Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Abstract

İnsanlarda kromozom segregasyon hataları yumurta Düşükler ve doğum kusurları çoğunluğu için sorumlu olan. Ayrıca, kadınların yaşlandıkça, hamile kalma aneuploid bir fetus önemli ölçüde artırır ve bu olay riskini maternal yaş etkisi bilinir. Doğru kromozom ayrışma sırasında segregasyonun bölümler için bir gereklilik olduğunu bakım kardeş Kromatit uyum yumurta deneyim genişletilmiş profaz döneminde. Hem insanlar hem de model organizmalar saytolojik kanıtlar segregasyonun uyum süreci yaşlanma sırasında bozulur gösteriyor. Buna ek olarak, insan yumurta segregasyon hataları mayoz sırasında en yaygın olan ben, kol uyum Prematüre kaybı ile tutarlı. Model organizmalar uyum yaş bağımlı kaybı altında yatan mekanizmaları çözülüyor için kritik kullanımıdır. Drosophila melanogaster segregasyonun uyum içinde yumurta Yönetmeliği çalışmak için birçok avantaj sunar. Ancak, yakın zamana kadar sadece genetik testler kol uyum içinde yumurta farklı genotip veya farklı deneysel koşullar altında kaybı için tahlil mevcut idi. Floresans in situ kullanmak için hibridizasyon (balık) doğrudan görselleştirmek için kusurları kol uyum içinde prometafaz içinde ben ve metafaz Drosophila yumurta tutuklandı, detaylı bir iletişim kuralı sağlanmıştır. X kromozomu distal koluna hybridizes bir balık sonda üreten ve confocal Z yığınları toplama, bir araştırmacı, birçok bireysel balık sinyalini üç boyutlu görselleştirme ve kardeş olup olmadığını belirlemek Kromatit kolları ayrılmış. Özetlenen yordamı kol uyum kusurları Drosophila yumurtalar yüzlerce ölçmek olanak sağlar. Bu nedenle, bu yöntem uyum bakım yanı sıra onun ölümü için yaşlanma sürecinde yol açan faktörler katkıda mekanizmaları araştıran için önemli bir araç sağlar.

Introduction

Mitoz ve mayoz sırasında kromozomların uygun segregasyon gerektirir bu kardeş Kromatit uyum olmak kurulan, muhafaza ve bir eşgüdümlü moda1,2' serbest bırakmak. Uyum S aşamasında kurulur ve kız kardeşi tutun fiziksel bağlantıları oluşturan cohesin tarafından karmaşık, aracılık ettiği chromatids birlikte. Mayoz, uyum bir crossover için distal, aynı zamanda rekombinant homologs bir arada tutmak için çalışır ve bu fiziksel ilişki uygun yönlendirmeyi sağlamaya yardımcı olur, metafaz üzerinde bivalent (şekil 1)3,4, iğ 5. Serbest bırakmak-in kol uyum anafaz, ters iğ Polonyalılar için ayırmak homologs sağlar. Ancak, kol uyum ise zamanından önce kayıp rekombinant homologs onların fiziksel bağlantı kesilirse, rastgele, hangi aneuploid gametler (şekil 1) neden olabilir ayırmak.

İnsan yumurta, kromozom segregasyon hataları Düşükler ve doğum kusurları, Down sendromu6gibi önde gelen neden olan ve onların insidansı katlanarak maternal yaş7ile artar. Kardeş Kromatit uyum içinde fetal yumurta kurulur ve segregasyonun rekombinasyon doğumdan önce tamamlanır. Yumurta sonra tutuklama orta profaz ben yumurtlama kadar ve bu tutuklama sırasında rekombinant homologs devam eden fiziksel Derneği kardeş Kromatit uyum dayanır. Bu nedenle, mayoz ve normal gebelik sonuçları sırasında doğru segregasyon gerektirir uyum 50 yıl kadar olduğu gibi kalır.

Uyum insan yumurta uzun süreli segregasyonun tutuklanması sırasında erken kaybı maternal yaş etkisi katkıda bulunmak için önerilen ve kanıt birkaç satırlık bu hipotez8,9çekmek için. Ancak, insan yumurta segregasyonun uyum eğitim sorunları göz önüne alındığında, bu olayın bizim anlayış çok fazla model organizmalar5,10,11,12, kullanımına dayanıyor 13,14,15.

Drosophila melanogaster yumurta segregasyonun uyum ve kromozom segregasyon çalışma için birçok avantaj sunar. Basit bir genetik tahlil bir döl aneuploid gamet kurtarmak ve Xkalitesini ölçmek sağlar-kromozom segregasyon büyük ölçekli11,16,17. Ayrıca, bir de ben kol uyum11,18, Prematüre kaybı ile tutarlı bir fenotip mayoz sırasında rekombinant homologs missegregate çünkü kromozom segregasyon hataları ortaya olup olmadığını belirlemek 19. Drosophila yumurta segregasyonun uyum durumunu gözlem yeri de Floresans in situ hibridizasyon (balık) kullanarak doğrudan. Her ne kadar floresan oligonucleotides bu tekrarlayan uydu serileri melezlemek için bir on yıl içinde pericentromeric uyum olgun Drosophila yumurta4,20, kol analizini izlemek için kullanılmış uyum çok daha zor olmuştur. Görselleştirme kol uyum devleti tek kopya büyük bir bölgeye yayılan bir sonda dizileri ve kol uyum yok olduğunda görünür sinyaller bireysel kız kardeşi için chromatids neden yeterince parlak gerektirir. Buna ek olarak, oosit fiksasyon koşulları ve etiketli DNA'lar boyutunu penetrasyon21 büyük olgun Drosophila oosit (200 µm geniş 500 µm uzun tarafından) içine kolaylaştırmak gerekir. Son zamanlarda, bir kol başarıyla yoklamaydı kullanılan görselleştirmek için Drosophila oosit chromatids anafaz sırasında ben, ama yazarlar onlar bir sinyal içinde prometafaz-ebil değil bulmak olduğunu ifade veya metafaz yumurta22tutuklandı. Burada Xüretimi için detaylı bir protokol sağlar-kromozom kol balık probları ve bizi kardeş Prematüre kaybı için Kromatit uyum içinde prometafaz tahlil için ben ve metafaz sağladı oosit hazırlanması koşulları ben yumurta. Bize segregasyonun uyum bakımı için gerekli olan gen ürünleri tanımlamak etkinleştirdiyseniz, bu teknikler, kardeşi için tahlil başkalarına sağlayacak Kromatit uyum kusurları farklı genotip olgun Drosophila yumurta içinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlıkları

  1. Çözümler Floresans in situ hibridizasyon (balık) için hazır olun. Tüm çözümler ultrasaf su kullanarak hazırlayın.
    1. 5 x değiştiren Robb'ın arabellek hazırlamak: 275 mM potasyum asetat, 200 mM sodyum asetat, sukroz 500 mM, 50 mM glikoz, 6 mM magnezyum klorür, 5 mM Kalsiyum klorür, 500 mM HEPES pH 7.4 =. PH 7,4 10 N NaOH kullanarak getir. Filtre sterilize ve -20 ° C'de depolayın Çözülme ve 1 x için gerektiği gibi sulandırmak ve 1 x aliquots-20 ° C'de depolayın
    2. 10 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) kullanarak 1.3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4x hazırlamak. PH 7,0 10 N NaOH kullanarak getirmek. Isıyla veya filtre sterilizasyon tarafından sterilize.
  2. Poli-L-lizin coverslips bir gün hazırlamak gerekli önce.
    1. 18 x 18 mm #1.5 coverslip yüzeyinin % 1 hidroklorik asit içeren % 70 etanol pipet ve 5 dk. kullanım vakum aspirasyon sıvı kaldırmak için kuluçkaya. Steril ultrasaf su ile yineleyin. Coverslip 0.1 mg/mL Poli-L-lizin ile yüzeyi kapak ve kuluçkaya 10 dakikadır.
    2. Sıvı kaldırmak ve 10 dk. kadar mağaza coverslips Poli-L-lizin tarafı toz önlemek için dar Kapaklı plastik bir kapta kurutma için Aspire edin.
  3. Çekti Pasteur Pipetler yumurta kaldırmadan sıvı çözümleri kaldırmak için hazırlayın. Bir Bunsen burner, uzun cam Pasteur pipet ortasına cam erir ve ayrı çeker kadar yavaşça her ucunda kablolarıylaberaber ateşte.

2. nesil kol sonda balık için

Not: Tüm santrifüj adımlar ~ 16.000-21.000 x g (çoğu masa üstü Mikrosantrifüjler üzerinde maksimum hız) de gerçekleştirilir. Kısa santrifüj spin belirtmek iplik 5-15 s. girdap vortexing ~ 15 gösterir için s max, aksi belirtilmediği sürece hız.

Not: BACs için kol probları BAC PAC kaynaklardan elde edilebilir. İki X kromozomu euchromatic kol problar ile bu yöntem başarıyla kullanmıştır. Bir kol soruşturma oluşan altı BAC klonları için saytolojik karşılık gelen bantları 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Diğer kol sonda saytolojik bantları 2F - 3 C-(BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13) karşılık gelen altı BAC klonlar oluşuyordu. BACs bölgeler itibariyle göz diğer Drosophila kromozom için: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. X kromozomu 359 bp uydu tekrarı tanımak iki pericentric problar ile bu yöntem başarıyla kullanmıştır. Bir 22 nükleotit sonda yoğun kullanılan ve iyi çalışıyor (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. 28 nükleotit sonda yakın zamanda test edildi ve aynı zamanda iyi çalıştı (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC 5' ile belirli bir fluorophore etiketli bir ticari kaynak (örneğin, tümleşik DNA teknolojileri) sipariş edilen oligonucleotides saf.

  1. BAC klon DNA Kit talimatları belirtildiği şekilde Tablo malzemelerihazırlayın. 100 mL 200 µL TE kültür elde edilen DNA Pelet resuspend; son DNA toplama 5-40 ng/µL BAC klon bağlı olarak arasındaki mesafe.
  2. DNA amplifikasyon her BAC güçlendirme kiti, belirtilen malzemeler tablo ve aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak gerçekleştirir. BAC DNA her klon için ayrı ayrı işlem. Enzimler ve arabellekleri adımları 2.2.1 2.2.3 aracılığıyla kiti ile birlikte kullanın.
    1. BAC DNA'ın rasgele parçalanma: 1 ng/µL DNA çözüm 200 µL PCR tüp içinde 10 µL hazırlamak için TE her BAC için kullanın. 10 X parçalanma arabelleği 1 µL ekleyin. Tüp bir PCR makinesi ile tam olarak 4 dakika süreyle 95 ° C'de hemen serin buz su örnekte yerleştirin ve kısaca santrifüj kapasitesi. Kuluçka zaman duyarlı olup herhangi bir sapma sonuçları değiştirebilir.
    2. Kitaplık hazırlama
      Not: Bu yöntemde amplifiable parçaları bir kütüphane oluşturmak için rasgele Astarlar kullanılır.
      1. Tüp DNA içeren ekleyin: 1 Kütüphane hazırlık arabellek, Kütüphane sabitleme çözüm 1 µL x 2 µL. Vortexing tarafından iyice karıştırın, kısaca, santrifüj kapasitesi ve tüp PCR makinesi 95 ° c 2 dakika süreyle hemen serin buz su örnekte yerleştirin ve kısaca santrifüj kapasitesi.
      2. Kütüphane hazırlık enzim 1 µL PCR tüp, mix ve santrifüj kısaca ekleyin. Yer PCR tüp PCR makinesi ve aşağıdaki gibi kuluçkaya: 16 ° C 20 dk, 24 ° C 20 dk, 37 ° C 20 dk, 5 dk, 75 ° C için için için 4 ° C'de basılı tutarak
      3. Örnekleri PCR makineden çıkarın ve kısaca santrifüj kapasitesi. Örnekleri hemen güçlendirilmiş ya da üç gün boyunca-20 ° C'de depolanan.
    3. BAC DNA Kütüphane amplifikasyon
      1. Aşağıdaki reaktifler tüm 15 µL rasgele parçası tepki ekleyin: 7,5 µL 10 x amplifikasyon Master Mix, 47,5 µL nükleaz boş su, 5 µL WGA DNA polimeraz. Vortexing tarafından iyice karıştırın ve kısaca santrifüj kapasitesi.
      2. Yer PCR tüp PCR makinesi ve aşağıdaki gibi kuluçkaya: ilk denatürasyon 95 ° C 3 dk, 14 94 ° C'de denatürasyon devredir 15 s 65 ° c 5 min için Tav Fırınları/uzantısı tarafından takip, sonra 4 ° C'de tutun
      3. Bisiklete binme tamamlandıktan sonra DNA toplama tahlil. DNA toplama en az 800 olmalıdır ng / µL. tutmak örnekleri 4 ° C'de veya mağaza-20 ° c kadar sindirim için hazır. İsteğe bağlı olarak, DNA parçası boyutu 400 çalıştırarak değerlendirmek ng DNA'ın % 2 özel jel. Parçaları 200 aralığında bp 3 KB (Şekil 2).
  3. Güçlendirilmiş DNA restriksiyon enzimi sindirim
    1. Yer 20 µg ' 1.5 mL microfuge tüp önceki bölümde güçlendirilmiş DNA'ın. Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, BfuCl, 0.5 µL 100 x BSA, restriksiyon enzimi sindirim arabellek x 5 µL 10 25 adet 20 birim eklemek ve ultrasaf H2o uygun miktarda ekleyerek 50 µL için ses düzeyini ayarlama
    2. "Denemeler" den gecede 37 ° C'de kapağı üzerinde yoğunlaşmayı önlemek için bir kuluçka kuluçkaya. Etanol sindirilir DNA çökelti. Sindirimi ekleyin: 1 µL glikojen, 1/10 Cilt 3M sodyum asetat, 2.5 birimleri % 100 moleküler sınıf etanol. -80 ° c için 1 saat veya gece boyunca kuluçkaya.
    3. 4 ° C'de 30 dk santrifüj Oda geçici % 70 etanol ve spin 4 ° C'de 5 min için 1 hacmi ile yıkayın DNA Pelet Süpernatant kaldırmak ve hava kuru cips veya yavaşça kuru bir hava akışı ile DNA izin.
    4. DNA Pelet 36 µL steril ultrasaf H2O resuspend ve DNA'ın 1 µL yaklaşık 285 olmalıdır DNA toplama tahlil için ng / µL. mağaza-20 ° C'de DNA
    5. İsteğe bağlı olarak DNA parçası boyutu 400 çalışan değerlendirmek ng DNA'ın % 2 özel jel. Çoğu parçaları 500 kadar sönük bir sinyal ile 100-200 bp arasında değişen bp (Şekil 2).
  4. 3' tepki takip
    1. Bir ısı blok 1 dk. için 100 ° C'de sindirilir DNA denatüre. Hemen buzlu suda chill. DNA 35 µL için aşağıdakileri ekleyin: 50 µL 400 mM sodyum cacodylate, 1 µL 10 mM DTT ve girdap iyi. 4 µL 25 mM CoCl2, 2.5 µL 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP 5 x TdT tampon ve 1 µL terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) 400 U malzemeler, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL tablosunda belirtilen gibi kiti etiketleme ARES üzerinden ekleyin / µL. girdap ve santrifüj kısaca.
      Dikkat: CoCl2 toksik, uygun koruma giymek.
    2. Yoğunlaşma önlemek için bir kuluçka 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya. 250 mm EDTA tepki ve kısa bir süre karıştırmak için girdap durdurmak için 1 µL ekleyin. Etanol (yukarıdaki adımları 2.3.2 - 2.3.4) açıklandığı gibi kuyruklu DNA çökelti. Kurutulmuş DNA Pelet 10 µL steril ultrasaf H2o mağaza DNA-20 ° C'de devam etmek için hazır kadar resuspend.
  5. Floresan boya konjugasyon malzemeleri tabloda belirtildiği gibi DNA etiketleme kit kullanarak yapmak.
    Not: boya eklendikten sonra örnekleri karanlıkta bırakın.
    1. 95 ° c ısı blok 5 min için kuyruklu DNA denatüre. Hemen DNA buzlu su ve santrifüj kısaca ne yapıyorsun? Kit talimatlara göre etiketleme arabellek hazırlamak ve 6 µL her DNA örneği ekleyin. Her tüp boya, DMSO 4 µL Takımı'ndan resuspend. Girdap ve santrifüj kısaca.
    2. Bir tüp boya etiketleme her reaksiyon için kullanın. Boya çözüm DNA, girdap ve santrifüj kısaca ekleyin. Karanlıkta 2 h için oda sıcaklığında etiketleme tepki kuluçkaya. Nükleaz ücretsiz 77 µL tarafından takip reaksiyonu durdurmak için 3 M hydroxylamine 3 µL eklemek H2O Takımı'ndan. Girdap ve santrifüj kısaca.
  6. Non-Birleşik boya malzemeleri tabloda belirtildiği gibi PCR arıtma seti kullanarak kaldırın. Üreticinin yönergeleri izleyin. DNA iki kez 40 µL elüsyon arabelleği her seferinde kullanarak sütundan elute.
  7. Etanol çökelti etiketli DNA (Adım 2.3.2 - 2.3.4) daha önce açıklandığı gibi. Kurutulmuş DNA Pelet 10 µL elüsyon arabellekte resuspend.
  8. Sonda karışım hazırlamak
    1. Etiketli DNA örneği almak için fluorochrome boya pmol/µL konsantrasyonu belirlemek. Fluorophore konsantrasyonu 30-100 pmol/µL, BAC bağlı olarak alanı. DNA toplama 300-800 ng/µL aralığı.
      Not: Mikroarray ayarı iyi malzeme tablosunda belirtilen gibi bir microvolume Spektrofotometre çalışır. Mikrodizi penceresinde, DNA-50 seçin ve fluorochrome belirtin.
    2. Ana bir karışım ekimolar tutarları (pmol fluor) BAC probları üçüzlerinin birleştirerek oluşturun. Birleştirme önce girdap 30 s. Donma/çözülme döngüsü önlemek için aliquots ana karışımı hazırlamak, parafin film tüpler buharlaşma önlemek ve içinde belgili tanımlık karanlık-20 ° C'de depolamak için geçerli
      Not: her biri 6 bireysel BAC 250 pmol içeren bir mastermix toplam hacmi 30-50 µL çalışmaları içinde de sondalar. Her BAC için 25 pmol (fluor) içeren bir aliquot 0.31 pmol fluor/µL her BAC için nihai sonda konsantrasyon ile iki 40 µL hibridizasyon reaksiyonlar için yeterli olacaktır.

3. diseksiyon ve yumurta fiksasyonu

  1. Uygun genotip 30 yetişkin bakire kadın toplamak. Geç sahne yumurtalar için zenginleştirmek için kadın erkek olmadan sinek gıda ve kuru maya ile bir şişe içinde 3-5 gün önce diseksiyon25tutun. Diseksiyon, önceki gün Maya ile taze bir şişe benzin olmadan kadın aktarın.
  2. Diseksiyon gerçekleştirin.
    Not: Bkz. şekil 3 araçları için gerekli. Aksi belirtilmediği sürece çekti Pasteur pipet kullanarak çözümler kaldırılır. Yumurtalıklar her zaman aktarırken bir % 10 BSA çözüm kaplı bir pipet ucu kullanın.
    1. Modifiye Robb'ın arabellek içeren bir sığ diseksiyon tabak içinde forseps yumurtalıklar tek bir erkek kaldırmak için kullanın. Kullanım forseps veya yavaşça iç ovarioles başvurmanız çözüm sağlayan her yumurtalık edebilir için tungsten iğne. Yayvan yumurtalık çifti 1 mL değiştiren Robb'ın arabellek içeren 1.5 mL microfuge tüp aktarın.
    2. 3.2.1 yumurtalıklar üzerinden 20-25 dişi 1.5 mL microfuge tüp içinde birikmesine arasındaki adımları yineleyin. 10 dakika içinde 20-25 kadın diseksiyonlarının bitirmek.
  3. Fiksasyon aşağıdaki gibi yapın.
    1. Çekti Pasteur pipet ile sıvı microfuge tüpü çıkarması, bir P1000 500 µL 37 ° C düzeltme çözüm yumurtalıklar için hızlı bir şekilde eklemek için kullanın ve sonra hemen oda sıcaklığında heptane 500 µL yumurtalık için ekleyin.
    2. Mix ve bir nutator 3 dakika süreyle yerleştirmek için sallamak microfuge tüp microfuge tüp nutator ve bir tüp raf için yumurta izin vermek 1 dk içinde yer altına yerleşmek için kaldırın. 4 dk toplam fiksasyon zamanı.
      Uyarı: Düzeltme çözüm ve heptane are zehirli-, uygun koruma giymek.
    3. Düzeltme çözümü kaldırmak ve yumurtalıklar % 0.5 BSA ve %0,1 içeren PBS 500 µL içinde 3 kez durulama Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Kalan genotip için yineleyin.

4. Chorions ve Vitelline membran kaldırılması

Not: Bkz. şekil 3 araçları için gerekli.

  1. Ayrı geç sahne yumurta
    1. 1 mL PBSBTx sığ bir diseksiyon yemek için ekleyin. Bir P200 BSA kaplamalı ucu ile (~ 150 µL) sabit yumurtalıklarda sığ tabak içine aktarmak için kullanın. Yumurtalık yukarı ve aşağı daha az olgun yumurta dan olgun yumurta çıkarmak için BSA kaplamalı pipet ucu pipet.
    2. Geç sahne yumurta yeterince ayrıldığında, tüm doku 500 µL microfuge tüp aktarın. Hakkında bırakarak bir çekti Pasteur pipet ile aşırı sıvı kaldırmak 150-200 µL tüp içinde. Bölüm 4.1 kalan genotip için yineleyin.
  2. Haddeleme için hazırlamak
    1. Önceden 200 µL kapağının PBSBTx. ile bir derin kuyu yemek ıslak ve bir kenara koyun. 3 buzlu cam slayt ve set slayt #3 bir kenara alın. Birlikte slaytları #1 ve #2 buzlu cam bölgelerinde hafifçe ovalayın. Onları herhangi bir cam kırıkları kaldırmak ve tek kullanımlık mendil ile kuru deiyonize suyla durulayın.
    2. Slaytlar #1 ve #2 PBSBTx ile buzlu bölgelerinde 50 µL PBSBTx için bir slayt ekleyerek ve bu bölgenin diğer slayt ile sürtünme kat. Sıvı tek kullanımlık bir bezle kaldırın.
    3. Slaytları diseksiyon mikroskop altında şekil 4Agösterilen yapılandırma yerleştirin. #1 ve #2 kişide, slaytları slayt #3 ile buzlu bölgelerinde slayt #2 destekleyen tutacak.
  3. Yumurta rulo; haddeleme doğrultusunda her zaman içinde düz bir çizgi ve asla dairesel bir hareket olduğundan emin olun.
    1. Prewet bir P200 pipet PBSBTx içinde ipucu ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından microfuge tüp içinde yumurta dağıttı. Sıvı içeren yumurta 50 µL Slayt #1 buzlu cam parçası Center'a aktarın. # Bunu yapmak için 2 slayt kaldırın.
    2. Bir mühür iki buzlu cam bölgeler arasındaki yüzey gerilimini sıvı oluşturur kadar yavaş yavaş slayt #2 indir. Buzlu alanı kapsayacak şekilde yeterli sıvı olması gerekiyordu ama hiçbiri dışarı sızan. Sıvı taşan çekti Pasteur pipet aşırı sıvı kaldırmak için kullanın.
    3. Tek elle yerde alt slayt (#1) tutun ve öte yandan üst slayt (#2) ileri geri tutarak slayt #2 düzeyi ve desteklenen Tarih slayt #3 yatay yönde taşımak için kullanın. Oosit hareketleri ve ilerleme kolay görüntüleme için mikroskop altında gerçekleştirin.
      Not: Bu hareketin sürtünme oluşturmak ve "roll" ve onların chorions kaybetmek yumurta neden. En az basınç kullanılmalıdır ve hareketleri kısa ve hızlı olmalıdır.
    4. Yatay yönde birkaç hareketleri sonra biraz hareket (şekil 4B) açısını değiştirmek. En iyi slayt (#2) hareketinin başlangıç yön (şekil 4B) dikey olana birden çok artışlarla bu açı 90 ° yavaş yavaş artırın. Not boş chorions sıvı içinde görünür hale gelir ve chorions eksik yumurta daha uzun ve daha ince görünür.
    5. Çözüm biraz bulutlu hale gelinceye kadar adımları 4.3.3 - 4.3.4 yaklaşık 7 - 10 kez yineleyin. Yumurta (% 75-85) çoğunluğu kendi vitelline membranlar yitirmeye göründüğünde haddeleme durdurmak.
      Not: Farklı bir sivri uç kez yumurta vitelline membranlar eksik görünür durumdadır. Vitelline membran chorions kaldırmak daha zordur. Hafif basınç vitelline membranlar kaldırılmasını sağlamak için yuvarlanma sırasında üst slayt (slayt #2) uygulanabilir. Tüm yumurta genellikle diğer yumurta imha içinde sonuçları vitelline membranlar kaldırmak için çalışıyor.
    6. Köşelerinden birini sürükleyerek alt slayt (#1) buzlu bölgenin merkezine doğru yumurta yuvarlandı böylece birikir buzlu bölgesinin merkezinde, hafifçe üst slayt (#2) kaldırın. Yumurta PBSBTx ile her iki slaytlardan PBSBTx içeren derin kuyu amacına durulayın.
    7. Slaytlar #1 ve #2 ultrasaf su, tek kullanımlık mendil ile Kuru Temizleme ve sıfırlama. 4.3.1 - tüm yumurta aynı genotip haddelenmiş kadar 4.3.6 yineleyin. Bu genellikle 3-4 tur genotip inişli çıkışlı gerektirir.
  4. İnişli çıkışlı sonra enkaz kaldırma
    1. 1 mL PBSBTx 15 mL konik tüp ekleyin. Tüp iki kat için sıvı girdap.
    2. Bir PBSBTx kullanarak P1000 pipet ucu, derin haddelenmiş yumurta de çanak transfer PBSBTx. Ekle PBSBTx bir ek 2 mL konik tüp yumurta içeren 1 mL içeren konik tüp kaplı.
    3. Yukarıdan aşağıya doğru yerleş, sonra üst enkaz (chorions, vitellines, vb) ile bir P1000 içeren çözüm 2 mL kaldırmak, başlar yumurta ver. Gerekirse, konik tüp onlar gibi opak yumurta görmek için karanlık bir arka plan karşı tutun.
    4. PBSBTx bir ek 2 mL için yumurta ekleyin ve adımları yineleyin 4.4.3. 4.4.3 yineleyin. enkaz kaldırma 3 tur toplam için.
    5. Bir PBSBTx kullanarak P1000 pipet ucu, geri orijinal 500 µL microfuge tüp için transfer yumurta kaplı. 20 - 25 kadın yaklaşık 50 µL haddelenmiş olgun yumurta verim.
  5. Bölüm 4 taze buzlu slaytlar, temiz derin kuyu bir yemek ve bir yeni konik tüp her genotip için kullanarak kalan genotip için yineleyin.
  6. Depolama gerekli ise, transfer yumurta için 1 x PBS %0.1 TritionX-100 ve mağaza ile bir gecede 4 ° C'de Formaldehit crosslinking tarafından non-iyonik deterjanlar ters olabilir çünkü uzun süreli depolama tavsiye edilmez.

5. BALIK

Not: Tüm yıkama üzerinde bir nutator oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleşir. Haddelenmiş yumurta microfuge tüp, özellikle formamide içeren çözümler altına yerleşmek için daha uzun sürer. Böylece yumurtalar sürecinde kayıp değil çözümleri değiştirirken hasta olmak önemlidir. Bu yumurtalar durular ve yıkamadan sonra yerleşmek izin için 5-15 dk bekliyor gerektirebilir. Ayrıca yumurta formamide içinde daha az opak olduğunu unutmayın.

  1. Çıkarma ve RNAse tedavi
    1. Yumurta 500 µL % 1'i içeren PBS ile durulayın Triton X-100 (PBSTx). Sıvı kaldırmak ve 500 µL ekleme çıkarma arabellek (RNAse içeren PBSTx). Nutator 2 h için oda sıcaklığında üzerinde kuluçkaya.
  2. Öncesi hibridizasyon yıkar
    1. Yumurta 500 µL serum sodyum sitrat içeren ara 20 (SSCT) x 2 ile 3 kez yıkayın. Bir aliquot (~ 500 µL/genotip) 2 x SSCT + % 50 formamide 37 ° c Onceden
      Dikkat: formamide toksik, uygun koruma giymek.
    2. 10 dakika için 3 kez yumurta 500 µL 2 yıkama x SSCT. Yumurtalar 10 min için 500 µL 2 x SSCT + % 20 formamide yıkayın. Yumurtalar 10 min için 500 µL 2 x SSCT + % 40 formamide yıkayın. Yumurtalar 10 min için 500 µL 2 x SSCT + % 50 formamide yıkayın.
    3. Sıvı kaldırın ve 37 ° c 2 x SSCT + % 50 formamide 500 µL. adımdaki örnek ve döndürme 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya 5.2.1 ekleyin.
      Not: bir rotator ile donatılmış bir hibridizasyon fırın de bunun için çalışır. Bir köpük microfuge tüp "float" rotator için bağlı Borular kapansin için kullanılabilir.
  3. Denatürasyon ve hibridizasyon
    1. Yumurtalar her tüp için 1 x hibridizasyon arabelleği 2.5 ng/µL centromeric sonda ve 0.31 pmol fluor/µL her BAC inceleyebilirsek içeren 40 µL kullanın. Sonda hibridizasyon arabelleği için tüm genotip yeterli bir çözüm hazırlamak. Girdap sonda karışımı 30 s eklemeden önce.
    2. BSA kaplı P200 pipet ucu kullanarak, yumurta 200 µL PCR tüp aktarın. Örnekleri 37 ° C ve izin yumurta yerleşmek yukarıdan aşağıya doğru tutun, sonra çekti Pasteur pipet mümkün olduğu kadar sıvı kaldırmak için kullanın.
    3. Hibridizasyon çözüm (2 bölümünde hazır) Probe'a yumurta içeren 40 µL ekleyin. Yumurtalar PCR makinesi içeren PCR tüpü yerleştirin ve aşağıdaki gibi kuluçkaya: 37 ° C 5 min, 92 ° C 3 dk, sonra 37 ° C gece için. Sonda yumurtalar için eklendikten sonra onları mümkün olduğunca karanlıkta bırakın.
  4. Sonrası hibridizasyon yıkar
    1. 2 x SSCT + % 50 formamide 37 ° c Onceden ve hibridizasyon kuluçka makinesine tutun. P200 BSA ile kaplı pipet ucu, 37 ° c 2 x SSCT + % 50 formamide 100 µL PCR tüp ile yumurta ekleyin ve yumurta bir yeni 500 µL microfuge tüp nakletmek.
    2. Aynı tüp ve yumurta kuluçka 37 ° C'de yerleşmek izin vermek için bir ek 400 µL 37 ° c 2 x SSCT + % 50 formamide ekleyin.
      Not: sık sık yerleşme Bu adımda daha uzun sürer. Olağandışı 15dk almak veya daha uzun. Sabır eksikliği yumurta önemli kaybına neden olur.
    3. 20 dk için 3 kez yumurta 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C'de % 50 formamide rotasyon ile yıkayın. Onlar razı yaparken yumurta 37 ° C'de tutun.
    4. 10 dakika için 3 kez yumurta 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C'de % 50 formamide rotasyon ile yıkayın. Onlar razı yaparken yumurta 37 ° C'de tutun.
    5. Oda sıcaklığında 10 dakika yumurtalar 500 µL 2 x SSCT + % 40 formamide bir nutator olarak yıkayın. Yumurtalar 10 min için 500 µL 2 x SSCT + % 20 formamide yıkayın. Yumurtalar 10 min için 500 µL 2 yıkama x SSCT.
  5. DAPI ile leke
    Dikkat: DAPI toksik, uygun koruma giymek.
    1. 500 µL DAPI çözüm (1 µg/ml) 2 yumurta 20 dakika yıkayın nutator üzerinde x SSCT. Yumurta 3 kez 500 µL 2 durulama x SSCT. Yumurtalar 2 kez 10 min için 500 µL 2 yıkama nutator üzerinde x SSCT. Coverslips üzerinde takmak hazır olana örnekleri için en fazla 4 saat içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  6. Montaj
    Not: Bkz. şekil 3 araçları için gerekli.
    1. Poli-L-lizin kaplı coverslip diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Yumurtalar, toplam yaklaşık 150 µL için sesini tüp sıvı kaldırın. BSA ile P200 pipet ucu, yukarı ve aşağı yumurta çözüm genelinde dağıtmak ve sonra yumurta/çözüm 40 µL Poli-L-lizin kaplı coverslip aktarmak için pipet kaplı.
    2. Bazı sıvı coverslip kadar yumurta coverslip için sopa ama hala sıvı tarafından çevrili bir çekti Pasteur pipet kullanarak kaldırın. Forseps, bir tarafta kapak slip basılı tutun ve yavaşça yumurta, yumurta üst üste tek bir katman ulaşmak için onları hareket kümeleri ayırmak için tungsten iğne kullanın.
    3. Yumurta çekti Pasteur pipet ile çevresinde sıvı geri kalanı kaldırın. Temiz cam slayt al ve herhangi bir toz darbe için sıkıştırılmış gaz kullanın. Medya (örneğin, Prolong-altın) ortasına kadar slayt montaj 22 µL ekleyin. Yavaşça coverslip doğru slayt örnek medya dokunuyor kadar örnek karşı karşıya montaj medya ile indirin. Yüzey gerilimi slayda uymaları coverslip neden olur.
    4. Taze dessicant (örneğin, drierite) tabakası içeren dar Kapaklı plastik bir kapta slaytlar yerleştirin. 3-5 gün önce görüntüleme karanlıkta kuru slayt izin. Zaman kurutma odanın nem bağlı olarak değişebilir.

6. görüntüleme

  1. Kuru slaytlar dessicant kutusundan kaldırma üzerine herhangi bir toz parçacıkları kaldırmak için temizlemek. Coverslips tırnak cilası ile kapatın. Kapalı slaytlar süresiz-20 ° C'de depolanmış olabilir
  2. 6 X Dijital zum ile bir yüksek sayısal diyafram 40 X Petrol amacı istimal confocal görüntüleri taramak lazer edinin.
    Not: İdeal olarak, sistem yazılımı bulmak ve onları görüntülerken segregasyonun kromozomlar birden fazla yumurta için X-Y konumunu işaretlemek için izin epifluorescence kullanarak. Bu yeteneği bir görüntüleme oturumu sırasında zaman kazandırır. Hızlı yapılan bir yüksek sayısal diyafram 60 X amacı ile beyazlatma kullanımı, ama seçilmiş confocal sistemi ile uygun olmayan diğer sistemler için çalışabilir.
  3. Üst ve alt DAPI sinyal kullanarak serinin ayarlama her yumurta için bir Z serisi yakalamak.
    Not: kazanç, ofset, ve lazer güç ampirik olarak yumurta kümesini kullanarak kararlı gerekir. Uygun parametreleri bulunca, sadece küçük ayarlamalar yapılması gerekir.
    Eğer satın alma değiştirilmiş ayarları gereklidir, daha önce toplanan görüntü yığını gerekli değişiklikleri tahmin etmek için kullanın. Ağartma önlemek için kol sonda Z serisi yakalama önce önceden gelen Imaging kaçınmalıdır. 0.25 µm adım büyüklüğü ile Z serisi genellikle 25 30 adım Yönlendirme ve kromozomlar yerleşimini bağlı olarak değişir. Daha küçük bir adım boyutu iki balık noktalar Aksiyel boyutun ayrılır, ama orada bir ticaret-off ile daha küçük adımlar ve ağartma nedeniyle sinyal yoğunluğu kaybı yakalamak için gereken zamanı değerlendirmek için bir yetenek artırabilir. 6 X digital vınlamak ve 1,024 x 512 resim alanı 40 X amaç görüntülerle 0,05 µm piksel boyutunu oluşturur.

7. görüntü analizi ve uyum kusurları için puanlama

  1. Sinyal gürültü oranı her yumurta19için en iyi duruma getirmek için Z serisi deconvolve.
    Not: Bir yazılım paketi Malzemeleri tablo içinde belirtilen bir gibi bir bütünleştirici restorasyon, kullanarak deconvolve yanı sıra kırpmak ve kontrastı Artır-görüntüleri izin verir. Önemlisi, bir görüntüleri ve skor uyum kusurları için üç boyutlu olarak sağlar bir yazılım paketi zorunludur.
  2. Her yumurta için kol ve DAPI sinyal ile colocalize centromeric foci çizelgeye geçirmek. Kohezyon kaybı üç ya da dört farklı ve ayrı sinyaller için belirli bir sonda sonuçlanır. İnce bir iple bağlı olan iki foci gözlemlemek için nadir değildir. En sıkı kriteri, bu resimde "ayrılmış" kabul olmaz

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 5 saytolojik bölge 6E-7B X kromozomu üzerinde hybridizes bir kol sonda ile elde edilen görüntüler sunar. Bu araştırma sonuçlarında DAPI Bununla birlikte yerelleştirir, arka plandan kolayca ayırt edilebilir ve başarıyla kol uyum kusurları farklı genotip19ölçmek için kullanılan bir sinyal. Miktar uyum kusurların kısıtlı prometafaz için ben ve metafaz ben aşamaları; Yumurtalar önce nükleer zarf arıza analizi19dışlandı. Sağlam bir nükleer zarf oosit kromozomlar çevreleyen sitoplazma koyu bir ayrık dairesel alan tarafından çevrili olacak çünkü DAPI kanalda tararken belirgindir.

Şekil 5B maksimum yoğunluk projeksiyon bireysel Z serisi deconvolution ve kontrast geliştirme sonra gösterir. Miktar uyum kusurların balık sayısı bu çakışma DAPI sinyal ile sinyalleri için her sonda belirlenmesi gerekir. Böyle bir analiz için üç boyutlu olarak birleştirilen görüntülerin görselleştirme zorunludur. Yalnızca açıkça tüm üç boyutlu DAPI sinyal ile ilişkili olan balık noktalar analize dahil edilmelidir.

Bozulmamış kız kardeş Kromatit uyum için kol ve pericentric sondalar (şekil 5B, sol) iki balık noktalar olarak kanıtlandığı. Ya sonda için üç ya da dört ayrı balık noktalar içeren yumurta uyum kusurları (şekil 5B, sağ) için kabul edilir. Tek tek noktalar sınıflandırılmış için iki balık sinyal minimal bütün üç boyutlu en küçük spot çapı için karşılık gelen bir mesafeye göre ayrılması gerekir. İki balık noktalar bağlayan ince zayıf konu nadir değildir. Böyle sinyalleri tamamen ayrılmış dikkate alınmaz ve bu nedenle uyum kusurların örnekler olarak sayılmaz.

6E-7B kol hibridizasyon sonda ile yaklaşık 15-%20 yansıma yumurtalar tamamen yoksun sinyal veya sinyal güvenle puanı için çok zayıftı. Buna ek olarak, kabaca görüntüsü yumurta % 5 diffüz kromozom sinyal geniş bir alanda sergilendi ve bunlar analiz çıkarıldı. Buna ek olarak, pericentric hibridizasyon sinyal eksik veya skoru çok yaygın olduğu yumurta karşılaşmaya nadir.

6E-7B kol sonda yoğun prometafaz kol uyum hataları ölçmek için kullanılan ve metafaz, Drosophila yumurta tutuklandı farklı genotip19. Ne zaman cohesin alt birim SMC3 orta profaz, 16,3 bulunan yüzde analiz olgun yumurta sırasında iki noktalar, kol uyum Prematüre kaybı gösterge kol daha büyük yerlere saçılmıştı. Buna ek olarak, biz ayrı kol noktalar SMC319normal düzeyde bulunan yumurta sadece % 5.1 gözlenen. Kol uyum sıklığını kusurları rağmen ilginçtir, birden fazla devirme genotip, chromatids nadiren kendi pericentric bölgeler19ayrı kaldık kardeş olarak yükseltilmiş oldu.

Figure 1
Şekil 1: uyum tutukluyorum genişletilmiş profaz sırasında kaybı yaş bağımlı kadın mayoz kromozom segregasyon hataları ve anöploidi yumurta içinde sonuçlanabilir. Uyum kardeş arasında siyah çubuklar tarafından temsil chromatids. Kol uyum rekombinant homologs bir arada tutmak için işlev görür ve anafaz, doğru ayrımı gereklidir ben. Kol uyum zamanından önce kaybolursa, aneuploid yumurta kaynaklanan kromozom missegregation oluşabilir. Bu rakam başvuru19adapte oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Boyut DNA moleküllerinin BAC parçalanma ve amplifikasyon (solda) ve sonra sonra restriksiyon enzimi sindirim (sağda) üç farklı BACs için. 400 ng güçlendirilmiş DNA ürünlerin ilk üç şerit gösterilir. Son üç şerit DNA parçalarının gecede kısıtlama "denemeler" den sonra göster. Güçlendirilmiş DNA ürün aralığı 200 den bp 3 kb. Kısıtlama Özet, 100-200 bp arasında değişiyordu çoğu parçaları, ama daha büyük parçaları sonra (en çok 500 bp) görünür idi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Sitoloji araçları. İletişim kuralında kullanılan araçlar: (1) çift forseps (#5 Dumont); (2) tungsten iğne; (3) Derin kuyu çanak kapağı; (4) sığ cam tabak dissekan; (5) çekti Pasteur pipet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Düzenleme ve hareket yumurta haddeleme için slaytların. (A) diyagramı slayt iletişim kuralında tanımlandığı gibi yumurta haddeleme için ayarlayın. Daha koyu alan slayt buzlu cam parçası gösterir. Hareket vektörel çizimler için slayt #2 (B) yönünü haddeleme yumurta sırasında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Balık tahlil sonuçları. (A) şematik Drosophila X kromozomu ve nerede iki problar (6 her BACs) kol ve iletişim kuralında tanımlanan 22 Oligonükleotid pericentromeric sonda melezlemek gösteriyor. İçin kolaylık, 6E-7B sonda 7B etiketlenir ve 2F - 3C sonda 3 C. etiketlenir (B) balık sonuçları (6E-7B sonda) sağlam kol uyum (iki kol sonda lekeler, homolog başına bir adet) ve kesintiye kol uyum (3-4 kol sonda lekeler) temsilcisi görüntülerini. DNA mavi, kol sonda sinyal sarı ve pericentric sonda sinyal kırmızıdır. Görüntüleri maksimum yoğunluk projeksiyonlar Z serisi deconvolution ve kontrast geliştirme sonra karşılık gelir. Ölçek çubuğu 2 µm =. Bu rakam başvuru19adapte oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Balık kullanımını değerlendirmek için kol uyum içinde prometafaz durumunu ben ve metafaz probları ben Drosophila yumurta Drosophila mayoz alanında önemli bir gelişme olduğunu. Tarihsel olarak, Drosophila araştırmacılar erken kol uyum olgun yumurta11,18,19kaybı anlaması için genetik testler için sınırlı olmuştur. Şimdi, burada sunulan yöntemleri ile doğrudan balık kullanarak kol uyum durumunu denetlesinler. Yeteneği büyük ölçüde erken kol Kohezyon kaybı için fiziksel kanıt elde etmek için yaklaşımlar kol uyum ve kromozom missegregation Drosophila yumurta içinde erken kaybına yol açan mekanizmalar eğitim kullanılabilir repertuar genişletir.

Kritik adımlar
Her ne kadar biz kritik parametreleri gerekli tek kopya sıralarını olgun Drosophila yumurta kromozom kolunda boyunca hybridizes bir floresan sonda başarılı görselleştirme için sistematik bir analizini yapmamış, sunduğumuz Aşağıdaki listede bu teknik başarısı için katkıda bulunan faktörler. Kol sonda üretmek için biz altı yaklaşık 0.8 Mb Xaralığını kapağı BAC probları örtüşen bir arada kullanılan-kromozom kol. Daha küçük bir bölge yayılmış daha az BACs kullanarak bizim ilk girişimi başarılı değildi. Buna ek olarak, parçalara ayırması ve sonunda etiketleme önce BAC DNA Alexa-647 ile yükseltmek için bir yöntemi kullandık. Etiketli kısıtlama parçaları çoğunluğu olan kalın doku21üzerinden verimli Difüzyon için gerekli de hedef boyutunu 150 nükleotit ile aynı fikirde 100-200 bp uzun (Şekil 2) vardı. Büyük Drosophila oosit morfolojisi korumak, ancak aynı zamanda sonda nüfuz izin fiksasyon koşullar gereklidir. Biz bizim önceden kullanılan fiksasyon yöntemi23 37 ° C'ye ısıtılmış bir düzeltme çözüm için oda sıcaklığında heptane ekleyerek değiştirdiniz Olası penetrasyon fiksasyon için indirdi sıcaklık yanı sıra vitelline membran aracılığıyla artırmak için heptane her iki yanı sıra kol uyum görselleştirme için başarılı fiksasyon koşullar katkıda düşünüyoruz.

Uyum Prematüre kaybı için raporlaması, bir miktar var olan kusurların sağlayan bir örnek boyutu gerektirir, orta düzeyde düşük. Çok sayıda olgun yumurta elde etmek için diğerleri yetişkin kadın 26,27eleme ile kombine bozulma blender kullandık. Burada biz bir yöntem hakkını tarif üzerinden 20-25 kadın yumurtalık incelemek, geç manuel ayırma ile yumurta pipetting tarafından aşama. Blender/Eleme yöntemi de bu iletişim kuralı ile çalışması gerekir iken, bir el diseksiyon eleme adım yumurta için harcadığı arabellek anafaz olasılığını azaltır fiksasyon önce daha kısa sürede ben başlangıçlı nedeniyle yapay yumurta avantajdır harekete geçirmek. Buna ek olarak, bu yöntem malzeme başlangıç olarak daha az sayıda kadın gerektirir, reaktifler daha küçük hacimli kullanır ve tüm bunların birden çok genotip işleme kolaylaştırmak daha basit bir iş akışı olan.

El diseksiyon ve manuel ayrılması olgun yumurta yumurta "almak için" yeterli miktarda koryon ve vitelline membran kaldırılması için sağlar ve yaklaşık 75-150 yumurta hibridizasyon yıkar, sonundaki sonuçları. Verimi en üst düzeye çıkarmak için bir numara yumurta tutuklandı metafaz bakire kadın erkek diseksiyon25önce yokluğunda mayalanarak şişeleri tutun etmektir. Chorions ve vitelline membran kaldırmak için haddeleme yumurta yumurta yok önlemek için nazik bir dokunuş ile gerçekleştirilmesi gerekir. Ancak, chorions ve vitelline membran yumurta % 100 çıkarmadan gerçekçi bir hedef değildir ve sadece aşırı haddeleme yumurta kaybına sonuçlanır. Bu nedenle, çalışırken her döngüsü ne zaman kesilmelidir yumurta olmaması chorions ve vitelline membran yaklaşık % 75-85.

Sınırlamaları
Üreten ve uyum içinde olgun Drosophila yumurta durumunu izlemek için kol problar kullanarak bizim başarı rağmen yordamı sınırlamalar hala acı çekiyor. Biz nadiren bir sinyal pericentromeric sonda için algılamak başarısız olsa da, kol sonda sinyal zayıf veya yumurta yaklaşık % 15-20 biz görüntüsü yok. Bir katkıda faktör pericentric Oligonükleotid sonda (22-28 nukleotid) fark nüfuz büyük kol sonda (100-200 nukleotid) karşı olabilir. Buna ek olarak, bu kol sonda için daha parlak bir sinyal pericentric sonda sonuçlarında tarafından tanınan büyük yinelenen sıra. Imaging zaman yumurta ve yumurta içinde segregasyonun kromozomların yerleşim yönünü da bir sorun mevcut. Segregasyonun kromozomlar nispeten hücre korteks yakın olmakla birlikte, ne zaman coverslip üzerinde montaj oosit yönünü kontrol etmek mümkün değildir. Bu nedenle, bazı kısmını yumurta, segregasyonun kromozomlar 100-200 µm coverslip ve sinyal yoğunluğu olabilir ve kaliteli oosit toplu görüntü çalışırken olumsuz etkilenebilir. Bu sınırlamalar son kantitatif analize dahil yumurta sayısı iletişim kuralında işlenen yumurta sayısından önemli ölçüde daha düşük olduğu anlamına gelir. Kol uyum içinde 100 yumurta durumunu belirleyen iki bağımsız hazırlıklar büyük olasılıkla gerektirir. Bir lazer confocal mikroskobu tarama kullanarak uyum kusurları miktarının bir ek sınırlayıcı faktör tipik bir Z serisi (yaklaşık 5 dk), yakalamak için gerekli zamanı bile ne zaman yakalanan alan 1,024 x 512 piksel olarak sınırlı. Bu uyum kontrolü ve deneysel genotip (100 her yumurta) karşılaştırılması yaklaşık 16 h resim koleksiyonu zaman gerektiren anlamına gelir.

Değişiklikler ve sorun giderme
Biz saytolojik pozisyon 6E-7B19 X kromozomu tanır bir sonda kullanarak kol uyum durumunu izlemek mümkün olmuştur. X kromozomu üzerindeki daha distal bir konuma hybridizes bir sonda chiasma bakım hatalarını algılama için daha çekici olabilir. Buna ek olarak, diğer araştırmacılar kol uyum diğer kromozom üzerinde analiz etmek isteyebilirsiniz. Biz autosomes araştırma girişiminde değil iken, ilk veri X kromozomu 2F - 3 C bölgesi de tanır bir sonda algılanabilir sinyal sonuçları gösterir. Ancak, sınırlı ön verilere dayanarak, 2F - 3C prob sinyal daha az "kompakt" 6E-7B sonda için bundan olabilir. Balık sinyallere sıkı ve bazı yumurta kromozomlar için net olmakla birlikte, diğer yumurta kromozomlar hibridizasyon İşaretimle önemli ölçüde kapatıyor. Kromozom morfolojisi hakiki farklılıkları iki saytolojik konum arasında sinyal bu farklılıkları yansıtmak, iki hibridizasyon etkinliğini değişkenlik probes veya farklı yumurtalar arasında sadece Stokastik değişkenlik olacak daha ayrıntılı bir analiz gerektirir.

Önemlisi, 6E-7B sonda için bile, biz bazı yumurtalar, diffüz kromozom sinyal gözlenen ve bu kez onların dışlama çözümlemesi gerektirdiği. Buna ek olarak, biz değişim sinyal kalitesi ve parlaklık 6E-7B sonda farklı hazırlıkları arasında fark ettim ve bu o görüntüleme gerekli parametreleri buna göre ayarlanmış. Hibridizasyon sıcaklığı 42 ° c yükselterek, diffüz sinyali ile yumurta sayısını değil, ama aşırı pericentric Oligonükleotid sonda işaretimi etkileyebilir. Bir çaba daha iyi kromozom morfolojisi24korumak için biz de daha düşük sıcaklıkta (80 ° C) daha uzun bir denatürasyon adım çalıştı, ama bu tedavi ne sinyal şiddeti artar ne de yumurta ile diffüz sayısı sınırlı olduğunu buldum Kromozom balık sinyal. Ayrıca parlak bir kol sinyal saytolojik bölge 5E-7B yayılmış bir yaklaşık 1,5 Mb aralığı için karşılık gelen 12 örtüşen BACs kullanarak elde etmek çalıştı. 12 bir BAC sonda kullanırken, varyasyon sinyal yoğunluk derecesini yanı sıra yumurta sinyal eksik yüzdesi ne zaman altı BACs kol sonda yapmak için kullanılan daha farklı değildi. Bu da daha fazla uyum kusurları için balık sinyallere daha büyük, daha zor bireysel chromatids için karşılık gelen noktalar gidermek yapım olduğu için 12 BAC sonda kullanırken puanı için zor oldu. Sinyal yok yeni hazırlanan bir sonda ile elde edilir durumda araştırmacılar güçlendirilmiş boyutunu kontrol etmelisiniz ve kısıtlama BAC son etiketleme için kullanılan parçaları öncelikle 100-200 bp aralığı içinde olduğunu doğrulamak için DNA sindirilir. Bu başarılı sonda hazırlanmasında en önemli faktörlerden biri olması muhtemeldir.

Gelecekteki yol tarifi
Protokolü immunostaining içerecek şekilde adapte yanı sıra resim alma geliştirmek için yapılacak çalışmalar diğer araştırmacılar yararlanacak önemli gelişmeler olur. Görüntü toplama sırasında görüntüleri Aksiyel boyut hem de daha hızlı resim alma daha fazla sayıda toplama uyum kusurları miktarının için avantajlı olur. Confocal tarama lazer için görüntüleme parametrelerini optimize içinde bulduk 0.25 µm Z serisi için kayda değer balık ağartma önlemek için kullanılabilir en küçük adım boyu olduğunu bildirir. Ancak, daha az 0.25 µm Z yığını tarafından ayrılan balık sinyalleri için bu adım boyu başarısızlık resimde arasında "boşluk" yakalamak için neden olabilir ve bu nedenle uyum hatalarının sayısı hafife. Bir iplik disk confocal daha hızlı görüntü edinme hızını küçük adım boyutları ağartma sinyal kullanılmak üzere izin verebilir. Bu daha doğru görüntü imar Aksiyel boyut sağlamak gibi uyum kusurları için analiz edilecek yumurta daha büyük sayıda izin. Buna ek olarak, immunostaining kol uyum durumunu balık görselleştirme ile birleştirme olanağını protokol önemli ölçüde artıracak. Birkaç hazırlıkları için iğ immunostaining aşağıdaki hibridizasyon yordamı gerçekleştirmeye çalıştınız. Ancak, güçlü işmili boyama sadece yumurta küçük bir kısmını içinde görünür. Ayrıca, ne zaman balık ve immunostaining kombine edilmiştir net değildir nedeniyle, sahte balık sinyalleri yüksek düzeyde segregasyonun kromozomlar çevrili. İmmunostaining önce veya sonra balık yordamı iletişim kuralını optimize etmek için daha fazla çalışmalar büyük ölçüde bu teknik kapasitesini genişletmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Bu eser NIH Grant Sharon E. Bickel için ödül GM59354 tarafından desteklenmiştir. Huy s. Nguyen floresan kol probları, Ann Lavanway confocal mikroskobu ile ilgili yardım ve J. Emiliano Reed teknik yardım için oluşturmak için protokol gelişmekte olan yardım için teşekkür. Ayrıca çok sayıda meslektaşları için yararlı tartışmalar ve tavsiye Drosophila toplumda teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 130 Drosophila mayoz yumurta kardeş Kromatit uyum kol uyum Floresans in situ hibridizasyon (balık)
Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans <em>In Situ</em> hibridizasyon (balık) kullanarak ben <em>Drosophila</em> yumurta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter