Summary
이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.
Abstract
인간에서는, oocytes에서 염색체 분리 오류 유산 및 기형 아 출산의 대부분에 대 한 책임이 있습니다. 또한, 여자 나이, 그들 마음속에 aneuploid 태아는 극적으로 증가 하 고이 현상의 위험 모성 연령 효과로 알려져 있다. Meiotic 분열 동안 정확한 염색체 분리에 대 한 요구 사항 중 하나는 자매의 유지 보수 oocytes 경험 확장된 의향 기간 chromatid 단결력. 인간 및 모형 유기 체에서 cytological 증거 meiotic 단결력 노화 과정 동안 악화 나왔다. 또한, 인간의 oocytes에서 분리 오류는 감수 분열 중 가장 널리 퍼진 나 팔 단결력의 조 손실와 일치. 모델 생물의 사용은 기초가 단결력의 연령에 따라 손실 메커니즘을 탈피 중요 합니다. 초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집력의 규칙을 공부에 대 한 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 최근까지, 유전 시험만 팔 응집력 oocytes 다른 genotypes 또는 다른 실험 조건에서의 손실에 대 한 분석 결과를 사용할 수 없었습니다. 여기, 상세한 프로토콜 형광에서 제자리에서 사용 하기 위한 교 잡 (물고기)을 직접 시각화 결함 prometaphase 팔 응집력에 나 고 분열 초파리 oocytes를 체포 하는 제공 됩니다. X 염색체의 원심 팔 hybridizes를 물고기 프로브를 생성 하 여 수집 하는 confocal Z 스택 연구원 수 3 차원에서 개별 물고기 신호의 수를 시각화 하 고 자매 여부 결정 chromatid 무기 분리. 설명한 팔 단결력 결함 초파리 oocytes의 수백에 계량을 가능 하 게. 따라서,이 방법은 단결력 유지 보수 뿐만 아니라 노화 과정의 죽음으로 이어질 요인에 기여 하는 메커니즘을 조사는 중요 한 도구를 제공 합니다.
Introduction
유사 분열, 감수 분열 동안 염색체의 적절 한 분리 필요 그 자매 chromatid 단결력, 유지, 설립 될와 조정된 패션1,2에 발표. 단결력 S 단계 설정 되 고 복잡 한, 자매는 실제 관계를 형성 하는 cohesin에 의해 중재 chromatids 함께. 감수 분열에서 결합 한 크로스 오버를 원심 또한 함께 재조합 homologs를 기능과이 실제 협회를 통해 올바른 방향이는 분열에의 나는 (그림 1)3,4, 스핀 들 5. 팔의 릴리스 anaphase에 응집력 나 반대 스핀 들 극을 분리 하는 homologs 수 있습니다. 그러나, 팔 단결력은 경우 중간, 손실 재조합 homologs 그들의 물리적 연결을 잃게 되며 임의로, 분리는 aneuploid gametes (그림 1)에서 발생할 수 있습니다.
인간의 oocytes에서 염색체 분리에 오류 유산 및 기형 아 출산, 다운 증후군6, 등의 주요 원인이 되며 그들의 발생 산 모 나이7기 하 급수적으로 증가. 자매 chromatid 단결력 태아 oocytes에서 설정 되 고 meiotic 재결합 출생 하기 전에 완료 됩니다. Oocytes 다음 체포 중간 의향에 나 배 란까지 고이 체포 하는 동안, 재조합 homologs의 지속적인된 물리적 협회 의존 자매 chromatid 단결력. 따라서, 감수 분열과 정상 임신 결과 정확한 분리 결합 최대 5 년간 그대로 유지 해야 합니다.
인간의 oocytes의 장기간된 meiotic 체포 중 응집 조 손실 모성 연령 효과에 기여할 제안 되었습니다와 증거의 여러 줄이 가설8,9를 지원 합니다. 그러나,이 현상의 우리의 이해의 대부분 모델 생물5,10,,1112, 를 사용 하 여 의존 인간의 oocytes meiotic 응집력의 과제를 감안할 때, 13,,1415.
초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집과 염색체 분리의 연구에 대 한 수많은 이점을 제공합니다. 간단한 유전자 분석 결과 수 aneuploid gametes에서 자손을 복구 하 고 X의 충실도 측정-대규모11,,1617에 염색체 분리. 또한, 하나 또한 나 팔 단결력11,18, 의 조 손실에 일치 하는 표현 형 감수 분열 시 재조합 homologs missegregate 때문에 염색체 분리 오류 발생 여부를 결정할 수 있습니다 19. 초파리 oocytes meiotic 응집력의 상태 관찰은 또한 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 직접. 비록 반복적인 위성 시퀀스에 교배 하는 형광 oligonucleotides 사용 되었습니다 10 년 이상 모니터링 성숙 초파리 oocytes4,20, 팔의 분석에서에서 pericentromeric 결합 하 단결력은 더욱 어려운 되었습니다. 팔 단결력의 상태 시각화 단일 복사본의 큰 영역에 걸쳐 프로브 시퀀스 이며 충분히 밝은 결과 개별 여동생에 대 한 표시 신호 chromatids 팔 단결력은 결 석 하는 경우 필요 합니다. 또한, oocyte 고정 조건 및 레이블이 지정 된 DNAs의 크기 큰 성숙한 초파리 oocyte (200 µ m 넓은 500 µ m 길이 의해)에 침투21 를 촉진 해야 합니다. 최근, 한 팔 조사는 성공적으로 활용, 하지만 저자 anaphase 동안 초파리 oocyte chromatids를 시각화 하기 위해 명시 된 그들은 prometaphase에 신호를 감지 하지 못했습니다 또는 분열 oocytes22를 체포. 여기 우리는 X의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제공-염색체 팔 물고기 조사 조건과 oocyte 준비 나 하 고 분열 chromatid 응집력 prometaphase 언 니의 조기 상실에 대 한 분석 결과 허용 난 oocytes. Meiotic 단결력의 유지 보수에 필요한 유전자 제품을 사용, 이러한 기술을 동생에 대 한 분석 결과를 다른 수 chromatid 단결력 다른 genotypes의 성숙한 초파리 oocytes에 결함.
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Protocol
1입니다. 준비
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형광 제자리에서 교 잡 (물고기)에 대 한 솔루션을 준비 합니다. 초순 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다.
- 5 수정 Robb의 버퍼 배 준비: 275 mM 칼륨 아세테이트, 아세트산 나트륨 200 m m, 500mm 자당, 50 m m 포도 당, 염화 마그네슘 6 m m, 5 m m 염화 칼슘, 500 mM HEPES pH 7.4 =. PH 7.4 10 N NaOH를 사용 하 여가지고. 필터를 소독 하 고-20 ° c.에 저장 해 동 하 고 필요에 따라 1 x 희석-20 ° c.에 1 x aliquots를 저장
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1.3 M NaCl, 70 m m 나2HPO4, 30 mM NaH2포4를 사용 하 여 x 10을 준비 합니다. 7.0 10 N NaOH를 사용 하 여 pH를가지고. 압력가 마로 소독 또는 필터 살 균, 소독.
-
폴 리-L-리 신 coverslips 1 일 준비 필요 하기 전에.
- 플라스틱 70% 에탄올 18 m m x 18 m m #1.5 coverslip의 표면에 1% 염 산을 포함 하 고 5 분 액체를 제거를 사용 하 여 진공 포부를 품 어. 불 임 초순와 반복. 0.1 mg/mL 폴 리-L-리 신으로 coverslip의 표면을 커버 하 고 10 분 동안 품 어.
- 액체를 제거 하 고 10 분 저장소 coverslips 폴 리-L-리 신 쪽 먼지를 피하기 위해 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 용기에 대 한 건조 한 공기를 발음.
- 가져온된 파스퇴르는 oocytes를 제거 하지 않고 액체 솔루션을 제거 하는 펫 준비. 분 젠 버너 불꽃 위로 당기면 부드럽게 각 끝에 유리와 녹아 떨어져 끌 때까지 긴 유리 파스퇴르 피 펫의 중간 열.
2입니다. 생선 팔 프로브 생성
참고: 모든 원심 분리기 단계 ~ 16000-21000 x g (대부분 가기 테이블 microcentrifuges에 최대 속도)에 수행 됩니다. 5-15 미 소용돌이 나타냅니다 ~ 15에 대 한 vortexing에 대 한 간략 한 원심 분리기 회전 회전을 나타내는 s 맥스에서 별도로 명시 하지 않는 한 속도.
참고: BACs 팔 프로브에 대 한 BAC PAC 자원에서 얻을 수 있습니다. 2 개의 X 염색체의 euchromatic 팔 프로브가이 방법으로 성공적으로 사용 되었습니다. 한 팔 프로브 구성 되었다 6 개의 BAC 클론의 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11) 밴드에 cytological에 해당. 하 cytological 밴드 2 층-3 C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13)에 해당 하는 6 개의 BAC 클론 다른 팔 조사에 의하여 이루어져 있다. BACs 지역에서 찾아볼 수 있습니다 다른 초파리 염색체에: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. X 염색체의 359 bp 위성 반복을 인식 하는 2 개의 pericentric 프로브는이 방법으로 성공적으로 사용 되었다. 22 뉴클레오티드 프로브 광범위 하 게 사용 되 고 (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23를 작용 한다. 28 뉴클레오티드 프로브 테스트 최근 고도 작용 (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC 정화 oligonucleotides 5' 특정 fluorophore 표시 명령 했다 (예를 들어, 통합의 DNA 기술) 상업 소스에서.
- BAC 클론 DNA 키트 재료의 테이블에에서 지정 된 지침에 따라 준비. 200 µ L 테;에 문화의 100 mL에서 얻은 DNA 펠 릿 resuspend 최종 DNA 농도 BAC 클론에 따라 5-40 ng / µ L 사이 배열 해야 한다.
- 증폭 키트를 사용 하 여 재료, 테이블과 다음 프로토콜에 지정 된 대로 각 혈에 대 한 DNA 증폭을 수행 합니다. 각 복제본에 대 한 BAC DNA를 개별적으로 처리 합니다. 효소 및 단계 2.2.3 통해 2.2.1 키트와 함께 제공 된 버퍼를 사용 합니다.
- BAC DNA의 임의의 분열: 각 혈 중 알코올 농도를 사용 하 여 테 10 µ L 200 µ L PCR 튜브에 1 ng / µ L DNA 솔루션의 준비. 10 X 조각화 버퍼의 1 µ L를 추가 합니다. 튜브 PCR 기계에 정확히 4 분 동안 95 ° C에 즉시 차가운 얼음 물에 샘플 놓고 짧게 원심. 보육 시간에 민감한 이며 어떤 편차 결과 변경할 수 있습니다.
- 라이브러리 준비
참고:이 방법은 amplifiable 파편의 라이브러리를 생성 하기 위해 임의의 뇌관 사용.- 튜브를 포함 하는 DNA 다음 추가 합니다: 라이브러리 준비 버퍼, 라이브러리 안정화 솔루션의 1 µ L x 1의 2 µ L. Vortexing에 의해 철저 하 게 혼합, 짧게, 원심 및 튜브 PCR 기계에 2 분 동안 95 ° C에 즉시 차가운 얼음 물에 샘플 놓고 짧게 원심.
- PCR 튜브, 믹스, 그리고 분리기를 간단히 라이브러리 준비 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 장소 PCR PCR 기계에 튜브와 같이 품 어: 20 분, 20 분, 20 분, 75 ℃ 5 분 동안 37 ° C 24 ° C에서 16 ° C는 다음 4 ° c.에서 개최
- PCR 기계에서 샘플을 제거 하 고 짧게 원심. 샘플 즉시 증폭 또는-20 ° C에서 최대 3 일 동안 저장 될 수 있습니다.
- BAC DNA 도서관의 확대
- 전체 15 µ L 임의 조각 반응에 다음과 같은 시 약을 추가: 증폭 마스터 믹스, 47.5 µ L x 7.5 µ L 10 Nuclease 무료 물, 5 µ L WGA DNA 중 합 효소. Vortexing에 의해 철저 하 게 혼합 하 고 짧게 원심.
- 장소 PCR PCR 기계에 튜브와 같이 품 어: 3 분, 15에 대 한 변성 94 ° C에서의 14 주기 초기 변성 95 ° C s, 5 분, 65 ° C에서 어 닐 링/확장명 다음 4 ° c.에서 개최
- 자전거 완료 되 면, DNA 농도 분석 결과. DNA의 농도 최소 이어야 한다 ng / µ L. 4 ° C에서 유지 견본 또는-20 ° C까지에 게 소화에 대 한 준비. 필요한 경우, 400를 실행 하 여 DNA 조각 크기를 평가 2 %agarose 젤에 DNA의 ng. 200에서 조각 다양 혈압 3 kb (그림 2).
- 증폭 된 DNA의 금지 효소 소화
- 1.5 mL microfuge 관에서 이전 섹션에서 증폭 된 DNA의 장소 20 µ g. Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, BfuCl, 0.5 µ L 100 x BSA, 금지 효소 소화 버퍼, x 5 µ L 10의 25 단위, 20 단위를 추가 하 고 초순 H2o.의 적절 한 금액을 추가 하 여 50 µ L에 양을 맞추십시오
- 뚜껑에 응축을 방지 하기 위해 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 다이제스트를 품 어. 에탄올 침전 소화 DNA. 다이제스트에 추가: 1 µ L glycogen, 1/10 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트, 2.5 볼륨 100% 분자 학년 에탄올. -80 ° C 1 시간 또는 하룻밤에서 품 어.
- 4 ° c.에 30 분 동안 원심 분리기 객실 온도 70% 에탄올과 스핀 4 ° c.에서 5 분의 1 볼륨 씻어 DNA 펠 릿 제거는 상쾌한 고 펠 렛 건조 공기 또는 공기의 꾸준한 부드럽게 건조 DNA.
- 36 µ L 살 균 초순 H2O DNA 펠 릿을 resuspend 하 고 DNA의 1 µ L를 사용 하 여 약 285 이어야 한다 DNA 농도 분석 결과 ng / µ L.-20 ° c.에 DNA 저장
- 선택적으로 DNA 조각 크기 400 실행 평가 2 %agarose 젤에 DNA의 ng. 대부분 조각 500 약해요 신호 100-200 bp에서 다양 bp (그림 2).
- 3 ' 미행 반응
- 열 블록에 1 분에 100 ° C에서 소화 DNA 변성 바로 얼음 물에 침착 해. DNA의 35 µ L를 다음 추가 합니다: 50 µ L 400 m m 나트륨 cacodylate, 1 µ L 10 mM DTT, 그리고 소용돌이 잘. 4 µ L 25 mM CoCl2, 2.5 µ L 2 m 5 m-(3-aminoallyl)-dUTP 라벨 키트 5 x TdT 버퍼, 그리고 1 µ L 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) 400 U 재료, 5 µ L 1 m m dTTP, 18 µ L의 테이블에 지정 된 ARES에서 추가 / µ L. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
주의: CoCl2 독성, 적절 한 보호를 착용. - 결로 방지 하기 위해 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어. 250 mM EDTA 반응과 소용돌이를 섞어 잠시 중지의 1 µ L를 추가 합니다. 에탄올 (단계 2.3.2-2.3.4) 위에서 설명한 대로 꼬리 DNA를 침전. Resuspend 10 µ L 살 균 초순 H2o. 저장소에에서 말린된 DNA 펠 릿 DNA-20 ° C에서 계속 하 준비까지.
- 열 블록에 1 분에 100 ° C에서 소화 DNA 변성 바로 얼음 물에 침착 해. DNA의 35 µ L를 다음 추가 합니다: 50 µ L 400 m m 나트륨 cacodylate, 1 µ L 10 mM DTT, 그리고 소용돌이 잘. 4 µ L 25 mM CoCl2, 2.5 µ L 2 m 5 m-(3-aminoallyl)-dUTP 라벨 키트 5 x TdT 버퍼, 그리고 1 µ L 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) 400 U 재료, 5 µ L 1 m m dTTP, 18 µ L의 테이블에 지정 된 ARES에서 추가 / µ L. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
- 형광 염료 활용 자료 테이블에 지정 된 대로 DNA 라벨 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
참고: 염색 추가 되 면 어둠 속에서 샘플을 계속.- 열 블록에 5 분 동안 95 ° C에서 꼬리 DNA 변성 즉시 차가운 DNA 얼음 물과 원심 분리기에 짧게. 키트의 지침에 따라 라벨 버퍼를 준비 하 고 각 DNA 샘플을 6 µ L를 추가 합니다. 키트에서 DMSO의 4 µ L에 염료의 각 튜브를 resuspend. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
- 염료에의 한 튜브를 사용 하 여 각 라벨 반응에 대 한. 짧게 DNA, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 염료 솔루션을 추가 합니다. 어둠 속에서 2 h에 대 한 실 온에서 라벨 반응을 품 어. 추가 3 M hydroxylamine 77 µ L nuclease 무료의 뒤 반응을 중지 하의 3 µ L H2O 키트에서. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
- 자료의 테이블에 지정 된 대로 PCR 정화 키트를 사용 하 여 비 활용 된 염료를 제거 합니다. 제조업체의 지침을 따릅니다. 두 번 40 µ L 차입 버퍼의 각 시간을 사용 하 여 열에서 DNA을 elute.
- 에탄올 침전 이전 설명 레이블이 DNA (단계 2.3.2-2.3.4). 10 µ L 차입 버퍼에 말린된 DNA 펠 릿을 resuspend.
- 프로브 혼합물 준비
- 레이블이 지정 된 dna pmol / µ L에 형광 색소 염료의 농도 결정 합니다. Fluorophore 농도 30-100 pmol / µ L, BAC 따라에서 범위 수 있습니다. DNA 농도 300-800 ng / µ L에서 범위 수 있습니다.
참고: microarray 설정은 microvolume 분 광 광도 계, 자료의 테이블에 지정 된 것과 같은 잘 작동 합니다. Microarray 창에서 DNA-50을 선택 하 고는 형광 색소를 지정 합니다. - 아데닌 양의 (pmol fluor) 각 BAC 프로브를 결합 하 여 믹스 마스터를 만듭니다. 결합 하기 전에 소용돌이 30 s. 냉동/해 동 주기를 방지 하려면 마스터 믹스의 aliquots을 준비, 파라핀 필름 증발을 방지 하 고-20 ° c.에 어둠에 저장 튜브 적용
참고: 포함 하는 각 6 개별 BAC의 250 pmol mastermix 프로브는 30-50 µ L 작품의 전체 볼륨에 잘 합니다. 각 혈에 대 한 25 pmol (형 석)을 포함 하는 약 수 0.31 pmol 형 석 / µ L 각 혈에 대 한 최종 조사 농도로 두 40 µ L 교 잡 반응에 대 한 충분 한 될 것입니다.
- 레이블이 지정 된 dna pmol / µ L에 형광 색소 염료의 농도 결정 합니다. Fluorophore 농도 30-100 pmol / µ L, BAC 따라에서 범위 수 있습니다. DNA 농도 300-800 ng / µ L에서 범위 수 있습니다.
3. 해 부 및 Oocytes의 고정
- 적절 한 유전자 형의 30 성인 처녀 여성을 수집 합니다. 늦은 단계 oocytes에 대 한 풍부 하 게 해 부25전에 3-5 일에 대 한 사용 비행 음식과 건조 효 모와 함께 유리병에 남성 없이 여성을 잡아. 해 부, 전날 누 룩과 신선한 유리병을 가스 없이 여성을 전송 합니다.
-
해 부를 수행 합니다.
주: 필요한 도구에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오. 솔루션은 다른 설명이 없는 한 가져온된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 됩니다. 난소를 항상 전송할 때 10 %BSA 해결책으로 피 펫 팁을 사용 합니다.- 수정 Robb의 버퍼를 포함 하는 얕은 해 접시, 집게를 사용 하 여 단일 여성에서 난소를 제거 하. 집게를 사용 하거나 내부 ovarioles에 연결할 솔루션을 수 있도록 각 난소를 부드럽게 퍼짐에 텅스텐 바늘. 1 mL 수정 Robb의 버퍼를 포함 하는 1.5 mL microfuge 관 splayed 난소의 쌍을 전송 합니다.
- 3.2.1 1.5 mL microfuge 관에서 20-25 여성에서 난소를 축적 단계를 반복 합니다. 10 분 이내 20-25 여성의 해 완료.
-
다음과 같이 고정을 수행.
- 가져온된 파스퇴르 피 펫과 microfuge 관에 액체를 제거 하 고 신속 하 게 난소를 37 ° C 수정 솔루션의 500 µ L을 추가 하는 P1000 사용 즉시 난소에 실내 온도 헵의 500 µ L 추가.
- 혼합 하 고 3 분에 대 한 nutator에 흔들어 microfuge 관 하단에 정착 nutator는 oocytes 있도록 1 분 튜브 랙에 장소에서 microfuge 관을 제거 합니다. 총 고정 시간은 4 분 이다.
주의: 수정 솔루션 및 헵 독성, 적절 한 보호를 착용. - 수정 솔루션을 제거 하 고 0.5 %BSA 0.1%를 포함 하는 PBS의 500 µ L에 난소 3 번을 씻어 Triton X-100 (PBSBTx)
- 나머지 genotypes를 반복 합니다.
4입니다. Chorions 및 Vitelline 세포 막의 제거
주: 필요한 도구에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오.
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별도 늦은 단계 oocytes
- 얕은 해 접시를 1 mL PBSBTx를 추가 합니다. 얕은 접시에 고정된 난소 (~ 150 µ L)를에서 전송 하는 P200 BSA 코팅 팁 사용 합니다. 덜 성숙 oocytes에서 성숙한 oocytes를 꺼내 려 BSA 코팅된 피 펫 팁 난소를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.
- 때 늦은 단계 oocytes 충분히 구분 하 고, 모든 조직 500 µ L microfuge 관으로 전송. 가져온된 파스퇴르 피 펫, 떠날에 대 한 과잉 액체를 제거 튜브에 150-200 µ L. 나머지 genotypes 섹션 4.1 반복 합니다.
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압 연에 대 한 준비
- 미리 젖은 PBSBTx. 커버의 200 µ L로 깊은 잘 요리 하 고 따로. 3 서 리 낀된 유리 슬라이드 및 설정된 슬라이드 #3 옆으로 얻을. 함께 슬라이드 # 1과 # 2의 젖 빛된 유리 영역을 문질러 부드럽게. 어떤 유리 파편을 제거 하 고 일회용 닦아 건조 하 이온된 수에 그들을 씻어.
- 한 슬라이드에 PBSBTx의 50 µ L을 추가 하 고 다른 슬라이드와 함께이 지역 문 지르고 하 여 슬라이드 #1 및 #2 PBSBTx의 서 리 낀된 지역 코트. 일회용 지우기 액체를 제거 합니다.
- 그림 4A에 표시 된 구성에서 해 현미경 슬라이드를 놓습니다. 계속 슬라이드 # 3와 #1 및 #2 접촉에서 슬라이드의 반투명된 영역 슬라이드 # 2를 지원 합니다.
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롤 oocytes; 회전의 방향으로 직선에 결코 원형 모션 항상 인지 확인 합니다.
- Prewet는 P200 피 펫 팁 PBSBTx에서 그리고 아래로 pipetting으로 microfuge 관에 oocytes를 분산. 젖 빛된 유리 부분의 슬라이드 # 1의 센터에 액체 포함 oocytes의 50 µ L를 전송 합니다. 슬라이드가 #2 올립니다.
- 액체의 표면 장력 두 젖 빛된 유리 지역 사이 물개를 만듭니다 때까지 천천히 슬라이드 #2 낮은. 충분 한 액체를 두르고 지역을 커버 해야 하지만 아무도 밖으로 들어와서 해야 합니다. 액체 범람 하는 경우 가져온된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 과잉 액체를 제거 하.
- 한 손으로 자리에 하단 슬라이드 (#1)를 보유 하 고 다른 손으로 앞뒤로 슬라이드 #2 수준 및 지원된 슬라이드 #3 유지, 수평 방향으로 가기 슬라이드 (#2)를 사용 하 여. Oocyte 움직임과 진행의 쉽게 시각화를 위한 현미경을 수행 합니다.
참고:이 운동 마찰을 생성 하 고 "롤"와 그들의 chorions를 잃는 oocytes를 일으킬 것 이다. 최소한의 압력을 사용 해야 하 고 짧고 빠른 움직임 이어야 한다. - 수평 방향으로 몇 움직임 후 약간 운동 (그림 4B)의 각도 변경 합니다. 여러 단위로 가기 슬라이드 (#2)의 움직임은 시작 방향 (그림 4B)에 수직 될 때까지 점차적으로 90 °이 각도 증가. Chorions 빈 참고 액체에서 볼 수와 chorions 부족 oocytes 길고 얇은 나타납니다.
- 솔루션은 약간 흐린 됩니다 때까지 단계 4.3.3-4.3.4 7-10 회 정도 반복 합니다. Oocytes (75-85%)의 대다수 그들의 vitelline 막 잃었을 때 회전을 중지 합니다.
참고: 독특한 뾰족한 끝은 종종 oocytes 부족 vitelline 막에 표시. Vitelline 막은 chorions 보다 제거 하기가 더 어렵습니다. 가벼운 압력 vitelline 세포 막의 제거를 달성 하기 위해 중 상단 슬라이드 (슬라이드 2)에 적용할 수 있습니다. Vitelline 막 oocytes는 종종 다른 oocytes의 파괴에 결과에서 제거 하려고 합니다. - 부드럽게 가기 슬라이드 (#2), 두르고 지역의 센터에 축적 oocytes를 압 연 하 하단 슬라이드 (#1) 두르고 지역의 센터의 모서리 중 하나를 끌어. PBSBTx 포함 된 깊은 잘 접시에 PBSBTx와 두 슬라이드에서 oocytes를 씻어.
- 슬라이드 #1 및 #2 초순, 일회용 닦아 건조 깨끗 하 고 다시 설정. 단계 4.3.1-4.3.6 동일한 유전자 형의 모든 oocytes 압 연 때까지 반복 합니다. 이 보통의 유전자 형 당 3-4 라운드를 필요 합니다.
-
압 연 후 이물질을 제거
- 15 mL 원뿔 튜브를 1 mL PBSBTx를 추가 합니다. 튜브의 양쪽 코트 액체를 소용돌이 친다.
- PBSBTx을 사용 하 여 코팅 P1000 피 펫 팁, 포함 하는 PBSBTx. 추가 포함 하는 oocytes 원뿔 튜브에 PBSBTx의 추가적인 2 mL의 1 mL 원뿔 튜브에 깊은에서 압 연된 oocytes 잘 요리 하는 전송.
- Oocytes는 바닥에 정착, 다음 상단 한 P1000와 파편 (chorions, vitellines, 등)을 포함 하는 솔루션의 2 개 mL를 제거 하 고 삭제 하기 시작 하자. 필요한 경우, 그들은 싱크 불투명 oocytes를 보러 어두운 배경 원뿔 튜브를 잡으십시오.
- Oocytes에 PBSBTx의 추가적인 2 mL를 추가 하 고 4.4.3 단계를 반복 합니다. 4.4.3을 반복 합니다. 파편 제거의 3 라운드의 총에 대 한.
- P1000 피 펫 팁, 원래 500 µ L microfuge 관에 다시 전송 oocytes 코팅은 PBSBTx를 사용 하 여. 20-25 여성 연된 성숙 oocytes의 약 50 µ L를 양보 한다.
- 각 유전자 형에 대 한 신선한 두르고 슬라이드, 깨끗 한 깊은 잘 요리와 새로운 원뿔 튜브를 사용 하 여 나머지 genotypes 섹션 4를 반복 합니다.
- 저장소가 필요한 경우 전송 oocytes 0.1 %TritionX-100와 저장소 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤 장기 저장에는 포름알데히드 가교 비 이온 세제에 의해 반전 될 수 있다 때문에 권장 하지 않습니다.
5입니다. 물고기
참고: 모든 세척 수행 됩니다 실 온에서 nutator에 달리 언급 하지 않는 한. 압 연 된 oocytes formamide를 포함 하는 솔루션에 (서) 특히 microfuge 관의 바닥에 정착 더 오래 걸릴. Oocytes는 과정에서 손실 되지 솔루션 변경 때 인내심을 중요 하다. 이 린스와 세척 후 정착 oocytes를 5-15 분을 대기 해야 합니다. 또한 메모는 formamide에 oocytes는 덜 불투명 하는.
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추출 및 RNAse 처리
- 1% 포함 된 PBS의 500 µ L로 oocytes 린스 Triton X-100 (PBSTx). 액체를 제거 하 고 500 µ L 추가 추출 버퍼 (RNAse를 포함 하는 PBSTx). 2 시간에 대 한 실 온에서 nutator에 품 어.
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사전 교 잡 세척
- Oocytes 트윈 20 (SSCT)를 포함 하는 염 분 나트륨 시트르산 x 500 µ L 2와 3 번 씻어. 약 수 (~ 500 µ L/유전자 형) x SSCT + 37 ° c 50% formamide 2의 예 열
주의: formamide 독성, 적절 한 보호를 착용. - 500 µ L 2에서에서 3 시간 10 분 대 한 oocytes를 씻어 x SSCT. X SSCT + 20% formamide 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어. X SSCT + 40% formamide 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어. X SSCT + 50% formamide 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어.
- 액체를 제거 하 고 샘플링 하 고 회전 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어 5.2.1 단계에서 37 ° C 2 x SSCT + 50 %formamide 500 µ L를 추가 합니다.
참고:는 회전자를 갖춘 교 잡 오븐이를 위해 잘 작동 합니다. 거품 microfuge 관 "플 로트"는 회전자에 연결 된 튜브를 확보 하 여 사용할 수 있습니다.
- Oocytes 트윈 20 (SSCT)를 포함 하는 염 분 나트륨 시트르산 x 500 µ L 2와 3 번 씻어. 약 수 (~ 500 µ L/유전자 형) x SSCT + 37 ° c 50% formamide 2의 예 열
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변성 및 교 잡
- Oocytes의 각 관 2.5 ng / µ L centromeric 프로브 및 0.31 pmol 형 석 / µ L의 각 BAC 프로브 1 x 교 잡 버퍼의 40 µ L을 사용 합니다. 모든 genotypes에 대 한 충분 한 교 잡 버퍼에 프로브 솔루션을 준비 합니다. 추가 하기 전에 소용돌이 프로브 믹스 30 s.
- BSA-코팅 P200 피 펫 팁을 사용 하 여, 200 µ L PCR 튜브에 oocytes를 전송 합니다. 아래, 37 ° C와 하자 oocytes 정착에 샘플을 계속 다음 가져온된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 가능한 많은 액체를 제거 합니다.
- 프로브는 oocytes (2 절에서 준비)를 포함 하는 하이브리드 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. PCR 기계에 oocytes를 포함 하는 PCR 튜브를 놓고 다음과 같이 품 어: 3 분, 다음 37 ° C 하룻밤 동안 92 ° C 5 분 동안 37 ° C. 프로브는 oocytes에 추가 되, 계속 그들 어둠 속에서 가능 한 한 많이.
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교 잡 후 세척
- SSCT + 37 ° C에 50% formamide x 2를 예 열 하 고 교 잡 인큐베이터에서 유지. BSA와 코팅 P200 팁 플라스틱, oocytes는 PCR 튜브에 37 ° C 2 x SSCT + 50 %formamide 100 µ L를 추가 하 고 새로운 500 µ L microfuge 관에는 oocytes를 전송.
- 같은 튜브를 하자는 oocytes 정착 인큐베이터에서 37 ° C에서 37 ° C 2 x SSCT + 50 %formamide 추가 400 µ L를 추가 합니다.
참고:이 단계에서 더 오래 걸립니다 종종 정착. 15 분을 특이 한 이상 아니다. 인 내의 부족 oocytes의 상당한 손실이 발생 합니다. - 500 µ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C에서 50 %formamide 회전에서 3 시간 20 분 대 한 oocytes를 씻어. 그들은 정착 하는 동안 37 ° C에서 oocytes를 유지.
- 500 µ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C에서 50 %formamide 회전에서 3 시간 10 분 대 한 oocytes를 씻어. 그들은 정착 하는 동안 37 ° C에서 oocytes를 유지.
- 실 온에서 10 분 동안 oocytes x SSCT + 40 %formamide nutator에 500 µ L 2에에서 씻어. 500 µ L 2 x SSCT + 20 %formamide에서 10 분 동안 oocytes를 씻어. 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어 x SSCT.
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DAPI와 얼룩
주의: DAPI 독성, 적절 한 보호를 착용.- 2에서 500 µ L DAPI 솔루션 (1 µ g/ml)에서 20 분 대 한 oocytes를 씻어는 nutator에 x SSCT. 린스는 oocytes 500 µ L 2에에서 3 번 x SSCT. 500 µ L 2에서에서 2 시간 10 분 대 한 oocytes를 씻는 nutator에 x SSCT. 그들은 coverslips에 준비가 될 때까지 어둠 속에서 실 온에서 최대 4 시간 샘플을 저장할 수 있습니다.
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장착
주: 필요한 도구에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오.- 폴 리-L-리 신 코팅된 coverslip 해 현미경을 놓습니다. Oocytes, 약 150 µ L 총 볼륨 조정의 튜브에서 액체를 제거 합니다. BSA와 P200 피 펫 팁, 위아래로 분산 솔루션을 통해 oocytes를 다음 폴 리-L-리 신 코팅된 coverslip에 oocytes/솔루션의 40 µ L를 전송 피 펫 코팅.
- oocytes는 coverslip에 충실 하지만 여전히 액체를 둘러싸인 때까지 뽑아 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 하는 coverslip에서 액체의 일부를 제거 합니다. 겸 자, 1 개의 측에 커버 슬립을 누른와 텅스텐 바늘을 사용 하 여 부드럽게 oocytes, 겹치지 oocytes의 단일 레이어를 달성 하기 위해 이동의 덩어리를 분리.
- 가져온된 파스퇴르 피 펫과 oocytes 주위 액체의 나머지를 제거 합니다. 깨끗 한 유리 슬라이드 고 압축된 가스를 사용 하 여 모든 먼지에서 타격. 슬라이드의 중간에 (예를 들면, 머리말-금) 미디어 탑재 22 µ L를 추가 합니다. 천천히 샘플, 직면 하 고 미디어 접촉 샘플 설치 미디어와 함께 coverslip로 슬라이드를 낮춥니다. 표면 장력은 슬라이드에 coverslip을 발생할 것입니다.
- 신선한 dessicant (예, drierite)의 레이어를 포함 하는 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 용기에 슬라이드를 배치 합니다. 슬라이드 이미징 하기 전에 어둠 속에서 3-5 일 동안 건조 하자. 건조 시는 방의 습도 따라 달라질 수 있습니다.
6입니다. 영상
- 건조 제거 시 슬라이드 dessicant, 깨끗 한 상자에서 모든 먼지 입자를 제거 하는 그들. 매니큐어와 coverslips 인감. 봉인 된 슬라이드는-20 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있습니다.
- 레이저 공초점 이미지 6 배 디지털 줌과 높은 수 가늠 구멍 40 X 오일 목표를 사용 하 여 검색을 취득 합니다.
참고: 이상적으로, 시스템 소프트웨어를 사용 하나를 찾아서 여러 oocytes 위한 meiotic 염색체의 X-Y 위치를 표시 하는 그들을 보는 동안 epifluorescence를 사용 하 여. 이 기능은 이미지 세션 동안 시간이 절약 됩니다. 만든 높은 숫자 조리개 60 X 목적으로 표백 급속 한 선택한 confocal 시스템, 하지만 그것은 부적 절 한 사용이 다른 시스템에 대 한 작동 수 있습니다. - 각 oocyte, 위쪽 및 아래쪽 DAPI 신호를 사용 하 여 일련의 설정에 대 한 Z 시리즈를 캡처하십시오.
참고: 이득, 오프셋, 그리고 레이저 파워 oocytes의 하위 집합을 사용 하 여 실험적으로 결정 될 필요가 있을 것 이다. 일단 적당 한 매개 변수를 발견만 약간 조정 할 필요가 있어야 한다.
인수를 변경 하는 경우 설정 필요, 이전에 수집한 이미지 스택을 사용 하 여 필요한 사항을 변경 추정. 표백을 방지 하려면 미리 Z 시리즈를 캡처하기 전에 팔 프로브를 영상에서 후 렴. 0.25 µ m의 단계 크기, Z 시리즈 일반적으로 범위 25에서 30 단계 방향 및 염색체의 배치에 따라. 작은 단계 크기 두 물고기 명소 축 차원에서 분리 되어 있지만 작은 단계와 표백으로 인해 신호 강도의 손실 하는 데 필요한 시간으로 교환 여부를 평가 하는 하나의 능력을 높일 수 있습니다. 6 배 디지털 줌과 1024 x 512 이미지 필드 40 X 목표 0.05 μ m의 픽셀 크기의 이미지를 생성합니다.
7. 이미지 분석 및 단결력 결함에 대 한
- 각 oocyte19에 대 한 신호 대 잡음 비를 최적화 하기 위해 Z 시리즈 deconvolve
참고: 자료 테이블 에 지정 된 것과 같은 소프트웨어 패키지 통합 복원을 사용 하 여 deconvolve으로 자르기와 이미지 대비 향상에 있습니다. 중요 한 것은, 3 차원에서 보기 이미지와 응집력 결함에 대 한 점수에 있는 소프트웨어 패키지가 필수적입니다. - 각 oocyte 팔과 DAPI 신호 colocalize centromeric foci의 수 평면. 응집력의 손실 결과 특정 조사에 대 한 3 개 또는 4 개의 고유 하 고 분리 된 신호. 얇은 실에 의해 연결 된 두 개의 포커스를 관찰 하는 것은 드물지 않다. 가장 엄격한 기준에 의해 이러한 foci 하지 간주 됩니다 "구분."
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Representative Results
그림 5 는 X 염색체에 cytological 지역 6E-7B에 hybridizes는 팔 조사로 얻은 이미지를 선물 한다. 공동의 DAPI, localizes 신호에서이 조사 결과 배경에서 쉽게 구별할 수 이며 팔 단결력 결함 다른 genotypes19에 척도를 성공적으로 사용 되었습니다. 단결력 결함의 부 량 제한 되었다 prometaphase에 어 분열 I 단계; 핵 붕괴 이전 oocytes 분석19에서 제외 했다. 그대로 핵 봉투 oocyte 염색체 주변 세포질 보다 개별 원형 지역에 의해 둘러싸여 있을 것입니다 때문에 DAPI 채널에서 스캔할 때 분명 하다.
그림 5B deconvolution 및 대비 향상 후 개별 Z 시리즈의 최대 강도 계획을 보여 줍니다. 단결력 결함의 정량화 물고기의 수 신호는 중복 DAPI 신호를 각 프로브에 대 한 결정이 필요 합니다. 이러한 분석에 대 한 3 차원에 병합 된 이미지의 시각화 필수적입니다. 모든 3 개 차원에서 DAPI 신호에 명확 하 게 연관 된 물고기 명소만 분석에 포함 되어야 합니다.
그대로 동생 chromatid 단결력 팔 및 pericentric 프로브 (그림 5B, 왼쪽)에 대 한 두 개의 물고기 관광 명소로 입증 됩니다. Oocytes 어느 프로브에 대 한 3 개 또는 4 개의 분리 된 물고기 명소를 포함 하는 단결력 결함 (그림 5B, 오른쪽) 간주 됩니다. 개별 관광 명소로 분류 되기 위하여 두 물고기 신호는 작은 반점의 직경에 해당 하는 거리에 의해 모든 3 개 차원에서 최소한 구분 되어야 합니다. 두 물고기 관광 명소를 연결 하는 얇은 희미 한 스레드 흔하지 않습니다. 이러한 신호는 완전히 분리 된 간주 되지 않습니다 하 고 따라서 단결력 결함의 인스턴스로 계산 되지 않습니다.
6E-7B 팔 교 잡 조사, 약 15-20% 몇 군데 oocytes의 완전히 부족 신호 또는 신호 자신 있게 점수 너무 약 했다. 또한, 약 5% 군데 oocytes의 전시 염색체 신호 확산의 큰 영역 고 이러한 분석에서 삭제 했다. 반면, oocytes는 pericentric 교 잡 신호 누락 되었거나 너무 점수에 확산 발생 희귀 했다.
6E-7B 팔 프로브 prometaphase 팔 단결력 결함을 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다과 분열의 초파리 oocytes를 체포 다른 genotypes19. 때 cohesin 소 단위 SMC3는 뜨 중간 의향, 포함 된 분석 성숙한 oocytes의 16.3% 동안 두 개의 관광 명소, 팔 단결력의 조기 상실을 나타내는 팔 보다 큰. 대조적으로, SMC319의 정상적인 수준에 포함 된 oocytes의 5.1%에서 분리 된 팔 명소 관찰 합니다. 흥미롭게도, 비록 팔 단결력의 주파수 결함 여러 최저의 genotypes, 자매 chromatids 거의 그들의 pericentric 지역19에서 분리 되었다에서 상승 했다.
그림 1: 내가 체포 확장된 의향 동안 응집력의 연령에 따라 손실 여성 감수 분열의 계란에 이수성 염색체 분리에 오류에 발생할 수 있습니다. 단결력 자매 사이 검은 막대에 의해 대표 된다 chromatids. 팔 단결력 재조합 homologs를 함께 개최 기능과 anaphase에서 정확한 분리에 필요한 나. 팔 단결력은 분실 된 중간, aneuploid 계란의 결과로 염색체 missegregation 발생할 수 있습니다. 이 그림 참조19에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 그리고 3 개의 다른 BACs에 금지 효소 소화 (오른쪽) BAC 조각화 및 증폭 (왼쪽) 후 DNA 분자의 크기. 400 ng 증폭된 DNA 제품의 처음 3 개의 차선에 표시 됩니다. 마지막 3 개의 차선 하룻밤 제한 다이제스트 후 DNA 파편을 표시합니다. 증폭된 DNA 제품 범위 200에서 bp 최대 3 kb. 제한 다이제스트, 대부분 파편 100-200 bp에서 배열 했다 하지만 큰 조각 후 (최대 500 bp) 표시 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 세포학 도구. 프로토콜에 사용 되는 도구: (1) 쌍 집게 (#5 Dumont); (2) 텅스텐 바늘; (3) 깊은 우물 접시 커버; (4) 얕은 유리 해 부 접시; (5) 가져온된 파스퇴르 피 펫입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Oocytes를 압 연에 대 한 슬라이드의 운동과 배치. (A) 슬라이드의 다이어그램 프로토콜에 설명 된 대로 oocytes의 압 연에 대 한 설정. 어두운 영역 슬라이드의 젖 빛된 유리 부분을 나타냅니다. (B) 압 연 oocyte 중 슬라이드 # 2에 대 한 이동 벡터의 방향. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 물고기 시험 결과. (A) 회로도 초파리 X 염색체와 2 개의 프로브 (각 6 BACs) 팔 및 프로토콜에 설명 된 22 oligonucleotide pericentromeric 프로브 교배 묘사. 편의상, 6E-7B 프로브 7B 표시 됩니다. 및 C 2 층-3 조사 3 C. 표시 됩니다. (B) 물고기 (6E-7B 프로브)에 대 한 결과 그대로 팔 단결력 (두 팔 프로브 명소, 체 당 하나) 방해 팔 단결력 (3 ~ 4 팔 프로브 명소)에 대 한의 대표 이미지. DNA는 파란색, 팔 프로브 신호 노란색 이며 pericentric 프로브 신호는 빨간색. 이미지는 deconvolution 및 대비 향상 후 Z 시리즈의 최대 강도 계획에 해당합니다. 눈금 막대 2 µ m =. 이 그림 참조19에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
물고기를 사용 하 여 나 고 분열 prometaphase 팔 응집력의 상태를 평가 하기 위해 프로브 나 초파리 oocytes 초파리 감수 분열의 분야에서 중요 한 발전 이다. 역사적으로, 초파리 연구 성숙 oocytes11,,1819팔 응집력의 조 손실 유추를 유전자 검사로 제한 되었습니다. 자, 여기에 제시 된 방법으로 팔 단결력의 상태 수 수 분석 직접 물고기를 사용 하 여. 크게 팔 단결력의 조 손실에 대 한 물리적 증거를 얻을 수 초파리 oocytes에서 팔 응집과 염색체 missegregation의 조 손실 메커니즘 연구에 사용할 수 있는 접근의 레 퍼 토리를 확장 합니다.
중요 한 단계
우리가 하지 염색체 팔 성숙한 초파리 oocytes에 따라 단일 복사본 시퀀스에 hybridizes 형광 프로브의 성공적인 시각화에 필요한 중요 한 매개 변수에 대 한 체계적인 분석을 수행 했습니다, 하지만 우리는 제공 합니다 이 방법의 성공에 기여 할 수 있습니다 요인의 다음 목록. 팔 프로브를 생성 하려면 사용 하는 X에 약 0.8 m b의 간격을 커버 하는 BAC 프로브 겹치는 6의 조합-염색체 팔. 적은 BACs를 더 작은 영역을 사용 하 여 우리의 초기 시도 실패 했다. 또한, 그리고 알 렉 사-647로 끝 레이블 전에 BAC DNA를 증폭 하는 방법을 사용는 우리. 분류 된 제한 조각의 대부분은 100-200 bp 긴 (그림 2), 두꺼운 조직21을 통해 효율적인 보급에 필요한 150 뉴클레오티드의 대상 크기와 잘 동의 했다. 큰 초파리 oocyte의 형태를 유지 하지만 또한 프로브 삽입을 허용 하는 고정 조건 필수적입니다. 우리 실내 온도 헵 37 ° c.에 preheated 수정 솔루션에 추가 하 여 우리의 이전에 사용한 고정 방법23 수정 우리 생각 vitelline 막으로 고정을 위한 낮춘된 온도 통해 침투를 증가 하기 위하여 헵 추가 팔 단결력의 시각화를 위한 성공적인 고정 조건에 기여 가능.
응집력의 조 손실 시 금, 하나 존재 하는 결함의 정량화를 허용 하는 샘플 크기 필요 합니다 낮은 중간 수준에. 성숙한 oocytes의 많은 수를, 다른 믹서 기 장애 성인 여성 26,27체질 결합의 사용 해 왔다. 여기 우리 손에 방법 설명 해 부 20-25 여성에서 난소, 수동 분리 늦게 pipetting으로 oocytes 무대. 믹서 기/체질 방법이 프로토콜도 동작 하는 동안 한 손 해 부의 장점은 그 체질 하 단계 없이 oocytes 적은 시간을 할애 anaphase의 기회를 감소 고정 하기 전에 버퍼에 나 인공적인 계란 인해 발병 활성화입니다. 또한,이 시작 물자로 적은 여성 필요, 시 약의 작은 볼륨을 사용 하 여 메서드와 간단한 워크플로 모두 여러 genotypes 처리 용이 있다.
성숙한 oocytes의 손 해 부 및 수동 분리 chorion 및 vitelline 막 제거 oocytes "롤"의 충분 한 수량을 제공 하 고 교 잡 세척의 끝에 약 75-150 oocytes에서 결과. 수율을 최대화 하기 위해 하나의 트릭 분열 oocytes를 체포 해 부25전에 남성의 부재에 yeasted 튜브에 처녀 여성을 보유 하는. Chorions 및 vitelline 막 제거를 압 연 oocyte oocytes 파괴를 피하기 위하여 부드러운 터치와 함께 수행 되어야 합니다. 그러나,는 oocytes의 100%에서 chorions 및 vitelline 막 제거 현실적인 목표 이며 oocytes의 손실에 결과 과도 한 롤링만. 따라서, 각 회전 주기 중지 되어야 할 때 oocytes 부족 chorions 및 vitelline 막의 약 75-85%.
제한 사항
생성 및 성숙 초파리 oocytes 응집력의 상태를 모니터링 하려면 팔 프로브를 사용 하 여 우리의 성공에도 불구 하 고 절차는 여전히 한계에서 고통. 우리가 거의 pericentromeric 프로브에 대 한 신호를 감지 하지 못했습니다, 동안 팔 프로브 신호는 약한 또는 우리가 몇 군데는 oocytes의 약 15-20%에서 결 석. 하나의 기여 요인이 큰 팔 프로브 (100-200 뉴클레오티드) 대 pericentric oligonucleotide 조사 (22-28 뉴클레오티드)의 차동 침투 수 있습니다. 또한, 큰 반복 시퀀스 pericentric 조사 결과 팔 프로브 보다 밝은 신호에 의해 인식. Oocyte는 oocyte 내 meiotic 염색체의 배치의 방향은 또한 이미징 때 도전을 제시. Meiotic 염색체 셀 피 질에 가까운 상대적으로 있지만는 coverslip에 장착 된 oocyte의 방향을 제어할 수는. 따라서, 일부는 oocytes 분수에 meiotic 염색체는 coverslip와 신호 강도에서 100-200 µ m를 있을 수 있습니다 하 고 품질 수 있습니다 부정적인 영향을 미칠 수는 oocyte의 대량 통해 이미지 하려고 할 때 키를 누릅니다. 이러한 제한은 oocytes 최종 정량 분석에 포함 된 수 oocytes 프로토콜에서 처리의 숫자 보다 상당히 낮은 의미 합니다. 100 oocytes 팔 응집력의 상태 결정 가장 필요 합니다 두 개의 독립적인 준비. 단결력 결함 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여 측정에 추가적인 제한 요소는 전형적인 Z 시리즈 (약 5 분), 포착 하는 데 필요한 시간 캡처된 영역 1024 x 512 픽셀에 국한 됩니다 경우에. 즉, 제어 및 실험 genotypes (각 100 oocytes) 응집력의 비교 이미지 컬렉션 시간 약 16 h 필요한 것입니다.
수정 및 문제 해결
우리 팔 단결력 cytological 위치 6E-7B19 X 염색체를 인식 하는 프로브를 사용 하 여 상태 모니터링을 수 있다. X 염색체에 더 원심 위치에 hybridizes 프로브를 감지 chiasma 유지 보수의 실패에 대 한 더 바람직 있을 수 있습니다. 또한, 다른 연구자는 다른 염색체에 팔 단결력을 분석 하실 수 있습니다. 우리 프로브는 autosomes 시도 하지, 예비 데이터 또한 X 염색체의 2 층-3 C 지역 인식 프로브를 감지 신호에 결과 나타냅니다. 그러나, 제한 된 임시 데이터를 바탕으로, 2 층-3 C 프로브의 신호 수 있습니다 6E-7B 프로브에 대 한 보다 덜 "소형". 물고기 신호는 빡 빡 하 고 일부 oocyte 염색체에 대 한 선명 하 고, 비록 다른 oocytes의 염색체에 교 잡 신호는 상당히 더 확산 이다. 신호에 이러한 차이가 두 cytological 위치 사이 염색체 형태에서 진짜 차이 반영, 두의 교 잡 효율에서 변화 조사, 또는 다른 oocytes 사이 그냥 확률 변화 됩니다. 더 철저 한 분석을 필요로 합니다.
중요 한 것은, 약간 oocytes에 확산 염색체 신호 관찰도 6E-7B 프로브에 대 한 고이 자주 분석에서 그들의 배타를 필요한. 또한, 우리 신호 품질과 6E-7B 프로브의 다른 준비 사이의 밝기에 변화를 발견 했습니다 그리고이 필요한 그 이미지 매개 변수를 적절 하 게 조정 될. 42 ° C에 교 잡 온도 높여 확산 신호와 oocytes의 수를 축소 하지 않았다 그러나 pericentric oligonucleotide 조사에 대 한 신호를 영향 심각 했 어. 더 나은 염색체 형태24를 보존 하기 위해 노력, 우리 또한 낮은 온도 (80 ° C)에서 더 이상 변성 단계 했지만 발견이 치료도 신호 강도 증가와 확산 oocytes의 수를 감소 염색체 물고기 신호입니다. 우리는 또한 cytological 지역 5E-7B를 약 1.5 Mb 간격에 해당 하는 12 겹치는 BACs를 사용 하 여 밝은 팔 신호를 얻기 위해 시도 했다. 12 BAC 프로브를 사용 하는 경우 신호 강도에 변이의 정도 뿐만 아니라 신호 부족 oocytes의 비율 6 BACs 팔 프로브를 확인 하는 데 사용 했다 때 다 했다. 그것은 또한 물고기 신호 했다 더 큰, 더 어려운 개별 chromatids에 해당 하는 관광 명소를 해결 하 고 있기 때문에 12 BAC 프로브를 사용 하 여 응집 결함에 대 한 점수를 더 도전 이었다. 신호가 새로 준비 프로브와 함께 가져온 경우, 연구자는 증폭의 크기를 확인 해야 하 고 제한 소화 BAC DNA 파편 끝 라벨에 사용 되는 100-200 bp 범위 내에서 주로 확인 하. 이 성공적인 조사 준비에서 가장 중요 한 요소 중 하나가 될 것입니다.
미래 방향
이미지 수집으로 immunostaining를 포함 하는 프로토콜을 적응을 향상 시키기 위해 미래의 작업 다른 연구자를 도움이 될 것 이라고 주요 개선 될 것 이다. 이미지 수집, 중 축 차원 뿐만 아니라 빠른 이미지 수집 이미지의 큰 숫자를 수집 것입니다 단결력 결함 측정을 위한 유리한. 레이저 공초점 레이저 스캐닝 이미징 매개 변수 최적화, 우리는 0.25 µ m는 Z 시리즈에 대 한 물고기의 감지할 수 표백 방지 하기 위해 사용 될 수 있는 작은 단계 크기 신호 발견. 그러나, 물고기 Z 스택의 미만 0.25 µ m에 의해 구분 되는 신호에 대 한이 단계 크기는 foci 사이 "공간"을 잡으려고 실패 될 수 있습니다 하 고 따라서 단결력 결함의 수를 과소 평가 수 있습니다. Confocal 회전 디스크의 빠른 이미지 수집 속도 작은 단계 크기 표백 신호 없이 사용할 수 있습니다. 이 것이 축 차원에 보다 정확한 이미지 재건을 제공 뿐 아니라 oocytes 단결력 결함에 대 한 분석의 많은 수를 허용. 또한, 팔 응집 상태의 생선 시각화와 immunostaining을 결합 하는 능력 프로토콜 향상 시킬 크게 것 이다. 다양 한 준비에 대 한 스핀 들 immunostaining 교 잡 절차를 수행 하 여 보았습니다. 그러나, 강력한 스핀 들 얼룩에 oocytes의 극히 일부에 표시 했다. 또한, 명확 하지 않은 이유를 위해 가짜 물고기 신호의 상부 포위 meiotic 염색체 물고기와 immunostaining 결합 했다. 앞 이나 물고기 절차 후 immunostaining를 허용 하는 프로토콜을 최적화 하기 위해 추가 작업이 기술의 기능을 확장 크게 것 이다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 샤론 E. 강사에 게 수 여 하는 NIH 그랜트 GM59354에 의해 지원 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 앤 Lavanway와 기술 지원에 대 한 제이 에밀리 리드 형광 팔 프로브를 생성 하기 위한 프로토콜을 개발에 도움에 감사 위이 Q. 응웬 하 고. 우리는 또한 유용한 토론 및 조언을 위한 초파리 커뮤니티에서 수많은 동료를 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
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