Summary
وتصف هذه الورقة في إعداد وتقييم الماغنيسيوم المستمدة من مصفوفة الخلايا الجذعية الوسيطة الحبل السري مع نموذج عيب وتر الرضفة ثنائية في الفئران. هذا النموذج كان مرتبطاً اعتلال مقبولة وكان وجدت للكشف عن الاختلافات بين الأوتار غير المعالجة والمعالجة، وبين المعالجتين اختبارها.
Abstract
الطب التجديدي توفر بدائل جديدة للأوضاع التي تشكل تحديا للعلاجات التقليدية. انتشار والاعتلال من تيندينوباثي عبر الأنواع، جنبا إلى جنب مع الخصائص العلاجية محدودة لهذا النسيج، قد دفع البحث عن العلاجات الخلوية ودفع تطوير نماذج تجريبية لدراسة فعاليتها. الحبل السري المستمدة من مصفوفة الخلايا الجذعية الوسيطة (UCM-ماجستير) هي المرشحين جذابة لأنها وفيرة، من السهل جمع، والالتفاف حول الشواغل الأخلاقية والمخاطر لتشكيل تيراتوما، إلا تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البدائية أوثق من الفائدة MSCs. المعنوية المستمدة من الأنسجة الكبار تركز على الشيتوزان كاستراتيجية لتعزيز خصائص MSCs من خلال تشكيل كروي. هذه الورقة تفاصيل تقنيات لعزل UCM-MSCs، إعداد الماغنيسيوم على الفيلم الشيتوزان، وتحليل أثر تشكيل كروي في التعبير علامة السطحية. ونتيجة لذلك، يتم وصف إنشاء نموذج إصابة وتر الرضفة الثنائية في الفئران لغرس في فيفو الماغنيسيوم. ماجستير UCM شكلت على الفيلم الشيتوزان. ولوحظ لا تعقيد في الدراسة فيما يتعلق بالإصابة بالأمراض، وأشدد على ارتفاع الآثار، أو الإصابة بالانسجة. مجموع نقاط الوظيفية للفئران تعمل في 7 أيام كان أقل من الفئران العادية، ولكن عادت إلى وضعها الطبيعي في غضون 28 يوما بعد الجراحة. وأكد عشرات النسيجي لشفاء الأنسجة وجود جلطة في معالجة العيوب التي قيمت في 7 أيام، نظراً لغياب رد فعل جسم غريب، وتتقدم الشفاء في غضون 28 يوما. هذا النموذج عيب وتر الرضفة الثنائية ضوابط الاختلاف بين الأفراد عن طريق إنشاء عنصر تحكم داخلي في كل الفئران، المرتبطة باعتلال مقبولة، ويسمح بالكشف عن الاختلافات بين الأوتار غير المعالجة والعلاجات.
Introduction
إصابة وتر واحدة من الأسباب الأكثر شيوعاً من ضمور العضلات والألم كبيرا عبر الأنواع1. في الطب البيطري، وإصابات الأوتار واربطه من اهتمام خاص بالخيول، كما تشرك 82 في المائة من جميع الإصابات في خيول السباق العضلي، وأن 46 في المائة من تلك التي تؤثر على الأوتار والأربطة2،3. تشكيل ندبا تؤثر على خصائص النشاط الحيوي لتلتئم الأوتار ويفسر تشخيص حراسة للعودة إلى استخدام الرياضية بعد إصابات الأوتار المثنية؛ إعادة الإصابة يحدث داخل سنتين في تصل إلى 67 في المائة خيول تعامل متحفظ4. الطب التجديدي يوفر بدائل مبتكرة بشرط أن التحديات العلاجات التقليدية. العلاج بالخلايا الجذعية الذاتي قد تنتج بعض النتائج المشجعة5،6 ولكنها محدودة بالإصابة بالأمراض المرتبطة بجمع الأنسجة والإدارة تأخر بسبب تجهيز/إعادة برمجة الخلايا والتأثير الحالة الصحية للمريض (مثل العمر) على خصائص الجذعية الخلايا7،8. توفر هذه القيود أساسا منطقياً للتحقيق متمكنة من الخلايا الجذعية كبديل جاهز. الخلايا الجنينية المستمدة من adnexa هي المرشحين جذابة للتحايل على الشواغل الأخلاقية والمخاطر لتشكيل تيراتوما المرتبطة بالخلايا الجذعية الجنينية. بين adnexa الجنين، الحبل السري مصفوفة (UCM)، كما يدعى جيلي في وارتون، وفيرة وسهلة لجمع.
بغض النظر عن مصدر الخلية، تعزيز ستيمنيس ضروري لإنشاء بنك خلية للطب التجديدي allogenic. ومن ناحية فنية، يمكن تعريف ستيمنيس كإمكانية التمايز الذاتي تجديد ونسب متعددة9. أدلة ستيمنيس يعتمد على الانتشار والتمايز فحوصات، جنبا إلى جنب مع التعبير عن الجين علامات Oct4، Sox2، و نانج9. استراتيجية واحدة لتعزيز ستيمنيس تعتمد على استخدام المواد الحيوية بمثابة باطلة الحشو والناقلين تعزيز انتشار والتفريق بين UCM-MSCs. وهذا النهج يلغي الشواغل المتعلقة بالتلاعب بعوامل النسخي لإعادة برمجة خلايا ناضجة في الخلايا المستحثة pluripotent. من بين المواد الحيوية تعتبر شركات النقل المحتملة للخلايا الجذعية، الشيتوزان جذابة لتوافق مع الحياة والانحلالية10. هذا أمينوبوليساكتشاريدي طبيعية شكلتها ديسيتيليشن القلوية من كيتين، السكاريد الطبيعية الأكثر وفرة من الثانية، التي تم الحصول عليها أساسا سوببرودوكت من المحار10. ونحن قد سبق التحقيق التفاعلات بين MSCs والسقالات الشيتوزان، ولاحظ تشكيل الماغنيسيوم11،،من1213،،من1415، 16-ونحن أيضا تقريرا عن تفوق تشوندروجينيسيس على الشيتوزان المصفوفات12،13،،من1415،،من1617، 18. في الآونة الأخيرة، وصف دراستين مستقلتين تشكيل الماغنيسيوم بالانسجة الدهنية وأنسجة المشيمة المستمدة MSCs مثقف في19،فيلم الشيتوزان20. هذا تشكيل الماغنيسيوم يعزز ستيمنيس ليس فقط، بل أيضا تحسين الاحتفاظ بالخلايا الجذعية بعد في فيفو غرس20.
انتشار والاعتلال من تيندينوباثي عبر الأنواع حفزت على وضع نماذج تجريبية لدراسة الفسيولوجيا المرضية تيندينوباثيس واختبار علاجات جديدة مثل حقن الخلايا الجذعية. التهاب الأوتار كولاجيناز المستحثة بالخيول، نموذج مشترك لإثبات فعالية استخدام MSCs في إصلاح وتر21. أهمية هذا النهج محدودة، كما حقن تتسبب في تغييرات الالتهابات الحادة، بينما تيندينوباثيس السريرية تنجم عادة عن المزمن أوفيرسترين،من2223. وباﻹضافة إلى ذلك، يستحث استجابة شفاء الكيميائية التعريفي مرض وتر وعدم تكرار عملية الشفاء البصر في الحالات السريرية22،23. قد وصفت الختان جزء من وتر المثنية السطحية الرقمية كنموذج جراحية لالتهاب الأوتار في24من الخيول. في الآونة الأخيرة، تم استخدام نهج كسبها لتقييد الضرر النفسي إلى النواة المركزية ل وتر المثنية السطحية رقمي25. محاكاة النماذج الجراحية لا إليه التعب التي قد تؤدي إلى المرض وتر الطبيعية، وتميل إلى الافتقار إلى إمكانية تكرار نتائج في مدى الأضرار التي تم إنشاؤها25. بغض النظر عن النموذج، والاعتلال والتكاليف المرتبطة بنماذج الخيول من وتر الأمراض هي قيود إضافية، مما يبرر اهتمام بنماذج القوارض كخطوة أولى في فيفو التقييم لعلاجات جديدة.
واحدة من المزايا الرئيسية لنماذج تجريبية في القوارض تتكون من التكلفة والقدرة على التحكم في تقلب بين الأفراد. يمكن أن تكون موحدة فيما يتعلق بمختلف العوامل الفسيولوجية بسبب معدلات النمو السريع لهذه القوارض وقصيرة نسبيا تمتد من الحياة، الحد من مصادر التباين وذلك تقليل عدد الحيوانات اللازمة للكشف عن الاختلافات. وقد اعتمدت استراتيجيات للحث على وتر الأمراض في القوارض تعريفهم الكيميائية، ولكن أيضا على إنشاء الجراحية لوتر جزئية عيوب21. نماذج العمليات الجراحية قد محاكاة أفضل من النماذج الكيميائية الطبيعية تيندينوباثيس، ولكن يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدلات الاعتلال وفشل ذريع لوتر معطوب. وفي هذا الصدد، يبدو الفئران أفضل المرشحين من الفئران لهذه النماذج، حسب حجمها يسمح بإنشاء أكبر العيوب، وبالتالي تيسير التقييم لشفاء الأنسجة. استخدمت جرذان سبراغ داولي في الدراسات التجريبية من تيندينوباثيس في أربع مجموعات رئيسية وتر: الكفة والمثنية والعرقوب والاوتار الرضفة26. ومن بين هذه النماذج التي تنطوي على وتر الرضفة جاذبية خاصة بسبب حجم أكبر من هذا الوتر وسهولة الوصول إليه27. وتعلق وتر الرضفة في عضلة الفخذ على الاحدوبه الظنبوبيه. وفي إطار هذه الآلية الباسطة، هو الرضفة العظام سيسامويد التي توجه عمل الرباعية، ويحدد مدى الدانية وتر الرضفة. ويسهل وجود المراسي عظمى في درجات الدانية والبعيدة لوتر الرضفة اختبارات النشاط الحيوي. النماذج التي تنطوي وتر الرضفة عادة تعتمد على العيوب الجراحية أحادية الجانب، مع وتر سليمة كونترالاتيرال بوصفه28،تحكم29. نموذج عيب وتر الرضفة الأكثر شيوعاً ينطوي على نسق الجزء المركزي (1 ملم في العرض) من وتر الرضفة من ذروة القاصي الرضفة لإدراج الاحدوبه الظنبوبيه، بينما ترك وتر الرضفة كونترالاتيرال سليمة. وشملت التدابير نتائج علم الأنسجة، واختبار النشاط الحيوي غير مدمرة أو اختبار النشاط الحيوي للفشل والتصوير بالموجات فوق الصوتية، و السابقين فيفو تصوير الأسفار، والمراقبة الإجمالي والاختبارات الوظيفية28،30 ،31. نماذج أحادية الجانب لا تسمح بالمقارنة بين العلاج المقترح مع إدارة المحافظ إصابة مماثلة داخل الحيوان نفسه. وبالمثل، يتطلب مقارنة بين عدة علاجات الحيوانات منفصلة. أن القضاء على الاختلافات الفردية بين نموذج ثنائية وتقليل عدد الحيوانات اللازمة ل دراسة32. بيد أن الإصابات الثنائية قد تزيد من معدلات الاعتلال والضعف الثنائية يمكن أن يعوق تقييم العلاج. عدد قليل من الدراسات بإيجاز تقرير استخدام وتر الرضفة الثنائية العيوب في الفئران ولكن التركيز على آثار العلاج بدلاً من إدارة التعاونية القريبة والاعتلال من33،النموذجي34.
دراسة هذا الهدف الطويل الأجل وضع استراتيجية لتحسين بقاء ستيمنيس و في فيفو متجهة إلى زرع allogenic UCM-MSCs. ولتحقيق هذا الهدف، أبلغنا مؤخرا ستيمنيس محسنة من UCM MSCs بتشكيل الماغنيسيوم في الفيلم الشيتوزان والحضانة تحت البيئة التاكسج35. هذه الخصائص في المختبر كانت ترتبط بتحسين خصائص النشاط الحيوي لعيوب وتر الرضفة تعامل مع UCM مكيفة-MSCs-استناداً إلى هذه النتائج، ونموذج عيب وتر الرضفة الثنائية الفئران يبدو مناسباً لاختبار المرشح علاجات ل إصابات وتر36. والغرض من هذه الدراسة ذكرت هنا هو توفير بروتوكولات مفصلة لعزل وتوصيف UCM-MSCs، إعداد نظام توصيل البيولوجية للخلايا الجذعية، وإنشاء ومعالجة عيوب وتر الرضفة الثنائية، والمنطوق بعد الاسترداد والتقييم من الأنسجة الشفاء داخل العيوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) للعلوم "جامعة الصحة الغربية".
1-العزلة والتوسع في MSCs من مصفوفة الخيلي الحبل السري
- الحصول على المشيمة من فرس الكبار (حامل) بعد أن لاحظ فوالينج وعزل أسيبتيكالي الحبل السري من المشيمة. إبقاء الحبل السري في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 1% البنسلين-ستربتوميسين (P/S) في 4 درجات مئوية أثناء النقل حتى التجهيز.
- أغسل الحبل السري مرتين مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني مع 1% P/S في أنبوب 50 مل. قسم الحبل السري إلى شظايا طوله 2 بوصة في لوحة 150 مم وتغسل في درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني مع % 1 هو تشطف P/S في أنبوب 50 مل اثنين أو ثلاث مرات، حتى أكثر من الدم.
- قطع الحبل السري طوليا للكشف عن السفن. إزالة السفن، بما في ذلك الشرايين 2، والوريد، وساق الانتويك من السلك باستخدام الملقط، والمقص. جمع مصفوفة الحبل السري (جيلي في وارتون)، وهي السفن المحيطة بها مصفوفة مثل جيلي، على لوح 150 مم بالقشط مع مشرط، وتخطر هلام أربا غرامة.
- جيلي "مكان وارتون" من 2 – 3 أجزاء الحبل السري (حوالي 12 – 15 ز) في أنبوب 50 مل مع 15 مل من 0.1% (w/v) كولاجيناز نوع IA الحل في برنامج تلفزيوني. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف ح 3-4 حتى يذوب.
- الطرد المركزي هضم الأنسجة في ز 300 x لمدة 15 دقيقة ونضح المادة طافية. ريسوسبيند الأنسجة هضمها في 15 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني مع 1% P/S، مزيج من بيبيتينج والطرد المركزي في ز 150 x لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية (المياه والصرف الصحي). تكرار الغسيل مرتين أكثر.
- ريسوسبيند غسلها الخلايا في 15 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني مع 1% P/S، مزيج من بيبيتينج وسلالة من 100 ميكرومتر خلية مصفاة، أجهزة الطرد المركزي في ز 150 x لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية.
- تعد الثقافة المتوسطة (سم) بخلط السكر منخفض دولبيكو المتوسطة "تعديل النسر" (جي-دميم) مع المصل البقري الجنين (FBS)، و 1% P/س. تعقيم المتوسطة عن طريق الترشيح.
- ريسوسبيند الخلايا المتوترة في 10 مل سم قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية ومزيج من بيبيتينج ونقل إلى 25 سم2 زراعة الأنسجة قارورة واحتضان في 5% CO2 في الرطوبة 90% و 37.0 درجة مئوية. سم كل 3 أيام حتى تصل الثقافة إلى التقاء 70 – 80%، عندما سوف باساجيد الثقافة من التغيير.
- للمرور الثقافة، نضح سم من قارورة وتغسل مع 5 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني مرتين، وفصل مع 3 مل حمض التربسين/الإيثيلين 0.25% (يدتا) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحييد التربسين/يدتا مع 6 مل سم قبل تسخينها إلى 37.0 درجة مئوية، ومزيج من بيبيتينج، ونقل في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في ز 150 x لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية. ريسوسبيند خلايا منفصلة في 1 مل سم، مزيج من بيبيتينج. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. إعادة البذور في 25 سم2 زراعة الأنسجة قارورة 5,000 الخلايا/سم2، واحتضان في 5% CO2 في الرطوبة 90% و 37.0 درجة مئوية.
2-إعداد الماغنيسيوم مع UCM-MSCs مثقف في الأفلام الشيتوزان
- لتحضير 100 مل محلول الشيتوزان 1% (w/v)، أضف ز 1 من الشيتوزان في 99 مل ماء المقطر (dH2س)، ومزيج جيد مع محرض مغناطيسية.
- إضافة ميليلتر 670 من حمض الخليك الجليدية ويستمر الخلط حتى يذوب الشيتوزان ويصبح لزج. هذا عادة ما يستغرق 3-4 ح.
- إضافة 500 ميليلتر من الشيتوزان الحل إلى كل من لوحة زراعة الأنسجة 12-جيدا جيدا، ودوامه لوحة توزيع حل الشيتوزان بالتساوي وتغطية كافة السطح السفلي.
- الجاف للوحة الشيتوزان الحل مغلفة إطار الاندفاق الصفحي مجلس الوزراء دون غطاء بين عشية وضحاها على ح 24. مرة واحدة المجففة، وسيتم تشكيل رقيقة والتقيد بها على لوحة.
- تحييد الفيلم الشيتوزان بإضافة 1 مل من 0.5 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) الحل في كل بئر واحتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة. نضح هيدروكسيد الصوديوم من كل بئر وتغسل كل جيدا مع 1 مل من dH2س ثلاث مرات. تغسل كل جيدا مع 1 مل إيثانول 70% (EtOH) مرة واحدة.
- لتعقيم الفيلم الشيتوزان، إضافة 1 مل من 70% EtOH إلى كل خير واحتضان بين عشية وضحاها في مجلس الوزراء الاندفاق الصفحي. نضح EtOH المتبقية من كل بئر في اليوم التالي. تغسل كل جيدا مع 1 مل PBS العقيمة ثلاث مرات. تعقيم الفيلم الشيتوزان مع الأشعة فوق البنفسجية تحت الاندفاق الصفحي مجلس الوزراء بين عشية وضحاها دون غطاء.
- لنموذج الماغنيسيوم من UCM MSCs، البذور الموسع وباساجيد الخلايا في كل بئر 5,000 الخلايا/سم2، واحتضان في 5% CO2 في الرطوبة 90% و 37.0 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن المحتضنة الخلايا تحت نقص أو نورموكسيا، تبعاً لمصلحة المحقق.
3-التعبير عن علامات السطحية التي تم تحليلها عن طريق التدفق الخلوي
-
إعداد تعليق خلية مفردة
- اللوحة القياسية
- إزالة المتوسطة من كل بئر ويغسل مرتين مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني.
- فصل الخلايا مع 500 ميليلتر من كاشف تفكك خلية في كل بئر من صفيحة 12-جيدا لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- وبعد الحضانة، أضف 1 مل من تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% جيش صرب البوسنة) في كل بئر ومزيج من بيبيتينج لفصل الخلايا.
- نقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 150 x ز لمدة 5 دقائق.
- لوحة الشيتوزان
- جمع جميع الماغنيسيوم يسفط المتوسطة باستخدام ماصة مع تلميح 1,000 ميليلتر. نقل المتوسطة التي تم جمعها في أنبوب مخروطي 15 مل. وبعد جمع المتوسطة، تغسل جيدا بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل برنامج تلفزيوني غسلها في أنبوب مخروطي 15 مل نفس.
- الطرد المركزي الماغنيسيوم في 150 غ س لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
- إضافة 500 ميليلتر من الكاشف تفكك الخلية (مثلاً، أككوتاسي)، واحتضان لمدة 5 – 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. مزيج من بيبيتينج استخدام تلميح 1 مل حتى ننأى الماغنيسيوم ولم تعد مرئية.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت المصبوغة في تعليق خلية مفردة وأجهزة الطرد المركزي في 150 x ز لمدة 5 دقائق.
- اللوحة القياسية
-
غسل الخلايا
- إزالة المادة طافية من الأنبوبة المخروطية وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل البرد تلطيخ المخزن المؤقت. تبقى الخلايا على الجليد في جميع أنحاء التجربة من هذه الخطوة.
- الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق (الغسل).
- تغسل مرتين.
-
تلطيخ الخلايا
- الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
- عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. إعادة تعليق 1 × 106 خلايا في حجب 50 ميليلتر المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الحصان 10%)، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- إضافة 10 ميليلتر fluorescein isothiocyanate (فيتك) مترافق الأجسام المضادة (CD44، CD90، CD105، CD34، histocompatibility الرئيسية المعقدة (MHC) الدرجة الثانية أو تحكم ايستب لكل جسم) و 40 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت، ثم احتضان محمية من الضوء ح 1 على الجليد.
- أضف 3 مل البرد تلطيخ المخزن المؤقت وخلط والطرد المركزي في ز 300 x لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية (الغسل).
- تكرار الغسيل مرتين.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من تلطيخ المخزن المؤقت
- إضافة 5 ميليلتر من 7-عاد (صلاحية صبغ) واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد
- تحليل عينات الخلايا ملطخة بتدفق سيتوميتير. استبعاد الحطام بأصغر SSC ومنتدى التعاون الأمني، وتحديد خلايا قابلة للحياة مع انخفاض الإقبال على 7-الإغراق. ارسم FL1 و FL2 على y-والعاشر-المحاور، على التوالي. استخدم عنصر التحكم ايستب لإنشاء بوابة فوق خط قطري. قياس النسبة المئوية للخلايا الملون إيجابيا في المنطقة. العدد الأقل من 20,000 الأحداث/نموذج (تكميلية الشكل 1).
- قياس النسبة المئوية للخلايا الملون مع الأجسام المضادة التي النابضة خلايا قابلة للحياة والسيارات-الأسفار، واستقطاع النسبة المئوية للخلايا الملون مع التحكم ايستب.
4-ثنائية وتر الرضفة عيب النموذجي في الفئران
- حدد الفئران سبراغ داولي (البالغين الذكور، 4 – 5 أشهر من العمر، وزن الجسم ز 350-375). ملاحظة الحجم الكبير نسبيا للفئران المستخدمة لهذا النموذج.
- تخدير وتطبيق العين الاصطناعية زيوت التشحيم الفئران مع سيفوفلوراني 8% في الأكسجين 100% 2 لتر في الدقيقة تسليمها عبر القناع، حتى اختفاء منعكس قرصه-تو في قاعة التعريفي.
- إدارة حقنه عضليا من ميلوكسيكام (1 مغ/كغ) التسكين وقائية.
- مكان الفئران بين اثنين من زجاجات المياه 0.5 لتر مملوءة بالمياه الدافئة ومغطاة بقطعة من قماش للمحافظة على درجة حرارة الجسم والموقف، بينما يمنع إصابة الجلد. الشريط كل الأطراف إلى طاولة المفاوضات. للحد من خطر انخفاض حرارة الجسم، يغطي الجسم مع التفاف فقاعة (الشكل 1).
- المحافظة على التخدير مع تدفق مستمر من سيفوفلوراني 5% في خليط الأكسجين 100% 1 لتر عبر مخروط الآنف، مع الحيوان على ريكومبينسي الظهرية في لوح تسخين المياه.
- لتجنب الصدمات الجلد، مقطع لا المواقع الجراحية. بدلاً من ذلك، تطبيق كريم مزيل الشعر على حد سواء يعوق. استخدام خافضة اللسان لإزالة كريم والشعر.
- فرك موقع الجراحية مع فرك ديجلوكوناتي الكلورهيكسيدين، وشطف مع الإيثانول 70% 3 مرات.
- جداً الجلد مع شفرة المبضع #15 عقيمة في اتجاه الدانية إلى الأعلى، على الجانب كرانيوميديال خنق. بدء شق الدانية إلى مستوى الرضفة حوالي 1 سم، وتوسيعه القاصي إلى السلية قصبي حوالي 5 ملم.
- وتعكس الجلد لفضح وتر الرضفة بتحرير الأنسجة الكامنة تحت الجلد مع شفرة المبضع #15.
-
استخدام شفرة المبضع #15، المكوس المركزية الثالثة لكل وتر الرضفة (1 ملم) من الجانب الأعلى من الرضفة إلى الاحدوبه الظنبوبيه.
- قم بمحاذاة أسلاك كيرشنر 0.99 ملم-قطر ضد الوتر كقالب لتوحيد حجم الخلل في كل أطرافه (الشكل 2).
- جعل 2 كامل-سمك شقوق في كل جانب من أسلاك كيرشنر بشفرة المبضع #15 لعزل الجزء المركزي للوتر (الشكل 3). يرسخ القسم المركزي بروكسيمالي وديستالي مع غرامة قزحية مقص (الشكل 4).
- قبل إغلاق اللفافة من خنق، إدراج تجلط (تعليق خلية مختلطة والكاريبي والمحيط الهادئ) لمجموعات العلاج المناسب كما هو موضح في 5.5. إغلاق اللفافة مع نمط الصليبي والجلد مع نمط الأدمة باستخدام 5-0 بوليجلاكتين 910 خياطة الجروح (الشكل 5).
- تكرار الإجراء على خنق كونترالاتيرال.
ملاحظة: يتم تعيين عيب واحد عشوائياً لعلاج (الخلايا الجذعية مكيفة على الشيتوزان أو مثقف في لوحات قياسية). العيب contralateral ترك فارغاً، ليكون بمثابة الرقابة الداخلية. - بعد الجراحة، إدارة أقراص 4 من انروفلوكساسين (2 ملغ/قرص، شفويا، مرة واحدة يوميا) وقرص ميلوكسيكام (2 ملغ/قرص، شفويا، مرة واحدة يوميا) لمدة 7 أيام. هذه الجرعات الذي أوصت به طبيب بيطري حيوانات مختبرية وتمت الموافقة عليها في البروتوكول إياكوك.
5-تسليم MSCs داخل عيب وتر الرضفة
- تخدير الفئران صحية الذي لا يستخدم لإنشاء عيب وتر الرضفة مع سيفوفلوراني 8% في الأكسجين 100% 2 لتر في الدقيقة تسليمها عبر القناع، حتى اختفاء منعكس قرصه-تو في قاعة التعريفي.
- جمع الدم 5 مل بثقب القلب من الفئران سبراغ داولي أنيسثيتيزيد (البالغين الذكور، 4 – 5 أشهر، وزن الجسم ز 350-375)، في حقنه 5 مل مع 20 غ إبرة تحتوي على 1 مل من حمض-سترات-سكر العنب (5:1 v/v).
- Euthanize الفئران بعد ثقب القلب وجمع الدم، عن طريق الحقن إينتراكارديال من بينتوباربيتال (100 مغ/كغ)، بينما تحت التخدير نفسها.
- الطرد المركزي العينة في 350 غ س لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل المادة طافية وتخزين مختبرين (120 ميليلتر في كل) في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- مباشرة قبل غرس في فيفو ، ذوبان الجليد قاسمة أعلاه ومزيج 20 ميليلتر مع 0.5 × 106 MSCs (من 1.9 أو 3.1.2.1) منفصلة عن لوحات قياسية باستخدام التربسين/يدتا، أو جمع من لوحات الشيتوزان بالتنظيف (مع برنامج تلفزيوني والمتوسطة).
- إضافة 6 ميليلتر من كلوريد الكالسيوم 10% (كاكل2) إلى ميليلتر 100 المتبقية من البلازما المذابة في بئر لوحة 96-جيدا تنشيط البلازما والحث على تشكيل جلطة (تنشيط البلازما مكيفة: الكاريبي والمحيط الهادئ).
- مزيج تعليق خلية (20 ميليلتر) والكاريبي والمحيط الهادئ (100 ميليلتر) لتشكيل جلطة (الشكل 6). ضع تجلط داخل عيب وتر الرضفة التي تم إنشاؤها قبل إغلاق اللفافة خنق (راجع الخطوة 4.10.3).
6. الوظيفية نتيجة
- مراقبة الفئران مرتين في يوم لعلامات الألم، استناداً إلى37،النطاق (RGS) كشر الفئران38 وتورم أكثر المواقع غرس.
ملاحظة: نظام التهديف (0 – 6) وضعت لتقييم دالة الإسعافية استناداً إلى الأنشطة 3، بما في ذلك توقيت هند أطرافهم الدائمة مع الأمامية أيد (0-3)، وفي الوقت المناسب دون مساعدة هند أطرافهم الدائمة (0 – 2)، والقدرة على الصعود 17 سم أقفاص بلاستيكية جدار (0 – 1) ( الجدول 1). - تقييم الفئران للأنشطة الدائمة أطرافهم هند اثنين في الصباح وفي المساء من كل نقطة الوقت لحساب على درجة متوسط.
- تقييم الفئران لقدرته على تسلق جدار قفص بلاستيك 17 سم بنجاح مع كل أطرافه هند الوصول إلى الأعلى.
7-إجمالي المظهر والتشريح المرضى لوتر الرضفة
- Euthanize الفئران في 7 أيام (لتقييم التهاب) أو 28 يوما (لتقييم شفاء الأنسجة) وظيفة العلاج عن طريق الحقن إينتراكارديال من بينتوباربيتال (100 مغ/كغ) تحت التخدير مع سيفوفلوراني 8% والأكسجين 100% ل 2 تسليمها عبر قناع.
- حصاد وحدات الاحدوبه الرضفة-وتر-الساق بدون مشرط ومقص بعد القتل الرحيم. إزالة الأنسجة الرخوة والأربطة حول خنق، باستثناء وتر الرضفة.
- فحص كل عينة للمظهر الإجمالي وسماكة الأربطة (الشكل 7).
- توجيه العينة بوضع عقده للجراح من بوليديوكسانوني 5.0 على الجانب الأفقي والدانية من الوتر. إصلاح كل عينة في 10% محلول الفورمالين مخزنة محايدة والحصول على مقاطع عرضية (5 ميكرومتر) من الجزء في منتصف كل وتر.
- وصمة عار الأقسام باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين، وتريتشرومي ماسون لتلطيخ عقب البروتوكولات القياسية.
- تفحص الباب الكشف عن وجود ورم دموي داخل عيب، فضلا عن التغيرات المرضية مثل التهاب.
- تقييم النتيجة النسيجي للأقسام باستخدام نظام التهديف المنشورة سابقا، استناداً إلى الصف الكولاجين، درجة من الأوعية، والغضاريف تشكيل (الجدول 2)39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد نتائج الدراسة الحالية، كما يعني ± SD (الانحراف المعياري). الخلايا المعزولة من الحبال السري من ماريس 6، وتم مقارنة النسبة المئوية لخطوط الخلايا المعزولة معربا عن كل علامة الخلية السطحية تحت تكييف المعايير أو الشيتوزان مع اختبار فريدمان، كتحليل تباين غير حدودي مع تكرار التدابير. لإنشاء نموذج عيب وتر، استخدمت 8 الفئران لتقييم عملية جراحية بعد 7 أيام والفئران 12 استخدمت لتقييم 28 يوما. النتائج النتائج الفنية وتعرض كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (الخطأ المعياري للوسط) ومقارنة باستخدام الاختبار t. واختير UCM كمصدر خلوية نظراً لما وفرة، وسهولة جمع، وانتشار متفوقة بالنسبة إلى سائر مصادر adnexa الجنين40. الخلايا المعزولة من UCM مثقف لوحات قياسية على الإبقاء على شكل مثل تنتجها الخلايا الليفية في جميع أنحاء التوسع. وشكلت خلايا الماغنيسيوم عند مثقف على لوحة الشيتوزان (الشكل 8).
أعربت غالبية الخلايا المزروعة تحت ظروف قياسية عن CD44 (98.6 ± 1.62%)، CD90 (88.7 ± 3.04%)، و CD105 (77.9 ± 6.84%)، بينما التعبير عن CD34 (0.07 ± % 0.17) والثاني MHC (1.33 ± 1.12%) كانت منخفضة للغاية. تحت الثقافة مكيفة، ومستويات التعبير CD44 (± 97.0 2.12%) و CD34 (1.13 ± 1.58 في المائة) لم تختلف عن الثقافات القياسية، بينما مستويات التعبير من CD90 (33.3 ± 37.1%) و CD105 (54.0 ± 19.0%) انخفضت والثاني MHC (2.84 ± % 0.98) زيادة35.
وبعد عزل وتوصيف UCM-MSCs في المختبر، كان السلوك البيولوجي للخلايا مكيفة مقارنة بالخلايا المزروعة تحت ظروف قياسية في طراز عيب وتر الرضفة ثنائية في الفئران. علاج العيوب في كل الفئران بمثابة الضوابط الداخلية. كان الحد الأدنى في جميع الفئران المنطوق بعد تورم وحلها في غضون 48 ساعة. حسب RGS، أي من الفئران عرض علامات الألم أو المعاناة مثل المداري تشديد، الآنف/الخد التسطيح، أو تغيير الإذن/الخط الطولي. ويستهلك جميع الفئران مجموعة عادية من الكريات 3 – 4 أو 15 – 20 غراما من العلف يوميا طوال فترة الدراسة. مجموع نقاط الوظيفية، بما في ذلك مساعدة وأعلى في الفئران العادية مقارنة بالفئران تعمل في 7 أيام بدون مساعدة من أطرافهم هند الدائمة، فضلا عن تسلق عشرات (n = 8، ف < 0.0001، الجدول 3). ومع ذلك، عاد إجمالي الدرجات الوظيفية إلى وضعها الطبيعي في غضون 28 يوما بعد الجراحة (n = 12، ف = 0.78). ولذلك، أظهرت الفئران وتر الرضفة الثنائية عيب نماذج فعالة للحد من التفاوت بين الأفراد وتخفيض عدد الحيوانات اللازمة دون أن يسبب اعتلال كبير (فيديو 1–5).
حوالي 37% الأوتار التي جمعت في 28 يوما يبدو ملحوظا سميكة (الشكل 7). سماكة هذه كانت موزعة بالتساوي بين العيوب فارغة والمعالجة. زيادة مجموع الدرجات النسيجي مع مرور الوقت في علاج العيوب (n = 20، ف = 0.0034). عند كل مكون لدرجة الشفاء تم تقييمه بشكل مستقل، المعلمة الوحيدة المتغيرة مع الزمن وتألفت من تكوين الغضاريف، والذي زاد من بين 7 و 28 يوما (n = 20، ف < 0.0001). الأوعية تميل إلى الزيادة مع الوقت (p = 0.3)، ولكن لم يختلف تكوين الكولاجين (ف = 0.69). عند الفحص النسيجي، لوحظ التهاب في جميع الأقسام أنسجة الأوتار بحث في 7 أيام بعد الجراحة، بغض النظر عن وجود العلاج. ورم دموي كان حاضرا في جميع العيوب المعالجة. عشرات الأوعية النسيجي (الجدول 2، الشكل 9) تتراوح من 0 إلى 1، يوحي arteriole معتدلة وتسلل الشعرية، بينما الصف الكولاجين عشرات (الجدول 2، الرقم 10) تتراوح بين 2 إلى 3 الشاملة، مما يوحي تكوين الكولاجين معتدلة على نطاق واسع. عشرات تشكيل الغضروف (الجدول 2، الرقم 11) تتراوح من 0 إلى 2 اقتراح لا تكوين الغضاريف، معتدلة تشكيل الغضروف من 25% إلى 50% منطقة مقطع وتر. تتجه جميع الأرقام النسيجي مع الجانب الأيسر كما الجانب الأمامي، والأعلى كالجانب الآنسي للمقطع العرضي الجزء الخاص الوتر في منتصف.
رقم 1: تحديد المواقع من الفئران، والتحضير لعملية جراحية معقمة. وكان وضع كل الفئران بين اثنين من زجاجات المياه 0.5 لتر مملوءة بالمياه الدافئة ومغطاة بقطعة من قماش للمحافظة على درجة حرارة الجسم والموقف، بينما يمنع إصابة الجلد. الحدود القصوى لكل الفئران كانت مسجلة بالجدول والهيئة كانت مغطاة بالتفاف فقاعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نموذج الجراحية من عيب وتر الرضفة (المحاذاة). يتم محاذاة أسلاك كيرشنر 0.99 ملم-قطر ضد الوتر كقالب لتوحيد حجم الخلل في كل أطرافه.
الشكل 3: نموذج الجراحية من عيب وتر الرضفة (شقوق). مصنوعة اثنين كامل-سمك الشقوق على كل جانب من أسلاك كيرشنر عزل جزء مركزي من الوتر.
الشكل 4: نموذج الجراحية من عيب وتر الرضفة (بتر). القسم المركزي هو مستأصل بروكسيمالي وديستالي، خلق عيب في مطابقة حجم أسلاك كيرشنر. يتم إظهار منطقة مستأصل داخل المربع خط منقط.
الرقم 5: مظهر يعوق تشغيلها بعد العمليات الجراحية- وأغلقت اللفافة مع نمط الصليبي والجلد كانت مغلقة مع نمط الأدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إعداد المنشط البلازما مكيفة لإيصال UCM-MSCs- وتوقفت الخلايا الجذعية في البلازما مكيفة قبل التنشيط. وأدرج تجلط الناتجة في عيوب وتر الرضفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: الإجمالي لمظهر طبيعي (ج، د) وسميكة (A, B) الأوتار. (أ، ج) وجهات النظر الخلفي؛ (ب، د) آراء الأطراف؛ تحديد الممتلئة الساق وأسهم رقيقة تحديد الأوتار.
الرقم 8: لوحة مورفولوجيا الخلايا المزروعة في زراعة الأنسجة تحت 19% مستوى الأكسجين (المجموعة القياسية: A) والشيتوزان الفيلم تحت 5% مستوى الأكسجين (مجموعة مكيفة: ب). عزل الخلايا كانت محور الدوران على شكل مجموعة قياسية (A) وشكلت الماغنيسيوم على تكييف المجموعة (ب). شريط المقياس = 400 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: الممثل الضوء ميكروجرافس المستخدمة لتصنيف الأوعية. وبعد 7 أيام للشفاء، تلقي الأوتار مع عدم المعالجة صف 0 (أ، د)، بينما تلك الخلايا مكيفة (ج، و) أو الخلايا القياسية (ب، ه) تلقي درجة من 0, 5 و 0، على التوالي. في غضون 28 يوما، المتلقاة الأوتار غير المعالجة (G, J) صف 0، بينما تلك مع تكييف الخلايا (أنا،ل) أو الخلايا القياسية (H,K) وتلقى عشرات من 1.0 و 0.5، على التوالي. الأسهم تحديد الأوعية الدموية الموجودة في العينة وتر. أسهم تشير إلى الأوعية الدموية في 100 X التكبير تتوافق مع الأسهم نفس الإشارة إلى الأوعية الدموية في التكبير 400 x. الأنسجة وتر العادي (M, N). Trichrome وصمة عار Masson's (أ، ب، ج، ز، ح، الأول، م)؛ وصمة الهيماتوكسيلين وويوزين (د، ه، و، ي، ك، ل، ن)؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر (أ-ن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: الممثل الضوء ميكروجرافس المستخدمة لتصنيف الكولاجين. وبعد 7 أيام للشفاء، تلقي الأوتار مع عدم المعالجة درجة 2.5 (أ، د) بينما تلك مع العلاج (ب، ج، ه، و) حصل على درجة 3.0. في غضون 28 يوما، المتلقاة الأوتار غير المعالجة (G, J) درجة 3.0، بينما تلك مع تكييف الخلايا (الأول، L) أو الخلايا القياسية (H, K) وتلقى عشرات من 1.0 و 3.0، على التوالي. يمكن تقدير الفوضى ألياف وتر في insets X 400 (H, K). الأنسجة وتر العادي (M, N). Trichrome وصمة عار Masson's (أ، ب، ج، ز، ح، الأول، م)؛ وصمة الهيماتوكسيلين وويوزين (د، ه، و، ي، ك، ل، ن)؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر (أ-ن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 11: الممثل الضوء ميكروجرافس المستخدمة لتصنيف الغضروف. بعد 7 أيام للشفاء، مكيفة الأوتار مع عدم المعالجة (أ، د)، الذين أما مع الخلايا (ج، و) أو الخلايا القياسية (باء، هاء)، تلقت جميع الرتب 0. في غضون 28 يوما، المتلقاة الأوتار غير المعالجة (G, J) صف 1.0، بينما تلك مع تكييف الخلايا (الأول، L) أو الخلايا القياسية (H, K) وتلقى عشرات من 0 و 2.0، على التوالي. تشير الأسهم في تشوندروسيتيس موجودة في العينة وتر. أسهم تشير إلى تشوندروسيتيس في 100 X التكبير تتوافق مع الأسهم نفس الإشارة إلى تشوندروسيتيس في 400 X التكبير. الأنسجة وتر العادي (M, N). Trichrome وصمة عار Masson's (أ، ب، ج، ز، ح، الأول، م)؛ وصمة الهيماتوكسيلين وويوزين (د، ه، و، ي، ك، ل، ن)؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر (أ-ن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: تقييم الدالة الإسعافية في الفئران. توقيت الدائمة دون مساعدة هند أطرافهم (ق: 1 – 5 نقاط 1) لوحظ 4 ح قد. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 2: تقييم الدالة الإسعافية في الفئران. توقيت أطرافهم هند الدائمة مع الأمامية بمساعدة (0 – 5 نقاط s: 0) أشير إلى الرتبة 4 ح عمليا. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 3: تقييم الدالة الإسعافية في الفئران. توقيت الدائمة دون مساعدة هند أطرافهم (نقاط s 1-5: 1)، توقيت أطرافهم هند الدائمة مع الأمامية بمساعدة (ق: 5 – 10 نقاط 1) أشير إلى ما بعد 14 يوما عمليا. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 4: تقييم الدالة الإسعافية في الفئران. توقيت أطرافهم هند الدائمة مع الأمامية بمساعدة (نقاط s 10 – 15: 2)، دون قدرة على تسلق جدار قفص بلاستيك 17 سم (لا تسلق: نقاط 0) لوحظ بعد 27 يوما عمليا. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 5: تقييم الدالة الإسعافية في الفئران. توقيت أطرافهم هند الدائمة مع الأمامية بمساعدة (ق: 5 – 10 نقاط 1)، مع القدرة على تسلق جدار قفص بلاستيك 17 سم (نعم: نقاط 1) أشير إلى ما بعد 14 يوما عمليا. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
| الاختبار الوظيفي | 0 | 1 | 2 | 3 | نقاط |
| أطرافهم هند تقف مساعدة | 0-5 s | > 5-10 ق | > 10-15 ق | > 15 s | |
| أطرافهم هند الوقوف دون مساعدة | 0 – 1 s | > s 1 – 5 | > 5 s | ||
| القدرة على التسلق | لا | نعم | |||
| المجموع |
الجدول 1: سجل النظام لتقييم دالة الإسعافية في الفئران. نظام لتسجيل النقاط (0 – 6) وضعت لتقييم دالة الإسعافية استناداً إلى 3 أنشطة بما في ذلك توقيت هند أطرافهم الدائمة مع الأمامية أيد (0 – 3)، وانتهت دون مساعدة هند أطرافهم الدائمة (0 – 2)، والقدرة على تسلق جدار قفص بلاستيك 17 سم (0-1).
| الصف الكولاجين | |||||
| 0 | الكولاجين الطبيعي الموجه عرضية | ||||
| 1 | تغييرات خفيفة مع ألياف الكولاجين أقل من 25% غير منظم | ||||
| 2 | مشوش تغيرات معتدلة مع ألياف الكولاجين بين 25% و 50% | ||||
| 3 | تغييرات ملحوظة مع الكولاجين أكثر من 50% غير منظم | ||||
| درجة من الأوعية | |||||
| 0 | تسلل معتدلة من الأنسجة مع الشرايين | ||||
| 1 | وجود الشعيرات الدموية | ||||
| 2 | لا يوجد تسلل المفرج | ||||
| تشكيل الغضروف | |||||
| 0 | لا يوجد تكوين الغضروف | ||||
| 1 | العقيدات معزولة هيلين الغضروف | ||||
| 2 | تشكيل غضروف معتدلة من 25% إلى 50% | ||||
| 3 | تكوين الغضروف واسعة النطاق، وأكثر من 50% مجال المشاركة | ||||
الجدول 2: علم الأنسجة وسجل الدرجات. تم تصنيف درجة النسيجي من المقاطع استناداً إلى الصف الكولاجين، درجة من الأوعية، وتشكيل الغضروف (مقتبس من روزنباوم et al. 39)
| المجموعة | يعني ± ووزارة شؤون المرأة |
| عادي (n = 3) | 6.00 ± 0.48 |
| 7 أيام بعد الجراحة (n = 8) | 2.25 ± 0.30 |
| 28 يوما بعد الجراحة (n = 12) | 5.83 ± 0.24 |
الجدول 3: الدرجات الوظيفية العادي الجرذان والفئران غير المعالجة- تم تصنيف الدرجات الوظيفية العادي الجرذان والفئران غير المعالجة 7 و 28 يوما بعد. n = عدد من الفئران.
التكميلية الرقم 1: النابضة استراتيجية ومثال للتعبير علامة السطحية: تم استبعاد الحطام على أساس الصغيرة منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب (A). الخلايا الحية اختيرت استناداً إلى تلطيخ السلبية مع الكشف عنها بواسطة FL3 عاد 7 (ب). ايستب تحكم المتطابقة (ج) استخدمت كمراقبة سلبية لإنشاء بوابة فيتك CD44 الإيجابية الخلايا (د).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلايا الخيول اختيرت لهذا المشروع لأننا نعتزم في نهاية المطاف لاختبار نهج المرشح في إدارة تيندينوباثيس الطبيعية في الخيول. في الواقع، إصابات وتر في الخيول جذابة كنماذج طبيعية من تيندينوباثي في الرجل بسبب التشابه البيولوجي بين الخيول المثنية الرقمية سطحية والعرقوب في البشر41. تم اختيار السطح علامات خلية CD44، CD90، CD105، CD34، والثاني MHC إيمونوفينوتيبينج خلايا، وفقا للمعايير التي أوصت بها "الجمعية الدولية" "العلاج الخلوي"42. في دراسة أجريت مؤخرا، تم اكوكم MSCs ل CD44 الإيجابية والسلبية CD34 والثاني MHC، بغض النظر عن ظروف الثقافة. الخلايا المزروعة تحت ظروف قياسية كانت أيضا إيجابية ل CD90 و CD105، وبالتالي الوفاء بالمعايير ل MSCs من حيث التعبير عن علامات السطحية. بالإضافة إلى ذلك، أن هذه الدراسة هي أول تقرير عن تشكيل الماغنيسيوم عندما تستزرع اكوكم-MSCs على الفيلم الشيتوزان، تؤكد التقارير السابقة بشأن البشرية MSCs19،20. تم استكشاف تقنيات استزراع خلية 3D على نطاق واسع على مدى عقود تهدف إلى خلق بيئة تشبه مكانة الفسيولوجية. وفي الواقع، أظهرت هذه الدراسة مستويات التعبير الجيني ستيمنيس تحسين Oct4، Sox2، و نانوج، وتمايز تحسين المحتملة، وهو ما يتسق مع سائر التقارير19،20. وأفادت الآخرين immunomodulatory تحسين خصائص43 والغضاريف هيلين التجدد44 استخدام MSCs الماغنيسيوم. بين ثقافة 3D تقنيات مختلفة مثل قوارير زر الزيادة والنقصان، وتتولى الخلية المفاعلات الحيوية، لوحة غير ملتصقة، مصفوفات الطبيعية والاصطناعية، وأفلام الشيتوزان تبدو جذابة لعدة أسباب. وهذا النهج لا تتطلب معدات باهظة الثمن وفعالة من حيث التكلفة مقارنة بلوحات غير ملتصقة بمصفوفات الاصطناعية، منذ الشيتوزان هو منتج ثانوي لصناعة المأكولات البحرية. استزراع الخلايا في الأفلام الشيتوزان السهل من الناحية الفنية. جنبا إلى جنب، سوف تسمح هذه المزايا التطبيق السريري على نطاق واسع45.
نموذج وتر الرضفة الثنائية المقترحة هنا يبدو مقبولاً من حيث الإصابة بالأمراض. ولوحظ في دراسة أجريت مؤخرا دراسة لا مضاعفات. أننا نشعر بالقلق لا سيما إزاء خطر المجهدة الآثار الناجمة عن عيوب كبيرة بما يكفي السماح بتغيير النشاط الحيوي وغذائها قابلة للاكتشاف. ودفعت هذه الشواغل اختيار الفئران على الفئران لهذه الدراسة استناداً إلى الدراسات السابقة المتعلقة بالحجم والنضج الوتر لنماذج الإصابة السريرية. قد وصفت 'عيب نافذة' أو عيب وتر الرضفة الوسطى الثالثة في الأرانب46 والفئران30،31 دراسة شفاء الأربطة والتعزيز. وقد وجد وتر الرضفة نموذج 'عيب نافذة' استنساخه لدراسة إصلاح وتر في الفئران مع علم الأنسجة31،39، النشاط الحيوي اختبار30،31، والأسفار السابقين فيفو 31من التصوير. في هذه الدراسة، حجم العيب يعادل ثلث وتر الرضفة الوسطى، وكانت موحدة مع أسلاك كيرشنر 0.99 ملم-قطر كقالب. وكانت هذه الأبعاد كافية لدراسة وتر الشفاء دون أن تسبب تمزق بعد العمليات الجراحية. بسبب حجمها التشريحية أكبر مقابل الفئران، الجرذان يمكن أن تستوعب أكبر العيوب، وتحسين إمكانية تكرار نتائج الإصابات وتقديم العلاج والتدابير من نتائج.
البروتوكول التسكين تدار على الفئران في هذه الدراسة كانت فعالة في السيطرة على الألم بعد العمليات الجراحية، كما تقيم مع37،RGS38. واختير هذا سجل النظام هنا نظراً لأنه تم التحقق من صحة سابقا كالكشف عن التغيرات السلوكية بعد العمليات الجراحية التي تعكس الألم في الفئران37،38. ويستند RGS علامات بسيطة نسبيا لتحديد، مثل تشديد المداري وتسطيح الآنف/الخد والإذن/الخط الطولي التغييرات. كما تحتفظ الفئران تناول الطعام عادي في جميع أنحاء هذه الدراسة، التي تؤيد زيادة فعالية هذا البروتوكول التسكين. وفي الواقع، وجدت التقارير السابقة ارتباط بين الألم بعد العمليات الجراحية وتغيرات وزن الجسم في الفئران المعالجة بمضادات الالتهاب غير الستيرويدية، مثل ميلوكسيكام47. واختير هذا العامل في هذه الدراسة والإدارة الاستباقية مستمدة من دراسات في الفئران37،48 والكلاب49، حيث تم العثور على إدارة العوامل المضادة للالتهابات قبل الجراحة مباشرة إلى تخفف الألم المستحث جراحيا. وجرى تقييم الدالة كمؤشر إضافي للألم بعد العمليات الجراحية، واستخدام نظام لتسجيل النقاط الرامية إلى تقييم استخدام كلا أطرافه الحوض. الأنشطة الثلاثة المحددة هنا تقديم تقييم عام لنطاق الحركة واستعدادها لتحمل الوزن على أطرافه الحوض. سجل هذا النظام مستمد من كلتا الدراستين الانتعاش وظيفية والدينامية في الفئران50،51 وصمم لمقارنة مسار الوقت النتائج الوظيفية ولاحظ. علامات تشير إلى أن العيب وتر الثنائية التي يسببها انخفاض مؤقت في وظيفة في 7 أيام، مع عودة إلى وضعها الطبيعي في غضون 28 يوما. نقاط دالة يظهر أكثر حساسية في اكتشاف الألم الثانوي لشروط العظام من RGS. استخدمت اختبارات وظيفية مماثلة لتقييم وتر الشفاء مثل "الفهرس الوظيفية أخيل"28ومخلب وواسعة التدابير51، أو نظم أخرى العيانية سجل52.
تم تصميم هذا النموذج لتقليل عدد الحيوانات الملتحقين بالدراسة، مع التمييز بين النتائج بين الأوتار غير المعالجة واثنين من العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. وتناقش في منشور آخر36آثار المعالجات اختبرت في هذه الدراسة. النموذج المستخدم هنا يسمح بالكشف عن الاختلافات العلاج عن طريق استخدام رقابة داخلية في كل الفئران، جنبا إلى جنب مع اختبار النشاط الحيوي غير مدمرة للأوتار في 28 يوما (البيانات غير المعروضة هنا).
واختير البلازما مكيفة المنشط بسبب استخدامها المشترك كناقل للخلايا الجذعية، وتوافق مع الحياة، وإمكانية الوصول، والتطبيقات السريرية الحالية في إدارة تيندينوباثيس53،54. قد ساهمت شفاء الأوتار المعالجة، ولكن سمح المحلية الاحتفاظ بالخلايا الجذعية، وأنها لا تتداخل مع المقارنة بين مجموعات العلاج، منذ سواء شملت نفس الكمية من البلازما مكيفة المنشط. ميزات النسيجي الأوتار غير المعالجة تتسق مع الأوصاف السابقة لوتر الشفاء، حيث أنسجة نخرية وحزم الكولاجين تعطلت تتم إزالة البلعمه والأنزيمات الحال التي الضامة أثناء مرحلة الالتهاب، الذي يستمر لفترة تصل إلى 10 أيام بعد إصابة54،،من5556. خلال المرحلة التكاثري، انتشار الهاتف الخلوي والأوعية الدموية في موقع الإصلاح أعظم في 28 يوما بعد إصلاح وتر57،58. أننا وجدنا علاقة متبادلة بين سماكة الظاهر الأوتار والمجالات المشتركة بين القطاعات، وانخفاض معامل مرونة بالنسبة للعينات. وبناء على هذه النتائج، يبدو النتيجة النسيجي تعكس التغييرات الأنسجة التي قد لا تكون مرغوبة ولا تؤدي إلى قوة النشاط الحيوي، مثل اختلال ألياف الكولاجين، والأوعية، وتشوندروجينيسيس. في المستقبل، يمكن تحسين قدرة هذا النموذج على تميز العلاج على أساس الخصائص النسيجي بإدماج معايير إضافية مثل وجود تينوسيتيس، تنظيم المصفوفة خارج الخلية، ومحتوى بروتيوغليكان، و توزيع52،ألياف الايلاستين59.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن ينوه الدكتور سو، دكتوراه، لأن التحليل الإحصائي للبيانات. يشكر المؤلفون أيضا الدكتور مكلور، طبيب بيطري، دكتوراه داكلام، لتقديم المشورة لها في التخدير والألم إدارة البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة. وأيد هذا المشروع المنح المقدمة من "جامعة الصحة الغربية" العلوم مكتب نائب الرئيس للبحث (12678v) وصناديق وزارة الزراعة قسم 1433 (2090).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
- Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
- Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
- Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
- Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
- Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
- Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
- Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
- VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
- Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
- Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
- Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
- Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
- Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
- Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
- Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
- Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
- Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
- Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
- Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
- van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
- Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
- Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
- Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
- Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
- Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
- Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
- Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
- Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
- Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
- Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
- Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
- Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
- Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
- Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
- Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
- Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
- Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
- Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
- Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
- Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
- Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
- Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
- Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
- Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
- Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
- Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
- Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
- Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
- Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
- Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).
