Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Med fluorescens In Situ hybridisering (FISH) för att övervaka tillståndet för Arm sammanhållning i metafasen och metafas I Drosophila oocyter

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Detta manuskript presenterar en detaljerad metod för att generera X-kromosom arm sonder och utför fluorescens i situ hybridisering (FISH) att undersöka tillståndet i syster kromatida sammanhållning i metafasen och metafas jag arresterad Drosophila oocyter. Detta protokoll är lämplig för att avgöra om meiotiska arm sammanhållning är intakt eller störd i olika genotyper.

Abstract

I människor ansvarar kromosom segregation fel i oocyter för majoriteten av missfall och missbildningar. Dessutom som kvinnor ålder, är risken att bli gravid en aneuploid fostret ökar dramatiskt och detta fenomen kallas moderns ålderseffekt. Ett krav för korrekt kromosomsegregering under meiotiska divisionerna är underhåll av syster kromatida sammanhållning under perioden utökade profas som oocyter erfarenhet. Cytologiska bevis hos både människor och modellorganismer tyder på att meiotiska sammanhållning försämras under åldrandeprocessen. Dessutom segregation fel i mänskliga äggceller är vanligast under meios I, överensstämmer med tidig förlust av arm sammanhållning. Användning av modellorganismer är avgörande för att nysta upp de mekanismer som ligger bakom åldersberoende förlust av sammanhållning. Drosophila melanogaster erbjuder flera fördelar för att studera regleringen av meiotiska sammanhållning i oocyter. Tills nyligen var dock bara genetiska tester tillgängliga till assay för förlust av arm sammanhållning i oocyter av olika genotyper eller olika experimentella villkor. Här är ett detaljerat protokoll förutsatt för att använda fluorescens i situ hybridisering (FISH) att direkt visualisera defekter i arm sammanhållning i metafasen jag och metafas jag arresterad Drosophila oocyter. Genom att generera en fisk sond som hybridizes till distala armen av X -kromosomen och samla confocal Z stackar, forskare kan visualisera antalet enskilda fisk signaler i tre dimensioner och avgöra om syster kromatida armar är separerade. Förfarandet gör det möjligt att kvantifiera arm sammanhållning defekter i hundratals Drosophila oocyter. Som sådan, ger denna metoden ett viktigt verktyg för att undersöka de mekanismer som bidrar till sammanhållningen underhåll samt de faktorer som leder till dess undergång under åldrandeprocessen.

Introduction

Ordentlig segregation av kromosomerna under Mitos och meios kräver att syster kromatida sammanhållningen vara etablerade, underhålls och släppt i ett samordnat1,2. Sammanhållning är etablerad under S-fasen och medieras av den cohesin komplex, som utgör fysiska kopplingar som håller syster kromatiderna grupp. I meios, sammanhållning distalt en crossover fungerar även för att hålla rekombinant homologs ihop och detta Läkarundersökninganslutning säkerställer rätt orientering av bivalent på metaphasen jag spindel (figur 1)3,4, 5. Release av arm sammanhållning på Anaphasen jag tillåter homologs att segregera till motsatta spindeln poler. Förlora sin fysiska anslutningen dock om arm sammanhållning är förlorade tidigt, rekombinant homologs kommer att och segregera slumpmässigt, vilket kan resultera i aneuploid könsceller (figur 1).

I mänskliga äggceller, fel i kromosomsegregering är den vanligaste orsaken till missfall och missbildningar, till exempel Downs syndrom6, och deras förekomst ökar exponentiellt med moderns ålder7. Syster kromatida sammanhållning är etablerat i fostrets oocyter och meiotisk rekombination är klar före födseln. Oocyter sedan gripa i mitten av profas jag tills ägglossning och under denna gripande, den fortsatta fysiska anslutningen av rekombinant homologs bygger på syster kromatida sammanhållning. Därför kräver korrekt segregation under meios och normala graviditeter att sammanhållning förblir intakt i upp till fem decennier.

För tidig förlust av sammanhållning under långvarig meiotiska gripandet av mänskliga äggceller har föreslagits bidra till moderns ålder effekten och flera rader av bevis som stöder denna hypotes8,9. Men med tanke på utmaningarna som studerar meiotiska sammanhållning i mänskliga äggceller, mycket av vår förståelse av fenomenet bygger på användning av modell organismer5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster oocyter erbjuder många fördelar för studiet av meiotiska sammanhållning och kromosom segregering. En enkel genetisk analys gör att man kan återhämta sig avkomma från aneuploid könsceller och mäta trohet av X-kromosomsegregering på en stor skala11,16,17. Dessutom kan man också bestämma huruvida kromosom segregation fel uppstå eftersom rekombinant homologs missegregate under meios I, en fenotyp som överensstämmer med tidig förlust av arm sammanhållning11,18, 19. direkt observation av meiotiska sammanhållning i Drosophila oocyter är också möjligt med hjälp av fluorescens i situ hybridisering (FISH). Även om fluorescerande oligonukleotider som hybridiserar till repetitiva satellit sekvenser har använts i över ett decennium för att övervaka pericentromeric sammanhållning i mogen Drosophila oocyter4,20, analys av arm sammanhållningspolitiken har varit mycket mer utmanande. Visualisering av arm sammanhållning kräver en sond som sträcker sig över en stor region för exemplar sekvenser och är tillräckligt ljust för att leda till synliga signaler för enskilda syster kromatiderna när arm sammanhållning är frånvarande. Dessutom måste äggcellen fixering villkor och storleken på de märkta utsedda nationella myndigheterna underlätta penetration21 in i den stora mogna Drosophila äggcellen (200 µm breda av 500 µm lång). Nyligen, en arm sonden var framgångsrikt utnyttjat att visualisera Drosophila äggcellen kromatiderna under Anaphasen jag, men författarna uppgav att de inte kunde upptäcka en signal i metafasen eller metafas jag arresterad oocyter22. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för generering av X-kromosomen arm fisk sonder och äggcell förberedelse villkor som har låtit oss till assay för tidig förlust av syster kromatida sammanhållning i metafasen jag och metafas jag oocyter. Dessa tekniker, vilket har gjort det möjligt för oss att identifiera genprodukter som krävs för underhåll av meiotiska sammanhållning, kommer att tillåta andra till assay för syster kromatida sammanhållning defekter i mogen Drosophila oocyter från olika genotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelser

  1. Bereda lösningar för fluorescens i situ hybridisering (FISH). Förbereda alla lösningar med hjälp av ultrarent vatten.
    1. Förbereda 5 x modifierade Robbs buffert: 275 mM kalium acetat, 200 mM natriumacetat, 500 mM sackaros, glukos 50 mM, 6 mM magnesiumklorid, kalciumklorid 5 mM, 500 mM HEPES pH = 7.4. Ge pH 7,4 använder 10 N NaOH. Filter sterilisera och förvara vid-20 ° C. Tina och späd till 1 x som behövs och lagra 1 x alikvoter vid-20 ° C.
    2. Förbereda 10 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1,3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4. Ta pH till 7,0 använder 10 N NaOH. Sterilisera i autoklav eller filter sterilisering.
  2. Förbereda poly-L-lysin coverslips en dag innan behövs.
    1. Pipettera 70% etanol som innehåller 1% saltsyra på ytan av en 18 x 18 mm #1.5 täckglas och inkubera i 5 min. Använd vakuum strävan att ta bort vätska. Upprepa med sterilt ultrarent vatten. Täcka ytan av täckglas med 0,1 mg/mL poly-L-lysin och inkubera i 10 min.
    2. Aspirera för att ta bort vätska och lufttorka för 10 min. Store coverslips poly-L-lysin sidan uppåt i en plastbehållare med ett tättslutande lock för att undvika damm.
  3. Förbereda drog Pasteur pipetter ta bort flytande lösningar utan att ta bort oocyterna. Över en bunsenbrännare flamma, värme i mitten av en lång glas Pasteur-pipett samtidigt som du försiktigt drar i varje ände tills glaset smälter och drar isär.

2. generering av Arm sond för fisk

Obs: Alla centrifug steg utförs vid ~ 16.000-21 000 x g (maximal hastighet på de flesta bordsskiva microcentrifuges). Kort centrifug spinn ange spinning för 5-15 s. Vortex indikerar vortexa för ~ 15 s vid max fart om inget annat anges.

Obs: BACs för arm sonder kan erhållas från BAC PAC resurser. Två X -kromosom euchromatic arm sonder har använts framgångsrikt med denna metod. En arm sond bestod av sex BAC kloner motsvarande till Cytologisk band 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Andra arm sonden bestod av sex BAC kloner motsvarande till Cytologisk band 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs till andra Drosophila kromosom regioner kan bli betat på: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Två pericentric sonder som känner igen den 359 bp satellit upprepningen av X -kromosomen har använts framgångsrikt med denna metod. En 22 nukleotid sond har använts flitigt och fungerar bra (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. En 28 nukleotid sond testades nyligen och även arbetat väl (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC renat oligonukleotider 5' märkt med en specifik fluorophore beställdes från en kommersiell källa (t.ex., integrerad DNA teknik).

  1. Prep BAC klon DNA kit anvisningarna som anges i Tabellen för material. Återsuspendera DNA pelleten erhållits från 100 mL av kulturen i 200 µL TE; den slutliga DNA-koncentrationen bör ligga mellan 5-40 ng/µL beroende på BAC klonen.
  2. Utföra DNA förstärkning för varje BAC med hjälp av amplifiering kit, som anges i tabellen av material, och följande protokoll. Bearbeta BAC DNA för varje klon individuellt. Använda enzymer och buffertar som levereras med setet i steg 2.2.1 genom 2.2.3.
    1. Slumpmässiga fragmentering av BAC DNA: för varje BAC, använda TE för att förbereda 10 µL 1 ng/µL DNA lösning i en 200 µL PCR-röret. Tillsätt 1 µL 10 X fragmentering buffert. Placera röret i en PCR-maskin på 95 ° C under exakt 4 min. omedelbart cool provet i isvatten och centrifugera kort. Inkubationstiden är dags känsliga och eventuella avvikelser kan förändra resultaten.
    2. Bibliotek förberedelse
      Obs: Denna metod använder slumpmässiga primers för att generera ett bibliotek av amplifiable fragment.
      1. Till röret som innehåller DNA tillägga följande: 2 µL av 1 x bibliotek förberedelse buffert, 1 µL bibliotek stabilisering lösning. Blanda omsorgsfullt genom vortexa, Centrifugera kort, och placera röret i PCR-maskinen vid 95 ° C i 2 min. omedelbart cool provet i isvatten och centrifugera kort.
      2. Tillsätt 1 µL av bibliotek förberedelse enzym till PCR-röret, mix och centrifugera kort. Plats PCR tube i PCR-maskinen och inkubera enligt följande: 16 ° C i 20 min, 24 ° C i 20 min, 37 ° C i 20 min, 75 ° C i 5 min, håll sedan vid 4 ° C.
      3. Ta prover från PCR-maskinen och centrifugera kort. Prover kan amplifieras omedelbart eller förvaras vid-20 ° C i upp till tre dagar.
    3. Förstärkning av BAC DNA bibliotek
      1. Lägg till följande reagenser till hela 15 µL slumpmässiga fragment reaktion: 7,5 µL 10 x förstärkning Master Mix, 47,5 µL Nuclease gratis vatten, 5 µL WGA DNA-polymeras. Blanda omsorgsfullt genom vortexa och centrifugera kort.
      2. Plats PCR tube i PCR-maskinen och inkubera enligt följande: inledande denaturering 95 ° C i 3 min, 14 cykler av denaturering vid 94 ° C för 15 s, följt av glödgning/förlängning vid 65 ° C i 5 min, håll sedan vid 4 ° C.
      3. Efter cykling är komplett, assay DNA koncentrationen. Koncentrationen av DNA bör vara minst 800 ng / µL. hålla prover vid 4 ° C eller förvaras vid-20 ° C tills redo för matsmältningen. Du kan också bedöma DNA fragment storlek genom att köra 400 ng DNA på en 2% agarosgel. Fragment bör variera från 200 bp till 3 kb (figur 2).
  3. Restriktionsenzym rötning av amplifierade DNA
    1. Placera 20 µg amplifierade DNA från föregående avsnitt i ett 1,5 mL mikrofugrör. Lägg till 20 enheter av Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 enheter av BfuCl, 0,5 µL 100 x BSA, 5 µL 10 x restriktionsenzym matsmältningen buffert och justera volymen till 50 µL genom att tillsätta lämplig mängd ultrarena H2O.
    2. Inkubera digest över natten vid 37 ° C i en inkubator att förhindra kondensbildning på locket. Etanol fällningen smält DNA. Lägg till digest: 1 µL glykogen, 1/10 volym 3M natriumacetat, 2,5 volymer 100% molekylärbiologisk kvalitet etanol. Inkubera vid-80 ° C under 1 timme eller över natten.
    3. Centrifugera under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta DNA pelleten med 1 volymdel rum temp 70% etanol och snurra för 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och låt DNA pellet lufttorka eller torka försiktigt med en stadig ström av luft.
    4. Återsuspendera DNA pelleten i 36 µL Sterilt ultrarent H2O och Använd 1 µL av DNA till assay DNA koncentrationen, som bör vara cirka 285 ng / µL. lagra DNA vid-20 ° C.
    5. Eventuellt bedöma DNA fragment storlek kör 400 ng DNA på en 2% agarosgel. De flesta fragment bör variera från 100-200 bp, med en svagare signal upp till 500 bp (figur 2).
  4. 3' förföljer reaktion
    1. Denature smält DNA vid 100 ° C i 1 min i en värme-block. Chill omedelbart i isvatten. Till de 35 µL av DNA, Lägg till följande: 50 µL 400 mM natrium cacodylate, 1 µL 10 mM DTT och vortex väl. Tillsätt 4 µL 25 mM CoCl2, 2,5 µL 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP från ARES märkning kit som anges i tabellen av material, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL 5 x TdT buffert, och 1 µL terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT) 400 U / µL. virvel och centrifugera kort.
      FÖRSIKTIGHET: CoCl2 är giftigt, bära lämpligt skydd.
    2. Inkubera i 2 h vid 37 ° C i en inkubator för att förhindra kondens. Tillsätt 1 µL av 250 mM EDTA att stoppa reaktionen och vortex kort att blanda. Etanol fällningen tailed DNA som beskrivs ovan (steg 2.3.2 - 2.3.4). Återsuspendera torkade DNA pelleten i 10 µL Sterilt ultrarent H2O. butiken DNA vid-20 ° C tills det att fortsätta.
  5. Genomföra fluorescerande färgämne konjugering med hjälp av DNA märkning kit som anges i tabellen material.
    Obs: När färgen läggs hålla prover i mörkret.
    1. Denature tailed DNA vid 95 ° C i 5 min i en värme-block. Omedelbart cool DNA i isvatten och centrifugera kort. Förbereda märkning buffert enligt instruktionerna kit och Lägg 6 µL till varje DNA-prov. Återsuspendera varje tub av färgämnet i 4 µL av DMSO från kit. Vortex och centrifugera kort.
    2. Använd en tub färgämne för varje märkning reaktion. Lägga till färgämne lösningen i DNA, vortex, och centrifugera kort. Inkubera märkning reaktionen i rumstemperatur i 2 h i mörkret. Tillsätt 3 µL av 3M hydroxylamin att stoppa reaktionen följt av 77 µL av den nuclease-fri H2O från kit. Vortex och centrifugera kort.
  6. Ta bort icke-konjugerad färgämne med hjälp av PCR-rening kit som anges i tabellen i material. Följ tillverkarens instruktioner. Eluera DNA från kolumnen två gånger med 40 µL av eluering buffert varje gång.
  7. Etanol fällningen märkt DNA som beskrivs tidigare (steg 2.3.2 - 2.3.4). Återsuspendera torkade DNA pelleten i 10 µL eluering buffert.
  8. Förbereda sonden blandning
    1. För märkt DNA, bestämma koncentrationen av fluorokrom färgämnet i pmol/µL. Fluorophore koncentrationen kan variera från 30-100 pmol/µL, beroende på BAC. De DNA-koncentrationen kan variera från 300-800 ng/µL.
      Obs: Inställningen microarray fungerar bra på en microvolume spektrofotometer, som den som anges i tabellen i material. I fönstret microarray Välj DNA-50 och ange fluorokrom.
    2. Skapa en master mix genom att kombinera equimolar belopp (pmol fluor) av varje av de BAC sonderna. Vortex 30 s innan kombinera. För att undvika frysning/upptining cykler, förbereda alikvoter av huvudmixen, tillämpa paraffin filma på rören för att förhindra avdunstning och förvaras i mörker vid-20 ° C.
      Obs: En mastermix innehållande 250 pmol av varje av de 6 individuella BAC sonder i en total volym på 30-50 µL fungerar väl. En alikvot innehållande 25 pmol (fluor) för varje BAC kommer att räcka för två 40 µL hybridisering reaktioner, med en sista sonden koncentration av 0,31 pmol fluor/µL för varje BAC.

3. dissektion och fixering av oocyter

  1. Samla 30 vuxna oskuld honor av lämpliga genotyp. För att berika för sent skede oocyter, håll kvinnor utan män i en injektionsflaska med flyga mat och torrjäst i 3-5 dagar innan dissektion25. Dagen innan dissektion, överföra honorna utan gas till en färsk injektionsflaska med jäst.
  2. Utföra dissektion.
    Obs: Se figur 3 för verktyg som behövs. Lösningar tas bort med hjälp av en drog Pasteur-pipett om inget annat anges. När du överför äggstockarna alltid Använd en pipett spets belagd med en 10% BSA lösning.
    1. I ett grunt dissekera maträtt innehållande modifierad Robbs buffert, använda pincett bort äggstockarna från en enda kvinna. Använd tång eller en Volfram nål för att försiktigt splay varje äggstock, så att lösningen att kontakta inre ovarioles. Överföra para av utspärrade äggstockarna till ett 1,5 mL mikrofugrör med 1 mL modifierade Robbs buffert.
    2. Upprepa steg 3.2.1 ackumulera äggstockar från 20-25 kvinnor i den 1,5 mL mikrofugrör. Slut dissektioner av 20-25 honorna inom 10 min.
  3. Så här gör du fixering.
    1. Med en drog Pasteur-pipett, bort vätskan i mikrofugrör, Använd en P1000 att snabbt tillsätt 500 µL 37 ° C fix-lösning i äggstockarna och sedan omedelbart tillsätt 500 µL rumstemperatur heptan i äggstockarna.
    2. Skaka mikrofugrör att blanda och placera på en nutator för 3 min. ta bort mikrofugrör från nutator och plats i en tube rack för 1 min att tillåta oocyterna sedimentera till botten. Den totala fixering tid är 4 min.
      Varning: Fix-lösning och heptan är giftiga, bära lämpligt skydd.
    3. Ta bort den rätta lösningen och skölj äggstockarna 3 gånger i 500 µL PBS med 0,5% BSA och 0,1% Triton x-100 (PBSBTx)
  4. Upprepa för återstående genotyper.

4. borttagning av Chorions och Vitelline membran

Obs: Se figur 3 för verktyg som behövs.

  1. Separat sent skede oocyter
    1. Tillsätt 1 mL PBSBTx till ett grunt dissekera maträtt. Använd en P200 med BSA belagda spets för att överföra fast äggstockarna (i ~ 150 µL) i grunt skålen. Pipettera äggstockarna upp och ner med BSA belagda pipettspetsen rubba de mogna äggceller från mindre mogen oocyterna.
    2. När sent skede oocyter är tillräckligt avgränsade, överföra alla vävnaden till en 500 µL mikrofugrör. Ta bort överflödig vätska med en drog Pasteur-pipett, lämnar om 150-200 µL i röret. Upprepa punkt 4.1 för återstående genotyper.
  2. Förbereda för rullande
    1. Pre våt en djupt väl skålen med 200 µL PBSBTx. luckan och ställ åt sidan. Få 3 frostade glasskivor och set bild #3 åt sidan. Försiktigt gnugga Regionkommittén frostat glas bilder #1 och #2. Skölj dem i avjoniserat vatten för att ta bort alla glas-skärvor och torka med en disponibel torka.
    2. Coat Regionkommittén frostat bilder #1 och #2 med PBSBTx genom att lägga 50 µL av PBSBTx till en bild och gnugga denna region med den andra bilden. Ta bort vätska med en disponibel torka.
    3. Placera glasen i dissekera Mikroskop i konfigurationen visas i figur 4A. Regionkommittén frostat bilder #1 och #2 i kontakt, med bild #3 fortsätta att stödja bild #2.
  3. Rulla oocyter; Se till att riktningen av rullande är alltid i en rak linje och aldrig en cirkelrörelse.
    1. Prewet en P200 pipett spets i PBSBTx och skingra oocyterna i mikrofugrör genom pipettering upp och ner. Över 50 µL vätska innehållande oocyter till mitten av frostat glas med bild #1. Lyft bild #2 att göra detta.
    2. Långsamt Sänk bild #2 ytspänning vätska skapar en tätning mellan de två regionerna i frostat glas. Det bör finnas tillräckligt med vätska att täcka området frostat men ingen bör sipprar ut. Om vätskan är överfyllda, använda en drog Pasteur-pipett ta bort överflödig vätska.
    3. Hålla i botten bilden (#1) på plats med ena handen och Använd den andra handen till flytta den översta bilden (#2) fram och tillbaka i en horisontell riktning, att hålla bild #2 nivå och stöds på bild #3. Utför under ett mikroskop för enkel visualisering av äggcell rörelser och framsteg.
      Obs: Denna rörelse kommer att generera friktion och orsaka oocyterna att ”rulla” och förlorar sin chorions. Minimal trycket bör användas och rörelser bör vara korta och snabba.
    4. Efter några rörelser i horisontell riktning, något ändra vinkeln på rörlighet (figur 4B). I flera steg, gradvis öka denna vinkel 90° tills rörligheten för den översta bilden (#2) är vinkelrät mot start (figur 4B). Observera att tomma chorions kommer att visas i vätskan och oocyter som saknar chorions visas längre och tunnare.
    5. Upprepa steg 4.3.3 - 4.3.4 ca 7 - 10 gånger tills lösningen blir lätt grumlig. Sluta rulla då majoriteten av oocyter (75-85%) tycks ha förlorat sin vitelline membran.
      Obs: En distinkt spetsiga änden syns ofta på oocyter som saknar vitelline membran. Vitelline membran är svårare att ta bort än chorions. Lätt tryck kan tillämpas på den översta bilden (bild #2) medan rullande för att uppnå avlägsnande av vitelline membran. Försöker du ta bort vitelline membran från alla oocyterna resulterar ofta i förstörelsen av andra oocyter.
    6. Lyft försiktigt upp den översta bilden (nr 2), att dra ett av dess hörn till mitten av regionen frostat av nedre bilden (nr 1) så att rullade oocyter ackumuleras i centrera av regionen frostat. Skölj oocyter från båda bilderna med PBSBTx i djup väl skålen som innehåller PBSBTx.
    7. Rena bilder #1 och #2 med ultrarent vatten, torka med en disponibel torka, och återställa. Upprepa steg 4.3.1 - 4.3.6 tills alla oocyterna av samma genotyp har rullat. Detta kräver oftast 3-4 rundor av rullande per genotyp.
  4. Ta bort skräp efter valsningen
    1. Tillsätt 1 mL PBSBTx i en 15 mL koniska rör. Snurra vätskan för att bestryka sidorna av röret.
    2. Med hjälp av en PBSBTx belagd P1000 pipettspetsen, överföring rullade oocyterna från deep dish väl till den koniska rör innehållande 1 mL PBSBTx. Lägg till ytterligare 2 mL av PBSBTx till konisk röret som innehåller oocyterna.
    3. Låt oocyterna börjar att bosätta sig i botten, sedan ta bort toppen 2 mL lösning som innehåller skräp (chorions, vitellines, etc.) med en P1000 och kassera. Om det behövs, håll koniska röret mot en mörk bakgrund se ogenomskinlig oocyterna som sjunker de.
    4. Lägga till ytterligare 2 mL av PBSBTx till oocyterna, och upprepa steg 4.4.3. Upprepa 4.4.3. totalt 3 rundor av avlägsnande av skräp.
    5. Med hjälp av en PBSBTx belagd P1000 pipettspetsen, överföring oocyter tillbaka till den ursprungliga 500 µL mikrofugrör. 20 - 25 kvinnor bör ge ca 50 µL rullade mogen oocyter.
  5. Upprepa punkt 4 för de återstående genotyper som använder färska frostat bilder, en ren djupt väl maträtt och en ny konisk tub för varje genotyp.
  6. Om lagring är nödvändig, överföra oocyter till 1 x PBS med 0,1% TritionX-100 och store övernattning vid 4 ° C. Långsiktig lagring rekommenderas inte eftersom formaldehyd crosslinking kan vändas av icke-joniskt rengöringsmedel.

5. FISK

Obs: Alla tvättar utförs på en nutator vid rumstemperatur om inget annat anges. Oocyter som har rullat ta längre tid att lösa till botten av mikrofugrör, särskilt i lösningar som innehåller formamid. Det är viktigt att ha tålamod när du ändrar lösningar så att oocyter inte försvinner i processen. Detta kan kräva väntar 5-15 min att låta oocyter bosätta sig efter sköljningar och tvättar. Observera också att oocyter i formamid mindre ogenomskinlig.

  1. Utvinning och RNAse behandling
    1. Skölj oocyter med 500 µL PBS med 1% Triton x-100 (PBSTx). Ta bort vätskan och tillsätt 500 µL utvinning buffert (PBSTx innehållande RNAse). Inkubera i nutator i rumstemperatur i 2 h.
  2. Före hybridisering tvättar
    1. Skölj oocyter 3 gånger med 500 µL 2 x saltlösning natriumcitrat innehållande Tween 20 (SSCT). Värm en alikvot (~ 500 µL/genotyp) 2 x SSCT + 50% formamid till 37 ° C.
      Försiktighet: formamid är giftigt, bära lämpligt skydd.
    2. Tvätta oocyter 3 gånger för 10 min varje i 500 µL 2 x SSCT. Tvätta oocyter i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 20% formamid. Tvätta oocyter i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 40% formamid. Tvätta oocyter i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 50% formamid.
    3. Ta bort vätskan och tillsätt 500 µL av 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid från steg 5.2.1 för provtagning och inkubera i 2 h vid 37 ° C med rotation.
      Obs: En hybridisering ugn utrustad med en rotator fungerar bra för detta. En skum mikrofugrör ”flyta” bifogas rotator kan användas för att säkra rören.
  3. Denaturering och hybridisering
    1. För varje tub av oocyter, Använd 40 µL av 1 x hybridisering buffert innehållande 2,5 ng/µL centromeric sond och 0,31 pmol fluor/µL av varje BAC sond. Bered en lösning av probe i hybridisering buffert tillräckligt för alla genotyperna. Vortex sonden mix 30 s innan du lägger till.
    2. Använda en BSA-belagd P200 pipettspetsen, överföra oocyter till en 200 µL PCR-röret. Hålla prover vid 37 ° C och låt oocyter kvitta till botten och sedan använda en drog Pasteur-pipett att ta bort så mycket vätska som möjligt.
    3. Tillsätt 40 µL av hybridisering lösning innehållande sonden (förberedd i avsnitt 2) att oocyterna. Placera PCR-röret som innehåller oocyter i PCR-maskinen och inkubera enligt följande: 37 ° C i 5 min, 92 ° C för 3 min, sedan 37 ° C under natten. Efter sond läggs till oocyterna, hålla dem i mörker så mycket som möjligt.
  4. Efter hybridisering tvättar
    1. Värm 2 x SSCT + 50% formamid till 37 ° C och hålla den i hybridisering inkubatorn. Med en BSA belagda P200 Pipettera tip, tillsätt 100 µL av 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid till PCR-röret med oocyterna och överföra oocyterna till ett nytt 500 µL mikrofugrör.
    2. Lägga till en ytterligare 400 µL av 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid samma tube och låt oocyterna bosätta sig vid 37 ° C i inkubatorn.
      Obs: Lösa ofta tar längre tid på detta steg. Det är inte ovanligt att ta 15 min eller längre. Brist på tålamod kommer att resultera i betydande förlust av oocyter.
    3. Tvätta oocyterna 3 gånger för 20 min varje i 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid vid 37 ° C med rotation. Hålla oocyter vid 37 ° C medan de kvitta.
    4. Tvätta oocyterna 3 gånger för 10 min varje i 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid vid 37 ° C med rotation. Hålla oocyter vid 37 ° C medan de kvitta.
    5. Vid rumstemperatur, tvätta oocyterna i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 40% formamid på en nutator. Tvätta oocyterna i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 20% formamid. Tvätta oocyterna i 10 min i 500 µL 2 x SSCT.
  5. Fläcken med DAPI
    FÖRSIKTIGHET: DAPI är giftigt, bära lämpligt skydd.
    1. Tvätta oocyter i 20 min i 500 µL DAPI lösning (1 µg/ml) i 2 x SSCT på nutator. Skölj oocyterna 3 gånger i 500 µL 2 x SSCT. Tvätta oocyter 2 gånger för 10 min varje i 500 µL 2 x SSCT på nutator. Prover kan lagras i upp till 4 h i rumstemperatur i mörkret tills de är redo att montera på coverslips.
  6. Montering
    Obs: Se figur 3 för verktyg som behövs.
    1. Placera ett poly-L-lysin belagda täckglas under mikroskopet dissekera. Avlägsna vätskan från röret oocyter, justera den totala volymen till ca 150 µL. Med en BSA belagd P200 pipettspetsen, pipett upp och ner för att skingra oocyter under hela lösningen, och sedan överföra 40 µL av oocyter/lösningen till ett poly-L-lysin belagda täckglas.
    2. Ta bort del av vätskan från den täckglas som använder en drog Pasteur-pipett tills oocyterna hålla sig till täckglaset men fortfarande är omgivna av vätska. Med pincett, håll ned cover slip på ena sidan och Använd en Volfram nål att försiktigt separera klumpar av oocyter, flytta dem att uppnå ett enda lager av icke-överlappande oocyter.
    3. Ta bort resten av vätskan runt oocyterna med en drog Pasteur-pipett. Ta en ren glasskiva och använda komprimerad gas för att blåsa av damm. Tillsätt 22 µL montering media (t.ex., förlänga-guld) till mitten av bilden. Sakta sänka bilden mot täckglaset, med montering media inför provet tills media berör provet. Ytspänning kommer att orsaka täckglaset att följa bilden.
    4. Placera bilder i en plastbehållare med ett tättslutande lock som innehåller ett lager av färsk torkmedel (t.ex., drierite). Låt bilderna torka 3-5 dagar i mörkret innan imaging. Torktiden kan variera beroende på luftfuktigheten i rummet.

6. imaging

  1. När du tar bort torra diabilder från rutan av torkmedel, ren dem för att ta bort alla dammpartiklar. Försegla coverslips med nagellack. Förseglade bilder kan lagras på obestämd tid vid-20 ° C.
  2. Förvärva laserscanning confocal bilder med en hög numeriska bländaröppningen 40 X olja objektiv med 6 X digital zoom.
    Obs: Helst systemprogramvaran tillåter en att hitta och markera den X-Y platsen meiotiska kromosomer för flera oocyter medan du tittar på dem med hjälp av epifluorescence. Den här funktionen sparar tid under en bildsession. Snabb blekning med en hög numeriska bländaröppningen 60 X mål gjorde dess användning som är olämpliga med det valda confocal systemet, men det kanske fungerar för andra system.
  3. Fånga en Z-serien för varje äggcell, ställa in toppen och botten av serien med av DAPI.
    Obs: Viktökning, offset, och laser power kommer att behöva bestämmas empiriskt med hjälp av en delmängd av äggceller. När lämpliga parametrar finns, bör endast smärre justeringar behöver göras.
    Om förändrad förvärv inställningar krävs, Använd den tidigare insamlade bildstapel för att uppskatta nödvändiga ändringar. För att undvika blekning, avstå från pre imaging arm sonden innan fånga Z-serien. Med en stegstorlek 0,25 μm, Z serien varierar vanligtvis från 25 till 30 steg beroende på läggning och placering av kromosomerna. En mindre stegstorlek kan förbättra ens förmåga att bedöma huruvida två fisk ställen skiljs i axiell dimension, men det finns en avvägning med den tid som krävs för att fånga mindre steg och förlust av signal intensiteten på grund av blekning. Ett 40 X-objektiv med 6 X digital zoom och en 1,024 x 512 bildfält genererar bilder med en pixelstorlek på 0,05 µm.

7. bild analys och scoring för sammanhållning defekter

  1. Deconvolve Z-serien för att optimera signal-brusförhållandet för varje äggcell19.
    Obs: Ett programvarupaket som det anges i Material tabell gör att man kan deconvolve med integrativ restaurering, samt beskära och kontrast-förbättra bilder. Ännu viktigare, är ett programpaket som gör att man kan visa bilder och Poäng för sammanhållning defekter i tre dimensioner absolut nödvändigt.
  2. För varje äggcell, räkna antalet arm och centromeric foci som colocalize med DAPI signalen. Förlust av sammanhållning resulterar i tre eller fyra distinkta och separerade signaler för en viss sond. Det är inte ovanligt att observera två foci som är anslutna med en tunn tråd. Av de strängaste kriterierna anses dessa foci inte vara ”separerade”.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 visar bilder tagna med en arm-sond som hybridizes till Cytologisk regionen 6E-7B på X -kromosomen. Denna sond resultat i en signal som lokaliserar samarbete med DAPI, är lätt urskiljbara från bakgrunden och har använts framgångsrikt att kvantifiera arm sammanhållning defekter i olika genotyper19. Kvantifiering av sammanhållning defekter begränsades till metafasen jag och metafas jag arrangerar; oocyter före kärn kuvert uppdelning uteslöts från analysen19. Ett intakt kärn-kuvert är uppenbart när du skannar i DAPI kanalen eftersom äggcellen kromosomerna kommer att vara omgiven av en diskret cirkelring som är mörkare än den omgivande cytoplasman.

Figur 5B visar maximal intensitet projektioner av enskilda Z serien efter deconvolution och kontrast förbättring. Kvantifiering av sammanhållning defekter kräver att bestämma för varje sond antalet fiskar signalerar att överlappning med DAPI signalen. En sådan analys är visualisering av de sammanslagna bilderna i tre dimensioner absolut nödvändigt. Endast fisk ställen som är tydligt kopplade till DAPI signalen i alla tre dimensioner bör ingå i analysen.

Intakt syster kromatida sammanhållning framgår som två fisk fläckar för både arm och pericentric sonder (figur 5B, vänster). Oocyter som innehåller tre eller fyra separerade fisk ställen för antingen sonden anses ha sammanhållning defekter (figur 5B, höger). För att klassas som enskilda ställen, måste två fisk signaler separeras minimalt i alla tre dimensioner av ett avstånd som motsvarar diametern på den minsta fläck. Tunna svag trådar ansluta två fisk fläckar är inte ovanliga. Sådana signaler anses inte helt separerade och därför räknas inte som instanser av sammanhållning defekter.

Med 6E-7B arm hybridisering sonden var cirka 15-20% av oocyterna avbildas helt saknade signalen eller signalen för svag för att tryggt poäng. Dessutom ungefär 5% av oocyterna avbildas uppvisade ett stort område av diffusa kromosomala signal och dessa var kasserad från analysen. Det var däremot sällsynt att stöta oocyter som pericentric hybridisering signalen var saknas eller är alltför diffusa att poäng.

6E-7B arm sonden har använts i stor utsträckning att kvantifiera arm sammanhållning defekter i metafasen och metafas jag arresterad Drosophila oocyter från olika genotyper19. När den cohesin subuniten SMC3 slogs ned under mitten av profas, 16,3% av mogen oocyterna analyserade innehöll större än två beväpna ställen, vägledande för tidig förlust av arm sammanhållning. Däremot observerade vi separerade arm ställen i endast 5,1% av oocyter som innehöll normala nivåer av SMC319. Intressant, även om frekvensen av arm sammanhållning defekter var förhöjda i flera knockdown genotyper, Syster kromatiderna skildes sällan i sin pericentric regioner19.

Figure 1
Figur 1: åldersberoende förlust av sammanhållning under den utökade profas jag arrestera av kvinnliga meios kan resultera i fel i kromosomsegregering och aneuploidi i ägget. Sammanhållning är företrädd av svarta fält mellan syster kromatider. Arm sammanhållning fungerar för att hålla rekombinant homologs ihop och krävs för korrekt segregering på Anaphasen jag. Om arm sammanhållning förloras tidigt, kan kromosom missegregation uppstå, vilket resulterar i ett aneuploid ägg. Denna siffra var anpassad från referens19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: storlek DNA-molekyler efter BAC fragmentering och förstärkning (vänster) och efter restriktionsenzym matsmältningen (höger) för tre olika BACs. 400 ng av amplifierade DNA produkter visas i de första tre köer. De sista tre körfält visar DNA-fragment efter övernattning begränsning digest. De amplifierade DNA-produkterna varierar från 200 bp upp till 3 kb. Efter begränsning digest, de flesta fragment varierade från 100-200 bp, men större fragment (upp till 500 bp) var synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: cytologi verktyg. Verktyg som används i protokollet: (1) par pincett (#5 Dumont); (2) Volfram nål; (3) djupt väl skålen med locket; (4) grunt glas dissekera maträtt; (5) drog Pasteur-pipett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Arrangemang och rörelse av bilder för rullande oocyter. (A) Diagram över bilden inställd för rullande oocyter som beskrivs i protokollet. Mörkare området betecknar frostat glas delen av bilden. (B) riktning rörelse vektorer för bild #2 under äggcellen rullande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. FISK assay resultat. (A) Schematisk skildrar Drosophila X -kromosomen och där de två beväpna sonder (6 BACs varje) och 22 oligonukleotiden pericentromeric sonden beskrivs i protokollet hybridiserar. För enkelhetens skull 6E-7B sonden är märkt 7B och 2F - 3C sonden är märkt 3C. (B) representativa bilder av fisk resultat (6E-7B probe) för intakt arm sammanhållning (två arm sonden fläckar, en per homolog) och störd arm sammanhållningen (tre till fyra arm sonden fläckar). DNA är blå, arm sonden signalen är gul och pericentric sond signalen är röd. Bilder motsvarar maximal intensitet projektioner av Z-serien efter deconvolution och kontrast förbättring. Skalstapeln = 2 µm. Denna siffra var anpassad från referens19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Användningen av fisk sonder för att bedöma tillståndet för arm sammanhållning i metafasen jag och metafas I Drosophila oocyter är ett betydande framsteg i fältet av Drosophila meios. Historiskt har har Drosophila forskare varit begränsad till genetiska tester för att härleda tidig förlust av arm sammanhållning i mogna äggceller11,18,19. Nu, med de metoder som presenteras här, delstaten arm sammanhållning kan analyseras direkt med fisk. Förmågan att få fysiska bevis för tidig förlust av arm sammanhållning avsevärt utökar repertoaren av strategier tillgängliga att studera de mekanismer som leder till för tidig förlust av arm sammanhållning och kromosom missegregation i Drosophila oocyter.

Kritiska steg
Även om vi inte har utfört en systematisk analys av kritiska parametrar som är nödvändiga för lyckad visualisering av en fluorescerande sond som hybridizes till exemplar sekvenser längs kromosom armen i mogen Drosophila oocyter, vi erbjuder den följande lista av faktorer som kan ha bidragit till framgången för denna teknik. För att generera arm sonden, vi använde en kombination av sex överlappande BAC sonder som täcker ett intervall på cirka 0,8 Mb på X-kromosomen arm. Våra inledande försök med färre BACs som sträckte sig över en mindre region var inte framgångsrika. Dessutom har vi använt en metod att splittra och förstärka BAC DNA innan slutet-märkning med Alexa-647. Majoriteten av begränsning fragment som var märkt var 100-200-bp lång (figur 2), vilket stämmer väl överens med målet storlek 150 nukleotider som behövs för effektiv diffusion genom tjocka vävnader21. Fixering villkor som bevara morfologi av den stora Drosophila äggcellen men också tillåta sonden penetration är nödvändiga. Vi har ändrat våra tidigare använt fixering metod23 genom att lägga till rumstemperatur heptan en fix-lösning som förvärmts till 37 ° C. Vi anser att det är möjligt att båda tillägg av heptan att öka penetration genom vitelline membran samt sänkt temperaturen för fixering bidragit till framgångsrika fixering villkor för visualisering av arm sammanhållning.

När testmetoder för tidig förlust av sammanhållning, en kräver en urvalsstorlek som tillåter kvantifiering av defekter som förekommer vid låga till måttliga nivåer. För att få ett stort antal mogna äggceller, har andra använt mixer störningar av vuxna kvinnor kombinerat med siktning 26,27. Här beskriver vi en metod till hands dissekera äggstockar från 20-25 kvinnor, med manuell separation av sena stage oocyter genom pipettering. Medan metoden blender/siktning bör också arbeta med detta protokoll, är en fördel med hand dissektion att utan steget siktning oocyter mindre tid i buffert före fixering, vilket minskar risken för Anaphasen jag debut på grund av konstgjorda ägg aktivering. Dessutom, denna metod kräver färre kvinnor som utgångsmaterial, använder mindre volymer av reagenser, och har ett enklare arbetsflöde, varav alla underlätta bearbetning flera genotyper.

Hand dissection och manuell separation av mogna äggceller innehåller tillräckliga mängder av oocyter att ”rulla” för borttagning av chorion och vitelline membran och resulterar i ungefär 75-150 oocyter i slutet av de hybridisering tvättarna. Ett knep att maximera avkastningen av metafas jag arresterad oocyter är att hålla oskuld honor i yeasted injektionsflaskor i avsaknad av män innan dissektion25. Äggcellen rullande för att ta bort chorions och vitelline membran måste utföras med en lätt beröring för att undvika att förstöra oocyter. Men ta bort chorions och vitelline membran från 100% av oocyterna är inte ett realistiskt mål och överdriven rullande endast resulterar i förlust av oocyter. Därför, varje rullande cykel bör stoppas när cirka 75-85% av oocyter brist chorions och vitelline membran.

Begränsningar
Trots vår framgång på generera och använda arm sonder för att övervaka tillståndet för sammanhållningen i mogen Drosophila oocyter, lider förfarandet fortfarande begränsningar. Medan vi inte sällan lyckats upptäcka en signal för pericentromeric sonden, arm sonden signalen var svag eller frånvarande i cirka 15-20% av oocyterna att vi avbildas. En bidragande faktor kan vara differentiell genomträngningen av pericentric oligonukleotiden sonden (22-28 nukleotider) kontra större arm sonden (100-200 nukleotider). Dessutom stora repetitiva sekvensen igen av pericentric sond resultaten i en signal som är ljusare än för arm sonden. Orientering av äggcell och placeringen av meiotiska kromosomer inom äggcellen presenterar också en utmaning när imaging. Trots de meiotiska kromosomerna är relativt nära cell cortex, är det omöjligt att styra inriktningen av äggcellen vid montering på täckglaset. Därför i en del av oocyterna, meiotiska kromosomerna kan vara 100-200 µm från täckglaset och signal intensiteten och kvalitet kan påverkas negativt när du försöker bild genom huvuddelen av en äggcell. Dessa begränsningar innebär att antalet oocyter som ingår i den slutliga kvantitativ analysen är betydligt lägre än antalet oocyter bearbetas i protokollet. Fastställande av vilken stat arm sammanhållning i 100 oocyterna kommer troligen att kräva två oberoende preparat. Ytterligare en begränsande faktor kvantifiera sammanhållning defekter med hjälp av en laser skanning confocal Mikroskop är den tid som krävs för att fånga en typisk Z serie (ca 5 min), även när det erövrade området är begränsat till 1 024 x 512 pixlar. Detta innebär att jämförelse av sammanhållning i kontroll och experimentella genotyper (100 oocyter varje) kommer att kräva ungefär 16 h bild samling tid.

Modifieringar och felsökning
Vi har kunnat övervaka tillståndet för arm sammanhållning med hjälp av en sond som erkänner X -kromosomen cytologiska position 6E-7B19. En sond som hybridizes till en mer distala plats på X -kromosomen kan vara mer önskvärt för att upptäcka fel i chiasma underhåll. Dessutom kan andra forskare vill analysera arm sammanhållning på andra kromosomer. Medan vi inte har försökt att probe i autosomer, visar preliminära data att en sond som erkänner regionen 2F - 3C i X -kromosomen också resulterar i en detekterbara signal. Baserat på begränsade preliminära data, kan signalera av sonden 2F - 3C dock mindre ”kompakt” än för 6E-7B sonden. Även om fisk signalerna är tight och skarpa för vissa äggcellen kromosomer, är hybridisering signalen i kromosomerna andra oocyter betydligt mer diffust. Om dessa skillnader i signal återspeglar verkliga skillnader i kromosom morfologi mellan de två cytologiska platserna, variabilitet i hybridisering effektiviteten av två sonder, eller bara stokastiska variationer mellan olika oocyterna kommer kräver en grundligare analys.

Viktigt, även för 6E-7B sonden, vi observerade en diffus kromosomala signal i vissa oocyter, och detta krävde ofta deras uteslutning från analys. Dessutom har vi märkt variation i signalkvalitet och ljusstyrka mellan olika beredningar av 6E-7B sonden och detta krävde att imaging parametrar justeras därefter. Att höja hybridisering temperaturen till 42 ° C inte minska antalet oocyter med diffusa signal, men det påverka allvarligt signalen för pericentric oligonukleotiden sonden. I ett försök att bättre bevara kromosom morfologi24, vi också försökte en längre denaturering steg vid en lägre temperatur (80 ° C), men fann att denna behandling varken ökat signal intensiteten eller minskat antalet oocyter med diffusa kromosomala fisk signal. Vi försökte också få en ljusare arm-signal med hjälp av 12 överlappande BACs motsvarar cirka 1,5 Mb intervall som sträckte sig över cytologiska regionen 5E-7B. När du använder en 12 BAC sond, var graden av variation i signalintensitet samt procentandelen av oocyter saknar signal inte annorlunda än när sex BACs användes för att göra arm sonden. Det var också mer utmanande att Poäng för sammanhållning fel när du använder 12 BAC sonden eftersom fisk signalerna var större, vilket gör det svårare att lösa fläckar motsvarar enskilda kromatider. I fall där ingen signal erhålls med en nyligen beredd sond forskare bör kontrollera storleken på den förstärkta och begränsning rötas BAC DNA för att bekräfta att de fragment som används för slutet märkning primärt inom intervallet 100-200 bp. Detta är sannolikt en av de mest kritiska faktorerna i framgångsrika sonden förberedelse.

Framtida inriktningar
Framtida arbete för att förbättra bild förvärv samt anpassning av protokollet att omfatta immunfärgning skulle vara stora förbättringar som skulle gynna andra forskare. Under bildsamling, skulle samla ett större antal bilder i den axiella dimension samt snabbare bild förvärvandet vara fördelaktigt för att kvantifiera sammanhållning defekter. Optimera imaging parametrarna för laser scanning confocal, hittade vi att 0,25 µm var den minsta stegstorlek som kan användas för Z-serien för att undvika märkbar blekning av fisken signalerar. Men för fisk signaler som är avgränsade med mindre än 0,25 µm i Z-stacken, detta stegstorlek kan resultera i ett misslyckande att fånga ”utrymmet” mellan foci och kan därför underskatta antalet sammanhållning defekter. En snurrande skiva confocal snabbare bild förvärv hastighet kan tillåta mindre steg storlekar kan användas utan signal blekning. Detta skulle ge mer exakt bildrekonstruktion i dimensionen axiell samt tillåta större antalet oocyter ska analyseras för sammanhållning defekter. Dessutom skulle möjligheten att kombinera immunfärgning med fisk visualisering av arm sammanhållning avsevärt förbättra protokollet. För ett antal preparat försökte vi utföra spindeln immunfärgning efter förfarandet för hybridisering. Men var robust spindeln färgning synlig i endast en bråkdel av oocyterna. Dessutom av skäl som inte är tydliga, omgiven högre nivåer av falska fisk signaler meiotiska kromosomerna när fisk och immunfärgning kombinerades. Ytterligare arbete för att optimera protokollet för att tillåta immunfärgning antingen före eller efter fisk förfarandet vill kraftigt utöka kapaciteten hos denna teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH Grant GM59354 tilldelas Sharon E. Bickel. Vi tackar Huy Q. Nguyen för hjälp för att utveckla protokollet för att generera fluorescerande arm sonder, Ann Lavanway för hjälp med konfokalmikroskopi och J. Emiliano Reed för tekniskt bistånd. Vi tackar också många kollegor i Drosophila gemenskapen för bra diskussioner och rådgivning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 130 Drosophila meios äggcell Syster kromatida sammanhållning arm sammanhållning fluorescens i situ hybridisering (FISH)
Med fluorescens <em>In Situ</em> hybridisering (FISH) för att övervaka tillståndet för Arm sammanhållning i metafasen och metafas I <em>Drosophila</em> oocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter