Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluering af stamceller behandlinger i en Bilateral Patellar senen skade Model i rotter

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56810
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

Summary

Dette papir beskriver forberedelse og evaluering af navlestreng matrix-afledte mesenkymale stamceller spheroids med en bilateral patellar senen defekt model i en rotte. Denne model blev var forbundet med en acceptabel sygelighed og fundet til at opdage forskelle mellem ubehandlet og behandlede sener, og mellem de to behandlinger testet.

Abstract

Regenerativ medicin giver nye alternativer til forhold, der udfordrer traditionelle behandlinger. Prævalens og sygelighed af tendinopati på tværs af arter, har kombineret med de begrænsede helbredende egenskaber af dette væv, bedt om søgning efter cellulære terapier og fremdrives udviklingen af eksperimentelle modeller at studere deres effektivitet. Navlestrengen matrix-afledte mesenkymale stamceller (UCM-MSC) er tiltalende kandidater, fordi de er rigelige, nem at samle, omgå de etiske bekymringer og risikoen for teratom dannelse, men ligner primitive embryonale stamceller tættere end voksen væv-afledte MSCs. betydende interesse har fokuseret på chitosan som en strategi til at forbedre egenskaberne af MSCs gennem klumpformet dannelse. Dette papir detaljer teknikker til at isolere UCM-MSC'er, forberede spheroids på chitosan film, og analysere effekten af klumpformet dannelse på overfladen markør udtryk. Derfor er skabelsen af en bilateral patellar senen skade model i rotter beskrevet for i vivo implantation af UCM-MSC spheroids dannet på chitosan film. Ingen komplikation blev observeret i undersøgelsen med hensyn til morbiditet, understreger stigende effekter, eller væv infektion. Den samlede funktionelle score på de opererede rotter på 7 dage var lavere end normale rotter, men vendte tilbage til normal inden for 28 dage efter operationen. Histologiske snesevis af væv-healing bekræftet tilstedeværelsen af en blodprop i behandlede defekter evalueres på 7 dage, manglende udenlandske krop reaktion, og forløbet helbredende på 28 dage. Denne bilaterale patella senen defekt model var styrer Inter individuel variation via oprettelsen af en intern kontrol i hver rotte, forbundet med acceptabel sygelighed, og tilladt registrering af forskelle mellem ubehandlet sener og behandlinger.

Introduction

Senen skade er en af de mest almindelige årsager til betydelige smerter og muskel atrofi på tværs af arter1. I veterinærmedicin er sener og ledbånd skader af særlig interesse for heste, som 82% af alle personskader i væddeløbsheste indebærer bevægeapparatet, og 46% af dem påvirker sener og ledbånd2,3. Arvæv dannelse påvirker de biomekaniske egenskaber af helede sener og forklarer bevogtet prognosen for tilbagevenden til athletic brug efter flexor senen skader; re-skade, der opstår i løbet af 2 år op til 67% af heste behandles konservativt4. Regenerativ medicin giver nye alternativer til en betingelse, der udfordrer traditionelle behandlinger. Autolog stamcelleterapi har produceret nogle opmuntrende resultater5,6 , men er begrænset af de sygelighed forbundet med væv samling, forsinket administration som følge af forarbejdning/omprogrammering af celler og påvirkning af den patientens sundhedstilstand (f.eks. alder) på egenskaber af stamceller-celler7,8. Disse begrænsninger give et rationale for at undersøge allogene stamceller som off-the-shelf alternativ. Føtal adnexa-afledte celler er tiltalende kandidater, fordi de omgå de etiske bekymringer og risikoen for teratom formation forbundet med embryonale stamceller. Blandt føtal adnexa er navlestrengen matrix (UCM), også kaldet Wharton's Jelly, rigelig og let at samle.

Uanset celle kilde er forbedring af stemness afgørende at etablere en celle bank for allogen regenerativ medicin. Fra et funktionelt synspunkt, kan stemness defineres som potentialet for selvfornyelse og multi lineage differentiering9. Dokumentation af stemness bygger på spredning og differentiering assays, sammen med udtryk af genet markører Oct4, Sox2, og Nanog9. En strategi til at forbedre stemness er baseret på brugen af biomaterialer at tjene som ugyldige fyldstoffer og luftfartsselskaber forbedre spredning og differentiering af UCM-MSCs. Denne fremgangsmåde fjerner bekymringer med hensyn til manipulation af transcriptional faktorer til at omprogrammere voksne celler inducerede pluripotente celler. Blandt biomaterialer betragtes som potentielle smittebærere for stamceller, er chitosan tiltrækkende for sin biokompatibilitet og nedbrydelighed10. Denne naturlige aminopolysaccharide er dannet af alkalisk deacetylation af kitin, den anden mest rigelige naturlige polysaccharid, primært fremstillet som et subproduct skaldyr10. Vi har tidligere undersøgt samspillet mellem MSCs og chitosan stilladser og observeret dannelsen af spheroids11,12,13,14,15, 16. vi også rapporteret om overlegenhed af chondrogenesis chitosan matricer12,13,14,15,16,17, 18. For nylig, to uafhængige undersøgelser beskrevet spheroids dannelsen af fedtvæv og moderkage væv udvundet MSCs kulturperler på en chitosan film19,20. Denne dannelse af spheroids ikke kun forbedret stemness, men også forbedret fastholdelse af stamceller efter i vivo implantation20.

Prævalens og sygelighed af tendinopati på tværs af arter har bedt om udviklingen af eksperimentelle modeller til at studere Patofysiologi af tendinopathies og teste nye behandlinger såsom stamcelle injektioner. I heste er collagenase-induceret senebetændelse en fælles model til at påvise effektiviteten ved hjælp af MSCs i senen reparation21. Relevansen af denne tilgang er begrænset, da injektioner forårsage akut inflammatoriske forandringer, der henviser til, at klinisk tendinopathies sædvanligvis et resultat af kronisk overanstrenger22,23. Derudover kemiske induktion af senen sygdom inducerer en healing svar og replikerer ikke nedsat helingsprocessen i kliniske tilfælde22,23. Excision af et segment af overfladiske digital flexor senen er blevet beskrevet som en kirurgisk model af senebetændelse i heste24. For nylig, en minimalt invasiv metode blev brugt til at begrænse de traumatiske skader til den centrale kerne af overfladiske digital flexor sene25. Kirurgisk modeller ikke simulere den træthed mekanisme, der kan føre til naturlige senen sygdom, og har tendens til at mangle reproducerbarhed i omfanget af skader oprettet25. Uanset model, sygelighed og omkostningerne forbundet med equine modeller af senen er sygdomme yderligere begrænsninger, som berettiger en interesse i gnavere modeller som et første skridt i vivo evaluering af nye behandlingsformer.

En af de vigtigste fordele ved eksperimentelle modeller i gnavere består af omkostninger og muligheden for at styre mellem individuelle variation. Gnavere kan være standardiseret med hensyn til forskellige fysiologiske faktorer på grund af deres hurtige vækst og korte relativt levetider, begrænse kilder til variation og derfor reducerer antallet af dyr, der kræves til at opdage forskelle. Strategier til at fremkalde senen sygdomme hos gnavere har stolet på kemiske induktion, men også på kirurgisk oprettelsen af delvis senen defekter21. Kirurgisk modeller kan simulere naturlige tendinopathies bedre end kemiske modeller, men kan føre til højere sygelighed og katastrofale svigt af beskadigede senen. I henseende synes rotter bedre kandidater end mus for disse modeller, da deres størrelse giver mulighed for skabelse af større fejl, derved at lette evalueringen af væv healing. Sprague-Dawley rotter har været brugt i eksperimentelle studier af tendinopathies i fire store senen grupper: rotator cuff, flexor, Achilles og patella sener26. Blandt disse er modeller der involverer patellar senen særligt tiltrækkende på grund af den større størrelse af denne sene og nem adgang til den27. Patellar senen tillægger den tibial tuberositas quadriceps muskler. Inden for denne extensor mekanisme er patella en sesamoid knogle, der dirigerer handlingen af quadriceps og skildrer det proksimale omfanget af patellar senen. Tilstedeværelsen af benede ankre på de proksimale og distale udvidelser af patellar senen letter biomekaniske tests. Modeller der involverer patellar senen typisk stole på ensidig kirurgisk defekter, med en kontralaterale intakt senen tjener som en kontrol28,29. Den mest almindelige patellar senen defekt model indebærer udtagelse den centrale del (1 mm i bredden) af patellar senen fra den distale spids af knæskallen til indsættelsen af den tibial tuberositas, mens de kontralaterale patellar senen er overladt intakt. Foranstaltninger af resultater har inkluderet histologi, ikke-destruktiv biomekaniske prøvning eller biomekaniske test fiasko, ultrasound imaging, ex vivo fluorescens imaging, brutto observation og funktionsprøver28,30 ,31. Ensidige modeller tillader ikke sammenligning af en foreslået behandling med konservative ledelse for en lignende skade inden for de samme dyr. Tilsvarende kræver sammenligning mellem flere behandlinger separate dyr. En bilaterale model ville eliminere mellem individuelle variationer og reducere antallet af dyr, der kræves for en undersøgelse32. Imidlertid bilaterale skader kan øge sygelighed, og bilaterale halthed kunne hindre behandling evaluering. Et par undersøgelser rapport kort brugen af bilaterale patellar senen defekter i rotter, men fokuserer på virkningerne af behandlinger i stedet for peri-operative ledelse og sygelighed af model33,34.

Denne undersøgelse langsigtede mål er at udvikle en strategi for at forbedre stemness og i vivo overlevelse af UCM-MSCs bestemt til allogen transplantation. For at nå dette mål har vi for nylig rapporteret forbedret stemness af UCM-MSCs ved dannelsen af spheroids på chitosan film og inkubering under hypoksiske miljø35. Disse in vitro- egenskaber var forbundet med forbedret biomekaniske egenskaber af patellar senen defekter behandles med konditioneret UCM-MSCs. baseret på disse resultater, rotte bilaterale patellar senen defekt model synes passende at teste kandidat behandlinger for senen skader36. Formålet med undersøgelsen rapporterede her er at give detaljerede protokoller til isolering og karakterisering af UCM-MSC'er, forberedelse af en biologiske leveringssystemet for stamceller, oprettelse og behandling af bilaterale patella senen defekter og postoperativ Recovery og evaluering af væv, healing inden for fejl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Western University of Health Sciences.

1. isolering og udvidelse af MSCs fra Equine navlestrengen Matrix

  1. Få moderkagen fra en voksen mare (gravid) efter observeret foedselslandets og aseptisk isolere navlestreng fra moderkagen. Holde navlestrengen i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) ved 4 ° C under overførsel indtil behandling.
  2. Vaske navlestrengen to gange med stuetemperatur PBS med 1% P/S i en 50 mL tube. Afsnit navlestreng i 2-tommer lange fragmenter på 150 mm plade og vask i stuetemperatur PBS med 1% P/S i en 50 mL tube to eller tre gange, indtil de fleste af blod er skyllet ud.
  3. Skære navlestrengen på langs for at udsætte fartøjer. Fjerne fartøjer, herunder 2 arterier, en vene og en allantois stilk fra ledningen ved hjælp af saks og pincet. Indsamle navlestrengen matrix (Wharton's Jelly), som er de omkringliggende fartøjer, gelé-lignende matrix, på en 150 mm tallerken ved at skrabe med en skalpel, og hakkekød gelé i fine stykker.
  4. Sted Wharton's Jelly fra 2 – 3 navlestrengen fragmenter (ca 12-15 g) i en 50 mL tube med 15 mL af 0,1% (w/v) collagenase type IA løsning i PBS. Der inkuberes ved 37 ° C med blid ryster for 3-4 h indtil opløst.
  5. Centrifugeres fordøjet væv på 300 x g i 15 min. og Opsug supernatanten. Resuspend fordøjet væv i 15 mL stuetemperatur PBS med 1% P/S, mix af pipettering, centrifugeres ved 150 x g i 5 min og Opsug supernatanten (vask). Gentag vaskemaskine to gange mere.
  6. Resuspend vasket celler i 15 mL stuetemperatur PBS med 1% P/S, mix af pipettering, stamme af med 100 µm celle si, centrifugeres ved 150 x g i 5 min, og Opsug supernatanten.
  7. Forberede næringssubstratet (CM) ved at blande lav glucose Dulbecco ændret Eagle's Medium (LG-DMEM) med føtal bovint serum (FBS) og 1% P/S. sterilisere medium ved filtrering.
  8. Resuspend anstrengt celler i 10 mL af CM præ varmet til 37 ° C, mix af pipettering, overføres til en 25 cm2 vævskultur målekolbe og Inkuber i 5% CO2 på 90% fugtighed og 37.0 ° C. Ændre CM hver 3 dage indtil kulturen når 70 – 80% sammenløb, når kulturen vil være passaged.
  9. Aspirér CM fra kolben for at passage kultur, skylles med 5 mL af stuetemperatur PBS to gange, og frigøre med 3 mL 0,25% trypsin/ethylendiamintetra syre (EDTA) ved 37 ° C i 5 min.
  10. Neutralisere trypsin/EDTA med 6 mL af CM præ varmede 37.0 ° c, mix af pipettering, overføres til en 15 mL tube, centrifugeres ved 150 x g i 5 min, og Opsug supernatanten. Resuspend fritliggende celler i 1 mL af CM, mix af pipettering. Tælle de levedygtige celler benytter trypan blå og hemocytometer. Re-seed i en 25 cm2 vævskultur kolbe på 5.000 celler/cm2, og der inkuberes i 5% CO2 på 90% fugtighed og 37.0 ° C.

2. forberedelse af Spheroids med UCM-MSCs kulturperler på Chitosan film

  1. For at forberede 100 mL 1% (w/v) chitosan opløsning, tilføje 1 g af chitosan i 99 mL destilleret vand (dH2O), og bland godt med en magnetomrører.
  2. Tilføje 670 µL iseddike og fortsætte blanding indtil chitosan opløses og bliver tyktflydende. Det tager normalt 3-4 h.
  3. Tilsæt 500 µL af chitosan løsning i hvert hul i 12-godt vævskultur pladen, og slyng plade for at distribuere chitosan løsning jævnt og dække alle bunden overfladen.
  4. Tørre chitosan løsning belagt plade under laminar flow kabinet uden et dække natten over i 24 timer. Når tørret, dannet tynde film, og de overholdt plade.
  5. Neutralisere chitosan film ved tilsætning af 1 mL 0,5 N natriumhydroxid (NaOH) løsning til hver brønd og Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur. Opsug NaOH fra hver brønd og vaske hver godt med 1 mL af dH2O tre gange. Vask hver godt med 1 mL af 70% ethanol (EtOH) én gang.
  6. For at sterilisere chitosan film, tilsættes 1 mL af 70% EtOH i hver godt, og der inkuberes natten over i laminar flow kabinet. Opsug resterende EtOH fra hver brønd i den følgende dag. Vask hver godt med 1 mL steril PBS tre gange. Sterilisere chitosan film med ultraviolet lys under laminar flow kabinet natten over uden en dækning.
  7. Til form spheroids af UCM-MSC'er, frø udvidet og passaged celler i hver brønd på 5.000 celler/cm2, og der inkuberes i 5% CO2 på 90% fugtighed og 37.0 ° C.
    Bemærk: Celler kan blive udruget under hypoxi eller normoxia, afhængigt af investigator's interesse.

3. angivelse af celleoverflademarkører analyseret via flowcytometri

  1. Forberedelse af en enkelt cellesuspension
    1. Standard plade
      1. Fjern medium fra hver brønd og vaskes to gange med stuetemperatur PBS.
      2. Frigør celler med 500 µL af en celle dissociation reagens til hver brønd af et 12-godt plade for 5-10 min ved stuetemperatur.
      3. Efter inkubering tilsættes 1 ml af farvning buffer (PBS indeholdende 0,5% BSA) i hver brønd og mix af pipettering for at frigøre celler.
      4. Overføre cellesuspension til 15 mL konisk tube og centrifugeres ved 150 x g i 5 min.
    2. Chitosan plade
      1. Indsamle alle spheroids ved sugning medium ved hjælp af en pipette med 1.000 µL spids. Overføre indsamlede medium i en 15 mL konisk slange. Efter indsamling medium, vaske godt ved tilsætning af 1 mL PBS og overføre vasket PBS ind i samme 15 mL konisk rør.
      2. Centrifugeres spheroids ved 150 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
      3. Tilsættes 500 µL af celle dissociation reagens (f.eks., accutase) og der inkuberes i 5-10 min ved stuetemperatur. Mix af pipettering ved hjælp af en 1 mL tip indtil spheroids tage afstand og er ikke længere synlige.
      4. Der tilsættes 1 mL af farvning buffer ind i enkelt cellesuspension og centrifugeres ved 150 x g i 5 min.
  2. Vask celler
    1. Fjern supernatanten fra den koniske rør og genopslæmmes celler i 3 mL kold farvning buffer. Hold celler på is i hele eksperiment fra dette trin.
    2. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min (vask).
    3. Vaskes to gange.
  3. Farvning celler
    1. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min og Fjern supernatanten.
    2. Tælle levedygtige celler ved hjælp af en trypan blå og hemocytometer. Genopslæmmes 1 x 106 celler i 50 µL blokerende buffer (PBS indeholdende 10% hest serum) og Inkuber i 30 min på is.
    3. Tilsæt 10 µL fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugerede antistoffer (CD44, CD90, CD105, CD34, store histocompatibility complex (MHC) klasse II eller isotype kontrol for hver antistof) og 40 µL af farvning buffer, derefter inkuberes beskyttet mod lys for 1 h på is.
    4. Tilsættes 3 mL kold farvning buffer og bland, centrifugeres ved 300 x g i 5 min, og Opsug supernatanten (vask).
    5. Gentag vask to gange.
    6. Genopslæmmes celle pellet i 0,5 mL af farvning buffer
    7. Tilsæt 5 µL af 7-ald (levedygtighed farvestof) og Inkuber i 30 min på is
    8. Analysere farves celle prøver af flow Flowcytometret. Udelukke resterne af deres mindre SSC og FSC, og identificere levedygtige celler med lavere udbredelse af 7-ald. Plot FL1 og FL2 på y - og x-akserne, henholdsvis. Bruge isotype til at oprette en gate ovenfor den diagonale streg. Mål procentdelen af positivt farvede celler i området. Regne mindst 20.000 begivenheder/prøve (tillægs figur 1).
    9. Måler procentdelen af celler farves med antistoffer af gating levedygtige celler og auto-fluorescens, og fratræk procentdel af celler farves med isotype kontrol.

4. bilaterale Patellar senen defekt Model i rotter

  1. Vælg Sprague-Dawley rotter (voksne mandlige, 4 – 5 måneder gammel, vægt 350-375 g). Bemærk den relativt store størrelse af rotter bruges til denne model.
  2. Bedøver og anvende kunstige øje lubricant rotte med 8% Sevofluran i 2 L/min. 100% ilt leveret via maske, indtil forsvinden af knivspids-tå refleks i salen, induktion.
  3. Administrere en intramuskulær injektion af Meloxicam (1 mg/kg) som forebyggende analgesi.
  4. Placere rotten mellem to 0,5 L vand flasker fyldt med varmt vand og dækket med en klud til at opretholde kropstemperaturen og stilling, mens forhindrer huden skade. Tape hver ende til tabellen. For at reducere risiko for hypotermi, dække kroppen med bobleplast (figur 1).
  5. Vedligeholde anæstesi med kontinuerlig flow af 5% Sevofluran i 1 L 100% ilt blanding via næsen kegle, med dyr på dorsale recumbency på vand, varme pad.
  6. For at undgå hud trauma, ikke klippe de kirurgiske websteder. I stedet anvende hår remover cream over begge kvæler. Bruge en tunge depressor for at fjerne fløde og hår.
  7. Skrub operationsstedet med klorhexidin digluconate krat og skyl med 70% ethanol 3 gange.
  8. Incise huden med en steril #15 skalpel blade i en proksimalt for distal retning på craniomedial aspekt af knæ. Start snit ca 1 cm proksimalt for niveauet af patella, og udvide det ca 5 mm distalt for den tibial tuberkelbakterier.
  9. Afspejle huden til at udsætte den patellar senen ved at frigøre den underliggende subkutane væv med en #15 skalpel klinge.
  10. Bruger #15 skalpel blade, punktafgifter den midterste tredjedel af hver patellar senen (1 mm) fra den distale del af knæskallen til den tibial tuberositas.
    1. Justere en 0,99 mm-diameter Kirschner wire mod senen som en skabelon for at standardisere størrelsen af defekten i hver legemsdel (figur 2).
    2. Gøre 2 fuld-tykkelse snit på hver side af Kirschner wiren med en #15 skalpel bladene til at isolere den centrale del af senen (figur 3). Resect afsnittet centrale proksimalt og distalt med fine Iris saks (figur 4).
    3. Før du lukker fascia af knæ, indsætte blodprop (blandet cellesuspension og AVS-landene) for passende behandlingsgrupper som beskrevet i 5.5. Luk fascia med et korsbånd mønster og huden med en intradermal mønster ved hjælp af 5-0 polyglactin 910 suturer (figur 5).
  11. Gentag fremgangsmåden på de kontralaterale knæ.
    Bemærk: En defekt er randomiseret til en behandling (stamceller betinget chitosan eller kulturperler på standard plader). De kontralaterale defekt venstre tomme, at fungere som interne kontrol.
  12. Efter kirurgi, administrere 4 tabletter af enrofloxacin (2 mg/tablet, mundtligt, én gang dagligt) og en tablet af meloxicam (2 mg/tablet, mundtligt, én gang dagligt) i 7 dage. Disse doser blev anbefalet af en laboratorium animalsk dyrlæge og godkendt i IACUC protokol.

5. levering af MSCs i Patellar senen defekt

  1. Bedøver en sund rotte, som ikke anvendes til patellar senen defekt skabelse med 8% Sevofluran i 2 L/min. 100% ilt leveret via maske, indtil forsvinden af knivspids-tå refleks i salen, induktion.
  2. Indsamle 5 mL blod af cardiac punktering fra bedøvede Sprague-Dawley rotte (voksne mandlige, 4 – 5 måneder gammel, vægt 350-375 g), i en 5 mL sprøjte med en 20 G nål indeholdende 1 mL af syre-citrat-dextrose (5:1 v/v).
  3. Aflive rotten efter cardiac punktering og blod samling, ved intracardial injektion med pentobarbital (100 mg/kg), mens under samme anæstesi.
  4. Der centrifugeres prøve på 350 x g i 15 min. ved stuetemperatur. Overføre supernatanten og gemme delprøver (120 µL) ved-20 ° C indtil brug.
  5. Umiddelbart før i vivo implantation, tø den ovenstående delprøve og bland 20 µL med 0,5 x 106 MSCs (fra enten 1.9 eller 3.1.2.1) løsriver sig fra standard plader ved hjælp af trypsin/EDTA eller indsamle fra chitosan plader af rødmen (med PBS/medium).
  6. Tilføje 6 µL af 10% calcium chloride (CaCl2) til de resterende 100 µL af optøede plasma i et godt af 96-brønd plade til at aktivere plasmaet og fremkalde dannelse af en blodprop (aktiveret konditioneret plasma: ACP).
  7. Bland cellesuspension (20 µL) og AVS-landene (100 µL) til at danne en blodprop (figur 6). Placer blodprop i patellar senen defekten lavet før du lukker fascia af knæ (Se trin 4.10.3).

