Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

चूहों में एक द्विपक्षीय Patellar पट्टा चोट मॉडल में स्टेम सेल चिकित्सा का मूल्यांकन

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56810
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

Summary

इस पत्र की तैयारी और नाल कॉर्ड मैट्रिक्स के मूल्यांकन का वर्णन-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम एक चूहे में एक द्विपक्षीय patellar पट्टा दोष मॉडल के साथ spheroids कोशिकाओं । यह मॉडल एक स्वीकार्य रुग्णता के साथ जुड़ा हुआ था और अनुपचारित और इलाज tendons के बीच मतभेदों का पता लगाने के लिए पाया गया था, और दो उपचार के बीच का परीक्षण किया ।

Abstract

अपक्षयी चिकित्सा शर्तों है कि पारंपरिक उपचार चुनौती के लिए उपंयास विकल्प प्रदान करता है । प्रसार और प्रजातियों के पार tendinopathy की रुग्णता, इस ऊतक के सीमित चिकित्सा गुणों के साथ संयुक्त, सेलुलर चिकित्सा के लिए खोज के लिए प्रेरित किया और प्रयोगात्मक मॉडल के विकास के लिए उनके प्रभावकारिता का अध्ययन चालित । नाल कॉर्ड मैट्रिक्स-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम सेल (UCM-एमएससी) अपील उंमीदवारों क्योंकि वे प्रचुर मात्रा में हैं, इकट्ठा आसान कर रहे हैं, नैतिक चिंताओं और teratoma गठन के जोखिम को दरकिनार, अभी तक आदिम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से भी अधिक निकटता से मिलता जुलता वयस्क ऊतक-व्युत्पंन MSCs । महत्वपूर्ण ब्याज अंडाकार आकृति गठन के माध्यम से MSCs के गुणों को बढ़ाने के लिए एक रणनीति के रूप में chitosan पर ध्यान केंद्रित किया है । इस कागज विवरण तकनीक UCM-MSCs को अलग करने के लिए, chitosan फिल्म पर spheroids तैयार है, और सतह मार्कर अभिव्यक्ति पर अंडाकार आकृति गठन के प्रभाव का विश्लेषण । नतीजतन, चूहों में एक द्विपक्षीय patellar पट्टा चोट मॉडल के निर्माण के लिए vivo आरोपण में वर्णित है UCM-MSC chitosan फिल्म पर गठित spheroids. कोई जटिलता अध्ययन में रुग्णता के संबंध में देखा गया था, तनाव बढ़ते प्रभाव, या ऊतक संक्रमण. 7 दिनों में संचालित चूहों का कुल कार्यात्मक स्कोर सामान्य चूहों की तुलना में कम था, लेकिन सर्जरी के बाद 28 दिनों के भीतर सामान्य करने के लिए लौट आए. ऊतक चिकित्सा के ऊतकवैज्ञानिक स्कोर इलाज दोष में एक थक्का की उपस्थिति की पुष्टि 7 दिनों में मूल्यांकन, विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया के अभाव, और 28 दिनों में चिकित्सा प्रगति. इस द्विपक्षीय वुटने पट्टा दोष मॉडल एक चूहे में एक आंतरिक नियंत्रण के निर्माण के द्वारा अंतर व्यक्तिगत भिंनता नियंत्रण, स्वीकार्य रुग्णता के साथ जुड़ा हुआ था, और अनुपचारित tendons और उपचार के बीच मतभेदों का पता लगाने की अनुमति दी ।

Introduction

पट्टा चोट1प्रजातियों में महत्वपूर्ण दर्द और मांसपेशी शोष के सबसे आम कारणों में से एक है । पशु चिकित्सा, पट्टा और बंध चोटों में घोड़ों में विशेष रुचि के हैं, के रूप में दौड़ घोड़ों में सभी चोटों के 82% पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस प्रणाली शामिल है, और उन के 46% tendons और बंधनों को प्रभावित2,3। निशान ऊतक गठन चंगा tendons की यांत्रिक गुणों को प्रभावित करता है और फ्लेक्स पट्टा चोटों के बाद पुष्ट उपयोग करने के लिए वापसी के लिए पहरा पूर्वानुमान बताते हैं; फिर से चोट 2 साल के भीतर तक में होता है 67% तक के घोड़ों का इलाज रूढ़िवादी4। अपक्षयी चिकित्सा एक शर्त है कि पारंपरिक उपचार चुनौतियों के लिए उपंयास विकल्प प्रदान करता है । ऑटोलॉगस स्टेम सेल थेरेपी कुछ उत्साहजनक परिणाम5का उत्पादन किया गया है,6 लेकिन ऊतक संग्रह के साथ जुड़े रुग्णता द्वारा सीमित है, देरी प्रशासन प्रसंस्करण के कारण/ स्टेम सेल7,8के गुणों पर रोगी की स्वास्थ्य स्थिति (जैसे आयु) । इन सीमाओं एक बंद-the-शेल्फ विकल्प के रूप में allogeneic स्टेम सेल की जांच के लिए एक तर्क प्रदान करते हैं । भ्रूण adnexa-व्युत्पंन कोशिकाओं अपील उंमीदवारों क्योंकि वे नैतिक चिंताओं और teratoma भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ जुड़े गठन के जोखिम को दरकिनार कर रहे हैं । भ्रूण adnexa, नाल कॉर्ड मैट्रिक्स (UCM), भी व्हार्टन जेली नाम के बीच में, प्रचुर मात्रा में है और आसानी से इकट्ठा ।

सेल स्रोत की परवाह किए बिना, वृद्धि स्टेम allogenic अपक्षयी दवा के लिए एक सेल बैंक की स्थापना के लिए आवश्यक है । एक कार्यात्मक दृष्टिकोण से, स्टेम स्व के लिए क्षमता के रूप में परिभाषित किया जा सकता है नवीकरण और बहु वंश भेदभाव9। उपजी के सबूत प्रसार और भेदभाव परख पर निर्भर करता है, जीन मार्करों की अभिव्यक्ति के साथ Oct4, Sox2, और Nanog9। एक रणनीति उपजी को बढ़ाने के लिए शूंय भराव और वाहक प्रसार और UCM-MSCs के भेदभाव को बढ़ाने के रूप में सेवा करने के लिए सामग्री के उपयोग पर निर्भर करता है । यह दृष्टिकोण transcriptional कारकों के हेरफेर के बारे में चिंताओं को समाप्त करने के लिए प्रेरित pluripotent कोशिकाओं में परिपक्व कोशिकाओं reprogram । स्टेम सेल के लिए संभावित वाहक के रूप में माना जाता है, chitosan अपनी असंगति और क्षरण के लिए अपील कर रहा है10। इस प्राकृतिक aminopolysaccharide काइटिन, दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में प्राकृतिक polysaccharide, मुख्य रूप से शंख के एक उपउत्पाद के रूप में प्राप्त की alkaline deacetylation द्वारा गठित है10। हम पहले MSCs और chitosan पाड़ों के बीच बातचीत की जांच की है, और spheroids के गठन मनाया11,12,13,14,15, 16. हमने chondrogenesis की श्रेष्ठता पर भी सूचना दी chitosan मैट्रिक्स12,13,14,15,16,17, 18. हाल ही में, दो स्वतंत्र अध्ययन वसा ऊतक और नाल ऊतक MSCs एक chitosan फिल्म19,20पर प्रसंस्कृत व्युत्पंन द्वारा spheroids गठन वर्णित है । spheroids के इस गठन से न केवल तना बढ़ाया, बल्कि vivo आरोपण20 में के बाद स्टेम कोशिकाओं की अवधारण में सुधार हुआ ।

प्रजातियों के प्रसार और tendinopathy की रुग्णता प्रयोगात्मक मॉडल के विकास के लिए tendinopathies के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए प्रेरित किया है और ऐसे स्टेम सेल इंजेक्शन के रूप में नए उपचारों का परीक्षण । घोड़ों में, collagenase-प्रेरित tendonitis एक आम के लिए एक सामांय मॉडल को प्रदर्शित करने के लिए है tendons मरंमत21में MSCs का उपयोग कर । इस दृष्टिकोण की प्रासंगिकता सीमित है, के रूप में इंजेक्शन तीव्र भड़काऊ परिवर्तन का कारण है, जबकि नैदानिक tendinopathies आमतौर पर जीर्ण आरै22,23से परिणाम । इसके अलावा, tendons रोग के रासायनिक प्रेरण एक चिकित्सा प्रतिक्रिया लाती है और बिगड़ा चिकित्सा नैदानिक मामलों में मौजूद प्रक्रिया को दोहराने नहीं22,23। सतही डिजिटल फ्लेक्स पट्टा के एक खंड के उत्पाद के घोड़ों में tendonitis के एक शल्य चिकित्सा मॉडल के रूप में वर्णित किया गया है24। हाल ही में, एक ंयूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण को सतही डिजिटल फ्लेक्स पट्टा25के केंद्रीय कोर को दर्दनाक नुकसान को सीमित किया गया । सर्जिकल मॉडल थकान तंत्र है कि प्राकृतिक पट्टा रोग के लिए नेतृत्व कर सकते है अनुकरण नहीं करते हैं, और नुकसान की हद में reproducibility कमी के लिए करते है25बनाया । मॉडल की परवाह किए बिना, रुग्णता और लागत tendons रोगों के घोड़े के मॉडल के साथ जुड़े अतिरिक्त सीमाएं हैं, जो एक पहले कदम के रूप में कुतर मॉडलों में रुचि का औचित्य साबित करने के उपंयास चिकित्सा का मूल्यांकन vivo में ।

कुतर में प्रयोगात्मक मॉडलों का मुख्य लाभ में से एक लागत और अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने की क्षमता के होते हैं । मूषक को उनकी तीव्र वृद्धि दर और अपेक्षाकृत कम जीवन काल के कारण विभिन्न शारीरिक कारकों के संबंध में मानकीकृत किया जा सकता है, भिन्नता के स्रोतों को सीमित करना और इसलिए मतभेदों का पता लगाने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करना. रणनीतियों कुतर में tendons रोगों को प्रेरित करने के लिए रासायनिक प्रेरण पर भरोसा किया है, लेकिन यह भी आंशिक पट्टा दोष के सर्जिकल निर्माण पर21। सर्जिकल मॉडल प्राकृतिक tendinopathies रासायनिक मॉडलों की तुलना में बेहतर अनुकरण कर सकते हैं, लेकिन उच्च रुग्णता और क्षतिग्रस्त पट्टा की भयावह विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उस संबंध में, चूहों इन मॉडलों के लिए चूहों से बेहतर उम्मीदवार लगते हैं, के रूप में उनके आकार बड़ा दोष के निर्माण की अनुमति देता है, जिससे ऊतक उपचार के मूल्यांकन की सुविधा. Sprague-Dawley चूहों चार प्रमुख tendons समूहों में tendinopathies के प्रायोगिक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है: रोटेटर कफ, फ्लेक्स, दुखती, और patellar tendons26. इन के अलावा, patellar पट्टा शामिल मॉडल विशेष रूप से इस पट्टा के बड़े आकार की वजह से अपील कर रहे है और यह तक पहुंचने की आसानी27। patellar पट्टा टिबियल tuberosity को quadriceps मांसपेशी देते हैं । इस प्रसारक तंत्र के भीतर, वुटने एक sesamoid हड्डी है कि quadriceps की कार्रवाई का निर्देशन और रूपरेखा बनाती पट्टा के समीपस्थ हद patellar है । समीपस्थ और patellar पट्टा के बाहर की सीमा पर बोनी लंगर की उपस्थिति यांत्रिक परीक्षण की सुविधा । patellar पट्टा शामिल मॉडल आम तौर पर एकतरफा शल्य दोष पर भरोसा करते हैं, एक contralateral बरकरार एक नियंत्रण28,29के रूप में सेवारत पट्टा के साथ । सबसे आम patellar पट्टा दोष मॉडल टिबियल tuberosity के सम्मिलन के लिए वुटने के बाहर शीर्ष से केंद्रीय भाग (चौड़ाई में 1 मिमी) patellar पट्टा की एक्साइज शामिल है, जबकि contralateral patellar पट्टा बरकरार छोड़ दिया है । परिणामों के उपाय प्रोटोकॉल, गैर विनाशकारी यांत्रिक परीक्षण या विफलता के लिए यांत्रिक परीक्षण, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग, पूर्व vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग, सकल अवलोकन, और कार्यात्मक परीक्षणों को शामिल किया है28,30 ,31. एकतरफा मॉडल एक ही जानवर के भीतर एक समान चोट के रूढ़िवादी प्रबंधन के साथ एक प्रस्तावित उपचार की तुलना की अनुमति नहीं है । इसी तरह, कई उपचार के बीच तुलना अलग जानवरों की आवश्यकता है । एक द्विपक्षीय मॉडल अंतर व्यक्तिगत रूपों को खत्म करने और एक अध्ययन के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करेगा32। हालांकि, द्विपक्षीय चोटों रुग्णता में वृद्धि हो सकती है, और द्विपक्षीय लंगड़ा उपचार मूल्यांकन में बाधा सकता है । कुछ अध्ययनों से संक्षिप्त में द्विपक्षीय patellar पट्टा दोष के उपयोग की रिपोर्ट चूहों में लेकिन उपचार के बजाय पेरि से ऑपरेटिव प्रबंधन और मॉडल की रुग्णता पर ध्यान केंद्रित33,34.

इस अध्ययन के दीर्घकालिक लक्ष्य के लिए एक रणनीति विकसित करने के लिए स्टेम में सुधार और UCM के अस्तित्व में vivo -MSCs allogenic ट्रांसप्लांटेशन के लिए किस्मत में है । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम हाल ही में सुधार की सूचना दी है UCM-MSCs के गठन के द्वारा chitosan फिल्म और hypoxic पर्यावरण के तहत मशीन पर spheroids की35। इन विट्रो में गुण सुधार patellar पट्टा के यांत्रिक गुणों के साथ जुड़े थे कंडीशन्ड UCM-MSCs के साथ इलाज दोष । इन परिणामों के आधार पर, चूहे द्विपक्षीय patellar पट्टा दोष मॉडल परीक्षण उंमीदवार के लिए उपयुक्त लगता है पट्टा के लिए उपचार36चोटों । अध्ययन के प्रयोजन के लिए यहां की रिपोर्ट अलगाव और UCM के लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल-MSCs, स्टेम सेल, निर्माण और द्विपक्षीय वुटने पट्टा दोषों के उपचार के लिए एक जीवविज्ञान वितरण प्रणाली की तैयारी, और बाद ऑपरेटिव प्रदान करना है वसूली और दोषों के भीतर ऊतक उपचार के मूल्यांकन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां बताए गए सभी तरीकों को वेस्टर्न यूनिवर्सिटी ऑफ हेल्थ साइंसेज के संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (IACUC) ने मंजूरी दी है ।

1. अलगाव और घोड़े की नाल गर्भनाल मैट्रिक्स से MSCs का विस्तार

  1. एक वयस्क घोड़ी से अपरा प्राप्त करें (गर्भवती) के बाद मनाया foaling और aseptically नाल से गर्भनाल अलग । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% पेनिसिलिन-streptomycin (पी/एस) के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में गर्भनाल रखने के प्रसंस्करण तक स्थानांतरण के दौरान ।
  2. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 1% पी के साथ कमरे के तापमान पंजाबियों के साथ दो बार गर्भनाल धो लो । धारा में गर्भनाल 2 इंच लंबे टुकड़े पर 150 मिमी प्लेट और धोने के साथ कमरे के तापमान में 1% P/S के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब दो या तीन बार, जब तक रक्त का सबसे बाहर कुल्ला है ।
  3. गर्भनाल longitudinally काटने के लिए वाहिकाओं का पर्दाफाश । 2 धमनियों, एक नस, और संदंश और कैंची का उपयोग कर गर्भनाल से एक allantoic डंठल सहित जहाजों, निकालें । नाल गर्भनाल मैट्रिक्स (व्हार्टन जेली) है, जो जेली की तरह मैट्रिक्स के आसपास के जहाजों, एक स्केलपेल के साथ scraping द्वारा एक 150 मिमी प्लेट पर, और ठीक टुकड़ों में जेली कीमा लीजिए ।
  4. प्लेस व्हार्टन की जेली से 2-3 गर्भनाल टुकड़े (लगभग 12-15 ग्राम) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 0.1% की 15 मिलीलीटर के साथ (डब्ल्यू/collagenase प्रकार आइए पंजाब में समाधान । 3-4 घंटे के लिए भंग जब तक कोमल झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  5. 15 मिनट और महाप्राण supernatant के लिए 300 x जी में पचा ऊतक केंद्रापसारक । 1% P/S, pipetting द्वारा मिश्रण के साथ कमरे के तापमान 15 मिलीलीटर में पचा ऊतक reसस्पेंड, 5 मिनट के लिए 150 x g पर केंद्रापसारक, और महाप्राण supernatant (धो) । दोहराएं और दो बार धोने ।
  6. 1% पी के साथ कमरे के तापमान पंजाब के 15 मिलीलीटर में धोया कोशिकाओं reसस्पैंड, pipetting द्वारा मिश्रण, तनाव से 100 µm सेल छलनी के साथ, 5 मिनट के लिए 150 x जी पर केंद्रापसारक, और महाप्राण supernatant ।
  7. कम ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से (एलजी-DMEM) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पी के साथ मिश्रण द्वारा संस्कृति मध्यम (सेमी) तैयार करें निस्पंदन द्वारा माध्यम निष्फल ।
  8. सेमी पूर्व-37 डिग्री सेल्सियस, pipetting द्वारा मिश्रण, एक 25 सेमी2 ऊतक संस्कृति कुप्पी, और 5% CO2 में 90% आर्द्रता और ३७.० डिग्री सेल्सियस पर में करने के लिए गर्म के 10 मिलीलीटर में तनावपूर्ण कोशिकाओं reसस्पेंड । परिवर्तन मुख्यमंत्री हर 3 दिन तक संस्कृति 70-80% संगम तक पहुंचती है, जब संस्कृति का मार्ग होगा ।
  9. संस्कृति पारित करने के लिए, कुप्पी से महाप्राण सेमी, दो बार कमरे के तापमान के 5 मिलीलीटर के साथ धोने, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin/ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर के साथ अलग ।
  10. trypsin/EDTA बेअसर सेमी पूर्व के 6 मिलीलीटर के साथ ३७.० ° c के लिए गरम, pipetting द्वारा मिश्रण, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण, 5 मिनट के लिए 150 x जी पर केंद्रापसारक, और महाप्राण supernatant । सेमी की 1 मिलीलीटर में अलग कोशिकाओं reसस्पेंड, pipetting द्वारा मिश्रण । trypan नीले और hemocytometer का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती । 5,000 कोशिकाओं में एक 25 सेमी2 ऊतक संस्कृति कुप्पी में फिर से बीज/, और 5% सह में2 मशीन 90% आर्द्रता और ३७.० डिग्री सेल्सियस पर ।

2. Chitosan फिल्मों पर UCM-MSCs कल्चरल के साथ Spheroids की तैयारी

  1. 1% (w/v) chitosan समाधान के 100 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, आसुत जल (डीएच2O) के 99 मिलीलीटर में chitosan के 1 g जोड़ें, और एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ अच्छी तरह से मिश्रण ।
  2. हिमनदों एसिटिक एसिड के 670 µ एल जोड़ें और chitosan भंग जब तक मिश्रण जारी है और चिपचिपा हो जाता है । यह आमतौर पर 3-4 एच लेता है ।
  3. 12 की एक अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में chitosan समाधान के 500 µ एल जोड़ें, और थाली भंवर समान रूप से chitosan समाधान वितरित करने के लिए और नीचे की सतह के सभी कवर ।
  4. 24 घंटे के लिए रात भर कवर के बिना लामिना फ्लो कैबिनेट के तहत chitosan समाधान लेपित प्लेट सूखी । एक बार सूख जाने पर पतली फिल्म बनाई जाएगी और थाली का पालन किया जाएगा ।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए गर्मी में 0.5 N सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़कर chitosan फिल्म बेअसर । महाप्राण एक अच्छी तरह से NaOH और डीएच के 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लें2O तीन बार । एक बार 70% इथेनॉल (ेतोः) के 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लें ।
  6. chitosan फिल्म को निष्फल करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से 70% ेतोः के 1 मिलीलीटर जोड़ें और लामिना फ्लो कैबिनेट में रातोंरात गर्मी । अगले दिन में प्रत्येक कुआं से महाप्राण शेष ेतोः । तीन बार बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । एक कवर के बिना रात भर लामिना प्रवाह कैबिनेट के तहत पराबैंगनी प्रकाश के साथ chitosan फिल्म निष्फल ।
  7. UCM-MSCs के spheroids बनाने के लिए, बीज विस्तारित और मार्गीय कोशिकाओं में एक अच्छी तरह से 5,000 कोशिकाओं पर/cm2, और 5% CO2 में 90% आर्द्रता और ३७.० ° c में मशीन ।
    नोट: कोशिकाओं हाइपोक्सिया या normoxia के तहत, अंवेषक के हित के आधार पर किया जा सकता है ।

3. सतह मार्करों की अभिव्यक्ति प्रवाह Cytometry के माध्यम से विश्लेषण

  1. सिंगल सेल के निलंबन की तैयारी
    1. स्टैंडर्ड प्लेट
      1. एक अच्छी तरह से मध्यम निकालें और कमरे के तापमान पंजाबियों के साथ दो बार धो लो ।
      2. कक्ष के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए एक 12-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से एक सेल पृथक्करण रिएजेंट के 500 µ एल के साथ कोशिकाओं को अलग ।
      3. गर्मी के बाद, एक अच्छी तरह से और मिश्रण करने के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए pipetting से धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर (BSA 0.5% युक्त पंजाब) जोड़ें ।
      4. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण सेल सस्पेंशन और 5 मिनट के लिए 150 x g पर केंद्रापसारक ।
    2. Chitosan प्लेट
      1. aspirating माध्यम से एक 1,000 µ एल टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके सभी spheroids लीजिए । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एकत्र मध्यम स्थानांतरण । माध्यम इकट्ठा करने के बाद, पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़कर अच्छी तरह से धोने, और उसी 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में धोया पंजाबियों हस्तांतरण ।
      2. 5 मिनट के लिए 150 x g पर spheroids केंद्रापसारक और supernatant निकालें ।
      3. सेल पृथक्करण रिएजेंट के 500 µ एल जोड़ें (उदा, accutase) और कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए मशीन । spheroids अलग कर देना तक एक 1 मिलीलीटर टिप का उपयोग कर pipetting द्वारा मिक्स और अब दिखाई नहीं दे रहे हैं ।
      4. एक सेल निलंबन में धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 150 x जी पर केंद्रापसारक ।
  2. वाशिंग सेल
    1. शंकु ट्यूब से supernatant निकालें और ठंड धुंधला बफर के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । इस कदम से प्रयोग भर में बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
    2. 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक (धुलाई) ।
    3. दो बार धो लें ।
  3. धुंधला कोशिकाओं
    1. 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक और supernatant निकालें ।
    2. एक trypan नीले और hemocytometer का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती । फिर से निलंबित 1 एक्स 106 कोशिकाओं 50 µ एल में बफर अवरुद्ध (10% हार्स सीरम युक्त पंजाबियों) और बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    3. जोड़ें 10 µ l fluorescein isothiocyanate (FITC) संयुग्मित एंटीबॉडी (CD44, CD90, CD105, CD34, मेजर histocompatibility परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय, या isotype नियंत्रण प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए) और दाग बफर के 40 µ एल, तो बर्फ पर 1 एच के लिए प्रकाश से रक्षा की मशीन.
    4. ठंड धुंधला बफर और मिश्रण के 3 मिलीलीटर जोड़ें, 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक, और महाप्राण supernatant (धुलाई) ।
    5. दो बार धुलाई दोहराएं ।
    6. फिर से धुंधला बफर के 0.5 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित
    7. जोड़ें 5 µ 7 के एल-AAD (व्यवहार्यता डाई) और बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन
    8. प्रवाह cytometer द्वारा सना हुआ सेल नमूनों का विश्लेषण । उनके छोटे एसएससी और FSC द्वारा मलबे को बाहर निकालें, और 7-AAD के निचले के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की पहचान । प्लाट FL1 व FL2 पर क्रमशः वाय-व x अक्षित करें । कर्ण रेखा के ऊपर एक फाटक बनाने के लिए isotype नियंत्रण का उपयोग करें । क्षेत्र में सकारात्मक रूप से सना हुआ कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने । न्यूनतम 20,000 घटनाओं/नमूना (अनुपूरक आंकड़ा 1) को गिनना ।
    9. गेटिंग व्यवहार्य कोशिकाओं और ऑटो प्रतिदीप्ति द्वारा एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने, और isotype नियंत्रण के साथ दाग कोशिकाओं का प्रतिशत घटाना ।

4. द्विपक्षीय Patellar चूहा में पट्टा दोष मॉडल

  1. Select Sprague-Dawley चूहों (वयस्क पुरुष, 4 – 5 महीने की उम्र, शरीर का वजन 350 – 375 ग्राम). इस मॉडल के लिए इस्तेमाल चूहों के अपेक्षाकृत बड़े आकार नोट करें ।
  2. Anesthetize और लागू कृत्रिम नेत्र स्नेहक 2 एल में 8% sevoflurane के साथ चूहे/100% ऑक्सीजन मास्क के माध्यम से दिया, जब तक प्रेरण कक्ष में चुटकी पैर पलटा के गायब हो ।
  3. प्रशासन रिक्तिपूर्व analgesia के रूप में Meloxicam के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (1 मिलीग्राम/
  4. दो 0.5 एल पानी गर्म पानी से भरी बोतलों के बीच चूहे प्लेस और एक कपड़े से कवर करने के लिए शरीर का तापमान और स्थिति को बनाए रखने, जबकि त्वचा की चोट को रोकने । टेप प्रत्येक उग्रवाद की मेज पर । हाइपोथर्मिया के जोखिम को कम करने के लिए, बुलबुला लपेटो के साथ शरीर को कवर (चित्रा 1) ।
  5. 1 एल में 5% sevoflurane के सतत प्रवाह के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने नाक शंकु के माध्यम से 100% ऑक्सीजन मिश्रण, पानी हीटिंग पैड पर पृष्ठीय recumbency पर जानवर के साथ ।
  6. त्वचा आघात से बचने के लिए, शल्य साइटों क्लिप नहीं है । इसके बजाय, दोनों दबाना पर हेयर रिमूवर क्रीम लागू करें । क्रीम और बालों को हटाने के लिए एक जीभ पटाने का प्रयोग करें ।
  7. chlorhexidine digluconate सफ़ाई के साथ सर्जिकल साइट साफ़ करें, और 70% इथेनॉल के साथ 3 बार कुल्ला ।
  8. Incise के craniomedial पहलू पर, बाहर की दिशा में एक समीपस्थ में बाँझ #15 स्केलपेल ब्लेड के साथ त्वचा को दबाना । वुटने के स्तर के लिए 1 सेमी समीपस्थ के बारे में चीरा शुरू, और यह लगभग 5 मिमी टिबियल tubercle के लिए बाहर का विस्तार ।
  9. त्वचा को प्रतिबिंबित करने के लिए एक #15 स्केलपेल ब्लेड के साथ अंतर्निहित चमड़े के नीचे ऊतक मुक्त द्वारा patellar पट्टा बेनकाब ।
  10. स्केलपेल ब्लेड #15 का उपयोग करना, टिबियल tuberosity के लिए वुटने के बाहर के पहलू से प्रत्येक patellar पट्टा (1 मिमी) के मध्य तीसरे आबकारी ।
    1. प्रत्येक अंग में दोष के आकार को मानकीकृत करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पट्टा के खिलाफ एक 0.99 मिमी व्यास Kirschner तार संरेखित (चित्रा 2).
    2. एक #15 स्केलपेल ब्लेड के साथ Kirschner तार के प्रत्येक पक्ष पर 2 पूर्ण मोटाई चीरा बनाने के लिए पट्टा के केंद्रीय भाग को अलग (चित्रा 3) । मध्य धारा को समीपस्थ और ठीक आइरिस कैंची (चित्रा 4) के साथ विच्छेदन.
    3. प्रावरणी को दबाना बंद करने से पहले, उपयुक्त उपचार समूहों के लिए थक्का (मिश्रित सेल सस्पेंशन और ACP) डालें जैसा कि 5.5 में बताया गया है । एक cruciate पैटर्न और एक intradermal के साथ त्वचा को 5-0 polyglactin 910 टांके (चित्रा 5) का उपयोग कर पैटर्न के साथ प्रावरणी बंद करो ।
  11. contralateral दबाना पर प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    नोट: एक दोष बेतरतीब ढंग से एक इलाज के लिए सौंपा है (स्टेम कोशिकाओं chitosan पर वातानुकूलित या मानक प्लेटों पर कल्चरित). contralateral दोष खाली छोड़ दिया है, आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए ।
  12. सर्जरी के बाद, enrofloxacin के 4 गोलियाँ (2 मिलीग्राम/गोली, मौखिक रूप से, एक बार दैनिक) और meloxicam की एक गोली (2 मिलीग्राम/गोली, मौखिक रूप से, एक बार दैनिक) 7 दिनों के लिए । इन खुराकों एक प्रयोगशाला पशु पशुचिकित्सा द्वारा सिफारिश की और IACUC प्रोटोकॉल में अनुमोदित किया गया ।

5. Patellar पट्टा दोष के भीतर MSCs की डिलिवरी

  1. Anesthetize एक स्वस्थ चूहा जो 2 एल में 8% sevoflurane के साथ patellar पट्टा दोष निर्माण के लिए प्रयोग नहीं किया जाता है/100% ऑक्सीजन मुखौटा के माध्यम से दिया है, जब तक प्रेरण कक्ष में चुटकी पैर पलटा के गायब हो ।
  2. anesthetized Sprague-Dawley चूहा (वयस्क पुरुष, 4-5 महीने पुराने, शरीर का वजन 350-375 ग्राम) से कार्डियक पंचर द्वारा 5 मिलीलीटर रक्त ले लीजिए, एक 5 मिलीलीटर के साथ सिरिंज में एक 20 ग्राम सुई युक्त 1 मिलीलीटर एसिड-साइट्रेट-डेक्सट्रोज (5:1 v/
  3. Euthanize हृदय पंचर और रक्त संग्रह के बाद चूहे, pentobarbital (100 मिलीग्राम/किग्रा) के intracardial इंजेक्शन द्वारा, जबकि एक ही संज्ञाहरण के तहत ।
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 350 x g पर नमूना केंद्रापसारक । स्थानांतरण supernatant और स्टोर aliquots (120 µ एल प्रत्येक) पर-20 ° c उपयोग तक ।
  5. तुरंत vivo आरोपण में से पहले, ऊपर aliquot गल और 0.5 x 106 MSCs के साथ 20 µ एल मिश्रण (या तो 1.9 या 3.1.2.1 से) trypsin/EDTA का उपयोग कर मानक प्लेटों से अलग, या फ्लशिंग द्वारा chitosan प्लेट्स से इकट्ठा (पंजाबियों के साथ/
  6. 10% कैल्शियम क्लोराइड के 6 µ एल जोड़ें (CaCl2) के शेष 100 µ एल के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट के एक अच्छी तरह से प्लाज्मा को सक्रिय करने के लिए और एक थक्का के गठन के लिए प्रेरित (सक्रिय वातानुकूलित प्लाज्मा: एसीपी).
  7. मिश्रण सेल निलंबन (20 µ एल) और एसीपी (100 µ एल) एक थक्का (चित्रा 6) बनाने के लिए । patellar पट्टा दबाना के प्रावरणी बंद करने से पहले बनाया दोष के भीतर थक्का रखें (चरण 4.10.3 देखें) ।

6. कार्यात्मक परिणाम

  1. चूहों मुंह बनाना स्केल (RGS) 37, 38 और प्रत्यारोपण साइटों पर सूजन के आधार पर दर्द के लक्षण के लिए एक दिन में दो बार निगरानी, ।
    नोट: एक स्कोरिंग प्रणाली (0-6) 3 गतिविधियों के आधार पर एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था, forelimbs के साथ समय पर हिंद अंग खड़े सहित समर्थित (0-3), समय पर सहायता प्राप्त हिंद अंग खड़े (0-2), और एक 17 सेमी प्लास्टिक पिंजरे की दीवार पर चढ़ने की क्षमता (0 – 1) ( तालिका 1) ।
  2. दो हिंद अंग के लिए चूहों का मूल्यांकन सुबह में खड़े गतिविधियों और हर समय बिंदु की शाम में एक औसत स्कोर की गणना करने के लिए ।
  3. सफलतापूर्वक दोनों हिंद अंग शीर्ष तक पहुंचने के साथ एक 17 सेमी प्लास्टिक पिंजरे की दीवार पर चढ़ने की क्षमता के लिए चूहों का मूल्यांकन करें ।

7. सकल रूप और Patellar पट्टा के Histopathology

  1. 7 दिन में चूहों Euthanize (सूजन का मूल्यांकन करने के लिए) या 28 दिन (ऊतक चिकित्सा का मूल्यांकन करने के लिए) pentobarbital के intracardial इंजेक्शन द्वारा पोस्ट उपचार (100 मिलीग्राम/8% sevoflurane और 2 एल 100% ऑक्सीजन के साथ संज्ञाहरण के तहत मुखौटा के माध्यम से दिया ।
  2. फसल वुटने-पट्टा-टिबिया tuberosity इकाइयों स्केलपेल और इच्छामृत्यु के बाद कैंची से । patellar पट्टा के अलावा, दबाना के आसपास कोमल ऊतकों और बंधन को हटा दें ।
  3. सकल उपस्थिति के लिए प्रत्येक नमूना की जांच करें और पट्टा के और अधिक मोटा होना (चित्रा 7) ।
  4. ओरिएंट के समीपस्थ और पार्श्व पहलू पर 5.0 Polydioxanone के एक सर्जन की गांठ रखने के द्वारा नमूना पट्टा । 10% तटस्थ बफर formalin समाधान में प्रत्येक नमूना फिक्स और प्रत्येक पट्टा के मध्य भाग से अनुप्रस्थ वर्गों (5 µm) प्राप्त करते हैं ।
  5. hematoxylin और eosin का उपयोग कर वर्गों दाग, और Masson Trichrome मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित धुंधला ।
  6. दोष के भीतर रक्तगुल्म की उपस्थिति, साथ ही सूजन जैसे रोग परिवर्तन का पता लगाने के लिए खंड की जांच करें ।
  7. पहले से प्रकाशित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर वर्गों के ऊतकवैज्ञानिक स्कोर का मूल्यांकन, कोलेजन ग्रेड पर आधारित, angiogenesis की डिग्री, और उपास्थि गठन (तालिका 2)39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, परिणाम के रूप में अर्थ ± एसडी (मानक विचलन) प्रस्तुत कर रहे हैं । कोशिकाओं को 6 mares के गर्भनाल से अलग किया गया, और अलग सेल लाइनों के प्रतिशत मानक या chitosan कंडीशनिंग के तहत प्रत्येक कोशिका सतह मार्कर व्यक्त एक Friedman परीक्षण के साथ तुलना में थे, एक गैर के रूप में दोहराया के साथ विचरण के पैरामीट्रिक विश्लेषण के रूप में उपाय. पट्टा दोष मॉडल निर्माण के लिए, 8 चूहों 7 दिनों के बाद सर्जरी आकलन के लिए इस्तेमाल किया और 12 चूहों 28 दिनों के आकलन के लिए इस्तेमाल किया गया था । कार्यात्मक परिणामों के परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM (मतलब के मानक त्रुटि) और टी परीक्षण का उपयोग कर की तुलना में । UCM एक सेलुलर अपनी बहुतायत के कारण स्रोत के रूप में चुना गया था, संग्रह में आसानी, और बेहतर अंय भ्रूण adnexa सूत्रों के सापेक्ष40प्रसार । मानक प्लेटों पर UCM से पृथक कोशिकाओं को विस्तार भर में एक fibroblast की तरह आकार बनाए रखा । chitosan प्लेट (चित्रा 8) पर कल्चरित होने पर spheroids का गठन किया गया.

मानक शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कोशिकाओं के बहुमत व्यक्त CD44 (९८.६ ± १.६२%), CD90 (८८.७ ±), और CD105 (७७.९ ± ६.८४%), जबकि CD34 की अभिव्यक्ति (0.07 ± ०.१७%) और MHC द्वितीय (1.33 ± 1.12%) बहुत कम थे । वातानुकूलित संस्कृति के तहत, CD44 के अभिव्यक्ति स्तर (९७.० ± 2.12%) और CD34 (1.13 ± 1.58%) मानक संस्कृतियों से अलग नहीं किया, जबकि CD90 (३३.३ ± ३७.१%) और CD105 (५४.० ± १९.०%) की अभिव्यक्ति का स्तर कम हुआ और MHC द्वितीय (२.८४ ± ०.९८%)35वृद्धि हुई ।

अलगाव और UCM-MSCs के लक्षण वर्णन के बाद इन विट्रो में, वातानुकूलित कोशिकाओं के जैविक व्यवहार की तुलना में एक द्विपक्षीय patellar पट्टा दोष मॉडल में मानक शर्तों के तहत संस्कृति के चूहों में किया गया था । प्रत्येक चूहे में अनुपचारित दोष आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा की । बाद ऑपरेटिव सूजन सभी चूहों में कम है और 48 एच के भीतर हल किया गया था । RGS के अनुसार, चूहों में से कोई भी इस तरह के कक्षीय कस के रूप में दर्द या संकट के लक्षण प्रदर्शित, नाक/गाल समतल, या कान/ सभी चूहों के एक सामांय रेंज भस्म 3-4 छर्रों या 15-20 ग्राम फ़ीड के दैनिक अध्ययन भर में । कुल कार्यात्मक स्कोर, असिस्टेड और सहायता सहित हिंद अंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चढ़ाई स्कोर के साथ ही 7 दिनों में संचालित चूहों की तुलना में सामान्य चूहों में अधिक था (n = 8, p < 0.0001, तालिका 3) । हालांकि, कुल कार्यात्मक स्कोर (n = 12, पी = ०.७८) सर्जरी के बाद 28 दिनों के भीतर सामांय करने के लिए लौट आए । इसलिए, चूहा द्विपक्षीय patellar पट्टा दोष मॉडल को अंतर व्यक्तिगत भिंनता सीमित और महत्वपूर्ण रुग्णता के कारण बिना पशुओं की आवश्यक संख्या को कम करने के लिए प्रभावी होना दिखाया गया है (वीडियो 1–5) ।

28 दिनों में एकत्र tendons के बारे में 37% स्पष्ट रूप से गाढ़ा (चित्रा 7) दिखाई दिया । यह रोगन समान रूप से खाली और इलाज दोषों के बीच वितरित किया गया था । कुल ऊतकवैज्ञानिक स्कोर अनुपचारित दोषों में समय के साथ वृद्धि हुई (n = 20, p = ०.००३४). जब हीलिंग स्कोर के प्रत्येक घटक स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन किया गया था, केवल समय के साथ बदलने पैरामीटर उपास्थि गठन, जो 7 और 28 दिनों के बीच वृद्धि हुई (n = 20, पी < 0.0001). Angiogenesis समय (पी = 0.3) के साथ वृद्धि करने के लिए खड़ा है, लेकिन कोलेजन गठन अलग नहीं था (पी = ०.६९) । ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा पर, सूजन ' tendons ऊतक वर्गों के सभी में मनाया गया सर्जरी के बाद 7 दिनों में जांच की, उपचार की उपस्थिति की परवाह किए बिना । एक रक्तगुल्म सभी इलाज दोषों में मौजूद था । ऊतकवैज्ञानिक angiogenesis स्कोर (तालिका 2, चित्रा 9) से लेकर 0 में 1, मध्यम arteriole और केशिका घुसपैठ का सुझाव है, जबकि कोलेजन ग्रेड स्कोर (तालिका 2, चित्रा 10) 2 से 3 तक रेंज कुल मिलाकर, सुझाव व्यापक कोलेजन गठन के लिए उदार । उपास्थि गठन स्कोर (तालिका 2, चित्र 11) से लेकर 2 कोई उपास्थि गठन का सुझाव, के लिए 25% के मध्यम उपास्थि गठन के लिए 50% पट्टा अनुभाग क्षेत्र के. सभी ऊतकवैज्ञानिक आंकड़े पूर्वकाल पहलू के रूप में बाईं ओर के साथ उंमुख होते हैं, और पट्टा के मध्य भाग के अनुप्रस्थ अनुभाग के औसत दर्जे का पहलू के रूप में शीर्ष ।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों और अपूतित सर्जरी के लिए तैयारी की स्थिति । प्रत्येक चूहे को दो 0.5 एल पानी गर्म पानी से भरा बोतलों के बीच रखा गया था और एक कपड़े से कवर करने के लिए शरीर का तापमान और स्थिति को बनाए रखने, जबकि त्वचा की चोट को रोकने । प्रत्येक चूहे के पैरों को मेज पर टेप किया गया और उसके शरीर को बुलबुला लपेटो के साथ कवर किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: patellar पट्टा दोष (संरेखण) के सर्जिकल मॉडल । एक 0.99 मिमी व्यास Kirschner तार एक टेंपलेट के रूप में पट्टा के खिलाफ गठबंधन के लिए एक अंग में दोष के आकार का मानकीकरण है ।

Figure 3
चित्रा 3: patellar पट्टा दोष (चीरा) के सर्जिकल मॉडल । दो पूर्ण मोटाई चीरा Kirschner तार के प्रत्येक पक्ष पर बना पट्टा के एक केंद्रीय भाग को अलग कर रहे हैं ।

Figure 4
चित्रा 4: patellar पट्टा दोष के सर्जिकल मॉडल (लकीर) । मध्य अनुभाग Kirschner तार के आकार से मेल खाता दोष पैदा कर, समीपस्थ और विलम्बित है । विच्छेदित क्षेत्र बिंदीदार रेखा बॉक्स के भीतर दिखाया गया है ।

Figure 5
चित्रा 5: संचालित सजाई के बाद ऑपरेटिव प्रकटन. प्रावरणी एक cruciate पैटर्न के साथ बंद कर दिया गया था और त्वचा एक intradermal पैटर्न के साथ बंद कर दिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: UCM-MSCs के वितरण के लिए सक्रिय वातानुकूलित प्लाज्मा की तैयारी । स्टेम कोशिकाओं को सक्रियण से पहले वातानुकूलित प्लाज्मा में निलंबित कर दिया गया । जिसके परिणामस्वरूप थक्का patellar पट्टा दोषों में डाला गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: सामांय के सकल उपस्थिति (सी, डी) और अधिक मोटा (एक, ख) tendons । (क, ग) पीछे विचार; (ख, घ) पार्श्व विचार; ब्लॉक तीर टिबिया और पतले तीर की पहचान tendons की पहचान ।

Figure 8
चित्र 8: टिशू कल्चर प्लेट पर कल्चर्ड के तहत 19% ऑक्सीजन स्तर (मानक समूह: A) और chitosan फिल्म के तहत 5% ऑक्सीजन स्तर (वातानुकूलित समूह: ख) के अंतर्गत. पृथक कोशिकाओं धुरी मानक समूह पर आकार का था (एक) और गठन वातानुकूलित समूह (B) पर spheroids । स्केल बार = 400 µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: angiogenesis ग्रेडिंग के लिए प्रयुक्त प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ । उपचार के 7 दिनों के बाद, कोई उपचार के साथ tendons 0 (ए, डी), या तो वातानुकूलित कोशिकाओं के साथ उन जबकि (सी, एफ) या मानक कोशिकाओं (बी, ई) के एक ग्रेड प्राप्त किया, क्रमशः 0.5 और 0 के एक ग्रेड प्राप्त किया । 28 दिनों में, अनुपचारित tendons (जी, जे) 0 के एक ग्रेड प्राप्त किया, वातानुकूलित कोशिकाओं (मैं,एल) या मानक कोशिकाओं (एच,कश्मीर) के साथ उन जबकि क्रमशः 1.0 और 0.5 के स्कोर प्राप्त किया । तीर tendons नमूना में मौजूद रक्त वाहिकाओं की पहचान । 100X आवर्धन में रक्त वाहिकाओं की ओर इशारा करते हुए तीर 400x आवर्धन में रक्त वाहिकाओं की ओर इशारा करते हुए एक ही तीर के अनुरूप । सामांय पट्टा ऊतक (एम, एन) । Masson का trichrome दाग (ए, बी, सी, जी, एच, आई, एम); hematoxylin और eosin दाग (D, E, F, J, K, L, N); स्केल बार = 100 µm (A-N) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ कोलेजन ग्रेडिंग के लिए इस्तेमाल किया । उपचार के 7 दिनों के बाद, कोई इलाज के साथ tendons 2.5 का एक ग्रेड (ए, डी) उपचार के साथ उन जबकि (बी, सी, ई, एफप्राप्त) 3.0 के एक ग्रेड प्राप्त किया । 28 दिनों में, अनुपचारित tendons (जी, जे) 3.0 के एक ग्रेड प्राप्त किया, वातानुकूलित कोशिकाओं (मैं, एल) या मानक कोशिकाओं (एच, कश्मीर) के साथ उन जबकि क्रमशः 1.0 और 3.0 के स्कोर प्राप्त किया । पट्टा फाइबर के वि400X presets (एच, कश्मीर) में सराहना की जा सकती है । सामांय पट्टा ऊतक (एम, एन) । Masson का trichrome दाग (ए, बी, सी, जी, एच, आई, एम); hematoxylin और eosin दाग (D, E, F, J, K, L, N); स्केल बार = 100 µm (A-N) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: उपास्थि ग्रेडिंग के लिए प्रयुक्त प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ. उपचार के 7 दिनों के बाद, कोई इलाज के साथ tendons (ए, डी), या तो वातानुकूलित कोशिकाओं (सी, एफ) या मानक कोशिकाओं (बी, ई) के साथ उन, सभी 0 के एक ग्रेड प्राप्त किया । 28 दिनों में, अनुपचारित tendons (जी, जे) 1.0 के एक ग्रेड प्राप्त किया, वातानुकूलित कोशिकाओं (मैं, एल) या मानक कोशिकाओं (एच, कश्मीर) के साथ उन जबकि क्रमशः 0 और 2.0 के स्कोर प्राप्त किया । तीर पट्टा नमूना में मौजूद chondrocytes पर इशारा कर रहे हैं । 100X आवर्धन में chondrocytes की ओर इशारा करते हुए तीर 400X आवर्धन में chondrocytes की ओर इशारा करते हुए उसी तीरों के अनुरूप होते हैं । सामांय पट्टा ऊतक (एम, एन) । Masson का trichrome दाग (ए, बी, सी, जी, एच, आई, एम); hematoxylin और eosin दाग (D, E, F, J, K, L, N); स्केल बार = 100 µm (A-N) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

वीडियो 1: चूहों में एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन. समय पर की गई सहायता हिंद अंग खड़े (1-5 एस: 1 स्कोर) को-ऑपरेटिव 4 एच के बाद मनाया गया । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

वीडियो 2: चूहों में एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन. समय पर हिंद अंग forelimbs के साथ खड़े असिस्टेड (0-5 एस: स्कोर 0) 4 एच पोस्ट ऑपरेटिव नोट किया गया था । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

3 वीडियो: चूहों में एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन. समय पर की गई सहायता हिंद अंग खड़े (1-5 एस: स्कोर 1), समय पर हिंद अंग forelimbs सहायता के साथ खड़े (5-10 एस: स्कोर 1) 14 दिनों के बाद ऑपरेटिव नोट किया गया था । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

वीडियो 4: चूहों में एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन. समय पर हिंद forelimbs सहायता के साथ खड़े अंग (10-15 एस: 2 स्कोर), एक 17 सेमी प्लास्टिक पिंजरे की दीवार पर चढ़ने की क्षमता के बिना (कोई चढ़ाई: स्कोर 0) 27 दिनों के बाद ऑपरेटिव उल्लेख किया गया था । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

5 वीडियो: चूहों में एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन. समय पर हिंद forelimbs सहायता के साथ खड़े अंग (5-10 एस: 1 स्कोर), एक 17 सेमी प्लास्टिक पिंजरे की दीवार पर चढ़ने की क्षमता के साथ (हां: स्कोर 1) 14 दिनों के बाद ऑपरेटिव नोट किया गया था । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

कार्यात्मक परीक्षण 0 1 2 3 स्कोर
हिंद अंग खड़े असिस्टेड 0-5 एस > 5 – 10 एस > 10 – 15 एस > 15 एस
हिंद अंग स्टैंड की सहायता 0-1 एस > 1 – 5 एस > 5 एस
चढ़ाई की क्षमता नहीं हाँ
कुल

तालिका 1: चूहों में एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन करने के लिए स्कोरिंग प्रणाली. एक स्कोरिंग प्रणाली (0-6) forelimbs समर्थित (0-3) के साथ समय पर हिंद अंग खड़े सहित 3 गतिविधियों के आधार पर एम्बूलेंस समारोह का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था, समय पर असिस्टेड हिंद अंग खड़े (0-2), और एक 17 सेमी प्लास्टिक पिंजरे की दीवार (0-1) चढ़ाई करने की क्षमता ।

कोलेजन ग्रेड
0 सामांय कोलेजन उंमुख tangentially
1 कोलेजन फाइबर के साथ हल्के परिवर्तन से कम 25% अव्यवस्थित
2 25% और 50% के बीच कोलेजन फाइबर के साथ उदारवादी परिवर्तन अव्यवस्थित
3 कोलेजन के साथ चिह्नित परिवर्तन से अधिक 50% अव्यवस्थित
angiogenesis की डिग्री
0 धमनियों के साथ ऊतक के उदारवादी घुसपैठ
1 केशिकाओं की उपस्थिति
2 नहीं vasculature घुसपैठ
उपास्थि गठन
0 कोई उपास्थि गठन
1 पृथक hyaline उपास्थि पिंड
2 25% से 50% के मध्यम उपास्थि गठन
3 व्यापक उपास्थि गठन, शामिल क्षेत्र के 50% से अधिक

तालिका 2: प्रोटोकॉल स्कोरिंग ग्रेड. वर्गों के ऊतकवैज्ञानिक स्कोर कोलेजन ग्रेड, angiogenesis की डिग्री के आधार पर वर्गीकृत किया गया है, और उपास्थि गठन (Rosenbaum एट अल से अनुकूलित । 39)

समूह मतलब ± SEM
सामांय (n = 3) 6.00 ± ०.४८
सर्जरी के बाद 7 दिनों (n = 8) 2.25 ± 0.30
28 दिन सर्जरी के बाद (n = 12) ५.८३ ± ०.२४

तालिका 3: सामांय चूहों और अनुपचारित चूहों के कार्यात्मक स्कोर । सामांय चूहों और अनुपचारित चूहों के कार्यात्मक स्कोर 7 और 28 दिन पश्चात वर्गीकृत किया गया । n = चूहों की संख्या ।

अनुपूरक चित्रा 1: गेटिंग रणनीति और सतह मार्कर अभिव्यक्ति का उदाहरण: मलबे को स्मॉल FSC और एसएससी (ए) के आधार पर बाहर रखा गया । लाइव कोशिकाओं के आधार पर चुना गया नकारात्मक धुंधला के साथ 7-AAD FL3 द्वारा पता लगाया (B) । CD44-FITC धनात्मक कक्षों (D) का एक गेट बनाने के लिए ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में Isotype मिलाए गए नियंत्रण (C) का उपयोग किया गया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

घोड़े की कोशिकाओं को इस परियोजना के लिए चयनित है क्योंकि हम अंततः के लिए घोड़ों में प्राकृतिक tendinopathies के प्रबंधन में उंमीदवार दृष्टिकोण का परीक्षण करना चाहते थे । वास्तव में, घोड़ों में tendons चोटों क्योंकि घोड़े की सतह डिजिटल फ्लेक्स के बीच जैविक समानता के आदमी में tendinopathy के प्राकृतिक मॉडल के रूप में अपील कर रहे है और मनुष्य में दुखती पट्टा41। सेल भूतल मार्करों CD44, CD90, CD105, CD34, और MHC द्वितीय कोशिकाओं के immunophenotyping के लिए चयनित किया गया, के अनुसार सेलुलर थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा अनुशंसित मापदंड42। हाल ही के एक अध्ययन में, eqUCM-MSCs CD44 और CD34 और MHC द्वितीय के लिए नकारात्मक, संस्कृति की स्थिति की परवाह किए बिना सकारात्मक थे । मानक शर्तों के तहत संस्कृति वाले कक्ष भी CD90 और CD105 के लिए सकारात्मक थे, जिससे सतह मार्करों की अभिव्यक्ति के संदर्भ में MSCs के लिए मानदंड बैठक । इसके अतिरिक्त, यह अध्ययन spheroids के गठन पर पहली रिपोर्ट है जब eqUCM-MSCs chitosan फिल्म पर संस्कृति रहे हैं, मानव MSCs19,20पर पिछले रिपोर्ट की पुष्टि । 3 डी सेल संस्कृति तकनीक व्यापक दशकों के लिए एक शारीरिक आला जैसी वातावरण बनाने के लक्ष्य का पता लगाया गया है । दरअसल, इस अध्ययन में सुधार Oct4, Sox2, और Nanog, और बेहतर भेदभाव की क्षमता है, जो अंय रिपोर्टों19,20के साथ संगत है की जीन अभिव्यक्ति का स्तर बेहतर दिखाया । अंय सुधार इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण43 और hyaline उपास्थि पुनर्जनन44 MSCs spheroids का उपयोग की सूचना दी । विभिन्न 3d संस्कृति तकनीक के बीच जैसे स्पिनर कुप्पी, घूर्णन सेल के प्रतिप्रतिक्रियाएँ, नॉन-अनुयाई प्लेट, प्राकृतिक और सिंथेटिक मैट्रिक्स, chitosan फिल्में कई कारणों से आकर्षक लगती हैं. इस दृष्टिकोण महंगा उपकरण की आवश्यकता नहीं है और लागत प्रभावी गैर-अनुयाई प्लेटों सिंथेटिक मैट्रिक्स के साथ तुलना में है, के बाद से chitosan समुद्री भोजन उद्योग के एक द्वारा उत्पाद है । chitosan फिल्मों पर संवर्धन कोशिकाएँ तकनीकी रूप से आसान होती हैं. संयुक्त, इन लाभों को एक बड़े पैमाने पर45नैदानिक आवेदन की अनुमति होगी ।

द्विपक्षीय patellar पट्टा मॉडल यहां प्रस्तावित रुग्णता के मामले में स्वीकार्य प्रतीत होता है । कोई जटिलता हाल ही में एक अध्ययन अध्ययन में देखा गया था । हम विशेष रूप से काफी बड़े दोषों से प्रेरित तनावपूर्ण प्रभाव के जोखिम पर चिंतित थे जिससे पता लगाने के लिए यांत्रिक और ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन की अनुमति है । इन चिंताओं को इस अध्ययन के लिए चूहों पर चूहों के चयन के लिए प्रेरित आकार और पूर्व नैदानिक चोट मॉडल के लिए पट्टा के परिपक्वता से संबंधित अध्ययन के आधार पर । ' एक खिड़की दोष ' या मध्य-तीसरे patellar पट्टा दोष खरगोश46 और चूहों में वर्णित किया गया है30,31 के लिए पट्टा चिकित्सा और वृद्धि का अध्ययन । patellar ' पट्टा खिड़की दोष ' मॉडल प्रोटोकॉल31,39, यांत्रिक परीक्षण30,31, और पूर्व vivo प्रतिदीप्ति के साथ चूहों में पट्टा मरंमत का अध्ययन करने के लिए reproducible पाया गया है इमेजिंग31. इस अध्ययन में, दोष का आकार patellar पट्टा के मध्य तीसरे के समकक्ष था, और एक के रूप में एक 0.99 मिमी व्यास Kirschner तार के साथ मानकीकृत किया गया टेंपलेट । इन आयामों के बाद ऑपरेटिव टूटना के कारण बिना पट्टा उपचार के अध्ययन के लिए पर्याप्त थे । चूहों बनाम अपने बड़े शारीरिक आकार की वजह से, चूहों बड़े दोषों को समायोजित कर सकते हैं, चोट के reproducibility में सुधार, उपचार वितरण, और परिणाम के उपाय.

इस अध्ययन में चूहों को प्रशासित analgesia प्रोटोकॉल पोस्ट ऑपरेटिव दर्द को नियंत्रित करने में प्रभावी था, के रूप में RGS37,38के साथ मूल्यांकन किया गया । यह स्कोरिंग प्रणाली यहां का चयन किया गया था क्योंकि यह पहले से ऑपरेटिव व्यवहार परिवर्तन चूहों में दर्द को दर्शाती37,38के रूप में पहचान के रूप में मांय किया गया था । RGS इस तरह की पहचान करने के लिए अपेक्षाकृत सरल संकेत पर आधारित है, कक्षीय कस, नाक/गाल समतल, और कान/ चूहों को भी इस अध्ययन में एक सामांय भोजन का सेवन बनाए रखा है, जो आगे इस analgesia प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का समर्थन करता है । दरअसल, पिछले रिपोर्टों के बाद ऑपरेटिव दर्द और गैर के साथ इलाज चूहों में शरीर के वजन में परिवर्तन के बीच एक संबंध पाया है-स्टेरॉयड विरोधी inflammatories, जैसे कि meloxicam47. इस एजेंट का चयन इस अध्ययन में किया गया था और रिक्तिपूर्व प्रशासन चूहों में अध्ययन से प्राप्त किया गया था37,48 और कुत्तों49, जहां विरोधी भड़काऊ एजेंटों के तुरंत सर्जरी से पहले प्रशासन को पाया गया है शल्य चिकित्सा प्रेरित दर्द क्षीणन । समारोह के बाद ऑपरेटिव दर्द के एक अतिरिक्त संकेतक के रूप में मूल्यांकन किया गया था, दोनों श्रोणि अंगों के उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए डिजाइन एक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर । यहां चयनित तीन गतिविधियों को गति और श्रोणि अंगों पर वजन वहन करने की इच्छा की सीमा के एक सामांय आकलन प्रदान करते हैं । इस स्कोरिंग प्रणाली दोनों स्थिर और गतिशील चूहों में कार्यात्मक वसूली अध्ययन50,51 से व्युत्पंन किया गया था और कार्यात्मक परिणामों के समय पाठ्यक्रम की तुलना करने के लिए बनाया गया था मनाया । स्कोर संकेत मिलता है कि द्विपक्षीय पट्टा दोष 7 दिनों में समारोह में एक अस्थाई कमी प्रेरित 28 दिनों के भीतर सामांय करने के लिए एक वापसी के साथ । समारोह स्कोर RGS से आर्थोपेडिक स्थितियों के लिए माध्यमिक दर्द का पता लगाने में अधिक संवेदनशील दिखाई देता है । इसी तरह कार्यात्मक परीक्षण इस तरह की दुखती कार्यात्मक सूचकांक28, पंजा और प्रगति के उपाय51, या अंय macroscopic स्कोरिंग सिस्टम52के रूप में पट्टा चिकित्सा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

इस मॉडल के अध्ययन में नामांकित पशुओं की संख्या को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि अनुपचारित tendons और दो स्टेम सेल के बीच परिणाम अंतर-उपचार आधारित है । इस अध्ययन में परीक्षण उपचार के प्रभाव एक और प्रकाशन36में चर्चा कर रहे हैं । मॉडल यहां इस्तेमाल किया प्रत्येक चूहे में एक आंतरिक नियंत्रण के उपयोग के माध्यम से उपचार के मतभेदों का पता लगाने की अनुमति दी, गैर के साथ संयुक्त, 28 दिनों में tendons की विनाशकारी यांत्रिक परीक्षण (यहां प्रस्तुत नहीं डेटा) ।

सक्रिय वातानुकूलित प्लाज्मा tendinopathies53,54के प्रबंधन में स्टेम सेल, असंगति, पहुंच, और वर्तमान नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक वाहक के रूप में अपने आम उपयोग की वजह से चुना गया था । यह इलाज tendons की चिकित्सा के लिए योगदान दिया है सकते हैं, लेकिन अनुमति स्टेम सेल के स्थानीय प्रतिधारण, और यह उपचार समूहों की तुलना के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, क्योंकि दोनों सक्रिय वातानुकूलित प्लाज्मा की एक ही राशि शामिल हैं । अनुपचारित tendons की ऊतकवैज्ञानिक सुविधाओं के पिछले विवरण के साथ संगत कर रहे हैं पट्टा उपचार, जहां गल ऊतक और बाधित कोलेजन बंडल सूजन चरण के दौरान मैक्रोफेज द्वारा phagocytosis और lytic एंजाइमों द्वारा हटा रहे हैं, जो 10 दिन तक रहता है चोट के बाद54,55,56। प्रफलन चरण के दौरान, सेलुलर प्रसार और मरंमत स्थल की संवहनी 28 दिनों में सबसे बड़ी है के बाद पट्टा की मरंमत57,58। हम tendons, पार अनुभागीय क्षेत्रों, और नमूनों की लोच के कम मापांक के स्पष्ट और अधिक मोटा होना के बीच एक संबंध पाया । इन परिणामों के आधार पर, ऊतकवैज्ञानिक स्कोर को ऊतक परिवर्तन है कि वांछनीय नहीं किया जा सकता है प्रतिबिंबित और यांत्रिक शक्ति, कोलेजन फाइबर, angiogenesis, और chondrogenesis के विके रूप में नेतृत्व नहीं है लगता है । भविष्य में, ऊतकवैज्ञानिक विशेषताओं पर आधारित भेदभाव उपचार के लिए इस मॉडल की क्षमता tenocytes, extracellular मैट्रिक्स संगठन, proteoglycan सामग्री की उपस्थिति के रूप में अतिरिक्त मानदंडों को एकीकृत करके सुधार किया जा सकता है, और elastin फाइबर52,59का वितरण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

लेखक डॉ. सु, पीएचडी स्वीकार करना चाहते हैं, उसके आंकड़ों के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए । लेखक भी डॉ McClure, DVM, पीएचडी DACLAM, संज्ञाहरण और दर्द प्रबंधन के अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर उसकी सलाह के लिए धंयवाद । इस परियोजना के स्वास्थ्य विज्ञान कार्यालय के अनुसंधान के लिए उपराष्ट्रपति के पश्चिमी विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित (12678v) और USDA अनुभाग 1433 कोष (२०९०) था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 10x Hyclone SH30258.01 Consumable
Collagenase type IA Worthington LS004197 Consumable
DMEM low glucose Hyclone SH30021.FS Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03 Consumable
Penicillin/Streptomycin 100x Hyclone SV30010 Consumable
Trypsin 0.25% Hyclone SH30042.01 Consumable
Accutase Innovative Cell Technologies AT104 Consumable
Trypan blue Hyclone SV30084.01 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 Consumable
Chitosan Sigma C3646 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma S8045 Consumable
Bovine Serum Albumin Hyclone SH30574.01 Consumable
Round bottom polystyrene tube Corning 149591A Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC) AbD serotec MCA1082F Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC) AbD serotec MCA47FT Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC) AbD serotec MCA1085F Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control AbD serotec MCA928F Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) abcam ab11415 Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control abcam ab91356 Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC) BD BDB560942 Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC) BD BDB555748 Consumable
7-AAD BD BDB559925 Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Equipment
Vacutainer 5 mL Med Vet International RED5.0 Consumable
Acid-citrate-dextrose Sigma C3821 Consumable
Calcium Chloride Sigma C5670 Consumable
Sevoflurane JD Medical 60307-320-25 Consumable
Rats Charles River Strain code: 400 Experimental animal
Rat surgical kit Harvard apparatus 728942 Equipment
Surgical Blade #15 MEDLINE MDS15115 Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		 Bio Serv F06801 Consumable
Polyglactin 910, 5-0 Ethicon J436G Consumable
Eosin alchol shandon Thermo scientific 6766007 Consumable
Harris Hematoxylin Thermo scientific 143907 Consumable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

Tags

चिकित्सा अंक 133 चूहा मॉडल पट्टा चोट मॉडल Mesenchymal स्टेम सेल Chitosan Spheroids Patellar पट्टा खिड़की दोष
चूहों में एक द्विपक्षीय Patellar पट्टा चोट मॉडल में स्टेम सेल चिकित्सा का मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J.… More

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. J. Vis. Exp. (133), e56810, doi:10.3791/56810 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter