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Developmental Biology

Usando fluorescência hibridação In Situ (FISH) para monitorar o estado de coesão de braço em prometafase e metáfase eu oócitos de Drosophila

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.

Abstract

Em humanos, erros de segregação do cromossomo em oócitos são responsáveis para a maioria dos abortos espontâneos e malformações congénitas. Além disso, como as mulheres envelhecem, o risco de conceber que um feto aneuploid aumenta dramaticamente e este fenómeno é conhecido como o efeito da idade materna. Um requisito para a segregação do cromossomo precisos durante as divisões meióticas é manutenção da irmã coesão de cromátides irmãs durante o período de prófase estendida que a experiência de oócitos. Citológicas em seres humanos e organismos modelo sugerem que a coesão meiótica deteriora-se durante o processo de envelhecimento. Além disso, erros de segregação em oócitos humanos são mais prevalentes durante a meiose I, consistente com a perda prematura da coesão do braço. O uso de organismos modelo é fundamental para desvendar os mecanismos subjacentes a idade-dependente perda de coesão. Drosophila melanogaster oferece diversas vantagens para estudar o Regulamento de coesão meiótica em oócitos. No entanto, até recentemente, apenas testes genéticos estavam disponíveis a ensaiar para a perda de coesão de braço em oócitos de genótipos diferentes ou em diferentes condições experimentais. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido usando fluorescência em situ hibridação (peixe) para visualizar diretamente os defeitos na coesão de braço em prometafase I e metáfase prendi Drosophila oócitos. Gerando uma sonda de peixe que se para o braço distal do cromossomo X e coletando pilhas de Z confocal, um pesquisador pode visualizar o número de sinais individuais de peixes em três dimensões e determinar se irmã cromátide braços são separados. O procedimento descrito torna possível quantificar defeitos de coesão braço em centenas de oócitos de Drosophila . Como tal, este método oferece uma importante ferramenta para investigar os mecanismos que contribuem para a manutenção da coesão, bem como os fatores que levam à sua extinção durante o processo de envelhecimento.

Introduction

Adequada segregação dos cromossomos durante a mitose e meiose exige que a irmã cromátide coesão ser estabelecido, mantido e lançado em uma coordenada1,2. Coesão é estabelecida durante a fase S e é mediada pelo cohesin complexo, que forma ligações físicas que segure a irmã cromátides irmãs juntos. Na meiose, coesão distal de um crossover também funções para armazenar recombinantes homologs juntos e esta associação física ajuda a garantir a adequada orientação do forma bivalente na metáfase eu do eixo (Figura 1)3,4, 5. Lançamento do braço coesão na anáfase permite-lhe as homologs segregar para polos opostos do fuso. No entanto, se a coesão do braço é perdido prematuramente, recombinantes homologs perderá sua conexão física e segregar aleatoriamente, que pode resultar em gâmetas aneuploid (Figura 1).

Em oócitos humanos, erros na segregação do cromossomo são a principal causa de abortos e defeitos de nascimento, como síndrome de Down,6, e sua incidência aumenta exponencialmente com a idade materna7. Coesão de cromatídeos é criada em oócitos fetais e recombinação meiótica é concluída antes do nascimento. Oócitos depois prenda no meio da prófase eu até ovulação e durante esta prisão, associação física continuada de recombinantes homologs baseia-se na irmã coesão de cromátides irmãs. Portanto, precisa segregação durante a meiose e os resultados de gravidez normal exigem que coesão permanecem intactas por até cinco décadas.

Perda prematura de coesão durante a prolongada detenção meiótica de oócitos humanos tem sido proposta para contribuir para o efeito da idade materna e várias linhas de evidência suportam esta hipótese8,9. No entanto, tendo em conta os desafios da coesão meiótica em oócitos humanos a estudar, muito da nossa compreensão deste fenômeno baseia-se sobre a utilização do modelo organismos5,10,11,12, 13de14,,15.

Drosophila melanogaster oócitos oferecem inúmeras vantagens para o estudo da segregação meiótica de coesão e cromossomo. Um ensaio simples genético permite recuperar a descendência dos gâmetas aneuploid e medir a fidelidade do X-segregação de cromossomos em uma grande escala11,16,17. Além disso, um pode também determinar se erros de segregação do cromossomo surgem porque homologs recombinantes missegregate durante a meiose I, um fenótipo que é consistente com a perda prematura de braço coesão11,18, 19. direta observação do estado de coesão meiótica em oócitos de Drosophila também é possível usar a fluorescência em situ da hibridação (peixe). Apesar de oligonucleotídeos fluorescentes que hibridizam às sequências repetitivas de satélite têm sido usados por mais de uma década para monitorar pericentromeric coesão em madura Drosophila oócitos4,20, análise de braço coesão tem sido muito mais desafiador. Visualização do estado de coesão braço requer uma sonda que se estende por uma grande região de cópia única sequências e é brilhante o suficiente para resultar em sinais visíveis para cada irmã cromátides irmãs quando braço coesão está ausente. Além disso, as condições de fixação do oócito e tamanho dos DNAs rotuladas devem facilitar a penetração21 para o grande oócito maduro de Drosophila (200 µm de largura por 500 µm de comprimento). Recentemente, uma sonda de braço com êxito foi utilizado Visualizar cromátides irmãs oócito de Drosophila durante a anáfase, eu, mas os autores afirmou que não podia detectar um sinal em prometafase ou metáfase prendi oócitos22. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a geração de X-braço do cromossoma sondas de peixe e as condições de preparação de oócito que nos permitiram a ensaiar para a perda prematura da irmã coesão cromátide em prometafase I e metáfase eu oócitos. Estas técnicas, que nos permitiram identificar produtos de genes que são necessários para a manutenção da coesão meiótica, permitirá que outros a ensaiar para a irmã coesão cromátide defeitos em oócitos maduros de drosófila de diferentes genótipos.

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Protocol

1. preparações

  1. Prepare soluções para fluorescência em situ da hibridação (peixe). Prepare todas as soluções usando água ultrapura.
    1. Prepare-se 5 x tampão do Robb modificado: acetato de potássio 275mm acetato de sódio 200 mM, sacarose 500mm, glicose de 50 mM, 6 mM de cloreto de magnésio, cloreto de cálcio de 5 mM, pH de 500 mM HEPES = 7,4. Trazer o pH para 7,4 usando 10 N NaOH. Filtro de esterilizar e armazenar a-20 ° C. Descongelar e diluir a 1 x, conforme necessário e armazenar 1 alíquotas x a-20 ° C.
    2. Prepare a solução salina tamponada fosfato (PBS) usando 1.3 M NaCl, 70mm Na2HPO4, 30mm NaH2PO4de 10x. Trazer o pH para 7.0 usando 10 N NaOH. Esterilize em autoclave ou filtro de esterilização.
  2. Preparar as lamelas de poli-L-lisina, um dia antes necessário.
    1. Pipetar o etanol a 70% contendo 1% ácido clorídrico sobre a superfície de uma lamela de 18 x 18 mm #1.5 e incubar 5 min. aspiração vácuo do uso para remover o líquido. Repita com água ultrapura esterilizada. Cobrir a superfície da lamela com 0,1 mg/mL poli-L-lisina e incubar durante 10 min.
    2. Aspire para remover o líquido e secar por 10 min. loja lamelas poli-L-lisina para cima em um recipiente de plástico com uma tampa apertada para evitar poeira.
  3. Prepare-se puxado Pasteur pipetas para remover soluções líquidas sem remover os ovócitos. Sobre uma chama do bico de Bunsen, aqueça no meio de um copo longo pipeta Pasteur puxando suavemente em cada extremidade até o vidro derrete e puxa separados.

2. geração de braço sonda para peixes

Nota: Todas as etapas de centrifugação são realizadas a ~ 16.000-21.000 x g (velocidade máxima na maioria das microcentrifuges da parte superior de tabela). Rodadas de centrífuga breve indicam fiação para 5 a 15 s. Vortex indica num Vortex para ~ 15 s no max velocidade a menos que indicado o contrário.

Nota: BACs para sondas de braço podem ser obtidos BAC PAC recursos. Dois X cromossomo braço eucromatina sondas têm sido utilizadas com sucesso com este método. Uma sonda de braço foi composta de seis clones de BAC correspondente ao citológico bandas 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). A outra sonda de braço consistiu de seis clones de BAC correspondente para bandas citológica 2F C - 3 (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs para outro cromossomo de Drosophila regiões podem ser visitadas em: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Duas sondas de pericentric que reconhecem a repetição de satélite bp 359 do cromossomo X têm sido utilizadas com sucesso com este método. Uma sonda de 22 nucleotídeo tem sido amplamente utilizada e funciona bem (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Uma sonda de 28 nucleotídeo foi recentemente testada e também funcionou bem (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC purificado oligonucleotides 5' rotulado com um fluoróforo específico foram ordenados de uma fonte comercial (por exemplo, as tecnologias integradas de DNA).

  1. Prepare o DNA de clone BAC seguindo instruções do kit conforme especificado na Tabela de materiais. Resuspenda o pellet de DNA obtido a partir de 100 mL de cultura em 200 µ l de TE; a concentração final de DNA deve variar entre 5-40 ng / µ l, dependendo do clone de BAC.
  2. Execute a amplificação de DNA para cada BAC usando o kit de amplificação, conforme especificado na tabela de materiais e o seguinte protocolo. Processo de DNA BAC individualmente para cada clone. Uso de enzimas e buffers fornecidos com o kit em passos 2.2.1 através de 2.2.3.
    1. Fragmentação aleatória de DNA BAC: para cada BAC, usar TE preparar 10 µ l de uma solução de DNA 1 ng / µ l em um tubo PCR de 200 µ l. Adicione 1 µ l de tampão de fragmentação X 10. Colocar o tubo em uma máquina PCR a 95 ° C por exatamente 4 min. imediatamente legal a amostra em água gelada e centrifugar brevemente. A incubação é tempo sensível e qualquer desvio pode alterar os resultados.
    2. Preparação de biblioteca
      Nota: Este método utiliza primers aleatórios para gerar uma biblioteca de fragmentos ampliáveis.
      1. Para o tubo contendo o DNA adicione o seguinte: 2 µ l de 1 x Buffer de preparação de biblioteca, 1 µ l de solução de estabilização de biblioteca. Homogeneiza-se pela utilização do vortex, centrifugue brevemente e colocar o tubo na máquina de PCR a 95 ° C por 2 min. imediatamente legal a amostra em água gelada e centrifugar brevemente.
      2. Adicione 1 µ l de biblioteca preparação enzimática para o tubo do PCR, mistura e centrífuga brevemente. Lugar PCR tubo na máquina de PCR e incubá-los da seguinte forma: 16 ° C por 20 min, 24 ° C por 20 min, a 37 ° C por 20 min, 75 ° C por 5 min, em seguida, mantenha a 4 ° C.
      3. Retirar amostras da máquina do PCR e centrifugar brevemente. As amostras podem ser amplificadas imediatamente ou armazenadas a-20 ° C por até três dias.
    3. Amplificação da biblioteca de DNA BAC
      1. Adicionar os seguintes reagentes para a reação de fragmento aleatório inteiro 15 µ l: 7,5 µ l 10 x amplificação Master Mix, 47,5 µ l água livre de Nuclease, 5 µ l WGA DNA polimerase. Homogeneiza-se pela utilização do Vortex e centrifugar brevemente.
      2. Lugar PCR tubo na máquina de PCR e incubá-los da seguinte forma: iniciais da desnaturação de 95 ° C por 3 min, 14 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 15 s, seguido de recozimento/extensão a 65 ° C por 5 min, em seguida, mantenha a 4 ° C.
      3. Depois de andar de bicicleta é completa, do ensaio a concentração de DNA. A concentração de DNA deve ser pelo menos 800 ng / µ l. amostras de manter a 4 ° C ou loja a-20 ° C até pronto para a digestão. Opcionalmente, avaliar o tamanho do fragmento de DNA executando 400 ng de DNA em um gel de agarose 2%. Fragmentos devem variar de 200 bp e 3 kb (Figura 2).
  3. Digestão da enzima de restrição do DNA amplificado
    1. Lugar de 20 µ g de DNA amplificado da seção anterior em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 20 unidades de Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 unidades de BfuCl, 0,5 µ l 100 x BSA, 5 µ l 10 x buffer de digestão de enzima de restrição e ajustar o volume de 50 µ l, adicionando a quantidade adequada de ultrapura H2O.
    2. Incube a digest durante a noite a 37 ° C, em uma incubadora para impedir a condensação na tampa. Etanol precipitar o DNA digerido. Adicionar para o digest: 1 glicogênio µ l, acetato de sódio 3M volume 1/10, etanol 100% nível molecular de 2,5 volumes. Incube a-80 ° C durante 1 h ou durante a noite.
    3. Centrífuga para 30 min a 4 ° C. Pellet de DNA de lavar com 1 volume de sala temp 70% de etanol e rotação por 5 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante e deixar o DNA da pelota secar ao ar ou seque suavemente com um fluxo constante de ar.
    4. Resuspenda o pellet de DNA em 36 µ l estéril ultrapura H2O e utilizar 1 µ l de DNA a ensaiar a concentração de DNA, que deve ser aproximadamente 285 ng / µ l. armazenar o DNA a-20 ° C.
    5. Opcionalmente, avaliar o tamanho do fragmento de DNA executando 400 ng de DNA em um gel de agarose 2%. A maioria dos fragmentos devem variar de 100-200 bp, com um sinal mais fraco até 500 bp (Figura 2).
  4. 3' seguindo a reação
    1. Desnature o DNA digerido a 100 ° C por 1 min em um bloco de calor. Imediatamente esfriar em água gelada. À 35 µ l de DNA, adicione o seguinte: 50 µ l 400 milímetros de sódio cacodylate, 1 µ l 10 mM DTT e vórtice bem. Adicionar 4 µ l 25 mM CoCl2, 2,5 µ l 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP de ARES rotulagem kit conforme especificado na tabela de materiais, 5 µ l 1 mM dTTP, 18 µ l 5 x TdT buffer e transferase terminal deoxynucleotidyl de 1 µ l (TdT) 400 U / µ l. Vortex e centrífuga brevemente.
      Atenção: CoCl2 é tóxica, use proteção adequada.
    2. Incube durante 2 h a 37 ° C em uma incubadora para evitar a condensação. Adicione 1 µ l de 250 mM EDTA para parar a reação e o vórtice brevemente para misturar. Etanol precipitar o DNA de cauda, conforme descrito acima (passos 2.3.2 - 2.3.4). Resuspenda o pellet de DNA secado em 10 µ l estéril ultrapura H2O. loja do DNA a-20 ° C até que esteja pronto para continuar.
  5. Realizar a conjugação de tintura fluorescente usando o kit de DNA rotulagem conforme especificado na tabela de materiais.
    Nota: Uma vez que o corante é adicionado manter amostras no escuro.
    1. Desnature o DNA caudo a 95 ° C por 5 min em um bloco de calor. Imediatamente, cool DNA brevemente em água gelada e centrífuga. Preparar o buffer de rotulagem de acordo com as instruções do jogo e adicionar 6 µ l de cada amostra de DNA. Resuspenda cada tubo de corante em 4 µ l de DMSO do kit. Vórtice e centrífuga brevemente.
    2. Use um tubo de corante para cada reação de rotulagem. Adicione a solução de corante para o DNA, vórtice e centrífuga brevemente. Incube a reação de rotulagem em temperatura ambiente por 2 horas no escuro. Adicione 3 µ l de hidroxilamina 3M para parar a reação seguida por µ l 77 de nuclease isento de H2O do kit. Vórtice e centrífuga brevemente.
  6. Remova o corante não conjugada usando o kit de purificação de PCR conforme especificado na tabela de materiais. Siga as instruções do fabricante. Eluir o DNA da coluna duas vezes usando 40 µ l de tampão de eluição de cada vez.
  7. Etanol precipitar o DNA Etiquetado como descrito anteriormente (passos 2.3.2 - 2.3.4). Resuspenda o pellet de DNA secado em tampão de eluição 10 µ l.
  8. Preparar a mistura de sonda
    1. Para DNA etiquetada, determine a concentração do corante fluorocromo em pmol / µ l. A concentração de fluoróforo pode variar de 30-100 pmol / µ l, dependendo do BAC. A concentração de DNA pode variar de 300-800 ng / µ l.
      Nota: A configuração de microarray funciona bem em um Espectrofotômetro de microvolume, como o especificado na tabela de materiais. Na janela de microarray, selecione DNA-50 e especificar o fluorocromo.
    2. Crie uma mistura de mestre combinando montantes equimolar (pmol fluor) de cada uma das sondas BAC. Vórtice 30 s antes combinando. Para evitar ciclos de congelamento/descongelamento, preparar alíquotas do mestre mix, aplique película de parafina para os tubos para evitar a evaporação e armazenar no escuro a-20 ° C.
      Nota: Um mastermix contendo 250 pmol de cada um do CCB individuais 6 sondas em um volume total de 30-50 µ l funciona bem. Uma alíquota contendo 25 pmol (fluor) para cada BAC será suficiente para reações de hibridação de duas 40 µ l, com uma concentração final de sonda de 0,31 pmol fluor / µ l para cada BAC.

3. dissecção e fixação de ovócitos

  1. Colete 30 fêmeas adultas de virgens do genótipo adequado. Para enriquecer para oócitos de estágio final, segure fêmeas sem machos em um frasco com comida de mosca e fermento seco por 3-5 dias antes de dissecação25. No dia anterior dissecação, transferi as fêmeas sem gás para um frasco de doce com fermento.
  2. Faz a dissecação.
    Nota: Consulte a Figura 3 para ferramentas necessárias. Soluções são removidas usando uma pipeta Pasteur puxada, exceto onde anotado. Ao transferir os ovários sempre use uma ponta de pipeta revestida com uma solução de BSA de 10%.
    1. Em um prato raso dissecação contendo tampão do Robb modificado, use fórceps para remover os ovários de uma única fêmea. Uso de fórceps ou uma agulha de tungstênio para splay suavemente cada ovário, permitindo que a solução contatar ovarioles interna. Transferi o par de ovários inclinados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo tampão do 1ml modificado Robb.
    2. Repita a etapa 3.2.1 para acumular os ovários das fêmeas de 20-25 no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Termine as dissecções de 20 a 25 fêmeas dentro de 10 min.
  3. Execute a fixação da seguinte maneira.
    1. Com uma pipeta Pasteur puxada, remover o líquido no tubo de microcentrífuga, use um P1000 rapidamente adicionar 500 µ l de solução de correção de 37 ° C para os ovários e em seguida, adicione imediatamente 500 µ l de heptano de temperatura para os ovários.
    2. Tubo de microcentrífuga agitar para misturar e coloque em um nutator de 3 min. Retire o tubo de microcentrífuga da nutator e do lugar em uma cremalheira do tubo para 1 min permitir que os oócitos para resolver ao fundo. O tempo de fixação total é 4 min.
      Atenção: Solução de correção e heptano são tóxicos, use proteção adequada.
    3. Remover a solução e enxágue os ovários 3 vezes em 500 µ l de PBS contendo BSA de 0,5% e 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Repita para genótipos restantes.

4. remoção de Chorions e membranas vitelínico

Nota: Consulte a Figura 3 para ferramentas necessárias.

  1. Oócitos de estágio final separado
    1. Adicione 1 mL de PBSBTx para um prato raso de dissecação. Use um P200 com uma ponta revestida de BSA para transferir ovários fixos (em ~ 150 µ l) para o prato raso. Pipete ovários acima e para baixo com a ponta da pipeta revestido de BSA para desalojar os oócitos maduros de oócitos menos maduros.
    2. Quando tarde oócitos de palco são suficientemente separados, transferi todo o tecido para um tubo de microcentrífuga de 500 µ l. Remover o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxado, deixando cerca 150-200 µ l no tubo. Repeti a secção 4.1 para genótipos restantes.
  2. Prepare-se para laminação
    1. Pre-molhado um prato poço profundo com 200 µ l de PBSBTx. tampa e reserve. Obter 3 lâminas de vidro fosco e conjunto slide #3 de lado. Esfrega suavemente as regiões de vidro fosco de slides #1 e #2 juntos. Lave-os em água desionizada para remover qualquer cacos de vidro e seque com uma limpeza descartável.
    2. Pelagem foscas regiões dos slides #1 e #2 com PBSBTx adicionando 50 µ l de PBSBTx para um slide e esfregando esta região com o outro slide. Retire o líquido com uma limpeza descartável.
    3. Coloque as lâminas ao microscópio dissecação na configuração mostrada na Figura 4A. Mantém as regiões foscas de slides #1 e #2 no contato, com slide #3 apoio slide #2.
  3. Rolo de oócitos; Certifique-se de que a direção do rolamento é sempre em linha reta e nunca um movimento circular.
    1. Pipeta prewet um P200 dica em PBSBTx e dispersar os oócitos no tubo de microcentrífuga pipetando para cima e para baixo. Transferi 50 µ l de líquido contendo ovócitos para o centro da parte do slide #1 de vidro fosco. Levante o slide #2 para fazer isso.
    2. Abaixe lentamente o slide #2 até que a tensão de superfície do líquido cria uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deveria haver líquido suficiente para cobrir a área fosco, mas nenhum deve ser escorrer para fora. Se o líquido está transbordando, use uma pipeta Pasteur puxada para remover o excesso de líquido.
    3. Prender a lâmina inferior (#1) no lugar com uma mão e use a outra mão para mover a corrediça superior (#2) e para trás no sentido horizontal, mantendo o nível slide #2 e suportados no slide #3. Realizar-se sob um microscópio para fácil visualização dos movimentos do oócito e progresso.
      Nota: Este movimento vai gerar atrito e causar os oócitos "rolar" e perder a suas chorions. Pressão mínima deve ser usado e os movimentos devem ser curtos e rápidos.
    4. Depois de alguns movimentos no sentido horizontal, altere um pouco o ângulo de movimento (Figura 4B). Em múltiplos incrementos, gradualmente aumente este ângulo de 90° até que o movimento da lâmina superior (#2) é perpendicular à direção inicial (Figura 4B). Observe que o chorions vazios será visíveis no líquido e oócitos falta chorions aparecerá mais longo e mais fino.
    5. Repita os passos 4.3.3 - 4.3.4 cerca de 7 - 10 vezes até que a solução torna-se ligeiramente turva. O travão quando a maioria dos oócitos (75-85%) parece ter perdido suas membranas vitelínico.
      Nota: Uma extremidade pontiaguda distintiva é frequentemente visível em oócitos falta vitelínico membranas. Vitelínico membranas são mais difíceis de remover do que chorions. Uma ligeira pressão pode ser aplicada para a corrediça superior (slide #2) enquanto rola para conseguir a remoção das membranas vitelínico. Tentar remover vitelínico membranas de todos os oócitos, muitas vezes, resulta na destruição de outros oócitos.
    6. Levante suavemente a corrediça superior (#2), arrastando um dos seus cantos para o centro da região fosco da lâmina inferior (#1) para que rolou oócitos acumular-se no centro da região de fosco. Enxágue oócitos de ambos os slides com PBSBTx no poço profundo prato contendo PBSBTx.
    7. Slides #1 e #2 com água ultrapura, seca com uma limpeza descartável, de limpar e repor. Repita as etapas 4.3.1 - 4.3.6 até rolaram todos os oócitos com o mesmo genótipo. Isto requer geralmente 3-4 rodadas de rolamento por genótipo.
  4. Remover os resíduos após a laminagem
    1. Adicione 1 mL de PBSBTx para um tubo cônico de 15 mL. Agite o líquido para revestir os lados do tubo.
    2. Usar um PBSBTx revestido a ponta da pipeta P1000, transferência de oócitos laminados do fundo bem o prato para o tubo cônico contendo 1 mL de PBSBTx. adicionar um adicional 2 mL de PBSBTx para o tubo cônico contendo os ovócitos.
    3. Que comecem os oócitos resolver ao fundo, em seguida retire a tampa 2 mL de solução contendo detritos (chorions, vitellines, etc.) com um P1000 e descartar. Se necessário, segure o tubo cónico contra um fundo escuro para ver os ovócitos opacos como eles afundam.
    4. Adicionar um adicional 2 mL de PBSBTx para os oócitos e repita a etapa 4.4.3. 4.4.3 repetição. um total de 3 rounds de remoção de entulhos.
    5. Usar um PBSBTx revestido a ponta da pipeta P1000, oócitos de transferência para o tubo de microcentrífuga original 500 µ l. 20 - 25 fêmeas devem produzir cerca de 50 µ l de oócitos maduros laminados.
  5. Repita seção 4 para os genótipos restantes usando slides foscas frescas, um prato limpo profunda e um novo tubo cônico para cada genótipo.
  6. Se o armazenamento é necessário, transferência de oócitos de 1X PBS com 0,1% TritionX-100 e loja durante a noite a 4 ° C. Armazenamento a longo prazo não é recomendado porque reticulação de formaldeído pode ser revertida por detergentes não-iônicos.

5. PEIXE

Nota: Todas as lavagens são executadas em um nutator à temperatura ambiente a menos que indicado o contrário. Oócitos que tenham sido rolados levam mais tempo para resolver a parte inferior do tubo de microcentrífuga, especialmente em soluções que contêm o formamide. É importante ser paciente quando alterar soluções para que os oócitos não são perdidos no processo de. Isso pode exigir esperando 5-15 min para deixar oócitos resolver após lavagens e lavagens. Observe também que os oócitos em formamida são menos opacos.

  1. Tratamento de extração e RNAse
    1. Enxágue oócitos com 500 µ l de PBS contendo 1% Triton X-100 (PBSTx). Retire o líquido e adicione 500 µ l tampão de extração (PBSTx contendo RNAse). Incube em nutator em temperatura ambiente por 2 h.
  2. Pré-hibridização lavagens
    1. Enxágue oócitos 3 vezes com 500 µ l 2 x salina citrato de sódio, contendo Tween 20 (SSCT). Pré-aqueça uma alíquota (~ 500 µ l/genótipo) de 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C.
      Atenção: formamida é tóxica, use proteção adequada.
    2. Lave oócitos por 10 min cada por 3 vezes em 500 µ l 2 x SSCT. Lave oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 20% formamida. Lave oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 40% formamida. Lave oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + formamida 50%.
    3. Retire o líquido e adicionar 500 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% da etapa 5.2.1 a amostra e incubar durante 2 h a 37 ° C com rotação.
      Nota: Um forno de hibridização equipado com um rotor funciona bem para isso. Um tubo de microcentrífuga de espuma "float" anexado para o rotator pode ser usado para proteger os tubos.
  3. Desnaturação e hibridação
    1. Para cada tubo de oócitos, use 40 µ l de tampão de hibridização 1 x contendo sonda centromérica de 2,5 ng / µ l e 0,31 pmol fluor / µ l de cada sonda de BAC. Prepare uma solução da sonda em tampão de hibridização suficiente para todos os genótipos. Vórtice sonda mistura 30 s antes de adicionar.
    2. Utilize uma ponta de pipeta P200 BSA-revestido, transferência de oócitos para um tubo PCR de 200 µ l. Manter amostras a 37 ° C e deixe oócitos settle ao fundo e, em seguida, usar uma pipeta Pasteur puxada para remover tanto líquido quanto possível.
    3. Adicione 40 µ l de solução de hibridação com sonda (preparada na seção 2) de oócitos. Coloque o tubo PCR contendo ovócitos na máquina de PCR e incubá-los da seguinte forma: 37 ° C por 5 min, 92 ° C por 3 min, em seguida 37 ° C durante a noite. Após sonda é adicionada ao oócitos, mantê-los no escuro tanto quanto possível.
  4. Lavagens de pós-hibridização
    1. Pré-aqueça o 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C e mantê-lo na incubadora de hibridização. Com uma BSA revestido P200 Pipetar ponta, adicionar 100 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% para o tubo PCR com os oócitos e transferir os oócitos para um tubo de microcentrífuga de novo 500 µ l.
    2. Adicione um adicional de 400 μL de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% para o mesmo tubo e deixar que os oócitos resolver a 37 ° C na incubadora.
      Nota: Fixando-se, frequentemente, leva mais tempo para esta etapa. Não é incomum para levar 15 min ou mais. A falta de paciência resultará em perda significativa de ovócitos.
    3. Lave os oócitos por 20 min cada por 3 vezes em 500 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C com rotação. Manter oócitos a 37 ° C, enquanto eles resolvem.
    4. Lave os oócitos por 10 min cada por 3 vezes em 500 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C com rotação. Manter oócitos a 37 ° C, enquanto eles resolvem.
    5. À temperatura ambiente, lave os oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 40% formamida em um nutator. Lave os oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 20% formamida. Lave os oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT.
  5. Mancha com DAPI
    Cuidado: DAPI é tóxica, use proteção adequada.
    1. Lave oócitos por 20 min em solução DAPI 500 µ l (1 µ g/ml) em 2 x SSCT sobre o nutator. Lave os oócitos 3 vezes em 500 µ l 2 x SSCT. Lave os oócitos 2 vezes por 10 min cada em 500 µ l 2 x SSCT sobre o nutator. As amostras podem ser armazenadas por até 4 h à temperatura ambiente no escuro até que estejam prontos para montar em lamelas.
  6. Montagem
    Nota: Consulte a Figura 3 para ferramentas necessárias.
    1. Coloque uma lamela de poli-L-lysine revestida sob o microscópio de dissecação. Retire o líquido do tubo de oócitos, ajustando o volume total de cerca de 150 µ l. Com uma BSA revestido P200 ponta da pipeta, pipeta de cima e para baixo para dispersar oócitos em toda a solução e então transfira 40 µ l da solução de oócitos para uma lamela revestida de poli-L-lisina.
    2. Retire parte do líquido da lamela utilizando uma pipeta Pasteur puxada até os oócitos furar a lamela, mas ainda estão rodeados por líquido. Com a pinça, segure o deslizamento da tampa de um lado e usar uma agulha de tungstênio para dissociar suavemente touceiras de ovócitos, movendo-os para conseguir uma única camada de não-sobreposição de ovócitos.
    3. Remova o restante do líquido ao redor de oócitos com uma pipeta Pasteur puxado. Levar uma lâmina de vidro limpa e usar o gás comprimido para explodir toda a poeira. Adicione 22 µ l de mídia (por exemplo, Prolong-ouro) para o meio da corrediça de montagem. Baixe lentamente a lâmina em direção a lamela, com os meios de montagem virado para a amostra, até os meios de comunicação em contacto com a amostra. Tensão superficial fará com que a lamela aderir ao slide.
    4. Coloque slides em um recipiente de plástico com uma tampa tight-fitting que contém uma camada de dessecante fresco (por exemplo, drierite). Deixe slides secar por 3-5 dias no escuro antes de imagem. Tempo de secagem pode variar dependendo da umidade do quarto.

6. imaging

  1. Depois de retirar slides secos da caixa de dessecante, limpá-los para remover quaisquer partículas de poeira. Selar as lamelas com os esmaltes. Selado de slides podem ser armazenados indefinidamente a-20 ° C.
  2. Adquira imagens confocal com um objectivo de óleo abertura numérica elevada 40 X 6 X zoom digital de exploração do laser.
    Nota: Idealmente, software de sistema irá permitir a encontrar e marcar o local X-Y de cromossomos meióticos para vários oócitos enquanto visualiza-los usando epifluorescência. Esse recurso economiza tempo durante uma sessão de imagens. Rápida de branqueamento com um objectivo de abertura numérica elevada 60 X feito seu uso inadequado com o sistema escolhido confocal, mas pode funcionar para outros sistemas.
  3. Capture uma série de Z para cada oócito, definindo a parte superior e inferior da série usando o sinal DAPI.
    Nota: O ganho, deslocamento, e poder do laser precisará ser determinado empiricamente utilizando um subconjunto de ovócitos. Uma vez que parâmetros adequados são encontrados, apenas pequenos ajustes devem precisam ser feitas.
    Se alterou a aquisição configurações são necessárias, use a pilha de imagem previamente coletados para estimar as alterações necessárias. Para evitar o branqueamento, abster-se de pre-imagem da sonda de braço antes de capturar a série Z. Com um tamanho de passo de 0,25 µm, série Z tipicamente variar de 25 a 30 passos, dependendo da orientação e posicionamento dos cromossomos. Um tamanho de passo menor pode melhorar a capacidade de avaliar se os dois pontos de peixe são separados na dimensão axial, mas há um trade-off com o tempo necessário para capturar pequenos passos e perda de intensidade do sinal devido ao clareamento. Um objectivo X 40 com 6x zoom digital e um campo de imagem de 1.024 x 512 gera imagens com um tamanho de pixel de 0,05 µm.

7. imagem análise e pontuação para defeitos de coesão

  1. Deconvolve a série Z para otimizar a relação sinal-ruído para cada oócito19.
    Nota: Um pacote de software, como especificado na Tabela de materiais permite que se deconvolve usando restauração Integrativa, bem como de culturas e contraste-melhorar as imagens. Importante, um pacote de software que permite ver imagens e pontuação para a coesão defeitos em três dimensões é imperativo.
  2. Para cada oócito, tabular o número de braço e focos centromérica que colocalize com o sinal DAPI. Perda de coesão resulta em três ou quatro sinais distintos e separados por uma ponta de prova específica. Não é incomum observar dois focos que estão conectados por um fio fino. Pelos critérios mais rigorosos, estes focos não seriam considerados "separados".

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Representative Results

A Figura 5 apresenta imagens obtidas com uma sonda de braço que se a região citológica 6E-7B no cromossomo X . Este resulta da sonda em um sinal de que co localiza com o de DAPI, é facilmente distinguível do fundo e tem sido usada com sucesso para quantificar defeitos de coesão braço em diferentes genótipos de19. Quantificação de defeitos de coesão se restringia a prometafase I e metáfase eu estágios; oócitos antes da desagregação do envelope nuclear foram excluídos análise19. Um envelope nuclear intacto é evidente quando a varredura no canal DAPI porque os cromossomos oócito serão cercados por uma discreta área circular que é mais escura do que o citoplasma circundante.

Figura 5B mostra projeções de intensidade máxima de cada série Z após melhoria de Desconvolução e contraste. Quantificação de defeitos de coesão requer determinação, para cada sonda, que o número de peixes sinaliza essa sobreposição com o sinal DAPI. Para tal análise, visualização das imagens em três dimensões mescladas é imperativa. Apenas os pontos de peixe que estão claramente associados com o sinal DAPI em todas as três dimensões devem ser incluídos na análise.

Irmã intacta coesão cromátide evidencia-se como dois pontos de peixes para o braço e o pericentric sondas (Figura 5B, à esquerda). Oócitos contendo três ou quatro pontos de peixe separados para cada sonda são considerados ter defeitos de coesão (Figura 5B, direita). Para ser classificado como pontos individuais, dois sinais de peixe devem ser separados em três dimensões por uma distância correspondente ao diâmetro do menor ponto minimamente. Finos fios fracos conectando dois pontos de peixes não são incomuns. Tais sinais não são considerados completamente separados e, portanto, não são contados como instâncias de defeitos de coesão.

Com a sonda de hibridização de braço 6E-7B, aproximadamente 15-20% dos oócitos fotografada completamente carecia de sinal ou o sinal era muito fraco para marcar com confiança. Além disso, aproximadamente 5% dos oócitos fotografados exibiu uma grande área de sinal cromossômica difusa e estas foram descartadas da análise. Em contraste, era raro encontrar oócitos para que o sinal de hibridação pericentric estava ausente ou muito difuso de pontuação.

A sonda de braço 6E-7B tem sido amplamente utilizada para quantificar o braço coesão defeitos em prometafase e metáfase prendi Drosophila oócitos de diferentes genótipos19. Quando a subunidade cohesin SMC3 foi derrubada durante a prófase mid, 16,3% dos oócitos maduros analisados contida maior que dois pontos, indicativos de perda prematura de coesão do braço do braço. Em contraste, observou-se pontos separados de braço em apenas 5,1% dos oócitos que continha níveis normais de SMC319. Curiosamente, embora a frequência de coesão braço defeitos foi elevado em vários genótipos knockdown, irmã de cromátides irmãs raramente foram separados em suas regiões de pericentric19.

Figure 1
Figura 1: perda de idade-dependente da coesão durante a prófase estendida está preso da meiose feminina pode resultar em erros na segregação de cromossomos e aneuploidia no ovo. Coesão é representado por barras pretas entre a irmã cromátides irmãs. Braço coesão funções para armazenar recombinantes homologs juntos e é necessário para a segregação precisa na anáfase eu. Se o braço coesão está perdido prematuramente, missegregation cromossomo pode ocorrer, resultando em um ovo aneuploid. Esta figura era adaptada de referência19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: tamanho das moléculas de DNA após a fragmentação do BAC e amplificação (à esquerda) e após digestão enzimática de restrição (à direita) para três diferentes BACs. 400 ng de produtos amplificados do ADN são mostradas nas primeiras três pistas. As últimas três pistas mostram fragmentos de DNA após o resumo da restrição durante a noite. Os produtos de DNA amplificados variam de 200 bp até 3 kb. Após o resumo da restrição, a maioria dos fragmentos variou de 100-200 bp, mas fragmentos maiores (até 500 bp) eram visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: ferramentas de citologia. Ferramentas usadas no protocolo: (1) par de pinças (Dumont #5); (2) agulha de tungstênio; (3) fundo bem prato com tampa; (4) raso vidro dissecando o prato; (5) puxou uma pipeta Pasteur. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Arranjo e movimento de slides para rolamento oócitos. (A) diagrama do slide configurado para rolamento de oócitos, conforme descrito no protocolo. A área mais escura denota a parte de vidro fosco do slide. (B) direção de vetores de movimento para slide #2 durante o oócito rolando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Resultados de ensaios de peixe. (A) diagrama esquemático retrata o cromossomo X de Drosophila e onde os dois braço sondas (6 BACs cada) e a sonda de pericentromeric do 22 oligonucleotide descrita no protocolo de cruzar. Para manter a simplicidade, a sonda 6E-7B é rotulada 7B e a sonda 2F - 3C é etiquetada 3 C. (B) imagens representativas dos resultados de peixe (sonda 6E-7B) coesão intacta do braço (braço duas sonda pontos, um por homólogo) e coesão braço interrompidos (três a quatro pontos de sonda de braço). DNA é azul, o sinal de sonda de braço é amarelo e o sinal de sonda pericentric é vermelho. Imagens correspondem às projeções de intensidade máxima da série Z após melhoria de Desconvolução e contraste. Barra de escala = 2 µm. Esta figura era adaptada de referência19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O uso de peixes sondas para avaliar o estado da coesão de braço em prometafase I e metáfase eu Drosophila oócitos é um avanço significativo no campo da drosófila meiose. Historicamente, a drosófila pesquisadores foram limitados ao testes genéticos para inferir a perda prematura da coesão de braço em oócitos maduros11,18,19. Agora, com os métodos apresentados aqui, o estado da coesão do braço pode ser analisado usando diretamente o peixe. A capacidade de obter provas físicas para perda prematura da coesão braço grandemente expande o repertório das abordagens disponíveis para estudar os mecanismos que levam à perda prematura de missegregation de coesão e cromossomo braço em oócitos de Drosophila .

Passos críticos
Apesar de que não temos realizado uma análise sistemática dos parâmetros críticos necessários para visualização de sucesso de uma sonda fluorescente que se com sequências de cópia única ao longo do braço do cromossoma em oócitos maduros de Drosophila , oferecemos o seguinte lista de fatores que pode ter contribuído para o sucesso desta técnica. Para gerar a sonda de braço, usamos uma combinação de seis sobreposição sondas BAC que cobrem um intervalo de aproximadamente 0,8 Mb no X-braço do cromossomo. Nossas tentativas iniciais usando menos BACs que atravessavam uma região menor não foram bem sucedidas. Além disso, usamos um método para fragmentar e amplificar o DNA de BAC antes extremidade-etiquetando com Alexa-647. A maioria dos fragmentos de restrição que foram rotulados eram 100-200 bp longo (Figura 2), que concorda com o tamanho do alvo de 150 nucleotídeos que é necessário para difusão eficiente através de de tecidos grossos21. Condições de fixação que preservar a morfologia do oócito Drosophila grande, mas também permitam a penetração da sonda são essenciais. Modificamos o nosso método de fixação utilizado anteriormente23 adicionando heptano temperatura para uma solução de correção pré-aquecida a 37 ° C. Consideramos que é possível que ambos a adição de heptano para aumentar a penetração através da membrana vitelínico, bem como a temperatura baixou para fixação contribuiu para as condições de fixação bem sucedido para visualização da coesão do braço.

Quando a análise para perda prematura da coesão, um requer um tamanho de amostra que permite a quantificação de defeitos que estão presentes em baixa para níveis moderados. Para obter um grande número de oócitos maduros, outros autores utilizaram rompimento de liquidificador de fêmeas adultas combinado com peneiramento 26,,27. Aqui nós descrevemos um método à mão dissecar os ovários das fêmeas de 20-25, com a separação manual de tarde estágio oócitos por pipetagem. Enquanto o liquidificador/peneiração método deve funcionar também com este protocolo, uma vantagem de dissecação de mão é que sem o processo de peneiramento, oócitos passam menos tempo em buffer antes de fixação, o que diminui a chance de anáfase eu início devido ao ovo artificial ativação. Além disso, este método requer menos fêmeas como material de partida utiliza menores volumes dos reagentes e tem um fluxo de trabalho mais simples, todos os quais facilitam vários genótipos de processamento.

Separação de dissecção e manual mão de oócitos maduros fornece quantidades suficientes de ovócitos "rolar" para remoção de membrana cório e vitelina e resulta em cerca de 75-150 oócitos no final de lavagens da hibridação. Um truque para maximizar o rendimento de metáfase prendi oócitos é segurar as fêmeas virgens em frascos levedados na ausência de machos antes de dissecação25. Oócito rolando para remover chorions e membranas vitelínico deve ser realizado com um toque suave para evitar destruir oócitos. No entanto, chorions e membranas vitelínico retirar 100% dos oócitos não é uma meta realista e excessivo rolamento só resulta em perda de oócitos. Portanto, cada rolamento ciclo deve ser interrompido quando aproximadamente 75-85% dos oócitos falta chorions e membranas vitelínico.

Limitações
Apesar de nosso sucesso na geração e usando sondas de braço para monitorar o estado da coesão em oócitos maduros de Drosophila , o procedimento ainda sofre de limitações. Enquanto nós raramente falha ao detectar um sinal para a sonda pericentromeric, o sinal de sonda de braço era fraco ou ausente em cerca de 15-20% dos oócitos que nós fotografada. Um fator que contribui pode ser diferencial penetração da sonda do oligonucleotide pericentric (22-28 nucleotídeos) contra a sonda de braço maior (100-200 nucleotídeos). Além disso, a grande sequência repetitiva, reconhecida pelos resultados de sonda de pericentric em um sinal de que é mais brilhante do que para a sonda do braço. A orientação do oócito e colocação de cromossomos meióticos dentro o oócito também apresentam um desafio quando de imagem. Embora os cromossomos meióticos são relativamente perto do córtex celular, é impossível controlar a orientação do oócito durante a montagem no sentido do lamela. Portanto, em uma fração de oócitos, os cromossomos meióticos podem ser de 100-200 µm de lamela e a intensidade do sinal e qualidade pode ser afetada negativamente ao tentar imagem através da maior parte do oócito. Estas limitações, quer dizer que o número de oócitos incluído em última análise quantitativa é consideravelmente menor que o número de oócitos processadas no protocolo. Determinando o estado de coesão de braço em 100 oócitos provavelmente exigirá duas preparações independentes. Um fator limitante adicional na quantificação dos defeitos de coesão usando um microscópio confocal de varredura de laser é o tempo necessário para capturar uma típica série Z (aproximadamente 5 min), mesmo quando a área capturada é confinada a 1.024 x 512 pixels. Isto significa que a comparação de coesão em genótipos experimentais (100 oócitos cada) e controle exigirá aproximadamente 16 h de tempo de coleção de imagem.

Modificações e solução de problemas
Nós fomos capazes de monitorar o estado da coesão do braço usando uma sonda que reconhece o cromossomo X na posição citológica 6E-7B19. Uma sonda que se para uma localização mais distal no cromossomo X pode ser mais desejável para detectar a falha de manutenção do quiasma. Além disso, outros pesquisadores podem desejar analisar coesão de braço em outros cromossomos. Enquanto nós não tentou sondar os autossomos, os dados preliminares indicam que uma sonda que reconhece a 2F - 3C região do cromossomo X também resulta em um sinal detectável. No entanto, com base em dados preliminares limitados, o sinal da sonda C 2F - 3 pode ser menos "compacto" do que para a sonda 6E-7B. Embora os sinais de peixe são apertadas e batata frita por alguns cromossomos do oócito, o sinal de hibridação em cromossomos de outros oócitos é consideravelmente mais difuso. Estas diferenças no sinal refletem genuínas diferenças na morfologia do cromossomo entre os dois locais citológicos, variabilidade na eficiência da hibridação das duas sondas ou apenas estocástica variabilidade entre diferentes oócitos será exigem uma análise mais aprofundada.

Importante, mesmo para a sonda 6E-7B, observamos um sinal difuso cromossômico em alguns oócitos, e isso muitas vezes necessária sua exclusão da análise. Além disso, notamos variação na qualidade do sinal e brilho entre diferentes preparações da sonda 6E-7B e isso exigia essa imagem parâmetros ajustados em conformidade. Elevando a temperatura de hibridação de 42 ° C não reduz o número de oócitos com sinal difuso, mas ele um impacto o sinal para a ponta de prova do oligonucleotide pericentric. Em um esforço para melhor preservar a morfologia de cromossomo24, fizemos também um passo de desnaturação mais tempo em uma temperatura mais baixa (80 ° C), mas encontrou que este tratamento não aumentou a intensidade do sinal, nem reduziu o número de oócitos com difusa sinal de peixe cromossômico. Também procurou-se obter um sinal de braço mais brilhante usando 12 BACs sobreposição correspondente a um intervalo de Mb aproximadamente 1.5 que atravessavam a região citológica 5E-7B. Quando usando uma sonda de BAC 12, o grau de variação da intensidade do sinal, bem como a porcentagem de ovócitos sem sinal não foi diferente do que quando seis BACs foram usados para fazer a sonda de braço. Foi também o mais desafiador para marcar para defeitos de coesão ao usar a sonda de BAC 12 porque os sinais de peixe eram maiores, tornando mais difícil para resolver os pontos correspondentes a cromátides irmãs individuais. Nos casos em que nenhum sinal é obtido com uma sonda recém preparada, pesquisadores devem verificar o tamanho do amplificado e restrição digerido BAC DNA para confirmar que os fragmentos utilizados para fim de rotulagem são principalmente dentro da faixa de pressão de 100-200. É provável que seja um dos fatores mais críticos na preparação de sonda bem sucedida.

Direções futuras
Futuros trabalhos para melhorar a aquisição de imagens, bem como adaptar o protocolo para incluir immunostaining seria grandes melhorias que beneficiariam outros pesquisadores. Durante a coleta de imagem, coletar um número maior de imagens na dimensão axial, bem como a aquisição de imagens mais rápida seria vantajoso para a quantificação dos defeitos de coesão. Otimizar os parâmetros da imagem latente do laser scanning confocal, encontramos sinais de 0,25 µm foi o menor tamanho de passo que poderia ser usado para a série Z para evitar o branqueamento apreciável dos peixes. No entanto, para os sinais de peixes que são separados por menos de 0,25 µm na pilha de Z, este tamanho de etapa pode resultar em falha ao capturar o "espaço" entre os focos e, portanto, pode subestimar o número de defeitos de coesão. A maior velocidade de aquisição de imagem de um disco girando confocal pode permitir tamanhos menores de passo deve ser usado sem sinal do branqueamento. Isto daria reconstrução de imagem mais precisa da dimensão axial, bem como permitir o maior número de oócitos a serem analisados para defeitos de coesão. Além disso, a capacidade de combinar imunocoloração com visualização de peixes do estado de coesão braço aumentaria significativamente o protocolo. Para um número de preparações, nós tentamos realizar imunocoloração de eixo, seguindo o processo de hibridização. No entanto, eixo robusto coloração era visível em apenas uma pequena fração dos oócitos. Além disso, por razões que não são claras, níveis mais elevados de sinais espúrios de peixe rodeado dos cromossomos meióticos quando peixes e imunocoloração foram combinados. Mais trabalho para otimizar o protocolo para permitir que immunostaining antes ou após o procedimento de peixe iria expandir a capacidade desta técnica.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant GM59354 atribuído a Sharon E. Bickel. Agradecemos Huy p. Nguyen assistência no desenvolvimento do protocolo para a geração de sondas fluorescentes braço, Ann Lavanway para ajuda com microscopia confocal e J. Emiliano Reed para assistência técnica. Agradecemos também a numerosos colegas na Comunidade da drosófila para discussões úteis e conselhos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

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References

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Biologia do desenvolvimento edição 130 drosófila meiose oócito irmã cromátide coesão braço coesão fluorescência situ hibridação in (peixe)
Usando fluorescência hibridação <em>In Situ</em> (FISH) para monitorar o estado de coesão de braço em prometafase e metáfase eu oócitos de <em>Drosophila</em>
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Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

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