6. funktionelle resultat

  1. Overvåge rotter to gange om dagen for tegn på smerter, baseret på rotte grimasse skala (RGS)37,38 og hævelse over implantation websteder.
    Bemærk: Et pointsystem (0-6) blev udviklet til at evaluere Ambulant funktion baseret på 3 aktiviteter, herunder tidsbestemte hind lemmer stående med forbens understøttes (0-3), timet uden hjælp hind lemmer stående (0-2), og evnen til at forcere en 17 cm plast bur væg (0-1) ( Tabel 1).
  2. Evaluere rotter for de to hind lemmer stående aktiviteter i om morgenen og aftenen hver gang punkt til at beregne en gennemsnitlig score.
  3. Evaluere rotter muligheden for at med held klatre en 17 cm plast bur væggen med begge bagben lemmer at nå toppen.

7. brutto udseende og histopatologi af Patellar senen

  1. Aflive rotter i 7 dage (for at evaluere betændelse) eller 28 dage (for at evaluere væv healing) efter behandling af intracardial injektion med pentobarbital (100 mg/kg) under anæstesi med 8% Sevofluran og 2 L 100% ilt leveret via maske.
  2. Høste patella-senen-tibia tuberositas enheder af skalpel og saks efter aktiv dødshjælp. Fjerne bløde væv og ledbånd omkring knæ, undtagen patellar senen.
  3. Undersøge hver prøve for brutto udseende og fortykkelse af senen (figur 7).
  4. Orientere modellen ved at placere en kirurg knude af 5,0 Polydioxanone på den proksimale og laterale aspekt af senen. Løse hver prøve i 10% neutrale bufferet formalin løsning og få tværgående sektioner (5 µm) fra midten del af hver senen.
  5. Pletten sektioner ved hjælp af hæmatoxylin og eosin og Masson's Trichrome farvning følge standardprotokoller.
  6. Undersøge sektion for at påvise tilstedeværelsen af hæmatom inden for defekt, såvel som patologiske ændringer såsom betændelse.
  7. Evaluere den histologiske score af sektioner ved hjælp af det tidligere udgivne pointsystemet, baseret på kollagen grade, graden af angiogenese og brusk dannelse (tabel 2)39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaterne præsenteres i den aktuelle undersøgelse, da betyde ± SD (standardafvigelse). Celler blev isoleret fra umbilical snore af 6 hopper, og procentdelen af isolerede cellelinjer udtrykker hver celle overflade markør under standard eller chitosan conditioning blev sammenlignet med en Friedman test, som en ikke-parametrisk variansanalyse med gentagne foranstaltninger. For sene defekt modeloprettelse, 8 rotter blev brugt til 7 dage efter operationen vurdering og 12 rotter blev brugt til 28 dage vurdering. Resultaterne af funktionelle resultater præsenteres som betyder ± SEM (standard fejl af middelværdien) og sammenlignet ved hjælp af t-test. UCM blev valgt som en cellulær kilde på grund af sin overflod, lette indsamling og overlegen spredning i forhold til andre føtale adnexa kilder40. Celler isoleret fra UCM kulturperler på standard plader opretholdt en fibroblast-lignende figur i hele udfoldelse. Celler dannet spheroids når kulturperler på chitosan plade (figur 8).

Fleste celler dyrkes under standardbetingelser udtrykt CD44 (98,6 ± 1.62%), CD90 (88.7 ± 3,04%), og CD105 (77,9 ± 6,84%), mens udtryk af CD34 (0,07 ± 0,17%) og MHC II (1,33 ± 1,12%) var meget lave. Under konditioneret kultur, udtryk niveauer af CD44 (97.0 ± 2,12%) og CD34 (1,13 ± 1,58%) ikke afviger fra standarden kulturer, mens udtrykket niveauer af CD90 (33.3 ± 37,1%) og CD105 (54.0 ± 19,0%) faldt og MHC II (2,84 ± 0,98%) steg35.

Efter isolering og karakterisering af UCM-MSCs i vitro, den biologiske opførsel af konditioneret celler blev sammenlignet med celler dyrkes under standardbetingelser i en bilateral patellar senen defekt model i rotter. Ubehandlet defekter i hver rotte fungerede som interne kontroller. Postoperativ hævelse var minimal i alle rotter og løst inden for 48 timer. Ifølge RGS vises ingen af rotter tegn på smerte eller lidelse såsom orbital stramning, næse/kinden udfladning, eller øre/bakkenbart ændringer. Alle rotter forbruges en normal række 3 – 4 pellets eller 15 – 20 gram foder dagligt under hele undersøgelsen. Den samlede funktionelle score, herunder assisteret og ikke-støttede hind lemmer stående samt klatring scoringer var højere i normale rotter sammenlignet med betjente rotter i 7 dage (n = 8, p < 0.0001, tabel 3). Imidlertid den samlede funktionelle score vendt tilbage til normal inden for 28 dage efter operationen (n = 12, p = 0,78). Derfor, rotte bilaterale patellar senen defekt modeller har vist sig at være effektive til at begrænse indbyrdes individuel variation og reducere det nødvendige antal dyr uden at forårsage betydelig sygelighed (Video 1-5).

Omkring 37% af sener, der opsamlet på 28 dage syntes markant fortykket (figur 7). Denne fortykkelse var ligeligt fordelt mellem Tom og behandlede defekter. Samlede histologiske scores steget med tiden i ubehandlet defekter (n = 20, p = 0.0034). Hvornår hver enkelt komponent af den helbredende score blev evalueret uafhængigt, den eneste parameter ændrer med tid bestod af brusk dannelse, som steg mellem 7 og 28 dage (n = 20, p < 0,0001). Angiogenese tendens til at stige med tiden (p = 0,3), men kollagen dannelse ikke afviger (p = 0,69). Ved histologisk undersøgelse, blev betændelse observeret i alle de sener væv sektioner undersøgt på 7 dage efter operationen, uanset forekomsten af behandling. Et hæmatom var til stede i alle behandlede defekter. Histologiske angiogenese scores (tabel 2, figur 9) varierede fra 0 til 1, tyder på moderat arteriole og kapillær infiltration, mens kollagen grade scorer (tabel 2, fig. 10) varierede fra 2 til 3 overordnede, tyder på, moderat til omfattende kollagen dannelse. Brusk dannelse scores (tabel 2, Figur 11) varierede fra 0 til 2 foreslår ingen brusk dannelse, at moderat brusk dannelsen af 25% til 50% af senen sektion område. Alle histologiske tal er orienteret med den venstre side som den forreste del, og toppen som den mediale aspekt af den tværgående del af midten del af senen.

Figure 1
Figur 1: placering af rotter og forberedelse til aseptisk kirurgi. Hver rotte var placeret mellem to 0,5 L vand flasker fyldt med varmt vand og dækket med en klud til at opretholde kropstemperaturen og stilling, mens forhindrer huden skade. Yderpunkterne af hver rotte var tapede til tabellen og dens legeme var beklædt med bobleplast. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kirurgisk model af patellar senen defekt (alignment). En 0,99 mm-diameter Kirschner ledning er justeret mod senen som en skabelon for at standardisere størrelsen af defekten i hver legemsdel.

Figure 3
Figur 3: kirurgisk model af patellar senen defekt (indsnit). To fuld-tykkelse indsnit er lavet på hver side af Kirschner ledning til at isolere en central del af senen.

Figure 4
Figur 4: kirurgisk model af patellar senen defekt (resektion). Den centrale sektion er resektion proksimalt og distalt, at skabe en defekt matche størrelsen af Kirschner wire. Resektion område er vist inden for stiplede linje boks.

Figure 5
Figur 5: postoperativ udseende betjente kvæler. Fascia var lukket med et korsbånd mønster og huden var lukket med en intradermal mønster. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: forberedelse af aktiverede konditioneret plasma for levering af UCM-MSCs. Stamceller blev suspenderet i konditioneret plasma før aktivering. Den resulterende blodprop blev indsat i patellar senen defekter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Brutto udseende af normal (C, D) og fortykket (A, B) sener. (A, C) Posterior udsigt; (B, D) Lateral udsigt; Blokpile identificere skinnebenet og tynde pile identificere sener.

Figure 8
Figur 8: morfologi af celler dyrkes på vævskultur plade under 19% ilt niveau (standard gruppe: A) og chitosan film under 5% ilt niveau (konditioneret gruppe: B). isolerede celler blev spindel formet på standard gruppe (A) og dannede spheroids på konditioneret gruppe (B). Skalalinjen = 400 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: repræsentative lys micrographs bruges til klassificering af angiogenese. Sener med ingen behandling modtaget efter 7 dage af healing, en kvalitet af 0 (A, D), mens dem med enten aircondition celler (C, F) eller standard celler (B, E) modtog en klasse af 0,5 og 0, henholdsvis. På 28 dage modtaget ubehandlet sener (G, J) en kvalitet af 0, mens dem med aircondition celler (jeg,L) eller standard celler (H,K) modtaget snesevis af 1.0 og 0,5, henholdsvis. Pilene identificere blodårerne i senen prøven. Pilene peger på blodkarrene i 100 X forstørrelse svarer til samme pilene peger på blodkarrene i 400 x forstørrelse. Normal senen væv (M, N). Masson's trichrome pletten (A, B, C, G, H, I, M); hæmatoxylin og eosin pletten (D, E, F, J, K, L, N); Skalalinjen = 100 µm (A-N). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: repræsentative lys micrographs bruges til klassificering af kollagen. Sener med ingen behandling modtaget efter 7 dage af healing, en klasse af 2,5 (A, D) der henviser til dem med behandling (B, C, E, F) modtog en klasse af 3.0. På 28 dage modtaget ubehandlet sener (G, J) en klasse af 3.0, mens dem med aircondition celler (I, L) eller standard celler (H, K) modtaget snesevis af 1.0 og 3.0, henholdsvis. Uorganiseret af senen fibre kan blive værdsat i 400 X mellemværker (H, K). Normal senen væv (M, N). Masson's trichrome pletten (A, B, C, G, H, I, M); hæmatoxylin og eosin pletten (D, E, F, J, K, L, N); Skalalinjen = 100 µm (A-N). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: repræsentative lys micrographs bruges til klassificering af brusk. Efter 7 dage af healing, sener med ingen behandling (A, D), dem med enten aircondition celler (C, F) eller standard celler (B, E), alle modtaget en klasse 0. På 28 dage modtaget ubehandlet sener (G, J) en klasse af 1.0, mens dem med aircondition celler (I, L) eller standard celler (H, K) modtaget snesevis af 0 og 2.0, henholdsvis. Pilene peger på chondrocytter til stede i senen prøven. Pilene peger på chondrocytter i 100 X forstørrelse svarer til samme pilene peger på chondrocytter i 400 X forstørrelse. Normal senen væv (M, N). Masson's trichrome pletten (A, B, C, G, H, I, M); hæmatoxylin og eosin pletten (D, E, F, J, K, L, N); Skalalinjen = 100 µm (A-N). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: evaluering af Ambulant funktion i rotter. Tidsindstillet uden hjælp hind lemmer stående (1-5 s: score 1) var observeret 4 h post-operatively. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 2: vurdering af Ambulant funktion i rotter. Tidsindstillet hind lemmer stående med forbens bistået (0-5 s: score 0) blev bemærket 4 h post operativt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 3: evaluering af Ambulant funktion i rotter. Tidsindstillet uden hjælp hind lemmer stående (1-5 s: score 1), timet hind lemmer stående med forbens bistået (5 – 10 s: score 1) blev bemærket 14 dage efter operativt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 4: evaluering af Ambulant funktion i rotter. Tidsindstillet hind lemmer stående med forbens bistået (10 – 15 s: score 2), uden mulighed for at bestige et 17 cm plast bur væg (ingen klatring: score 0) blev bemærket 27 dage efter operativt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 5: evaluering af Ambulant funktion i rotter. Tidsindstillet hind lemmer stående med forbens bistået (5 – 10 s: score 1), med evnen til at forcere en 17 cm plast bur væg (ja: score 1) blev bemærket 14 dage efter operativt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Funktionelle Test 0 1 2 3 Score
Hind lemmer stå assisteret 0-5 s > 5 – 10 s > 10-15 s > 15 s
Hind lemmer stå uden hjælp 0-1 s > 1-5 s > 5 s
Klatring evne Nej Ja
I alt

Tabel 1: pointsystem for at evaluere Ambulant funktion i rotter. Et pointsystem (0-6) blev udviklet til at evaluere Ambulant funktion baseret på 3 aktiviteter herunder timet hind lemmer stående med forbens understøttes (0-3), timet uden hjælp hind lemmer stående (0-2), og evnen til at forcere en 17 cm plast bur væg (0-1).

Kollagen grade
0 Normal kollagen orienterede tangentielt
1 Mild ændringer med kollagen fibre, mindre end 25% uorganiseret
2 Moderate ændringer med kollagen fibre mellem 25% og 50% uorganiseret
3 Markante ændringer med collagen mere end 50% uorganiseret
Graden af angiogenese
0 Moderat infiltration af væv med arterioler
1 Tilstedeværelsen af kapillærer
2 Ingen Vaskulaturen infiltration
Brusk dannelse
0 Ingen brusk dannelse
1 Isolerede hyaline brusk knuder
2 Moderat brusk dannelsen af 25-50%
3 Omfattende brusk dannelse, mere end 50% af feltet involveret

Tabel 2: Scoring lønklasser histologi. Histologiske score på sektioner var klassificeret baseret på kollagen grade, graden af angiogenese og brusk dannelse (tilpasset fra Rosenbaum et al. 39)

Gruppe Betyde ± SEM
Normal (n = 3) 6.00 ± 0,48
7 dage efter operationen (n = 8) 2.25 ± 0,30
28 dage efter operationen (n = 12) 5.83 ± 0,24

Tabel 3: Funktionel snesevis af normale rotter og ubehandlet rotter. Funktionelle snesevis af normale rotter og ubehandlet rotter 7 og 28 dage var efter operationen klassificeret. n = antallet af rotter.

Tillægs figur 1: Gating strategi og eksempel på overfladen markør udtryk: Resterne var udelukket baseret på små FSC og SSC (A). Levende celler blev udvalgt på grundlag af negative farvning med 7-ald opdaget af FL3 (B). Isotype matchede kontrol (C) blev brugt som negativ kontrol til at skabe en port af CD44-FITC positive celler (D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Equine celler blev udvalgt til dette projekt, fordi vi i sidste ende har til hensigt at teste kandidat tilgange i forvaltningen af naturlige tendinopathies i heste. Senen skader hos heste er faktisk tiltrækkende som naturlige modeller af tendinopati i mand på grund af den biologiske lighed mellem equine overfladiske digital flexor og achillessenen i mennesker41. Celle celleoverflademarkører CD44, CD90, CD105, CD34 og MHC II blev udvalgt til Immunofænotypning af celler, i overensstemmelse med de kriterier, der anbefales af det internationale samfund for cellulære terapi42. I en nylig undersøgelse var eqUCM-MSCs positiv for CD44 og negative for CD34 og MHC II, uanset kultur betingelser. Celler dyrkes under standardbetingelser var også positive for CD90 og CD105, derved opfylder kriterierne for MSCs i form af udtryk af overflade markører. Desuden, er denne undersøgelse den første rapport om dannelsen af spheroids når eqUCM-MSCs er kulturperler på chitosan film, bekræfter tidligere rapporter om menneskelige MSCs19,20. 3D celle kultur teknikker har været grundigt udforsket i årtier med det formål at skabe et miljø, der ligner den fysiologiske niche. Ja, denne undersøgelse viste forbedret stemness gen expression niveauer af Oct4, Sox2, og Nanog, og forbedret differentiering potentiale, som er konsistent med andre rapporter19,20. Andre rapporterede forbedret immunmodulerende egenskaber43 og hyaline brusk regenerering44 ved hjælp af MSCs spheroids. Blandt forskellige 3D kultur teknikker såsom spinner kolber, roterende celle bioreaktorer, ikke-tilhænger plade synes naturlige og syntetiske matricer, chitosan film tiltalende af flere grunde. Denne tilgang kræver ikke dyrt udstyr og er omkostningseffektivt i forhold til ikke-tilhænger plader med syntetisk matricer, da chitosan er et biprodukt af seafood-branchen. Dyrkning af celler på chitosan film er teknisk let. Kombineret, ville disse fordele tillade kliniske anvendelse på en stor skala45.

Den bilaterale patellar sene model foreslået her vises acceptabel med hensyn til morbiditet. Ingen komplikation blev observeret i en undersøgelse for nylig undersøgelse. Vi var især bekymret over risikoen for stressende virkninger fremkaldt af defekter stor nok til at tillade påviselige biomekaniske og histologiske forandringer. Disse bekymringer bliver bedt om udvælgelsen af rotter over mus for denne undersøgelse baseret på tidligere undersøgelser vedrørende størrelse og løbetid af senen til prækliniske skade modeller. En 'vindue defekt' eller central-tredje patellar senen defekt er blevet beskrevet i kaniner46 og rotter30,31 for at studere senen healing og Brystforstørrelse. Patellar senen vindue defekt model er blevet fundet reproducerbar til at studere senen reparation i rotter med histologi31,39, biomekaniske test30,31, og ex vivo fluorescens Imaging31. I denne undersøgelse, størrelsen af defekten var svarende til den midterste tredjedel af patellar senen, og var standardiseret med en 0,99 mm-diameter Kirschner ledning som en skabelon. Disse dimensioner var tilstrækkelige til at studere senen healing uden at forårsage postoperativ brud. På grund af deres større anatomiske størrelse versus mus, kan rotter rumme større defekter, forbedre reproducerbarhed af skade, behandling levering og foranstaltninger af resultatet.

Analgesi protokollen administreres til rotter i denne undersøgelse var effektive i at kontrollere post-operative smerter, vurderet med RGS37,38. Denne pointsystemet blev valgt her, fordi det tidligere blev efterprøvet nemlig afsløre postoperativ adfærdsmæssige ændringer afspejler smerte i rotter37,38. RGS er baseret på tegn relativt enkelt at identificere, orbital stramning, næse/kinden udfladning og øre/bakkenbart ændringer. Rotter også fastholdt en normal fødeindtagelse i hele denne undersøgelse, hvilket yderligere understøtter effekten af protokollens analgesi. Faktisk, tidligere rapporter har fundet en sammenhæng mellem postoperativ smerte og krop vægtændringer i rotter behandlet med non-steroide anti-inflammatoriske, såsom meloxicam47. Denne agent blev valgt i denne undersøgelse og forebyggende administration stammer fra undersøgelser i rotter37,48 og hunde49, hvor administrationen af anti-inflammatoriske lægemidler umiddelbart inden kirurgi har vist sig at dæmpe kirurgisk induceret smerte. Funktionen blev vurderet som en yderligere indikator for postoperativ smerte, ved hjælp af et pointsystem, der er designet til at evaluere brugen af begge bækken lemmer. De tre aktiviteter, der er valgt her give en generel vurdering af vifte af bevægelse og villighed til at bære vægten på bækken lemmer. Denne pointsystemet blev afledt fra både statiske og dynamiske funktionel genopretning undersøgelser i rotter50,51 og var designet til at sammenligne tidsforløb af de funktionelle resultater observeret. Score indikerer, at den bilaterale sene defekt induceret en midlertidig nedgang i funktion på 7 dage, med en tilbagevenden til normale inden for 28 dage. Funktion score vises mere følsomme til at opdage smerte sekundært til ortopædiske betingelser end RGS. Lignende funktionelle tests har været anvendt til at evaluere senen healing som Achilles funktionelle indeks28, paw og skridtlængde foranstaltninger51eller andre makroskopiske scoring systemer52.

Denne model blev designet til at reducere antallet af dyr, der er indskrevet på studiet, mens differentiere resultater mellem ubehandlet sener og to stamcelle-baserede behandlinger. Virkningerne af de behandlinger, der er testet i denne undersøgelse er diskuteret i en anden publikation36. Den model, der anvendes her tilladt påvisning af behandling forskelle ved hjælp af en intern kontrol i hver rotte, kombineret med ikke-destruktiv biomekaniske test af sener på 28 dage (data ikke præsenteres her).

Aktiveret konditioneret plasma blev valgt på grund af sin fælles brug som transportør for stamceller, biokompatibilitet, tilgængelighed og aktuelle kliniske applikationer i forvaltningen af tendinopathies53,54. Det kan have bidraget til helbredelsen af behandlede sener, men tilladt lokale bevarelse af stamceller, og det interfererer ikke med sammenligning af behandlingsgrupper, da både indeholdt det samme antal aktiverede konditioneret plasma. De histologiske funktioner af ubehandlet sener er i overensstemmelse med tidligere beskrivelser af senen healing, hvor nekrotisk væv og forstyrret kollagen bundter er fjernet ved fagocytose og lytisk enzymer af makrofager fasen betændelse, som varer op til 10 dage efter skade54,55,56. I den proliferative fase er cellulære spredning og vaskularisering af webstedet reparation størst på 28 dage efter senen reparation57,58. Vi fandt en sammenhæng mellem den tilsyneladende fortykkelse af sener, tværsnitsareal og lavere modulus af elasticitet af prøver. Baseret på disse resultater, synes den histologiske score at afspejle væv ændringer, der ikke kan være ønskeligt og ikke fører til Biomekanisk styrke, såsom uorganiseret af kollagen fibre, angiogenese og chondrogenesis. Fremover vil denne model evne til at diskriminere behandlinger baseret på histologiske karakteristika kan forbedres ved at integrere ekstra kriterier såsom tilstedeværelsen af tenocytes, ekstracellulære matrix organisation, proteoglycan indhold, og distribution af elastin fibre52,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Su, ph.d., for hendes statistisk analyse af data. Forfatterne også takke Dr. McClure, DVM, ph.d.-DACLAM, for hendes råd om anæstesi og pain management protokoller bruges i undersøgelsen. Dette projekt blev støttet af tilskud fra Western University of Health Sciences Office af Vice President for forskning (12678v) og USDA afsnit 1433 midler (2090).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 10x Hyclone SH30258.01 Consumable
Collagenase type IA Worthington LS004197 Consumable
DMEM low glucose Hyclone SH30021.FS Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03 Consumable
Penicillin/Streptomycin 100x Hyclone SV30010 Consumable
Trypsin 0.25% Hyclone SH30042.01 Consumable
Accutase Innovative Cell Technologies AT104 Consumable
Trypan blue Hyclone SV30084.01 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 Consumable
Chitosan Sigma C3646 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma S8045 Consumable
Bovine Serum Albumin Hyclone SH30574.01 Consumable
Round bottom polystyrene tube Corning 149591A Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC) AbD serotec MCA1082F Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC) AbD serotec MCA47FT Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC) AbD serotec MCA1085F Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control AbD serotec MCA928F Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) abcam ab11415 Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control abcam ab91356 Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC) BD BDB560942 Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC) BD BDB555748 Consumable
7-AAD BD BDB559925 Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Equipment
Vacutainer 5 mL Med Vet International RED5.0 Consumable
Acid-citrate-dextrose Sigma C3821 Consumable
Calcium Chloride Sigma C5670 Consumable
Sevoflurane JD Medical 60307-320-25 Consumable
Rats Charles River Strain code: 400 Experimental animal
Rat surgical kit Harvard apparatus 728942 Equipment
Surgical Blade #15 MEDLINE MDS15115 Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		 Bio Serv F06801 Consumable
Polyglactin 910, 5-0 Ethicon J436G Consumable
Eosin alchol shandon Thermo scientific 6766007 Consumable
Harris Hematoxylin Thermo scientific 143907 Consumable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

Tags

Medicin sag 133 rotte model senen skade model mesenkymale stamceller Chitosan Spheroids Patellar senen vindue defekt
Evaluering af stamceller behandlinger i en Bilateral Patellar senen skade Model i rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J.… More

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. J. Vis. Exp. (133), e56810, doi:10.3791/56810 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter