Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluering av stilk cellen terapi i bilaterale patellarsenen skade modell i rotter

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56810
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

Summary

Dette dokumentet beskriver forberedelse og evaluering av navlestreng matrix-avledet mesenchymal stamceller spheroids med bilaterale patellarsenen feil modell i rotte. Denne modellen ble var assosiert med en akseptabel sykelighet funnet for å oppdage forskjeller mellom ubehandlede og behandlet sener og mellom to behandlinger testet.

Abstract

Regenerativ medisin skaffer romanen alternativer til forhold som utfordrer tradisjonell behandlinger. Utbredelse og sykelighet av tendinopathy over arter, har kombinert med begrenset helbredende egenskapene til dette vev, bedt om søk etter mobilnettet terapier og drevet utviklingen av eksperimentelle modeller å studere deres effekt. Navlestreng matrix-avledet mesenchymal stamceller (UCM-MSC) er tiltalende kandidater fordi de er rikelig, lett å samle, omgå Etiske bekymringene og risikoen for teratoma dannelse, men ligner primitive embryonale stamceller nærmere enn voksen vev-avledet MSCs. betydelig interesse har fokusert på chitosan som en strategi for å forbedre egenskapene til MSCs gjennom formet formasjon. Dette papiret detaljer teknikker å isolere UCM-MSCs, forberede spheroids på chitosan film, og analysere effekten av formet formasjon på overflaten markør uttrykk. Derfor er etableringen av bilaterale patellarsenen skade modell i rotter beskrevet for i vivo implantasjon av UCM-MSC spheroids dannet på chitosan film. Nei komplikasjon ble observert i studien forhold til sykelighet, stress stigende effekter eller vev infeksjon. Total funksjonelle score på styres rotter i 7 dager var lavere enn vanlig rotter, men tilbake til det normale innen 28 dager etter operasjonen. Histologiske scorene til vev-healing bekreftet tilstedeværelse av en blodpropp i behandlede defekter evalueres på 7 dager, fravær av fremmedlegemer reaksjon, og avansere helbredende på 28 dager. Denne bilaterale patella sene defekt modellen var styrer Inter individuell variasjon via etableringen av en intern kontroll i hver rotten forbundet med akseptabel sykelighet og tillatt påvisning av forskjellene mellom ubehandlet sener og behandlinger.

Introduction

Gjete skaden er en av de vanligste årsakene til betydelig smerte og muskelen atrofi over arter1. I veterinærmedisin er sene og ligament skader av spesiell interesse for hester, 82% av alle skader i hester involverer bevegelsesapparatet, og 46% av dem påvirke tendons og leddbånd2,3. Arrvev formasjon påvirker egenskapene biomekaniske helbredet sener og forklarer bevoktet prognosen for retur til atletisk bruk etter bøyer sene skader; Re-skader oppstår innen 2 år i opp til 67% av hestene behandlet konservativt4. Regenerativ medisin skaffer romanen alternativer til en tilstand som utfordrer tradisjonell behandlinger. Autologous stilk cellen terapi har produsert noen oppmuntrende resultater5,6 , men er begrenset av sykelighet forbundet med vev samling, forsinket administrasjon på grunn av behandling/omprogrammere celler og påvirkning av den pasientens helsetilstand (for eksempel alder) på egenskapene til stilk celler7,8. Disse begrensningene gir en begrunnelse for å undersøke allogene stamceller som en sokkel alternativ. Fosterets H59-avledet celler er tiltalende kandidater fordi de omgå Etiske bekymringene og risikoen for teratoma dannelse tilknyttet embryonale stamceller. Blant fosterets H59 er navlestreng matrix (UCM), også kalt Whartons gelé, rikelig og enkelt å samle.

Uavhengig celle kilden er styrke stemness viktig å etablere en cellen bank allogenic regenerativ medisin. Fra et funksjonelt synspunkt, kan stemness defineres som potensialet for selvtillit fornyelse og flere avstamning differensiering9. Bevis på stemness bruker spredning og differensiering analyser, sammen med uttrykk av genet markører Oct4, Sox2, og Nanog9. En strategi for å forbedre stemness, avhengig av bruk av biologisk materiale som ugyldige fyllstoff og bærere styrke spredning og differensiering av UCM-MSCs. Dette eliminerer angående manipulering av transcriptional faktorer å omprogrammere modne celler i indusert pluripotent celler. Biologisk materiale betraktet som potensielle stativer for stamceller, er chitosan tiltalende for biocompatibility og nedbrytbarhet10. Denne naturlige aminopolysaccharide er dannet av alkaliske deacetylation av chitin, det nest mest rikelig naturlig polysakkaridet, hovedsakelig fikk som en subproduct av skalldyr10. Vi har tidligere undersøkt interaksjoner mellom MSCs og chitosan stillaser og observert dannelsen av spheroids11,12,13,14,15, 16. vi også rapportert om overlegenhet chondrogenesis på chitosan matriser12,13,14,15,16,17, 18. Flere nylig, to uavhengige studier beskrevet spheroids dannelsen av fettvev og morkaken vev avledet MSCs kultivert på en chitosan filmen19,20. Denne dannelsen av spheroids ikke bare forbedret stemness, men også forbedret oppbevaring av stamceller etter i vivo implantasjon20.

Utbredelse og sykelighet av tendinopathy over arter har bedt om utvikling av eksperimentelle modeller å studere i Patofysiologien ved tendinopathies og teste nye behandlingsformer som stem cell injeksjoner. I hester er collagenase-indusert senebetennelse en felles modell å demonstrere effekt ved hjelp av MSCs i sene reparasjon21. Relevansen av denne tilnærmingen er begrenset, injeksjoner forårsake akutt inflammatoriske endringer, mens klinisk tendinopathies vanligvis resultat av kronisk overstrain22,23. I tillegg kjemiske induksjon av sene sykdom induserer en healing respons og replikerer ikke svekket helbredelsesprosessen i kliniske tilfeller22,23. Eksisjon av et segment i overfladisk digital bøyer senen har blitt beskrevet som en kirurgisk modell av senebetennelse i hester24. Nylig ble en minimal invasiv tilnærming brukt til å begrense det traumatic skaden til den sentrale kjernen av overfladiske digital bøyer sene25. Kirurgisk modeller ikke etterligne tretthet mekanismen som kan føre til naturlige sene sykdom, og pleier å mangler reproduserbarhet i omfanget av skaden opprettet25. Uansett modell, sykelighet og kostnader knyttet til equine modeller av sene er sykdommer flere begrensninger, som rettferdiggjør interesse gnager modeller som et første skritt i vivo evaluering av romanen terapi.

En av de viktigste fordelene med eksperimentelle modeller i gnagere består av kostnadene og muligheten til å kontrollere Inter-individuelle variasjon. Gnagere kan være standardisert med hensyn til ulike fysiologiske faktorer på grunn av deres raske vekst priser og korte relativt levetid, begrenser kilder til variasjon og derfor redusere antall dyr kreves for å gjenkjenne forskjellene. Strategier for å indusere sene sykdommer i Red har stolt på kjemiske induksjon, men også på kirurgisk etableringen av delvis sene defekter21. Kirurgisk modellene kan simulere naturlig tendinopathies bedre enn kjemiske modeller, men kan føre til høyere sykelighet og katastrofal svikt i skadet senen. I den forbindelse synes rotter bedre kandidater enn mus for disse modellene, som deres størrelse gjør etableringen av større feil, og dermed evaluere vev helbredelse. Sprague-Dawley rotter har blitt brukt i eksperimentelle studier av tendinopathies i fire store sene grupper: rotatorcuff, bøyer, Akilles og patellar sener26. Blant disse er modellene som involverer patellar senen spesielt attraktivt på grunn av større størrelsen på dette sene og enkel tilgang til den27. Patellarsenen festes quadriceps muskel til tibial tuberosity. I denne extensor mekanismen er patella en sesamoid bein som leder av quadriceps og delineates proksimale omfanget av patellar senen. Tilstedeværelsen av benete ankere på proksimale og distale omfanget av patellar senen forenkler biomekaniske tester. Modeller som involverer patellar senen vanligvis stole på ensidige kirurgisk feil, med en kontralateral intakt sene som en kontroll28,29. Den vanligste patellarsenen defekt modellen innebærer excising den sentrale delen (1 mm i bredde) av patellarsenen fra den distale toppen av patella for innsetting av tibial tuberosity, mens den kontralateral patellarsenen er intakt. Tiltak av resultatene har inkludert histology, ikke-destruktiv biomekaniske testing eller biomekaniske testing til svikt, ultralyd imaging, ex vivo fluorescens bildebehandling, brutto observasjon og funksjonelle tester28,30 ,31. Ensidig modeller tillater ikke sammenligning av en foreslått behandling med konservative ledelse av en lignende skader samme dyret. Tilsvarende krever sammenligning mellom flere behandlinger separate dyr. En bilaterale modell ville eliminere Inter enkeltvarianter og redusere antall dyr kreves for en studie32. Men bilaterale skader kan øke sykelighet og bilaterale klagesang kunne vanskeliggjøre behandling evaluering. Noen studier rapporterer kort bruk av bilaterale patellarsenen feil i rotter men fokus på effekten av behandlinger i stedet for peri-operative ledelse og sykelighet av modell33,34.

Denne studien langsiktige målet er å utvikle en strategi for å forbedre stemness og i vivo overlevelse av UCM-MSCs skal allogenic transplantasjon. For å oppnå dette målet, har vi nylig rapportert forbedret stemness av UCM-MSCs ved dannelsen av spheroids på chitosan film og inkubasjon under hypoxic miljø35. Disse i vitro egenskapene var assosiert med bedre biomekaniske egenskaper patellarsenen feil behandlet med betinget UCM-MSCs. basert på disse resultatene, rotte bilaterale patellarsenen feil modell synes egnet til å teste kandidat behandlinger for sene skader36. Formålet med studien rapporterte her er å gi detaljert protokoller for isolering og karakterisering av UCM-MSCs, utarbeidelse av en biologisk leveringssystem for stamceller, opprettelse og behandling av bilaterale patella sene feil og post-operativ utvinning og evaluering av vev helbredelse inne feil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Western University of Health Sciences.

1. isolering og utvidelse av MSCs i Equine navlestreng matrisen

  1. Få morkaken fra en voksen mare (gravid) når observert foaling og tas aseptisk isolere navlestrengen fra morkaken. Hold navlestrengen i fosfat bufret saltvann (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) på 4 ° C under overføring til behandling.
  2. Vask navlestrengen to ganger med romtemperatur PBS med 1% P/S i en 50 mL tube. Avsnittet navlestreng i 2-tommen-lang fragmenter på 150 mm plate og vask i romtemperatur PBS med 1% P/S i en 50 mL tube to eller tre ganger, til de fleste blod skylles ut.
  3. Kutte navlestrengen langs for å avsløre fartøy. Fjerne fartøyer, inkludert 2 arteriene, en stemning og en allantoic stilken fra ledningen med tang og saks. Samle navlestreng matrise (Whartons gelé), som er gelé-aktig matrix omkringliggende fartøyene, på en 150 mm tallerken ved skraping med en skalpell, og hakke gelé i fine stykker.
  4. Sted Wharton gelé fra 2 – 3 navlestreng fragmenter (ca 12-15 g) i et 50-mL tube med 15 mL 0,1% (w/v) collagenase type IA i PBS. Ruge på 37 ° C med mild rister for 3-4 h til oppløst.
  5. Sentrifuge fordøyd vev på 300 x g i 15 min og Sug opp nedbryting. Resuspend fordøyd vev i 15 mL romtemperatur PBS med 1% P/S, blande av pipettering sentrifuge 150 x g i 5 min og Sug opp nedbryting (vask). Gjenta vaske to ganger mer.
  6. Resuspend vasket celler i 15 mL romtemperatur PBS med 1% P/S, blande av pipettering, sil av med 100 µm celle sil, sentrifuge 150 x g for 5 min, og Sug opp nedbryting.
  7. Forberede kultur medium (CM) ved å blande lav glukose Dulbecco endret Eagle's Medium (LG-DMEM) fetal bovin serum (FBS) og 1% P/S. sterilisere medium ved filtrering.
  8. Resuspend anstrengt celler i 10 mL cm pre varmet til 37 ° C, blande av pipettering, overføre til en 25 cm2 vev kultur kolbe og ruge i 5% CO2 på 90% fuktighet og 37.0 ° C. Endre CM hver 3 dager til kultur når 70 – 80% samløpet, når kulturen vil være passaged.
  9. For å passasje kulturen, Sug opp CM fra kolbe, vask med 5 mL av romtemperatur PBS to ganger og koble med 3 mL 0,25% trypsin/ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) ved 37 ° C i 5 minutter.
  10. Nøytralisere trypsin/EDTA med 6 mL CM pre varmet 37.0 ° c, blande av pipettering, overføre til en 15 mL tube, sentrifuge 150 x g for 5 min, og Sug opp nedbryting. Resuspend frittliggende celler i 1 mL av CM, blande av pipettering. Telle levedyktig celler trypan blå og hemocytometer. Nytt frø i en 25 cm2 vev kultur kolbe på 5000 celler/cm2og ruge i 5% CO2 på 90% fuktighet og 37.0 ° C.

2. forberedelse av Spheroids med UCM-MSCs kultivert Chitosan filmer

  1. For å forberede 100 mL 1% (w/v) kitosan løsning, legge 1 g av chitosan i 99 mL destillert vann (dH2O), og bland godt med en magnetisk rørestang.
  2. Legg 670 µL iseddik og fortsetter å blande inntil chitosan oppløses og blir tyktflytende. Dette tar vanligvis 3-4 h.
  3. Legg til 500 µL av kitosan løsning i hver brønn av 12-vel vev kultur plate, og virvel platen for å fordele kitosan løsning jevnt og dekke alle bunnen.
  4. Tørr kitosan løsning belagt platen under laminær strømning kabinett uten deksel over natten for 24 timer. Når tørket, tynn film dannet og overholdt plate.
  5. Nøytralisere chitosan filmen ved å legge til 1 mL av 0,5 N natriumhydroksid (NaOH) løsning i hver brønn og ruge for 2 timer ved romtemperatur. Sug opp NaOH fra hver brønn og vaske hver godt med 1 mL av dH2O tre ganger. Vask hver godt med 1 mL av 70% etanol (EtOH) en gang.
  6. For å sterilisere chitosan film, Legg 1 mL av 70% EtOH i hvert godt og ruge over natten i laminær strømning skap. Sug opp gjenværende EtOH fra hver brønn i dagen. Vask hver godt med 1 mL steril PBS tre ganger. Sterilisere chitosan film med ultrafiolett lys under laminær strømning CAB natten uten deksel.
  7. Til skjemaet spheroids av UCM-MSCs, frø utvidet passaged celler i hver brønn på 5000 celler/cm2og ruge i 5% CO2 på 90% fuktighet og 37.0 ° C.
    Merk: Celler kan være ruges under hypoksi eller normoxia, avhengig av den investigator interesse.

3. uttrykk for overflate markører analysert via flowcytometri

  1. Utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon
    1. Standard plate
      1. Fjerne mediet fra hver brønn og vask to ganger med romtemperatur PBS.
      2. Koble celler med 500 µL av en celle dissosiasjon reagens til hver brønn av en 12-vel plate for 5-10 minutter ved romtemperatur.
      3. Etter inkubasjon Legg 1 ml av flekker buffer (PBS med 0,5% BSA) i hver brønn og bland av pipettering å koble celler.
      4. Overføre celle suspensjon i 15 mL konisk rør og sentrifuge 150 x g for 5 min.
    2. Chitosan plate
      1. Samle alle spheroids av aspirating mediet bruker en pipette med 1000 µL tips. Overføre samlet medium til et 15-mL konisk rør. Samle medium, vask godt ved å legge til 1 mL av PBS og overføre vasket PBS til samme 15 mL konisk rør.
      2. Sentrifuge spheroids på 150 x g i 5 min og fjerne nedbryting.
      3. Legg til 500 µL av cellen dissosiasjon reagensen (f.eks, accutase) og ruge for 5-10 minutter ved romtemperatur. Bland ved pipettering bruke en 1 mL tips til spheroids dissociate og vises ikke lenger.
      4. Legg 1 mL av flekker buffer i én celle suspensjon og sentrifuge 150 x g for 5 min.
  2. Vask celler
    1. Fjern nedbryting fra konisk røret og å suspendere cellene i 3 mL kald farging buffer. Holde celler på is hele eksperimentet dette trinnet.
    2. Sentrifuge 300 x g i 5 min (vask).
    3. Vask to ganger.
  3. Farging celler
    1. Sentrifuge 300 x g i 5 min og fjerne nedbryting.
    2. Telle levedyktig celler ved hjelp av en trypan blå og hemocytometer. Nytt suspendere 1 x 106 celler i 50 µL blokkering buffer (PBS inneholder 10% hest serum) og ruge i 30 min på is.
    3. Legge 10 µL fluorescein isothiocyanate (FITC) konjugerte antistoffer (CD44, CD90, CD105, CD34, store histocompatibility kompleks (MHC) klasse II eller isotype kontroll for hver antistoff) og 40 µL av flekker buffer, deretter ruge beskyttet fra lys 1t på is.
    4. Legge 3 mL kald farging buffer og bland, sentrifuge 300 x g i 5 min og Sug opp nedbryting (vask).
    5. Gjenta vaske to ganger.
    6. Nytt avbryte celle pellet 0,5 mL flekker buffer
    7. Legge til 5 µL av 7-AAD (levedyktighet fargestoff) og ruge i 30 min på is
    8. Analysere farget celle prøver av flyt cytometer. Utelate rusk av sine mindre SSC og FSC, og identifisere levedyktig celler med lavere opptak av 7-AAD. Tegn FL1 og FL2 på y - og x-aksene, henholdsvis. Bruke isotype kontrollen til å opprette en gate ovenfor den diagonale linjen. Måle andelen positivt farget celler i området. Telle minst 20.000 hendelser/sample (supplerende figur 1).
    9. Måle andelen celler farget med antistoffer av gating levedyktig celler og auto-fluorescens, og trekker prosentandelen av celler med isotype kontroll.

4. bilaterale patellarsenen feil modell i rotte

  1. Velg Sprague-Dawley rotter (voksen hann, 4-5 måneder gammel, kroppsvekt 350-375 g). Merk den relativt store størrelsen på rotter brukes for denne modellen.
  2. Bedøve og bruke kunstig øye smøremiddel rotte med 8% desflurane i 2 L/min 100% oksygen levert via maske, til forsvinningen av knip-toe refleks i induksjon kammeret.
  3. Administrere en intramuskulær injeksjon av har meloksikam (1 mg/kg) som preemptive analgesi.
  4. Sett rotta mellom to 0,5 L vann flasker fylt med varmt vann og dekket med en klut til å opprettholde kroppstemperatur og posisjon, mens forebygge hud skader. Tape hvert ytterpunkt til tabellen. For å redusere risikoen for nedkjøling, dekke kroppen med bobleplast (figur 1).
  5. Opprettholde anestesi med kontinuerlig strøm av 5% desflurane i 1 L 100% oksygen blanding via nesen kjegle, med dyr på dorsal recumbency på vann oppvarming pad.
  6. For å unngå huden trauma, ikke klipp kirurgisk nettsteder. I stedet bruke hår remover fløte over begge knær. Bruke en tunge depressor fjerne fløte og hår.
  7. Skrubbe kirurgiske området med chlorhexidine digluconate skrubbe og skylle med 70% etanol 3 ganger.
  8. Incise huden med sterilt #15 skalpell blad proksimale til distale retning, på craniomedial aspekt av kveler. Start i snitt ca 1 cm proksimale til nivået av patella, og utvide den ca 5 mm distale til tibial tuber.
  9. Gjenspeile huden til å utsette patellar senen ved å frigjøre den underliggende subkutant vev med #15 skalpell blad.
  10. Bruker #15 skalpell bladet, avgiftsdirektoratet sentrale tredje i hver patellarsenen (1 mm) fra den distale del av patella til tibial tuberosity.
    1. Justere en 0,99 mm-diameter Kirschner wire mot senen som mal for å standardisere størrelsen til mangelen på hvert lem (figur 2).
    2. Gjøre 2 full-tykkelse snitt på hver side av Kirschner ledningen med #15 skalpell blad å isolere den sentrale delen av senen (Figur 3). Resect sentrale delen proximally og distally med fine Iris saks (Figur 4).
    3. Før du lukker fascia av kveler, setter du inn blodpropp (mikset-celle suspensjon og ACP) for riktig behandlingsgrupper som beskrevet i 5.5. Lukk fascia med en cruciate mønster og huden med en intradermal mønster 5-0 polyglactin 910 suturer (figur 5).
  11. Gjenta på kontralateral kveler.
    Merk: En defekt er randomisert til behandling (stamceller dem under chitosan eller kultivert på standard plater). Kontralateral feilen er tomt, som intern kontroll.
  12. Etter operasjonen, administrere 4 tabletter enrofloxacin (2 mg/tablett, muntlig, en gang daglig) og en tablett på har meloksikam (2 mg/tablett, muntlig, en gang daglig) i 7 dager. Disse dosene ble anbefalt av laboratoriet dyr veterinær og godkjent i IACUC protokollen.

5. levering av MSCs i patellarsenen feilen

  1. Bedøve en sunn rotte som ikke brukes for patellarsenen feil etableringen med 8% desflurane i 2 L/min 100% oksygen levert via maske, til forsvinningen av knip-toe refleks i induksjon kammeret.
  2. Samle 5 mL blod av cardiac punktering fra bedøvet Sprague-Dawley rotta (voksen hann, 4-5 måneder gammel, kroppsvekt 350-375 g), i en 5 mL sprøyte med en 20 G nål som inneholder 1 mL av syre-citrate-druesukker (5:1 v/v).
  3. Euthanize rotta etter cardiac punktering og blod samling, ved intracardial injeksjon av pentobarbital (100 mg/kg), mens under den samme anestesi.
  4. Sentrifuge prøven 350 x g i 15 min ved romtemperatur. Overføre nedbryting og lagre dele (120 µL hver) på 20 ° C før bruk.
  5. Umiddelbart før i vivo implantasjon, tine den ovenfor aliquot og bland 20 µL med 0.5 x 106 MSCs (fra 1,9 eller 3.1.2.1) løsrevet fra standard plater med trypsin/EDTA, eller samle inn fra chitosan plater ved rødme (med PBS/middels).
  6. Legge til 6 µL av 10% veisalt (CaCl2) de resterende 100 µL tinte plasma i en godt av 96-brønns plate å aktivere plasma og skape en blodpropp (aktivert betinget plasma: ACP).
  7. Bland celle suspensjon (20 µL) og ACP (100 µL) til en blodpropp (figur 6). Plasser blodpropp i patellarsenen feilen opprettet før du lukker fascia av kveler (se trinn 4.10.3).

6. funksjonell utfallet

  1. Overvåke rotter to ganger om dagen for underskriver av smerte, basert på rotte grimase skala (RGS)37,38 og hevelse over webområdene implantasjon.
    Merk: Poengberegningssystem (0-6) ble utviklet for å evaluere ambulerende funksjon basert på 3 aktiviteter, inkludert tidsbestemt hind lem stående med forelimbs støttes (0-3), tidsbestemt unassisted hind lem stående (0-2), og muligheten til å klatre en 17 cm plast bur veggen (0-1) ( Tabell 1).
  2. Evaluere rotter for to baklem stående aktiviteter på morgenen og kvelden hver tidspunkt å beregne et gjennomsnittlig poengsum.
  3. Evaluere rotter mulighet til å kunne klatre en 17 cm plast bur vegg med både bakbeina nådde toppen.

7. brutto utseende og histopatologi av Patellar senen

  1. Euthanize rotter i 7 dager (for å evaluere betennelse) eller 28 dager (for å evaluere vev healing) innlegg behandling ved intracardial injeksjon av pentobarbital (100 mg/kg) under narkose med 8% desflurane og 2 L 100% oksygen levert via maske.
  2. Høste patella-sene-tibia tuberosity enheter av skalpell og saks etter euthanasia. Fjern bløtvev og leddbånd rundt kveler, bortsett fra patellarsenen.
  3. Undersøke hver prøven for brutto utseende og fortykkelse av senen (figur 7).
  4. Orientere prøven ved å plassere en kirurg 's knute av 5.0 Polydioxanone på den proksimale og laterale delen av senen. Løse hver prøven i 10% nøytral bufrede formalin løsning og få tverrgående deler (5 µm) fra midt-delen av hver sene.
  5. Stain delene med hematoxylin og eosin og Masson's Trichrome flekker etter standardprotokoller.
  6. Undersøke delen for å oppdage tilstedeværelsen av hematom i feil, i tillegg til patologiske forandringer som betennelse.
  7. Evaluere histologiske poengsummen for inndelinger ved hjelp av tidligere publiserte poengsystemet, basert på kollagen klasse, grad av angiogenese og brusk dannelse (tabell 2)39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne studien, er resultatene presentert som betyr ± SD (standardavvik). Cellene ble isolert fra navle snorer av 6 mares, og andelen isolert cellelinjer uttrykke hver celle overflaten indikator under standard eller chitosan condition ble sammenlignet med en Friedman test, som en ikke-parametriske variansanalyse med gjentatt tiltak. For oppretting av sene feil modell 8 rotter brukes av 7 dager etter operasjonen vurdering og 12 rotter ble brukt til 28 dager vurdering. Resultatene av funksjonelle resultatene presenteres som betyr ± SEM (standard feil av gjsnitt) og forhold ved hjelp av t-test. UCM ble valgt som en mobil kilde sin overflod, samling og overlegen spredning i forhold til andre fosterets H59 kilder40. Celler isolert fra UCM kultivert på standard plater opprettholdt en fibroblast-lignende form gjennom utvidelse. Celler dannet spheroids når kultivert på chitosan plate (Figur 8).

Fleste cellene kultivert under standard betingelser uttrykt CD44 (98.6 ± 1.62%), CD90 (88.7 ± 3.04%), og CD105 (77.9 ± 6.84%), mens uttrykk for CD34 (0.07 ± 0,17%) og MHC-II (1,33 ± 1.12%) var veldig lavt. Under betinget kultur, uttrykk nivåene av CD44 (97.0 ± 2,12%) og CD34 (1.13 ± 1.58%) ikke avvike fra standard kulturer, mens uttrykk nivåer av CD90 (33.3 ± sett 37,1%) og CD105 (54.0 ± 19,0%) redusert og MHC-II (2,84 ± 0,98%) økt35.

Etter isolering og karakterisering av UCM-MSCs i vitro, biologisk atferd betinget celler ble sammenlignet med celler kultivert under standard betingelser i en bilaterale patellarsenen feil modell i rotter. Ubehandlet feil i hver rotten var internkontroll. Post-operativ hevelse var minimal i alle rotter og løst innen 48 timer. Ifølge RGS vises ingen av rotter underskriver av smerte eller ubehag som orbital stramme, nese/kinnet sammenslåing eller øre/whisker endringer. Alle rotter fortært en normal rekkevidde av 3-4 pellets eller 15-20 gram feed daglig gjennom hele studiet. Total funksjonelle score, inkludert assistert og unassisted hind lem står, samt klatring score var høyere i vanlig rotter sammenlignet med styres rotter i 7 dager (n = 8, p < 0.0001, tabell 3). Imidlertid total funksjonelle score tilbake til det normale innen 28 dager etter operasjonen (n = 12, p = 0.78). Derfor vist rotte bilaterale patellarsenen feil modeller seg å være effektive for begrense Inter individuell variasjon og redusere det nødvendige antallet dyr uten å forårsake betydelige sykelighet (Video 1-5).

Ca 37% av sener samlet på 28 dager dukket markert fortykket (figur 7). Denne jevning var likt fordelt mellom Tom og behandlet. Totalt histologiske score økt med tid i ubehandlet feil (n = 20, p = 0.0034). Når hver komponent av healing score ble vurdert uavhengig, parameterne endre tid besto av brusk formasjon, som økt mellom 7 og 28 dager (n = 20, p < 0,0001). Angiogenese en tid (p = 0,3), men kollagen formasjon ikke avvike (p = 0.69). Ved histologiske undersøkelse, ble betennelse observert i alle sener vev deler undersøkt på 7 dager etter operasjonen, uavhengig av tilstedeværelse av behandling. En hematom hadde alle behandlede defekter. Histologiske angiogenese score (tabell 2, figur 9) varierte fra 0 til 1, tyder moderat arteriole og kapillær infiltrasjon, mens kollagen klasse score (tabell 2, Figur 10) varierte fra 2 til 3 totalt, noe som tyder moderat til omfattende kollagen formasjon. Brusk formasjon score (tabell 2, Figur 11) varierte fra 0 til 2 antyder ingen brusk formasjon, til moderat brusk dannelsen av 25% til 50% av området sene delen. Alle histologiske tallene er orientert med venstre side som den fremre del og toppen som den mediale aspektet av tverrstilt delen av midt delen av senen.

Figure 1
Figur 1: plassering av rotter og forberedelser for aseptiske kirurgi. Hver rotte ble plassert mellom to 0,5 L vann flasker fylt med varmt vann og dekket med en klut til å opprettholde kroppstemperatur og posisjon, mens forebygge hud skader. Ekstremiteter av hver rotte ble tapet til bordet og kroppen var dekket med bobleplast. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kirurgisk modell av patellarsenen feil (justering). En 0,99 mm-diameter Kirschner wire justeres mot senen som mal for å standardisere størrelsen til mangelen på hvert lem.

Figure 3
Figur 3: kirurgisk modell av patellarsenen feil (snitt). To full-tykkelse Snittene lages på hver side av Kirschner wire å isolere en sentral del av senen.

Figure 4
Figur 4: kirurgisk modell av patellarsenen feil (resection). Den midtre delen resected proximally og distally, opprette en defekt matchende størrelsen på Kirschner ledningen. Kappet området vises i prikket linje-boksen.

Figure 5
Figur 5: postoperativ utseendet på styres kveler. Konseptet ble stengt med en cruciate mønster og huden ble avsluttet med et intradermal mønster. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Forberedelse aktivert betinget plasma for levering av UCM-MSCs. Stamceller ble suspendert i betinget plasma før aktivering. Den resulterende blodproppen ble satt inn i patellarsenen mangler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Brutto utseendet til normal (C, D) og tykkere (A, B) sener. (A, C) Bakre visninger. (B, D) Lateral visninger. Brede piler identifisere tibia og tynn piler identifisere sener.

Figure 8
Figur 8: morfologi av celler kultivert på vev kultur plate under 19% oksygennivået (standard gruppe: A) og chitosan film under 5% oksygennivået (betinget gruppe: B). isolert celler var spindel formet på standard gruppe (A) og dannet spheroids på betinget gruppe (B). Skala bar = 400 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: representant lys micrographs brukes for angiogenese gradering. Etter 7 dager for helbredelse, fikk sener med ingen behandling en karakter av 0 (A, D), mens de med enten betinget celler (C, F) eller standard celler (B, E) mottatt en karakter av 0,5 og 0, henholdsvis. 28 dager mottatt ubehandlet sener (G, J) en karakter av 0, mens de med betinget celler (jeg,L) eller standard celler (H,K) fått score 1.0 og 0,5, henholdsvis. Pilene identifisere blodkar i sene prøven. Pilene som peker på at blodårer i 100 X forstørrelse tilsvarer samme pilene som peker på at blodårer i 400 x forstørrelsen. Normal sene vev (M, N). Masson's trichrome flekk (A, B, C, G, H, I, M); hematoxylin og eosin flekk (D, E, F, J, K, L, N); Skala bar = 100 µm (A-N). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: representant lys micrographs brukes til kollagen karaktersetting. Etter 7 dager for helbredelse fikk sener med ingen behandling en karakter av 2.5 (Ad) mens de med behandling (B, C, E, F) mottatt en karakter av 3.0. 28 dager mottatt ubehandlet sener (G, J) en karakter av 3.0, mens de med betinget celler (jeg, L) eller standard celler (H, K) mottatt scorene til 1.0 og 3.0, henholdsvis. Disorganization av den sene Fibre kan bli verdsatt i 400 X insets (H, K). Normal sene vev (M, N). Masson's trichrome flekk (A, B, C, G, H, I, M); hematoxylin og eosin flekk (D, E, F, J, K, L, N); Skala bar = 100 µm (A-N). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: representant lys micrographs brukes for brusk gradering. Etter 7 dager for helbredelse, sener med ingen behandling (A, D), med enten betinget celler (C, F) eller standard celler (B, E), alle fikk en karakter av 0. 28 dager mottatt ubehandlet sener (G, J) en karakter av 1.0, mens de med betinget celler (jeg, L) eller standard celler (H, K) mottatt scorene til 0 og 2.0, henholdsvis. Pilene peker på chondrocytes i sene prøven. Pilene som peker på chondrocytes i 100 X forstørrelse tilsvarer samme pilene som peker på chondrocytes i 400 X forstørrelsen. Normal sene vev (M, N). Masson's trichrome flekk (A, B, C, G, H, I, M); hematoxylin og eosin flekk (D, E, F, J, K, L, N); Skala bar = 100 µm (A-N). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1: evaluering av ambulerende funksjon i rotter. Tidsbestemt unassisted hind lem stående (1 – 5 s: score 1) ble observert 4 h post-operatively. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2: evaluering av ambulerende funksjon i rotter. Tidsbestemt baklem stående med forelimbs assistert (0-5 s: skala 0) ble bemerket 4 h legge operativt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3: evaluering av ambulerende funksjon i rotter. Tidsbestemt unassisted hind lem stående (1 – 5 s: score 1), tidsbestemt hind lem stående med forelimbs assistert (5-10 s: score 1) ble bemerket 14 dager legge operativt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 4: evaluering av ambulerende funksjon i rotter. Tidsbestemt baklem stående med forelimbs assistert (10-15 s: mål 2), uten mulighet til å klatre 17 cm plast bur veggen (ingen klatring: skala 0) ble bemerket 27 dager legge operativt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 5: evaluering av ambulerende funksjon i rotter. Tidsbestemt baklem stående med forelimbs assistert (5-10 s: score 1), muligheten til å klatre en 17 cm plast bur vegg (ja: score 1) ble bemerket 14 dager legge operativt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Funksjonstesten 0 1 2 3 Poengsum
Baklem stå assistert 0-5 s > 5-10 s > 10-15 s > 15 s
Baklem stå uten assistanse 0-1 s > 1 – 5 s > 5 s
Klatring evne nei ja
Totalt

Tabell 1: Scoring system for å evaluere ambulerende funksjon i rotter. Poengberegningssystem (0-6) ble utviklet for å evaluere ambulerende funksjon basert på 3 inkludert tidsbestemt hind lem stående med forelimbs støttes (0-3), tidsbestemt unassisted hind lem stående (0-2), og muligheten til å klatre en 17 cm plast bur vegg (0-1).

Kollagen klasse
0 Normal kollagen orientert tangentially
1 Mild endringer med kollagenfibre mindre enn 25% uorganisert
2 Moderat endringer med kollagenfibre mellom 25% og 50% uorganisert
3 Merkede endringer med kollagen mer enn 50% uorganisert
Graden av angiogenese
0 Moderat infiltrasjon av vev med arterioler
1 Tilstedeværelsen av kapillærene
2 Ingen blodkar infiltrasjon
Brusk formasjon
0 Ingen brusk formasjon
1 Isolert hyaline brusk knuter
2 Moderat brusk dannelsen av 25% til 50%
3 Omfattende brusk formasjon, mer enn 50% av feltet involvert

Tabell 2: Histology scoring karakterer. Histologiske score på delene var gradert basert på kollagen klasse, grad av angiogenese og brusk dannelse (tilpasset fra Rosenbaum et al. 39)

Gruppe Mener ± SEM
Normal (n = 3) 6.00 ± 0.48
7 dager etter operasjonen (n = 8) 2,25 ± 0,30
28 dager etter operasjonen (n = 12) 5.83 ± 0.24

Tabell 3: Funksjonelle scorene til vanlig rotter og ubehandlet rotter. Funksjonell scorene til vanlig rotter og ubehandlet rotter 7 og 28 dager ble postoperatively sensurert. n = antall rotter.

Supplerende figur 1: Gating strategi og eksempel på overflaten markør uttrykket: Avfall ble utelatt basert på små FSC og SSC (A). Levende celler ble valgt basert på negative farging med 7-AAD oppdaget av FL3 (B). Isotype matchet kontroll (C) ble brukt som negativ kontroll til å opprette en gate av CD44-FITC positive celler (D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Equine celler ble valgt for dette prosjektet fordi vi til slutt skal teste kandidat tilnærminger i forvaltningen av naturlige tendinopathies i hester. Sene skader i hester er faktisk tiltalende som naturlig modeller av tendinopathy mann gitt biologiske likhet mellom equine overfladisk digital bøyer og akillessene i mennesker41. Cellen overflate markører CD44, CD90, CD105, CD34 og MHC-II ble valgt for immunophenotyping av celler, i samsvar med kriteriene anbefalt av internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi42. I en fersk studie var eqUCM-MSCs positive for CD44 og negative CD34 og MHC-II, uansett oppdrettsforholdene. Celler kultivert under standard betingelser var også positivt for CD90 og CD105, og dermed møte kriteriene for MSCs i uttrykk for overflate markører. I tillegg er denne studien den første rapporten om dannelsen av spheroids når eqUCM-MSCs er kultivert på chitosan film, bekrefter tidligere rapporter på menneskelig MSCs19,20. 3D celle kultur teknikker utforsket mye i flere tiår å skape et miljø som ligner fysiologiske nisje. Faktisk denne studien viste forbedret stemness gene expression nivåer av Oct4, Sox2, og Nanog, og forbedret differensiering potensial, som er i samsvar med andre rapporter19,20. Andre rapportert forbedret immunmodulerende egenskaper43 og hyaline brusk gjenfødelse44 bruker MSCs spheroids. Blant ulike 3D kultur teknikker som spinner flasker, roterende celle bioreaktorer, ikke-tilhenger plate virke naturlige og syntetiske matriser, chitosan filmer appellerende for flere grunner. Denne fremgangsmåten krever ikke dyrt utstyr og er kostnadseffektiv sammenlignet med ikke-tilhenger plater med syntetisk matriser, siden chitosan er et biprodukt av sjømat. Dyrking celler chitosan filmer er teknisk lett. Kombinert, ville fordelene tillate klinisk anvendelse på en stor skala45.

Bilaterale patellarsenen modellen foreslås her synes akseptabelt i sykelighet. Nei komplikasjon ble observert i en fersk studie studie. Vi var spesielt bekymret over faren for stressende effekter forårsaket av feil store nok til å tillate synlig biomekaniske og histologiske endringer. Disse bekymringene bedt om valg av rotter over mus for denne studien basert på tidligere studier knyttet til størrelse og modenhet av senen for prekliniske skade modeller. En "vinduet defekt" eller sentral-tredje patellarsenen feil har blitt beskrevet i kaniner46 og rotter30,31 for å studere sene healing og styrking. Patellarsenen 'vinduet feil' modell har funnet reproduserbar for å studere sene reparasjon i rotter med histology31,39, biomekaniske30,31og ex vivo fluorescens bildebehandling31. I denne studien størrelsen på feilen var tilsvarende den sentrale tredje av patellarsenen, og ble standardisert med en 0,99 mm-diameter Kirschner ledning som en mal. Disse dimensjonene var tilstrekkelig å studere sene healing uten å forårsake postoperativ brudd. På grunn av deres større anatomisk størrelse versus mus rommer rotter større feil, forbedre reproduserbarhet skade, behandling leveringsmåte og mål for utfallet.

Analgesi protokollen administrert til rottene i denne studien var effektivt i å kontrollere postoperativ smerte, som vurdert med RGS37,38. Dette poengsystemet valgt her fordi det var tidligere godkjent som oppdager postoperativ atferdsendringer reflekterer smerter i rotter37,38. RGS er basert på tegn relativt enkle å identifisere, som orbital stramme, nese/kinnet sammenslåing og øre/whisker endringer. Rotter også vedlikeholdt en vanlig matinntak gjennom denne studie, som ytterligere støtter effekten av denne analgesi protokollen. Tidligere rapporter har faktisk funnet en sammenheng mellom postoperativ smerte og kroppen vekt endringer i rotter behandlet med ikke-steroide anti-inflammatories, som har meloksikam47. Denne agenten ble valgt i denne studien og preemptive administrasjon ble avledet fra studier i rotter37,48 og hunder49, der administrasjonen av anti-inflammatoriske midler umiddelbart før operasjonen har funnet å attenuere kirurgisk indusert smerte. Funksjonen ble vurdert som en ytterligere indikator på postoperativ smerte, ved hjelp av et poengsystem for å vurdere bruken av både bekken lemmer. De tre aktivitetene velges her gir en generell vurdering av bevegelse og vilje til å bære vekten på bekken lemmer. Dette poengsystemet ble avledet fra både statiske og dynamiske funksjonelle utvinning studier i rotter50,51 og var designet for å sammenligne time course of funksjonelle resultatene observert. Score indikerer at bilaterale sene feilen forårsaket en midlertidig nedgang i funksjonen på 7 dager, med en tilbakevending til normale innen 28 dager. Funksjonen score vises mer følsomme oppdage smerte sekundært til Ortopedisk forhold enn RGS. Lignende funksjonelle tester har blitt brukt til å evaluere sene healing som Akilles funksjonelle indeks28, pote og skrittlengde tiltak51, eller andre makroskopisk scoring systemer52.

Denne modellen ble utviklet for å redusere antall dyr i studien, mens unike resultater mellom ubehandlet sener og to stilk cellen-basert behandling. Effekten av behandlinger testet i denne studien er omtalt i en annen publikasjon36. Modellen brukes her tillatt påvisning av behandling forskjeller ved hjelp av en intern kontroll i hver rotte, kombinert med ikke-destruktiv biomekaniske testing av sener på 28 dager (data ikke presentert her).

Aktivert betinget plasma ble valgt på grunn av felles bruk som en bærer for stamceller, biocompatibility, tilgjengelighet og gjeldende kliniske applikasjoner i forvaltningen av tendinopathies53,54. Det kan ha bidratt til helbredelse av behandlet sener, men tillatt lokale oppbevaring av stamceller, og den forstyrre ikke med sammenligning av behandlingsgrupper, siden begge inkludert samme mengde aktivert betinget plasma. Histologiske funksjonene i ubehandlet sener er i samsvar med tidligere beskrivelser for sene helbredelse, der nekrotisk vev og forstyrret kollagen bunt er fjernet av fagocytose og lytisk enzymer av makrofager i betennelse fasen, som varer opptil 10 dager legge skade54,55,56. Under proliferativ fase er mobilnettet spredning og vascularity av reparasjon stedet størst på 28 dager etter sene reparere57,58. Vi fant en sammenheng mellom den tilsynelatende jevning av sener, cross-sectional områder og lavere modulus av elastisitet av prøver. Basert på disse resultatene, synes histologiske score å reflektere vev endringer som kanskje ikke ønskelig og ikke føre til Biomekaniske styrke, som disorganization av kollagen fibrene angiogenese og chondrogenesis. I fremtiden, evne til denne modellen å diskriminere behandlinger basert på histologiske egenskaper kan forbedres ved å integrere tilleggsvilkår som tilstedeværelse av tenocytes, ekstracellulær matriseorganisasjon, proteoglycan innhold, og distribusjon av elastin fiber52,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Su, PhD, for hennes statistisk analyse av dataene. Forfatterne også takke Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, for hennes råd om anestesi og smerte behandling protokoller brukes i studien. Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra Western University of Health Sciences Office Vice President for forskning (12678v) og USDA delen 1433 midler (2090).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 10x Hyclone SH30258.01 Consumable
Collagenase type IA Worthington LS004197 Consumable
DMEM low glucose Hyclone SH30021.FS Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03 Consumable
Penicillin/Streptomycin 100x Hyclone SV30010 Consumable
Trypsin 0.25% Hyclone SH30042.01 Consumable
Accutase Innovative Cell Technologies AT104 Consumable
Trypan blue Hyclone SV30084.01 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 Consumable
Chitosan Sigma C3646 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma S8045 Consumable
Bovine Serum Albumin Hyclone SH30574.01 Consumable
Round bottom polystyrene tube Corning 149591A Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC) AbD serotec MCA1082F Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC) AbD serotec MCA47FT Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC) AbD serotec MCA1085F Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control AbD serotec MCA928F Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) abcam ab11415 Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control abcam ab91356 Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC) BD BDB560942 Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC) BD BDB555748 Consumable
7-AAD BD BDB559925 Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Equipment
Vacutainer 5 mL Med Vet International RED5.0 Consumable
Acid-citrate-dextrose Sigma C3821 Consumable
Calcium Chloride Sigma C5670 Consumable
Sevoflurane JD Medical 60307-320-25 Consumable
Rats Charles River Strain code: 400 Experimental animal
Rat surgical kit Harvard apparatus 728942 Equipment
Surgical Blade #15 MEDLINE MDS15115 Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		 Bio Serv F06801 Consumable
Polyglactin 910, 5-0 Ethicon J436G Consumable
Eosin alchol shandon Thermo scientific 6766007 Consumable
Harris Hematoxylin Thermo scientific 143907 Consumable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

Tags

Medisin problemet 133 rotte modell sene skade modellen Mesenchymal stamceller Chitosan Spheroids patellarsenen vinduet defekt
Evaluering av stilk cellen terapi i bilaterale patellarsenen skade modell i rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J.… More

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. J. Vis. Exp. (133), e56810, doi:10.3791/56810 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter