Summary
Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.
Abstract
Medicina regenerativa fornece novas alternativas às condições que desafiam os tratamentos tradicionais. A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda a espécie, combinada com as propriedades curativas limitadas deste tecido, ter solicitado a busca de terapias celulares e impulsionou o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a sua eficácia. Cordão umbilical matriz-derivados mesenquimais células-tronco (UCM-MSC) são candidatos atraentes porque eles são abundantes, fácil de coletar, contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma, ainda assemelham-se a células-tronco embrionárias primitivas mais pròxima do que adulto derivado de tecido MSCs. significativo interesse centrou-se na quitosana como uma estratégia para melhorar as propriedades do MSCs através da formação de esferoide. Este papel detalhes técnicas para isolar a UCM-MSCs, preparar esferoides no filme de quitosana e analisar o efeito da formação de esferoide na expressão do marcador de superfície. Consequentemente, a criação de um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos é descrita para implantação na vivo de esferoides UCM-MSC formada-se em filme de quitosana. Nenhuma complicação foi observada no estudo em relação a morbidade, estresse crescentes efeitos, ou infecção do tecido. O escore funcional total dos ratos operados em 7 dias foi menor do que ratos normais, mas retornou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia. Golo de histológico da cicatrização tecidual confirmou a presença de um coágulo em defeitos tratados avaliada em 7 dias, ausência de reação de corpo estranho e progredindo cura em 28 dias. Este modelo de defeito do tendão patelar bilateral controla variação inter-individual, através da criação de um controle interno em cada rato, foi associado com morbidade aceitável e permitiu a deteção das diferenças entre os tendões não tratados e tratamentos.
Introduction
Lesão no tendão é uma das causas mais comuns de significativa atrofia muscular e dor em toda a espécie1. Em medicina veterinária, lesões de tendões e ligamentos são de especial interesse em cavalos, 82% de todas as lesões em cavalos de corrida envolvem o sistema músculo-esquelético, e 46% daqueles afetam os tendões e ligamentos2,3. Formação de tecido cicatricial afeta as propriedades biomecânicas dos tendões cicatrizadas e explica o prognóstico guardado para retorno ao Atlético uso após lesões dos tendões flexores; re-ferimento ocorre dentro de 2 anos em até 67% de cavalos tratados conservadoramente4. Medicina regenerativa fornece novas alternativas para uma condição que desafia os tratamentos tradicionais. Terapia de células-tronco autólogas produziu alguns animadores resultados5,6 , mas é limitada pela morbidade associada com a coleção de tecido, administração retardada devido ao processamento/reprogramação de células e a influência da Estado de saúde do paciente (tais como a idade) nas propriedades do tronco células7,8. Estas limitações fornecem uma lógica para a investigação de células-tronco alogênico como uma alternativa de prateleira. Células derivadas de seus anexos fetais são candidatos atraentes porque eles contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma associado com células-tronco embrionárias. Entre seus anexos fetais, matriz de cordão umbilical (UCM), também chamada geleia de Wharton, é abundante e fácil de coletar.
Independentemente da fonte da célula, aumentar stemness é essencial para estabelecer um banco de células para a medicina regenerativa alogênico. Do ponto de vista funcional, stemness pode ser definido como o potencial para diferenciação de auto-renovação e linhagem multi9. Provas de stemness se baseia em proliferação e diferenciação ensaios, juntamente com a expressão de genes marcadores Oct4, Sox2 e Nanog9. Uma estratégia para melhorar a stemness se baseia na utilização de biomateriais para servir como nulo enchimentos e transportadoras, realçando a proliferação e diferenciação de UCM-MSCs. Essa abordagem elimina preocupações em relação a manipulação de fatores transcricionais para reprogramar células maduras em células pluripotentes induzidas. Entre os biomateriais considerados como portadores de potenciais para as células-tronco, quitosana é atraente por sua biocompatibilidade e degradabilidade10. Este aminipolissacarídeo natural é formado por alcalina deacetilação da quitina, a segunda mais abundante polissacarídeo natural, principalmente obtida como um subproduto de marisco10. Temos anteriormente investigados interações entre MSCs e andaimes de quitosana e observou a formação de esferoides11,12,13,14,15, 16. também informamos sobre a superioridade da condrogênese em quitosana matrizes12,13,14,15,16,17, 18. Mais recentemente, dois estudos independentes descreveram formação de esferoides pelo tecido adiposo e tecido de placenta derivada MSCs cultivadas em um filme de quitosana19,20. Esta formação de esferoides não apenas reforçada stemness, mas também melhorou a retenção das células estaminais após na vivo implantação20.
A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda espécie tem solicitado o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a fisiopatologia de tendinopatias e testar novas terapias tais como injeções de células-tronco. Em cavalos, tendinite induzida por colagenase é um modelo comum para demonstrar a eficácia usando MSCs no tendão reparação21. A relevância desta abordagem é limitada, como as injeções causam alterações inflamatórias agudas, Considerando que tendinopatias clínicas geralmente resultam de crônica overstrain22,23. Além disso, a indução química de doença do tendão induz uma resposta curativa e não replica o processo de cicatrização prejudicado presente em casos clínicos22,23. Excisão de um segmento do tendão flexor digital superficial tem sido descrito como um modelo cirúrgico da tendinite em cavalos24. Mais recentemente, uma abordagem minimamente invasiva foi usada para restringir o dano traumático para o núcleo central do tendão flexor digital superficial25. Modelos cirúrgicos não simular o mecanismo de fadiga que pode levar à doença natural do tendão e tendem a falta de reprodutibilidade na extensão do dano criado25. Independentemente do modelo, a morbidade e custo associado com equinos modelos do tendão doenças são limitações adicionais, que justificam o interesse em modelos de roedores como um primeiro passo na vivo avaliação de novas terapias.
Uma das principais vantagens de modelos experimentais em roedores consiste o custo e a capacidade de controlar a variabilidade inter-individual. Roedores podem ser padronizados em relação a vários fatores fisiológicos devido a suas taxas de crescimento rápido e relativamente curta expectativa de vida, limitando as fontes de variação e, portanto, reduzindo o número de animais necessários para detectar diferenças. Estratégias para induzir doenças tendão em roedores têm confiado na indução química, mas também na criação cirúrgica de tendão parcial defeitos21. Modelos cirúrgicos podem simular melhor do que os modelos químicos naturais tendinopatias, mas podem levar a maior morbidade e falha catastrófica do tendão danificado. A esse respeito, ratos parecem candidatos melhores do que os ratos para estes modelos, como seu tamanho permite a criação de defeitos maiores, facilitando a avaliação da cicatrização tecidual. Foram utilizados ratos Sprague Dawley em estudos experimentais de tendinopatias em quatro grupos principais do tendão: manguito rotador, flexor, Aquiles e tendões patelar26. Entre estes, modelos envolvendo o tendão patelar são especialmente atraentes por causa do tamanho maior deste tendão e a facilidade de acessá-lo27. O tendão patelar anexa o músculo quadríceps a tuberosidade tibial. No âmbito deste mecanismo extensor, a patela é um osso sesamoide que direciona a ação do quadríceps e delineia a extensão proximal do tendão patelar. A presença de âncoras ósseas nas extensões proximais e distais do tendão patelar facilita testes biomecânicos. Modelos envolvendo o tendão patelar normalmente dependem de defeitos cirúrgicos unilaterais, com um tendão intacto contralateral, servindo como um controle28,29. O modelo mais comum de defeito do tendão patelar envolve a excisão da porção central (1 mm de largura) do tendão patelar partir do ápice distal da patela para a inserção da tuberosidade da tíbia, enquanto o tendão patelar contralateral é deixado intacto. Medidas de resultados incluíram, histologia, testes biomecânicos não-destrutivos ou testes biomecânicos para falha, ultra-sonografia, ex vivo imagens de fluorescência, observação bruta e testes funcionais28,30 ,31. Modelos unilaterais não permitir a comparação de um tratamento proposto com tratamento conservador de lesão semelhante dentro do mesmo animal. Da mesma forma, a comparação entre os vários tratamentos requer animais separados. Um modelo bilateral seria eliminar variações inter individuais e reduzir o número de animais necessários para um estudo de32. No entanto, lesões bilaterais podem aumentar a morbidade e claudicação bilateral poderia comprometer a avaliação do tratamento. Alguns estudos relatam brevemente o uso do tendão patelar bilateral defeitos em ratos mas foco sobre os efeitos dos tratamentos, ao invés de gestão peri-operatório e morbidade do modelo33,34.
Objetivo a longo prazo do presente estudo é desenvolver uma estratégia para melhorar a sobrevivência de stemness e na vivo da UCM-MSCs destinado a transplante alogênico. Para atingir este objetivo, recentemente informamos stemness melhorada da UCM-MSCs por formação de esferoides em filme de quitosana e incubação sob ambiente hipóxico35. Essas propriedades em vitro foram associadas com melhoria propriedades biomecânicas do tendão patelar defeitos tratados com condicionado UCM-MSCs. com base nestes resultados, o modelo de defeito do tendão patelar bilateral de rato parece apropriado para testar o candidato tratamentos para lesões de tendão36. A finalidade do estudo relatado aqui é fornecer protocolos detalhados para isolamento e caracterização de UCM-MSCs, elaboração de um sistema biológico de células-tronco, criação e tratamento de defeitos de tendão patelar bilateral e pós-operatório recuperação e avaliação de cura dentro dos defeitos de tecido.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de Western University of Health Sciences e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e expansão de MSCs da matriz equina do Cordão Umbilical
- Obter a placenta de uma égua adulta (grávida), depois observou parto e isolar assepticamente o cordão umbilical da placenta. Mantenha o cordão umbilical em solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante a transferência até o processamento.
- Lavar o cordão umbilical duas vezes com temperatura PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL. Secção do cordão umbilical em fragmentos de 2 polegadas-longa na placa de 150 mm e lavar em temperatura ambiente PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL, duas ou três vezes, até a maior parte do sangue é lavado para fora.
- Corte o cordão umbilical longitudinalmente para expor os navios. Remova os navios, incluindo 2 artérias, uma veia e uma haste alantoico da medula usando fórceps e a tesoura. Coletar o cordão umbilical matriz (geleia de Wharton), que é os matriz gelatinosa circundante dos navios, em uma placa de 150 mm por raspagem com um bisturi, e picar a gelatina em pedaços bem.
- Geleia lugar da Wharton dos fragmentos do cordão umbilical de 2 – 3 (cerca de 12 a 15 g) em um tubo de 50 mL com 15 mL de solução de tipo IA de colagenase de 0,1% (p/v) em PBS. Incube a 37 ° C, com agitação suave para 3-4 h até dissolver.
- Centrifugue o tecido digerido a 300 x g durante 15 min e aspire o sobrenadante. Resuspenda tecido digerido em 15 mL de temperatura PBS com 1% P/S, misture por pipetagem, centrifugar a 150 x g por 5 min e aspire o sobrenadante (lavagem). Repeti a lavagem duas vezes mais.
- Ressuspender lavada as células em 15 mL de temperatura PBS com 1% P/S, misture por pipetagem, estique por com filtro de célula 100 µm, centrifugar x 150 g por 5 min e aspire o sobrenadante.
- Preparar o meio de cultura (CM) misturando baixa glicose Dulbecco meio do modificado águia (LG-DMEM) com soro fetal bovino (FBS) e 1% P/S. esterilizar o meio por filtração.
- Ressuspender as células tensas em 10 mL de CM pré aquecido a 37 ° C, misture por pipetagem, transferir para um balão de cultura de tecidos de2 25 cm e incubar em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C. Mudança CM cada 3 dias até que a cultura atinja a confluência de 70 a 80%, quando a cultura vai ser passada.
- Para a passagem da cultura, Aspire CM do frasco, lavar duas vezes com 5 mL de temperatura PBS e separe com 3 mL de 0,25% ácido de tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C por 5 min.
- Neutralizar a tripsina/EDTA com 6 mL de CM pré aquecido de 37,0 ° C, misture por pipetagem, transferir para um tubo de 15 mL, centrifugar x 150 g por 5 min e aspire o sobrenadante. Resuspenda desanexadas células em 1 mL de CM, misture por pipetagem. Conte as células viáveis usando trypan azul e hemocytometer. Re-sementes para um balão de cultura de tecidos de2 25 cm em 5.000 células/cm2e incubar em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C.
2. preparação de esferoides com UCM-MSCs cultivadas em filmes de quitosana
- Para preparar 100 mL de solução de quitosana de 1% (p/v), adicionar 1 g de quitosana em 99 mL de água destilada (dH2O) e misture bem com um agitador magnético.
- Adicionar 670 µ l de ácido acético glacial e continue misturando até a quitosana dissolve-se e torna-se viscoso. Isso geralmente leva 3-4 h.
- Adicionar 500 µ l de solução de quitosana em cada poço da placa de cultura de tecidos de 12 poços, e a placa para distribuir uniformemente o solução de quitosana e cobrir toda a superfície inferior do redemoinho.
- Seque a placa de solução revestida de quitosana sob fluxo laminar sem uma cobertura durante a noite por 24 h. Uma vez seco, película fina será formada e se adere à placa.
- Neutralizar o filme de quitosana, adicionando 1 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 N em cada poço e incubar durante 2 h à temperatura ambiente. NaOH de cada poço de aspirar e lavar cada bem com 1 mL de dH2O três vezes. Cada um Lave bem com 1 mL de 70% de etanol (EtOH) uma vez.
- Para esterilizar o filme de quitosana, adicione 1 mL de 70% EtOH em cada bem e incubar durante a noite no gabinete de fluxo laminar. No dia seguinte, Aspire EtOH restante de cada poço. Cada um Lave bem com 1 mL de PBS estéril três vezes. Esterilize o filme de quitosana com luz ultravioleta sob fluxo laminar durante a noite sem uma capa.
- Esferoides de formulário da UCM-MSCs, semente expandiu e passadas as células em cada poço de 5.000 células/cm2e incuba em 5% CO2 em 90% de umidade e 37,0 ° C.
Nota: As células podem ser incubadas sob hipoxia ou normoxia, dependendo do interesse do investigador.
3. a expressão de marcadores de superfície analisada através de citometria de fluxo
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Preparação de uma suspensão de célula única
- Placa padrão
- Remover o meio de cada poço e duas lavagens com temperatura PBS.
- Separe células com 500 µ l de reagente de dissociação uma célula em cada poço de uma placa de 12 para 5 a 10 min à temperatura ambiente.
- Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão (PBS contendo 0,5% BSA) de coloração em cada poço e misture pipetando para destacar células.
- Transferi a suspensão de células em tubo cônico de 15 mL e centrifugar 150 x g por 5 min.
- Placa de quitosana
- Colete todos os esferoides por meio de aspiração com uma pipeta com uma ponta de 1.000 µ l. Transferência médio coletado em um tubo cônico de 15 mL. Depois de coletar médio, lavar bem, adicionando 1 mL de PBS e transferir PBS lavado para o mesmo tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugue esferoides a 150 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
- Adicionar 500 µ l de reagente de dissociação de célula (por exemplo, accutase) e incube por 5 a 10 min à temperatura ambiente. Misture por pipetagem usando uma ponta de 1 mL até esferoides dissociam e não são mais visíveis.
- Adicione 1 mL de tampão de coloração para a suspensão de célula única e centrifugar 150 x g por 5 min.
- Placa padrão
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Lavagem de células
- Remover o sobrenadante do tubo cónico e ressuspender as células em 3 mL de coloração reserva de frio. Manter as células no gelo durante todo o experimento desta etapa.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min (lavagem).
- Lave duas vezes.
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Coloração de células
- Centrifugar a 300 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
- Contagem de células viáveis usando um azul trypan e hemocytometer. Re-suspender 1 x 106 células em 50 µ l de bloqueio buffer (PBS com cavalo 10% soro) e incubam por 30 min no gelo.
- Adicionar 10 µ l fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anticorpos (CD44, CD90, CD105, CD34, histocompatibilidade complexo (MHC) classe II ou do isotipo controle para cada anticorpo) e 40 µ l de tampão de coloração e, em seguida, incubar protegido da luz por 1h no gelo.
- Adicionar 3 mL de coloração reserva de frio e misture, centrifugar a 300 x g por 5 min e aspire o sobrenadante (lavagem).
- Repita duas vezes de lavagem.
- Ressuspender o sedimento celular em 0,5 mL de tampão de coloração
- Adicionar 5 µ l de 7-AAD (tintura de viabilidade) e incube por 30 min no gelo
- Analise amostras de células coradas pelo citômetro de fluxo. Excluir os detritos por sua menor SSC e FSC e identificar células viáveis com baixa absorção de 7-AAD. Lote FL1 e FL2 no e x-eixos y, respectivamente. Use o isotipo controle para criar um portão acima da linha diagonal. Medir a porcentagem de células coradas positivamente na área. Conte pelo menos 20.000 eventos/amostra (complementar a Figura 1).
- Medir a porcentagem de células coradas com anticorpos por retenção de células viáveis e autofluorescência e subtrair a porcentagem de células coradas com isotipo controle.
4. modelo de defeito bilateral do tendão patelar em ratos
- Selecione ratos Sprague-Dawley (adultos masculinos, 4-5 meses de idade, peso corporal 350-375 g). Observe o tamanho relativamente grande dos ratos usados para este modelo.
- Anestesia e aplique o lubrificante do olho artificial o rato com 8% de sevoflurano em 2L/min 100% oxigênio entregue via máscara, até o desaparecimento do reflexo de pitada-dedo do pé na câmara de indução.
- Administre uma injeção intramuscular de Meloxicam (1 mg/kg) como analgesia preemptiva.
- Coloque o rato entre duas garrafas de água de 0,5 L com água morna e coberta com um pano para manter a temperatura corporal e posição, enquanto a prevenção de lesões de pele. Fita a cada extremidade da mesa. Para reduzir o risco de hipotermia, cobrir o corpo com plástico bolha (Figura 1).
- Manter a anestesia com fluxo contínuo de sevoflurano 5% na mistura de oxigênio 100% 1L através do cone de nariz, com o animal na prostração dorsal na almofada de aquecimento de água.
- Para evitar o trauma de pele, não clip os sítios cirúrgicos. Em vez disso, aplique o creme removedor do cabelo sobre ambos os reprima. Use o abaixador de língua para remover o creme e o cabelo.
- Esfregue o local cirúrgico com esfoliante de Digluconato de clorexidina e enxágue com etanol a 70% 3 vezes.
- Faça uma incisão na pele com uma lâmina de bisturi 15 # estéril no sentido proximal para distal, no aspecto craniomedial da asfixiar. Iniciar a incisão de cerca de 1 cm proximal ao nível da patela e estendê-lo a cerca de 5 mm distal ao tubérculo tibial.
- Refletir a pele para expor o tendão patelar, libertando o tecido subcutâneo subjacente com uma lâmina de bisturi #15.
-
Utilizando a lâmina de bisturi 15 #, impostos especiais de consumo o terço central da cada tendão patelar (1 mm) do aspecto distal da patela à tuberosidade da tíbia.
- Alinhe um fio de Kirschner 0.99 mm de diâmetro contra o tendão como um modelo para padronizar o tamanho do defeito em cada membro (Figura 2).
- Fazer 2 incisões da cheio-espessura de cada lado do fio de Kirschner com uma lâmina de bisturi 15 # para isolar a parte central do tendão (Figura 3). Ressecar a secção central proximalmente e distalmente com a tesoura de Iris fina (Figura 4).
- Antes de fechar a fáscia da sufocar, inserir o coágulo (suspensão de células mistas e ACP) para os grupos de tratamento adequado, conforme descrito em 5.5. Feche a fáscia com um padrão cruzado e pele com um padrão intradérmico usando 5-0 Poliglactina 910 as suturas (Figura 5).
- Repita o procedimento na asfixiar contralateral.
Nota: Um defeito é aleatoriamente para um tratamento (células-tronco condicionada à quitosana ou cultivadas em placas padrão). O defeito contralateral é deixado vazio, para servir como controle interno. - Após a cirurgia, administrar 4 comprimidos de enrofloxacina (2 mg/comprimido, por via oral, uma vez por dia) e um comprimido de meloxicam (2 mg/comprimido, por via oral, uma vez por dia) por 7 dias. Essas doses foram recomendadas por um veterinário de animais de laboratório e aprovadas no protocolo IACUC.
5. entrega do MSCs dentro o defeito do tendão patelar
- Anestesia um rato saudável, que não é usado para criação de defeito do tendão patelar com 8% de sevoflurano em 2L/min 100% oxigênio entregado via máscara, até o desaparecimento do reflexo de pitada-dedo do pé na câmara de indução.
- Colete sangue 5ml por punção cardíaca de rato Sprague-Dawley anestesiado (adultos masculinos, 4-5 meses de idade, peso corporal 350-375 g), em uma seringa de 5 mL com agulha 20g contendo 1 mL de ácido-citrato-dextrose (5:1 v/v).
- Eutanásia o rato após punção cardíaca e coleta de sangue, por Injeção intracardíaca de pentobarbital (100 mg/kg), enquanto sob a mesma anestesia.
- Centrifugar a amostra a 350 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir o líquido sobrenadante e armazenar (120 µ l cada) de alíquotas a-20 ° C até o uso.
- Imediatamente antes da implantação na vivo , descongelar a alíquota acima e misture 20 µ l com 0,5 x 106 MSCs (de 1,9 ou 3.1.2.1) retirados placas padrão usando tripsina/EDTA ou coletar de quitosana placas de rubor (com PBS/médio).
- Adicione 6 µ l de 10% de cloreto de cálcio (CaCl2) para os restantes 100 µ l de plasma descongelado num poço da placa de 96 poços para ativar o plasma e induzir a formação de um coágulo (ativado condicionado plasma: ACP).
- Misturar a suspensão de células (20 µ l) e ACP (100 µ l) para formar um coágulo (Figura 6). Coloque o coágulo dentro do tendão patelar defeito criado antes de fechar a fáscia da asfixiar (consulte a etapa 4.10.3).
6. resultado funcional
- Monitorar ratos duas vezes por dia para sinais de dor, com base no rato careta escala (RGS)37,38 e inchaço sobre os locais de implantação.
Nota: Um sistema de Pontuação (0-6) foi desenvolvido para avaliar a função ambulatorial com base em 3 atividades, incluindo cronometrado membro posterior permanente com membros dianteiros suportados (0-3), cronometrado desassistida membro posterior permanente (0-2) e a capacidade de escalar um 17cm gaiola plástica (de parede (0-1) A tabela 1). - Avalie as duas atividades permanentes de membro posterior de ratos de manhã e à noite de cada ponto de tempo para calcular um escore médio.
- Avalie os ratos para a capacidade de com êxito, escalar uma parede de gaiola plástica de 17 cm com ambas as patas chegar ao topo.
7. bruto aparência e Histopatologia do tendão patelar
- Eutanásia em ratos em 7 dias (para avaliar a inflamação) ou 28 dias (para avaliar a cicatrização tecidual) pós tratamento por Injeção intracardíaca de pentobarbital (100 mg/kg), sob anestesia com sevoflurano 8% e 100% de oxigênio de 2 L entregadas via máscara.
- Unidades da tuberosidade da tíbia-patela-tendão por bisturi e tesouras de colheita após eutanásia. Remova os tecidos moles e ligamentos em torno a asfixiar, exceto para o tendão patelar.
- Examine cada espécime de aparência bruta e espessamento do tendão (Figura 7).
- Oriente o espécime, colocando um cirurgião do nó de Polydioxanone 5.0 no aspecto proximal e lateral do tendão. Corrigir cada amostra em solução de formol tamponado neutro de 10% e obter secções transversais (5 µm) da porção média da cada tendão.
- Manche as seções usando hematoxilina e eosina e Trichrome de Masson seguindo protocolos padrão de coloração.
- Examine a seção para detectar a presença de hematoma dentro do defeito, bem como alterações patológicas, tais como inflamação.
- Avalie o resultado histológico das seções usando o sistema de Pontuação publicado anteriormente, com base no grau de colágeno, grau de angiogênese e cartilagem de formação (tabela 2)39.
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Representative Results
No estudo atual, os resultados são apresentados como média ± DP (desvio padrão). As células foram isoladas a partir do cordão umbilical de 6 mares e porcentagem de linhas de células isoladas expressando cada marcador de superfície celular sob condicionamento standard ou quitosana foram comparados com um teste de Friedman, como uma análise de variância não-paramétrica com repetidas medidas. Para a criação de modelo de defeito do tendão, 8 ratos foram utilizados para avaliação de pós-operatório de 7 dias e 12 ratos foram utilizados para avaliação de 28 dias. Resultados os resultados funcionais são apresentados como média ± SEM (erro padrão da média) e comparados usando o teste-t. UCM foi selecionada como uma fonte de celular devido a sua abundância, facilidade de coleta e proliferação superior em relação a outras fontes de anexos fetais40. Células isoladas de UCM cultivada em placas padrão mantiveram fibroblasto forma durante a expansão. Células formaram esferoides quando cultivadas na placa de quitosana (Figura 8).
A maioria das células cultivadas em condições padrão expressa CD44 (98,6 ± 1,62%), CD90 (88,7 ± 3,04%) e CD105 (77,9 ± 6,84%), enquanto expressão de CD34 (0,07 ± 0,17%) e MHC II (1,33 ± 1,12%) eram muito baixas. Sob cultura condicionada, os níveis de expressão de CD44 (97,0 ± 2,12%) e CD34 (± 1,13 1.58%) não diferiram das culturas padrão, enquanto os níveis de expressão de CD90 (33,3 ± 37,1%) e CD105 (54,0 ± 19,0%) diminuiu e MHC II (2,84 ± 0,98%) aumentou35.
Após o isolamento e caracterização de UCM-MSCs em vitro, o comportamento biológico das células condicionados foi comparado com a das células cultivadas sob condições normais em um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em ratos. Defeitos não tratados em cada rato serviram como controles internos. Pós-operatório inchaço foi mínimo em todos os ratos e resolvidos dentro de 48 h. De acordo com o RGS, nenhum dos ratos exibidos sinais de dor ou sofrimento como orbital de aperto, nariz/bochecha achatamento, ou alterações de orelha/Suiça. Todos os ratos consumiram um intervalo normal de 3 – 4 pelotas ou 15 a 20 gramas de ração diária ao longo do estudo. O escore total e funcional, incluindo assistida e desassistido membro posterior permanente, bem como partituras de escalada foi maior nos ratos normais, comparados com a de ratos operados em 7 dias (n = 8, p < 0,0001, tabela 3). No entanto, o escore funcional total voltou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia (n = 12, p = 0,78). Portanto, modelos de defeito do tendão patelar bilateral de rato tem demonstrados ser eficaz para limitar a variação inter-individual e reduzir o número necessário de animais sem causar morbidade significativa (Video 1–5).
Cerca de 37% dos tendões coletados em 28 dias apareceu acentuadamente espessada (Figura 7). Este espessamento foi igualmente distribuído entre defeitos vazios e tratados. Totais resultados histológicos aumentaram com o tempo em defeitos não tratados (n = 20, p = 0.0034). Quando cada componente da nota de cura foi avaliada de forma independente, o único parâmetro mudando com o tempo consistiu em formação de cartilagem, que aumentou entre 7 e 28 dias (n = 20, p < 0,0001). Angiogênese tende a aumentar com o tempo (p = 0,3), mas a formação de colágeno não diferiram (p = 0,69). Ao exame histológico, inflamação foi observada em todos cortes histologicos dos tendões examinados em 7 dias após a cirurgia, independentemente da presença de tratamento. Um hematoma esteve presente em todos os defeitos tratados. Golo de angiogênese histológica (tabela 2, Figura 9) variou entre 0 e 1, sugerindo a arteríola moderada e infiltração capilar, enquanto grau de colágeno marca (tabela 2, Figura 10) variaram de 2 a 3 global, sugerindo formação de colágeno moderada a extensa. Golo de formação de cartilagem (tabela 2, Figura 11) variou de 0 a 2 sugerindo sem formação de cartilagem, para moderar a formação de cartilagem de 25% a 50% da área de secção de tendão. Todas as figuras histológicas são orientadas com o lado esquerdo como o aspecto anterior e a parte superior como o aspecto medial da seção transversal da porção média do tendão.
Figura 1: posicionamento de ratos e preparação para a cirurgia asséptica. Cada rato foi colocado entre duas garrafas de água de 0,5 L com água morna e coberta com um pano para manter a temperatura corporal e posição, enquanto a prevenção de lesões de pele. As extremidades de cada rato foram gravadas para a mesa e o seu corpo foi coberto com plástico bolha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: modelo cirúrgico do defeito do tendão patelar (alinhamento). Um fio de Kirschner 0.99 mm de diâmetro está alinhado contra o tendão como um modelo para padronizar o tamanho do defeito em cada membro.
Figura 3: modelo cirúrgico do defeito do tendão patelar (incisões). Duas incisões de espessura total são feitas em cada lado do fio de Kirschner para isolar uma parte central do tendão.
Figura 4: modelo cirúrgico do defeito do tendão patelar (ressecção). A secção central é ressecada proximal e distal, criando um defeito combinando o tamanho do fio de Kirschner. Ressecado área é mostrada na caixa de linha pontilhada.
Figura 5: aparência pós-operatória de operado reprima. Fáscia foi fechada com um padrão cruzado e pele foi fechada com um padrão de intradérmico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: preparação do plasma condicionado registrado para a entrega da UCM-MSCs. Células-tronco foram suspensas em plasma condicionado antes da ativação. O coágulo resultante foi inserido no tendão patelar defeitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Bruta de aparência normal (C, D) e engrossado (A, B) tendões. (, C) Vista posterior; (B, D) Vista lateral; Setas largas identificam a tíbia e setas finas identificam os tendões.
Figura 8: morfologia de células cultivadas em cultura de tecidos da placa abaixo dos 19% nível de oxigênio (grupo padrão: A) e quitosana filme abaixo dos 5% nível de oxigênio (grupo condicionado: B). isolou pilhas foram eixo em forma de grupo padrão (A) e formaram esferoides no grupo condicionado (B). Barra de escala = 400 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: representante luz micrografias usadas para a classificação de angiogênese. Após 7 dias de cura, tendões sem tratamento receberam uma nota de 0 (A, D), Considerando que aqueles com células condicionadas (C, F) ou células padrão (B, E) receberam um grau de 0,5 e 0, respectivamente. Em 28 dias, os tendões não tratados (G, J) receberam uma nota de 0, Considerando que aqueles com condicionado células (eu,L) ou células padrão (H,K) receberam dezenas de 1,0 e 0,5, respectivamente. As setas identificam vasos sanguíneos presentes na amostra do tendão. As setas apontando para os vasos sanguíneos em ampliação de 100 X correspondem as mesmas setas apontando para os vasos sanguíneos na ampliação de 400x. Tecido do tendão normal (M, N). Tricromo de Masson (A, B, C, G, H, I, M); mancha de hematoxilina e eosina (D, E, F, J, K, L, N); Barra de escala = 100 µm (A-N). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: representante luz micrografias usadas para a classificação de colágeno. Após 7 dias de cura, tendões sem tratamento receberam um grau de 2.5 (A, D) Considerando que aqueles com tratamento (B, C, E, F) receberam um grau de 3.0. Em 28 dias, os tendões não tratados (G, J) receberam um grau de 3.0, Considerando que aqueles com condicionado células (eu, L) ou contagens de células padrão (H, K) recebidas do 1.0 e 3.0, respectivamente. A desorganização das fibras do tendão pode ser apreciada em 400 inserções de X (H, K). Tecido do tendão normal (M, N). Tricromo de Masson (A, B, C, G, H, I, M); mancha de hematoxilina e eosina (D, E, F, J, K, L, N); Barra de escala = 100 µm (A-N). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: representante luz micrografias usadas para a classificação de cartilagem. Após 7 dias de cura, tendões sem tratamento (A, D), aqueles com qualquer condicionado nas células (C, F) ou padrão (B, E), todos receberam uma nota de 0. Em 28 dias, os tendões não tratados (G, J) receberam um grau de 1.0, Considerando que aqueles com condicionado células (eu, L) ou células padrão (H, K) recebidas partituras de 0 e 2,0, respectivamente. As setas estão apontando para condrócitos presentes na amostra do tendão. As setas apontando para os condrócitos na ampliação de 100 X correspondem as mesmas setas apontando para os condrócitos a ampliação X 400. Tecido do tendão normal (M, N). Tricromo de Masson (A, B, C, G, H, I, M); mancha de hematoxilina e eosina (D, E, F, J, K, L, N); Barra de escala = 100 µm (A-N). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: avaliação da função ambulatorial em ratos. Cronometrado em pé sem ajuda de membro posterior (1 – 5 s: escore 1) observou-se 4 h no período pós-operatório. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Video 2: avaliação da função ambulatorial em ratos. Cronometradas membro posterior permanente com membros dianteiros assistidos (0 – 5 s: Pontuação 0) observou-se 4 h pós operatório. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 3: avaliação da função ambulatorial em ratos. Cronometrado em pé sem ajuda de membro posterior (1 – 5 s: escore 1), cronometrado membro posterior permanente com membros dianteiros assistidos (5 – 10 s: escore 1) observou-se 14 dias pós operatório. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Video 4: avaliação da função ambulatorial em ratos. Cronometradas membro posterior permanente com membros dianteiros assistidos (10-15 s: Pontuação 2), sem a capacidade de escalar uma parede de gaiola plástica de 17 cm (sem escalada: marcar 0) observou-se 27 dias pós operatório. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Video 5: avaliação da função ambulatorial em ratos. Cronometradas membro posterior permanente com membros dianteiros assistidos (5 – 10 s: escore 1), com a capacidade de escalar uma parede de gaiola plástica 17cm (Sim: escore 1) observou-se 14 dias pós operatório. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
| Teste funcional | 0 | 1 | 2 | 3 | Pontuação |
| Membro posterior stand assistida | 0 – 5 s | > 5 – 10 s | > 10-15 s | > 15 s | |
| Carrinho do membro posterior não assistido | 0-1 s | > 1 – 5 s | > 5 s | ||
| Habilidade de escalada | Não | Sim | |||
| Total |
Tabela 1: sistema para avaliar a função ambulatorial em ratos de pontos. Um sistema de Pontuação (0-6) foi desenvolvido para avaliar a função ambulatorial com base em 3 atividades incluindo cronometrado membro posterior permanente com membros dianteiros suportados (0-3), cronometrado de pé sem ajuda de membro posterior (0-2) e a capacidade de escalar uma parede de gaiola plástica de 17 cm (0-1).
| Grau de colágeno | |||||
| 0 | Normal colágeno orientado tangencialmente | ||||
| 1 | Leve muda com fibras colágenas desorganizado em menos de 25% | ||||
| 2 | Moderadas alterações com fibras de colágeno entre 25% e 50% desorganizado | ||||
| 3 | Mudanças marcadas com mais de 50% desorganizado de colágeno | ||||
| Grau de angiogênese | |||||
| 0 | Moderada infiltração de tecido com arteríolas | ||||
| 1 | Presença de capilares | ||||
| 2 | Não há infiltração da vasculatura | ||||
| Formação de cartilagem | |||||
| 0 | Sem formação de cartilagem | ||||
| 1 | Nódulos isolados de cartilagem hialina | ||||
| 2 | Formação de cartilagem moderada de 25% a 50% | ||||
| 3 | Formação de cartilagem extenso, mais de 50% do campo envolvido | ||||
Tabela 2: Histologia marcando notas. Classificação histológica das seções foram classificadas com base no grau de colágeno, grau de angiogênese e formação de cartilagem (adaptado de Rosenbaum et al . 39)
| Grupo | Quer dizer ± SEM |
| Normal (n = 3) | 6,00 ± 0,48 |
| 7 dias após a cirurgia (n = 8) | 2,25 ± 0,30 |
| 28 dias após a cirurgia (n = 12) | 5.83 ± 0,24 |
Tabela 3: Funcionais dezenas de ratos normais e ratos não tratados. Golo de funcional de ratos normais e ratos não tratados 7 e 28 dias no pós-operatório foram classificados. n = número de ratos.
Complementar Figura 1: Gating estratégia e exemplo de expressão do marcador de superfície: Os restos foi excluído com base em pequenas FSC e SSC (A). Células vivas foram Selecionadodas com base na coloração negativa com 7-AAD detectado pelo FL3 (B). Isotipo controle correspondente (C) foi usado como controle negativo para criar um portal de células positivas CD44-FITC (D).
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Discussion
Células de equinos foram Selecionadodas para este projeto porque pretendemos eventualmente testar abordagens de candidato na gestão de tendinopatias naturais em cavalos. De fato, lesões dos tendões em cavalos são atraentes como modelos naturais de tendinopatia no homem por causa da similaridade biológica entre os equino flexor digital superficial e tendão de Aquiles em seres humanos41. Marcadores superfície celular CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II foram selecionados para immunophenotyping das células, em conformidade com os critérios recomendados pela sociedade internacional de terapia celular42. Em um estudo recente, eqUCM-MSCs foram positivos para CD44 e negativo para CD34 e MHC II, independentemente das condições de cultura. As células cultivadas em condições padrão também foram positivas para CD90 e CD105, assim, dos critérios para MSCs em termos de expressão de marcadores de superfície. Além disso, este estudo é o primeiro relatório sobre a formação de esferoides quando eqUCM-MSCs são cultivadas em filme de quitosana, confirmando relatórios anteriores sobre humanos MSCs19,20. Técnicas de cultura de células 3D foi extensivamente exploradas por décadas com o objetivo de criar um ambiente parecido com o nicho fisiológico. Com efeito, este estudo mostrou níveis de expressão gene stemness melhorada de Oct4, Sox2e Nanog e maior diferenciação potencial, que é consistente com outros relatórios19,20. Outros relataram immunomodulatory melhoradas propriedades43 e cartilagem hialina regeneração44 usando MSCs esferoides. Entre várias técnicas de cultura 3D como frascos de girador, biorreatores de célula rotativa, placa não-aderente, matrizes naturais e sintéticas, filmes de quitosana parecem atraentes para várias razões. Esta abordagem não requer equipamento caro e é econômica em comparação com placas não-aderente com matrizes sintéticas, desde que a quitosana é um subproduto da indústria de frutos do mar. Cultivo de células em filmes de quitosana é tecnicamente fácil. Combinado, estas vantagens permitiria a aplicação clínica em uma grande escala de45.
O modelo de tendão patelar bilateral proposto aqui parece aceitável em termos de morbidade. Nenhuma complicação foi observada em um estudo recente do estudo. Estávamos especialmente preocupados sobre o risco de efeitos estressantes induzida por defeitos grandes o suficiente para permitir que as alterações histológicas e biomecânicas detectáveis. Estas preocupações solicitado a seleção de ratos sobre ratos para este estudo com base em estudos anteriores, relacionados com o tamanho e a maturidade do tendão para modelos pré-clínicos de lesão. Um 'defeito de janela' ou defeito do terço central do tendão patelar tem sido descrito em coelhos46 e ratos30,31 para estudar o tendão cicatrização e aumento. O tendão patelar modelo 'janela defeito' foi encontrado reprodutível para estudar a reparação do tendão em ratos com histologia31,39, biomecânicos de teste de30,31e ex vivo de fluorescência imagem31. Neste estudo, o tamanho do defeito era equivalente ao terço central do tendão patelar e foi padronizado com um fio de Kirschner 0.99 mm de diâmetro como um modelo. Estas dimensões foram adequadas para estudar o tendão se cura sem causar ruptura no pós-operatório. Por causa de seu tamanho anatômico maior contra ratos, ratos podem acomodar defeitos maiores, melhorando a reprodutibilidade da lesão, entrega de tratamento e medidas de resultado.
O protocolo de analgesia administrado aos ratos neste estudo foi eficaz no controle da dor pós-operatória, avaliada com o RGS37,38. Este sistema de pontuação foi selecionado aqui porque ele foi validado anteriormente como detectar mudanças de comportamento pós-operatórias refletindo a dor em ratos37,38. O RGS é baseado em sinais relativamente simples de identificar, como aperto orbital, achatamento do nariz/bochecha e alterações de orelha/Suiça. Ratos também mantiveram uma ingestão de alimentos normais ao longo deste estudo, que suporta ainda mais a eficácia do presente protocolo de analgesia. Com efeito, relatórios anteriores encontraram uma correlação entre a dor pós-operatória e alterações de peso do corpo em ratos tratados com anti-inflamatórios não-esteroides, tais como o meloxicam47. Este agente foi selecionada neste estudo e administração preemptiva foi derivada de estudos em ratos37,cães e48 49, onde a administração de agentes anti-inflamatórios imediatamente antes da cirurgia foi encontrada para atenuar a dor induzida cirurgicamente. Função foi avaliada como um indicador adicional da dor pós-operatória, usando um sistema de Pontuação para avaliar o uso de ambos os membros pélvicos. As três atividades selecionadas aqui fornecem uma apreciação geral sobre a amplitude de movimento e a disponibilidade para suportar o peso sobre os membros pélvicos. Este sistema de pontuação foi derivado de ambos os estudos estáticos e dinâmicos de recuperação funcional em ratos50,51 e foi desenhado para comparar o tempo de curso dos resultados funcionais observadas. Resultados indicam que o defeito bilateral tendão induziu uma diminuição temporária na função em 7 dias, com um retorno ao normal dentro de 28 dias. O escore de função aparece mais sensível na detecção de dor secundária à condições ortopédicas que o RGS. Testes funcionais semelhantes têm sido usados para avaliar a tendão cicatrização tais como o índice funcional de Aquiles28, pata e stride medidas51, ou outros de sistemas marcando52macroscópica.
Este modelo foi projetado para reduzir o número de animais incluídos no estudo, enquanto diferenciando os resultados entre os tendões não tratados e dois tratamentos baseados em células-tronco. Os efeitos dos tratamentos testados neste estudo são discutidos em outra publicação36. O modelo usado aqui permitiu a deteção das diferenças de tratamento através do uso de um controle interno de cada rato, combinado com testes biomecânicos não-destrutiva dos tendões em 28 dias (dados não apresentados).
Registrados condicionado plasma foi selecionado por causa de seu uso comum como um portador para células-tronco, biocompatibilidade, acessibilidade e aplicações clínicas atuais na gestão de tendinopatias53,54. Pode ter contribuiu para a cicatrização dos tendões tratados, mas permitiu a retenção local de células-tronco, e não interferir com a comparação dos grupos de tratamento, desde que ambos incluídos a mesma quantidade de plasma condicionado ativado. As características histológicas dos tendões não tratados são consistentes com descrições anteriores de cicatrização do tendão, onde tecido necrótico e feixes de colágeno interrompidos são removidos por enzimas líticas e fagocitose por macrófagos durante a fase de inflamação, que dura até 10 dias pós lesão54,55,56. Durante a fase proliferativa, proliferação celular e vascularização do site reparo é maior em 28 dias depois de reparar o tendão57,,58. Encontramos uma correlação entre a aparente espessamento dos tendões, áreas transversais e baixo módulo de elasticidade de espécimes. Com base nestes resultados, a classificação histológica parece refletir as alterações do tecido que não podem ser desejável e não conduzem a força biomecânica, tais como desorganização das fibras de colágeno, angiogênese e condrogênese. No futuro, a capacidade deste modelo de discriminar com base nas características histológicas de tratamentos pode ser melhorada integrando critérios adicionais, tais como a presença de tenocytes, organização de matriz extracelular, proteoglycan conteúdo, e distribuição das fibras de elastina52,59.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Su, PhD, a análise estatística dos dados. Os autores também agradecer Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, seus conselhos sobre a anestesia e dor gestão protocolos usados no estudo. Este projecto foi apoiado por concessões do Western University of Health Sciences escritório do Vice-Presidente de pesquisa (12678v) e USDA seção 1433 fundos (2090).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
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