z עבור כל oocyte, הגדרת העליון והתחתון של הסדרה באמצעות האות דאפי.
    הערה: לקבל, היסט, ואת עוצמת הלייזר צריך להיקבע מדעית באמצעות תת-קבוצה של oocytes. ברגע נמצאו פרמטרים מתאימים, התאמות קלות רק צריך להתבצע.
    אם השתנה רכישה נדרשות הגדרות, להשתמש של אוסף התמונות שנאספו בעבר כדי לאמוד את השינויים הדרושים. כדי למנוע הלבנת, להימנע מראש הדמיה החללית היד לפני לכידת הסדרה Z. עם גודל צעד של 0.25 מיקרומטר, סדרת Z בדרך כלל בטווח של 25 עד 30 צעדים בהתאם הכיוון ואת המיקום של הכרומוזומים. גודל צעד קטן יותר עשוי לשפר את היכולת להעריך אם שני מקומות דגים מופרדים בממד צירית, אבל יש פשרה עם הזמן הדרוש כדי ללכוד צעדים קטנים ואובדן של עוצמת האות בשל הלבנת. מטרה X 40 עם 6 X זום דיגיטלי ושדה 1,024 x 512 התמונה יוצרת תמונות עם גודל פיקסלים של 0.05 מיקרומטר.

7. תמונה ניתוח והניקוד לכידות פגמים

  1. Deconvolve הסדרה Z כדי למטב את האות לרעש יחס עבור כל oocyte19.
    הערה: חבילת תוכנה כגון שצוינה טבלת חומרים מאפשר אחד deconvolve באמצעות שיקום אינטגרטיבית, כמו גם לחתוך, חדות-לשפר תמונות. חשוב לציין, חבילת תוכנה המאפשר אחד כדי הצגת תמונות והניקוד לכידות פגמים בתלת מימד הכרחי.
  2. עבור כל oocyte, משיבים את מספר מוקדים centromeric זה colocalize עם האות דאפי וכאב בזרוע. אובדן של לכידות תוצאות האותות ברורים ולא מופרדות שלוש או ארבע עבור בדיקה ספציפית. . זה לא נדיר להתבונן בשני מוקדים מחוברים על חוט דק. לפי הקריטריונים המחמירים ביותר, מוקדים אלה לא ייחשב "מופרד".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 5 מציג תמונות שהושג עם בדיקה היד זה hybridizes על אזור cytological 6E-7B על כרומוזום ה- X . התוצאה בדיקה לאות שיתוף רגישה עם זה של דאפי, הוא שקל להבחין ברקע, שימש בהצלחה לכמת הזרוע לכידות פגמים שונים אחרים19. כימות של לכידות פגמים הוגבל ל prometaphase אני, מפה של אני שלבים; oocytes לפני התמוטטות מעטפת הגרעין לא נכללו ניתוח19. מעטפה גרעיני שלם ניכרת בסריקת בערוץ דאפי כי הכרומוזומים oocyte תהיו מוקפים אזור מעגלית דיסקרטית כהה יותר הציטופלסמה שמסביב.

איור 5B מראה תחזיות העוצמה המקסימלית של סדרת Z בודדים לאחר שיפור deconvolution והחדות. כימות של לכידות פגמים מחייב קביעת עבור כל בדיקה שמספר דגים מסמן את החפיפה עם האות דאפי. בשביל ניתוח כזה, ויזואליזציה של התמונות הממוזגות בתלת מימד הכרחי. רק דגים נקודות הקשורות בבירור האות דאפי כל בשלושה ממדים יש לכלול בניתוח.

אחותי שלם כרומטידה לכידות היא עדות הדג כשתי. נקודות על הגששים היד והן pericentric (איור 5B, משמאל). Oocytes המכיל שלושה או ארבעה מופרדים דגים מקומות גם בדיקה נחשבים לכידות פגמים (איור 5B, נכון). כדי להיות מסווגים נקודות בודדות, שני אותות הדגים חייבים להיות מינימלית מופרדים כל בתלת מימד על ידי המרחק המתאים לקוטר של ספוט מהקטן לגדול. דק חוטי חלש חיבור שני מקומות דגים אינן נדירות. אותות כאלה אינם נחשבים מופרדים לחלוטין, ולכן אינן נספרות בתור מופעים של לכידות פגמים.

עם החללית הכלאה 6E-7B הזרוע, כ 15-20% oocytes עם תמונה חסרה לחלוטין אות או האות היה חלש מכדי בביטחון ניקוד. בנוסף, בערך 5% oocytes עם תמונה הציג אזור גדול של האות כרומוזומלית ' מאטום לשקוף ', אלו שנמחקו מניתוח. לעומת זאת, זה היה נדיר לפגוש oocytes אשר האות הכלאה pericentric היה חסר או גם לפזר את התוצאה.

החללית הזרוע 6E-7B שימש בהרחבה לכמת הזרוע ליקויים לכידות-prometaphase, מפה של עצרתי דרוזופילה oocytes של אחרים שונים19. כאשר יחידת משנה cohesin SMC3 היו על הרצפה במהלך אמצע prophase, 16.3% oocytes מבוגר ניתחו הכילה יותר מאשר שתיים לחמש נקודות, מעיד על אובדן מוקדמת של הזרוע לכידות לעומת זאת, הבחנו הזרוע מופרדים כתמים ב- 5.1% בלבד של oocytes שהכילה רמות נורמליות של SMC319. מעניין, למרות התדירות של הזרוע לכידות פגמים היה גבוהות מרובים אחרים תמונות ציפורים, אחותי chromatids הופרדו לעיתים רחוקות שלהם אזורים pericentric19.

Figure 1
איור 1: תלויי-גיל אובדן של לכידות במהלך prophase המורחבת אעצור של מיוזה הנשי יכול לגרום שגיאות בסגרגציה כרומוזום, aneuploidy בתוך הביצה. לכידות מיוצג על-ידי קווים שחורים בין האחות chromatids. זרוע לכידות פונקציות להחזיק homologs רקומביננטי יחד והוא נדרש עבור הפרדה מדויקת ב "אנאפאזה" אני. אם הזרוע לכידות אובד בטרם עת, כרומוזום missegregation יכול להתרחש, וכתוצאה מכך ביצה aneuploid. איור זה הותאם הפניה19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גודל של מולקולות DNA אחרי הפיצול BAC והגברה (משמאל) ואחרי אנזים הגבלה עיכול (מימין) עבור שלושה BACs שונה. 400 ננוגרם של מוצרי ה-DNA מוגבר מוצגים בסמטאות שלושת. המסלולים שלושת להציג שברי דנ א לאחר התקציר הגבלת לילה. המוצרים DNA מוגבר נעות בין 200 bp עד 3 kb. לאחר לעכל את ההגבלה, רוב שברים נע בין 100-200 bp, אבל שברים גדולים יותר (עד 500 bp) היו גלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: כלים ציטולוגיה. כלים המשמשים פרוטוקול: (1) זוג מלקחיים (דומונט #5); (2) טונגסטן המחט; (3) צלחת באר עמוקה עם מכסה; (4) רדוד זכוכית לנתח מאכל; (5) משך פסטר פיפטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. סידור ותנועה של שקופיות עבור מתגלגל oocytes. (א) תרשים של השקופית להגדיר עבור המתגלגל של oocytes כמפורט בפרוטוקול. האזור הכהה יותר מציין את החלק זכוכית חלבית של השקופית. (B) הכיוון של התנועה וקטורים עבור שקופית #2 בזמן oocyte מתגלגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. דגים assay תוצאות. (א) מפרטים טכניים מתארת את כרומוזום X דרוזופילה ו זרוע שני רגשים (6 BACs כל) ואיפה החללית pericentromeric 22 oligonucleotide תיאר בפרוטוקול hybridize. פשטות, החללית 6E-7B תוצמד 7 ב, החללית 2F - 3C הנקרא 3 ג (B) להחליפן בתמונות של דגים תוצאות (6E-7B העצמית) עבור לכידות הזרוע שלם (הזרוע שני בדיקה כתמים, אחד לכל homolog) ועבור לכידות שיבשו את הזרוע (3-4 הזרוע בדיקה כתמים). הדנ א הוא כחול, האות בדיקה הזרוע הוא צהוב, האות בדיקה pericentric הוא אדום. תמונות תואמים לתחזיות העוצמה המקסימלית של סדרת Z לאחר שיפור deconvolution והחדות. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. איור זה הותאם הפניה19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש של דגים רגשים להעריך מצב היד לכידות ב prometaphase אני מפה של אני דרוזופילה oocytes הוא קידום משמעותי בשדה של מיוזה דרוזופילה . מבחינה היסטורית, חוקרים דרוזופילה היה מוגבל ל בדיקות גנטיות להסיק מוקדמת אובדן היד לכידות בוגרת oocytes11,18,19. עכשיו, עם השיטות המובאות כאן, המדינה של הזרוע לכידות יכול להיות לבדיקה ישירות באמצעות דגים. היכולת לקבל ראיות פיזיות לירידה מוקדמת של הזרוע לכידות מאוד מרחיב את הרפרטואר של גישות זמין לחקור את המנגנונים להוביל לאובדן מוקדמת של הזרוע לכידות והסכמה כרומוזום missegregation ב דרוזופילה oocytes.

שלבים קריטיים
אמנם לא ערכנו ניתוח שיטתי של פרמטרים קריטיים הכרחי עבור ויזואליזציה מוצלחת של החללית פלורסנט זה hybridizes כדי עותק בודד רצפים לאורך הזרוע כרומוזום בבוגרת דרוזופילה oocytes, אנו מציעים להלן רשימת הגורמים שתרמו להצלחה של טכניקה זו. כדי להפיק את המכשיר ביד, היינו שילוב של שישה חופפים הגששים BAC שמכסים מרווח של-0.8 Mb על ה- X-כרומוזום הזרוע. ניסיונותינו הראשונית באמצעות BACs פחות שהשתרעו אזור קטן יותר לא היו מוצלחים. בנוסף, השתמשנו בשיטה קטע, להגביר את ה-DNA BAC לפני סיום-תיוג עם אלקסה-647. הרוב המכריע של שברי הגבלה כי הודבקו תוויות היו 100-200 bp ארוך (איור 2), אשר מסכים עם הגודל היעד של נוקלאוטידים 150 הדרוש עבור דיפוזיה יעילה דרך רקמות בעובי21. תנאים קיבוע לשמר את המורפולוגיה של oocyte דרוזופילה גדול, אך גם לאפשר חדירה בדיקה חיוניים. אנחנו שינוי השיטה שלנו קיבוע שנעשה בה שימוש בעבר23 על-ידי הוספת בטמפרטורת החדר heptane ב פתרון פתרון טרופה על 37 מעלות צלזיוס. אנחנו חושבים שזה אפשרי כי הן תוספת של heptane ב להגברת החדירה דרך קרום vitelline, כמו גם הטמפרטורה הוריד עבור קיבעון תרמו קיבוע מוצלחת תנאים ויזואליזציה של הזרוע לכידות.

כאשר assaying לירידה מוקדמת של לכידות, אחד דורש גודל דגימה המאפשר כימות של פגמים הקיימים בנמוך עד בינוני רמות. כדי לקבל מספר רב של oocytes בוגר, אחרים השתמשו בלנדר שיבוש של נשים בוגרות בשילוב עם ניפוי 26,27. כאן נתאר שיטת יד לנתח השחלות של 20-25 נקבות, עם הפרדה ידנית של המנוח שלב oocytes על ידי pipetting. בעוד השיטה ניפוי/בלנדר צריך גם לעבוד עם פרוטוקול זה, אחד היתרונות של ניתוח יד הוא כי ללא השלב sieving, oocytes פחות זמן במאגר לפני קיבוע, אשר מפחית את הסיכוי "אנאפאזה" אני תחילת עקב ביצה מלאכותית הפעלה. בנוסף, שיטה זו דורשת פחות נקבות כמתחילה חומר משתמשת בכמויות קטנות יותר של ריאגנטים, יש זרימת עבודה פשוטה יותר, אשר מאפשרים עיבוד מרובים אחרים.

הפרדה לנתיחה, ידני יד oocytes בוגרת מספק כמויות מספיקות של oocytes "לגלגל" להסרת קרום chorion ו- vitelline ותוצאות כ 75-150 oocytes בסוף שוטף הכלאה. טריק אחד כדי למקסם את התשואה של מפה של עצרתי oocytes הוא להחזיק את הנקבות בתולה בקבוקונים yeasted בהיעדרו של זכרים לפני ניתוח25. Oocyte מתגלגל כדי להסיר chorions וממברנות vitelline חייב להתבצע עם מגע עדין על מנת למנוע השמדת oocytes. עם זאת, הסרת chorions וממברנות vitelline של oocytes 100% היא לא מטרה מציאותית ותוצאות מופרז מתגלגל רק הפסד של oocytes. לכן, בכל מחזור מתגלגל להפסיק מתי כ- 75-85% של oocytes חוסר chorions, ממברנות vitelline.

מגבלות
למרות ההצלחה שלנו-יצירת ושימוש הגששים הזרוע כדי לנטר את מצב לכידות בבוגרת דרוזופילה oocytes, הנוהל עדיין סובל מגבלות. אמנם לעיתים נדירות נכשלנו לזהות סיגנל החללית pericentromeric, האות בדיקה זרוע היה חלש או נעדר כ 15-20% של oocytes כי אנחנו עם תמונה. גורם תורם אחד עשוי להיות חדירה דיפרנציאלית של המכשיר oligonucleotide pericentric (22-28 נוקלאוטידים) לעומת המכשיר הזרוע גדול יותר (100-200 נוקלאוטידים). בנוסף, הרצף חוזרות גדולות המוכרות בתוצאות בדיקה pericentric אות כי הוא בהיר יותר מזה עבור המכשיר הזרוע. הכיוון של oocyte ואת המיקום של כרומוזומים meiotic בתוך oocyte גם להציג לאתגר כאשר הדמיה. למרות הכרומוזומים meiotic יחסית קרוב קליפת תא, זה בלתי אפשרי לשלוט בכיוון oocyte כאשר גובר על coverslip. לכן, בשבריר קצת oocytes, meiotic הכרומוזומים עשויים להיות 100-200 מיקרומטר מן coverslip את עוצמת האות, איכות ייתכן מושפעים באופן שלילי כאשר מנסים תמונה דרך עיקר oocyte. מגבלות אלה אומר המספר של oocytes כולל ניתוח כמותי הסופי הוא נמוך משמעותית ממספר oocytes עיבוד הפרוטוקול. קביעת המדינה של הזרוע לכידות ב 100 oocytes קרוב לוודאי ידרוש שני תכשירים עצמאית. גורם מגביל נוספות לכימות לכידות פגמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר הוא הזמן הדרוש כדי ללכוד סידרה Z טיפוסי (כ 5 דקות), אפילו כאשר האזור הלכוד מוגבל 1,024 x 512 פיקסלים. משמעות הדבר היא כי השוואה של לכידות שליטה, ניסיוני אחרים (100 oocytes כל) מחייבים כ 16 שעות של זמן אוסף תמונות.

שינויים ופתרון בעיות
היינו מסוגלים לנטר את מצב היד לכידות באמצעות בדיקה מזהה כרומוזום ה- X -6E-7B עמדה cytological19. בדיקה אשר hybridizes למיקום דיסטלי יותר על כרומוזום ה- X יכול להיות רצוי יותר לגילוי הכשל בהיקף תחזוקה. בנוסף, חוקרים אחרים ייתכן שתרצה לנתח את הזרוע לכידות על כרומוזום אחרים. בעוד אנחנו לא מנסים לחקור את autosomes, המידע הראשוני מציינים כי בדיקה מזהה האזור 2F - 3C של כרומוזום ה- X גם התוצאה היא אות לזיהוי. עם זאת, על סמך נתונים ראשוני מוגבלים, האות של המכשיר 2F - 3C עשוי להיות פחות "קומפקטית" יותר עבור המכשיר 6E-7B. למרות הסימנים דג חזק וחדים עבור כמה כרומוזומים oocyte, האות הכלאה על הכרומוזומים של אחרים oocytes הוא הרבה יותר מפוזר. הבדלים אלה אות משקפים הבדלים מקורית כרומוזום מורפולוגיה בין שני המיקומים cytological, השתנות יעילות הכלאה של השני רגשים, או השתנות סטוכסטי רק בין oocytes שונים יהיה דורשים ניתוח מעמיק יותר.

חשוב, אפילו בשביל לרכב הגישוש 6E-7B, הבחנו אות כרומוזומלית ' מאטום לשקוף ' ב כמה oocytes, ואת זה לעתים קרובות המתחייבות שלהם תצדיק את ניתוח. בנוסף, יש לנו לב וריאציה של איכות אות והבהירות בין תכשירים שונים של המכשיר 6E-7B, שדרשו את ההדמיה פרמטרים ניתן להתאים בהתאם. העלאת הטמפרטורה הכלאה עד 42 ° C לא להפחית את מספר oocytes עם האות ' מאטום לשקוף ', אבל זה להשפיע קשות את האות עבור המכשיר oligonucleotide pericentric. במאמץ לשמר טוב יותר מורפולוגיה כרומוזום24, אנחנו גם צעד דנטורציה יותר בטמפרטורה נמוכה יותר (80 ° C) אבל מצא כי טיפול זה הגביר את עוצמת האות וגם לא צמצמה את מספר oocytes עם ' מאטום לשקוף ' האות דגים כרומוזומלית. אנחנו גם ניסה לקבל אות יד בהיר יותר באמצעות 12 BACs חופפים המתאים מרווח כ- 1.5 Mb שהשתרעו אזור cytological 5E-7B. כאשר באמצעות בדיקה BAC 12, מידת וריאציה בעוצמת האות, כמו גם את אחוזי oocytes חסר אות היה שונה כאשר BACs שישה שימשו כדי ליצור את המכשיר ביד. זה היה גם מאתגרת יותר להבקיע לכידות פגמים בעת שימוש המכשיר BAC 12 כיוון האותות דגים היו גדולים יותר, וכך קשה יותר לפתור את המקומות המתאימים chromatids בודדים. במקרים שבהם אין אות מתקבל גשש החדש מוכן, חוקרים צריכים לבדוק את גודל מוגבר, הגבלת מתעכל BAC DNA כדי לאשר כי השברים משמש תיוג סוף הם בעיקר בטווח bp 100-200. . זה עשוי להיות אחד הגורמים הקריטיים ביותר לקראת בדיקה מוצלחת.

כיוונים לעתיד
העבודה כדי לשפר את ייבוא תמונות, כמו גם בהתאמת פרוטוקול כדי לכלול immunostaining יהיה שיפורים משמעותיים זה יפיק תועלת חוקרים אחרים. במהלך אוסף תמונות, אוסף מספר רב יותר של תמונות ממד צירית, כמו גם ייבוא תמונות מהר יותר יהיה יתרון עבור לכימות לכידות פגמים. מיטוב את הפרמטרים הדמיה עבור לייזר קונפוקלי סורק, מצאנו כי אותות 0.25 מיקרומטר היה גודל הצעד הקטן ביותר שניתן להשתמש בו עבור סדרת Z כדי למנוע הלבנת ניכר של הדג. אולם, עבור אותות דגים המופרדים באמצעות מיקרומטר פחות מ 0.25 במחסנית Z, גודל צעד זה עלול לגרום לכישלון כדי ללכוד את "הרווח" בין מוקדים, עשויים להעריך שלא כראוי את מספר פגמים לכידות. תמונות מהר יותר רכישה מהירות דיסק מסתובב קונפוקלי עשוי לאפשר בגדלים קטנים יותר צעד לשמש ללא האות הלבנה. זה לספק שחזור תמונה מדויקת יותר בממד צירית וכן היתר מספר גדול של oocytes כדי להיות מנותח לכידות פגמים. בנוסף, היכולת לשלב את immunostaining עם דגים ויזואליזציה של מצב היד לכידות לשפר באופן משמעותי את הפרוטוקול. מספר של ההכנות, ניסינו לבצע immunostaining פלך בעקבות ההליך הכלאה. אולם, צירים חזקים מכתים היה גלוי רק חלק קטן oocytes. יתר על כן, מסיבות לא ברורות, רמות גבוהות יותר של אותות דגים כדין מוקף הכרומוזומים meiotic כאשר דגים, immunostaining היו משולב. עבודה נוספת כדי למטב את הפרוטוקול לאפשר immunostaining לפני או אחרי הניתוח דגים ירחיב באופן משמעותי את היכולת של טכניקה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט GM59354 מוענק שרון אי ביקל. אנו מודים הוי נגוין ש לקבלת סיוע בפיתוח הפרוטוקול ליצירת זרוע פלורסנט הגששים, אן Lavanway לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ולאחר ג' ריד אמיליאנו לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם יחד עם עמיתים רבים בקהילה דרוזופילה עבור דיונים מועילים ועצות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 130 דרוזופילה מיוזה oocyte האחות כרומטידה לכידות לכידות הזרוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים)
באמצעות קרינה פלואורסצנטית <em>בחיי עיר</em> הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני <em>דרוזופילה</em> Oocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter