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Medicine

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56810
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

Summary

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Abstract

Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu Bedingungen, die traditionelle Behandlungen herausfordern. Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten, kombiniert mit den begrenzten heilenden Eigenschaften dieses Gewebes, aufgefordert, die Suche nach Zelltherapien und trieb die Entwicklung der experimentellen Modellen, deren Wirksamkeit zu studieren. Nabelschnur Matrix mesenchymaler Stammzellen (UCM-MSC) sind ansprechende Kandidaten, weil sie sind reichlich vorhanden, leicht zu sammeln, zu umgehen, die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung noch primitiven embryonalen Stammzellen mehr ähneln als Erwachsenen Gewebe abgeleitet MSCs. signifikante Interesse konzentriert sich auf Chitosan als Strategie, um die Eigenschaften des MSCs durch Sphäroid Bildung zu verbessern. Dieses Papier Details Techniken UCM-MSCs isolieren Sphäroide auf Chitosan Film vorzubereiten und analysieren die Wirkung der Sphäroid Bildung auf Surface Marker Ausdruck. Erstellung eines bilateralen Patellasehne Verletzungen Modells bei Ratten wird folglich für in Vivo Implantation der UCM-MSC Sphäroide auf Chitosan Film gebildet beschrieben. Ohne Komplikationen beobachtet wurde in der Studie in Bezug auf Morbidität, steigenden Effekte oder Gewebe Infektion zu betonen. Funktionale Gesamtpunktzahl der betriebenen Ratten nach 7 Tagen war niedriger als die von normalen Ratten, aber innerhalb von 28 Tagen nach der Operation zur Normalität zurückgekehrt. Histologischen Resultate von Heilung des Gewebes bestätigte das Vorhandensein eines Gerinnsels in behandelten Mängel 7 Tage ausgewertet aufgrund fehlender Fremdkörperreaktion und mit 28 Tagen Heilung voran. Dieses bilaterale Patella Sehne defekt Modell war steuert interindividuelle Variation durch Erstellung einer internen Kontrolle in jede Ratte mit akzeptablen Morbidität verbunden und erlaubt die Erkennung von Unterschieden zwischen unbehandelten Sehnen und Behandlungen.

Introduction

Sehnenverletzung ist eines der häufigsten Ursachen für erhebliche Schmerzen und Muskel-Atrophie Arten1. In der Veterinärmedizin sind Sehnen und Bänder Verletzungen von besonderem Interesse bei Pferden, wie 82 % aller Verletzungen im Rennpferde des Muskel-Skelett-Systems einbeziehen, und 46 % der Befragten Einfluss auf Sehnen und Bänder2,3. Bildung von Narbengewebe beeinflusst die biomechanischen Eigenschaften des geheilten Sehnen und erklärt die bewachte Prognose für Rückkehr zur sportlichen Nutzung nach Flexor Sehnenverletzungen; Re-Verletzung tritt innerhalb von 2 Jahren in bis zu 67 % der Pferde4konservativ behandelt. Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu eine Bedingung, die traditionelle Behandlungen herausfordert. Autologe Stammzell-Therapie hat einige ermutigende Ergebnisse5,6 aber ist begrenzt durch die Morbidität verbunden mit Gewebe Sammlung, verzögerte Verwaltung aufgrund der Verarbeitung/Neuprogrammierung der Zellen und der Einfluss von der Gesundheitszustand des Patienten (z.B. Alter) auf die Eigenschaften der Stammzellen Zellen7,8. Diese Einschränkungen bieten eine Begründung für die Untersuchung von allogenen Stammzellen als handelsübliche Alternative. Fetale Adnexe-abgeleitete Zellen sind ansprechende Kandidaten, weil sie die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung verbunden mit embryonalen Stammzellen umgehen. Gehört der fetalen Adnexe Nabelschnur Matrix (UCM), auch benannt Wharton Gelee, reichlich vorhanden und leicht zu sammeln.

Unabhängig von der Zelle Quelle unbedingt verbessern Stemness eine Zellbank für allogene regenerative Medizin zu etablieren. In funktioneller Hinsicht kann Stemness definiert werden als das Potenzial für die Differenzierung der Selbsterneuerung und Multi-Linie9. Nachweis der Stemness stützt sich auf die Proliferation und Differenzierung Assays, zusammen mit Ausdruck des Gens Marker Oct4, Sox2, und Nanog9. Eine Strategie zur Verbesserung der Stemness beruht auf der Verwendung von Biomaterialien als nichtig Füllstoffe und Verbesserung der Proliferation und Differenzierung der UCM-MSCs Träger dienen. Dieser Ansatz verhindert Bedenken in Bezug auf Manipulation der transcriptional Faktoren Reife Zellen in induzierte pluripotente Zellen umzuprogrammieren. Unter Biomaterialien als mögliche Träger Stammzellen zu gewinnen ist Chitosan attraktiv für seine Biokompatibilität und Abbaubarkeit10. Diese natürlichen Aminopolysaccharide bildet alkalischen Deacetylation von Chitin, das zweithäufigste natürliches Polysaccharid in erster Linie als eine Subproduct der Schalentiere10erhalten. Wir haben zuvor untersucht Wechselwirkungen zwischen MSCs und Chitosan Gerüste und beobachtet die Bildung von Sphäroide11,12,13,14,15, 16. berichteten wir auch über die Überlegenheit des werden auf Chitosan Matrizen12,13,14,15,16,17, 18. In jüngerer Zeit, zwei unabhängige Studien beschrieben Sphäroide Bildung von Fettgewebe und Plazenta-Gewebe abgeleitet MSCs auf einem Chitosan Film19,20kultiviert. Diese Formation der Sphäroide nicht nur verbesserte Stemness, sondern verbessert auch die Aufbewahrung von Stammzellen nach in-Vivo Implantation20.

Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten haben die Entwicklung der experimentellen Modellen zu studieren die Pathophysiologie der Sehnenpathologien und testen neue Therapien wie Stammzellinjektionen aufgefordert. Bei Pferden ist Kollagenase-induzierten Sehnenentzündungen ein gemeinsames Modell mit MSCs in Sehne Reparatur21Wirksamkeit zu demonstrieren. Die Relevanz dieses Ansatzes ist begrenzt, da Injektionen akute entzündliche Veränderungen verursachen, während klinischen Sehnenpathologien führen in der Regel aus chronische Überforderung22,23. Darüber hinaus chemische Induktion der Sehne Krankheit induziert eine heilende Reaktion und repliziert nicht beeinträchtigten Heilungsprozess im klinischen Fällen22,23. Exzision eines Segments der oberflächlichen Beugesehne Sehne wurde als chirurgische Modell von Tendinitis bei Pferden24beschrieben. In jüngerer Zeit, war ein minimal-invasive Ansatz verwendet, um die traumatischen Schäden an den zentralen Kern der oberflächlichen Beugesehne Sehne25einzuschränken. Chirurgische Modelle simuliert nicht die Müdigkeit-Mechanismus, der zu natürlichen Sehne Krankheit führen, und neigen dazu, Reproduzierbarkeit in das Ausmaß des Schadens25erstellt. Unabhängig von dem Modell, die Morbidität und Kosten im Zusammenhang mit equine Modelle der Sehne sind Krankheiten zusätzliche Einschränkungen, die ein Interesse an Nager-Modelle als ein erster Schritt für in Vivo Evaluation neuartiger Therapien zu rechtfertigen.

Einer der Hauptvorteile der experimentellen Modellen bei Nagetieren besteht aus die Kosten und die Fähigkeit, interindividuelle Variabilität zu kontrollieren. Nagetiere können in Bezug auf verschiedene physiologische Faktoren aufgrund ihrer rasanten Wachstumsraten standardisiert werden und relativ kurzen Lebensspanne und Abweichungen zu begrenzen und somit Verringerung der Zahl der Tiere erforderlich, Unterschiede zu erkennen. Strategien zur Sehne Krankheiten bei Nagetieren induzieren haben chemische Induktion, sondern auch über chirurgische Einrichtung teilweise Sehne Defekte21verlassen. Chirurgische Modelle können natürliche Sehnenpathologien besser als chemische Modelle simulieren, sondern zu höheren Morbidität und Totalausfall der beschädigten Sehne führen können. In dieser Hinsicht scheinen Ratten bessere Kandidaten als Mäuse für diese Modelle, da ihre Größe größere Defekte, wodurch Bewertung der Heilung des Gewebes ermöglicht. Sprague-Dawley Ratten wurden in experimentellen Studien der Sehnenpathologien in vier großen Sehne Gruppen verwendet: Rotatorenmanschette, Flexor, Achilles und Patella sehnen26. Unter diesen sind die Modelle mit der Patellasehne aufgrund der Größe dieser Sehne und die Leichtigkeit des Zugriffs auf es27besonders reizvoll. Die Patellasehne misst die Quadrizeps tibiale Tuber. Innerhalb dieser Beinstrecker-Mechanismus ist die Patella eine sesamoid Knochen, der leitet der Aktion des Quadrizeps und umreißt das proximale Ausmaß der Patellasehne. Das Vorhandensein von knöchernen Ankern an den proximalen und distalen Ausdehnungen der der Patellasehne erleichtert biomechanische Tests. Modelle mit der Patellasehne in der Regel verlassen sich auf einseitige operative Mängel mit einer kontralateralen intakte Sehne dient als ein Steuerelement28,29. Die häufigsten Patellasehne defekt-Modell umfasst den zentralen Teil der Patellasehne von der distalen Spitze der Patella, die Einfügung der tibiale Tuber (1 mm in der Breite) besteuert, während der kontralateralen Patellasehne intakt bleibt. Maßnahmen der Ergebnisse enthalten Histologie, zerstörungsfreie biomechanische Tests oder biomechanische Tests zu scheitern, Ultraschall-Bildgebung, ex Vivo Fluoreszenz-Bildgebung, grobe Beobachtung und Funktionstests28,30 ,31. Einseitige Modelle erlauben keine Vergleich einer vorgeschlagenen Behandlung mit konservativen Management einer ähnlichen Verletzung innerhalb der selben Tier. Vergleich zwischen mehreren Behandlungen erfordert ebenso eigene Tiere. Eine bilaterale Modell würde interindividuelle Unterschiede beseitigen und reduzieren Sie die Anzahl der Tiere, die für eine Studie32erforderlich. Jedoch bilaterale Verletzungen können Morbidität erhöhen und bilaterale Lahmheit Behandlung Bewertung behindern könnte. Einige Studien berichten kurz die Verwendung von bilateralen Patellasehne Mängel in Ratten sondern konzentrieren sich auf die Auswirkungen der Behandlungen statt Peri-operativen Management und Morbidität der das Modell33,34.

Langfristiges Ziel dieser Studie ist zur Entwicklung einer Strategie zur Verbesserung der Stemness und in Vivo Überleben der UCM-MSCs bestimmt zur allogenen Transplantation. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir vor kurzem verbesserten Stemness der UCM-MSCs durch Bildung der Sphäroide auf Chitosan Film- und Inkubation unter hypoxischen Umwelt35berichtet. Diese in-vitro- Eigenschaften waren verbunden mit verbesserten biomechanischen Eigenschaften der Patellasehne Mängel behandelt mit konditionierten UCM-MSCs. basierend auf diesen Ergebnissen, die bilateralen Patellasehne defekt Rattenmodell scheint geeignet, um Kandidaten zu testen Behandlungen für Sehne Verletzungen36. Der Zweck der Studie berichtet hier ist die ausführliche Protokolle für Isolierung und Charakterisierung von UCM-MSCs, Vorbereitung eines biologischen Liefersysteme für Stammzellen, Entstehung und Behandlung von bilateralen Patella Sehne Defekte und Post-operative Erholung und Bewertung der Gewebe, die Heilung innerhalb der Mängel.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Western University of Health Sciences genehmigt.

1. Isolierung und Ausbau der MSCs von Equine Nabelschnur Matrix

  1. Erhalten Sie die Plazenta von einem Erwachsenen Mare (schwanger), nach dem Abfohlen beobachtet und aseptisch isolieren Sie die Nabelschnur aus der Plazenta. Halten Sie die Nabelschnur in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) bei 4 ° C während der Übertragung bis zur Verarbeitung.
  2. Waschen Sie die Nabelschnur zweimal mit Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S in einem 50 mL-Tube. Abschnitt der Nabelschnur in 2 Zoll langen Fragmente auf 150 mm Teller und waschen in Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S in einem 50 mL Röhrchen zwei oder dreimal, bis die meisten der Blut ausgespült wird.
  3. Schneiden Sie die Nabelschnur längs um Schiffe verfügbar zu machen. Schiffe, darunter ein Viruswenig Stiel von der Schnur mit Zange und Schere 2 Arterien und eine Vene zu entfernen. Nabelschnur Matrix (Wharton Gelee), die die gallertartigen Matrix umgebenden Gefäße, auf einen Teller 150 mm durch Kratzen mit einem Skalpell zu sammeln und das Gelee in feine Stücke hacken.
  4. Ort Wharton Gelee aus 2 – 3 Nabelschnur Fragmente (ca. 12 – 15 g) in einen 50-mL-Tube mit 15 mL 0,1 % (w/V) Kollagenase Typ-IA-Lösung mit PBS-Puffer. Inkubation bei 37 ° C mit sanft schütteln für ca. 3-4 h bis aufgelöst.
  5. Zentrifugieren Sie verdaute Gewebe bei 300 X g für 15 min und aspirieren Sie überstand. Aufschwemmen verdaute Gewebe in 15 mL Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S, durch Pipettieren mischen, Zentrifugieren bei 150 X g für 5 min und aspirieren überstand (waschen). Wiederholen Sie die Reinigung zweimal mehr.
  6. Aufschwemmen gewaschen Zellen in 15 mL Raumtemperatur PBS mit 1 % P/S, mischen, indem Sie pipettieren, Belastung durch mit 100 µm-Zelle-Sieb, Zentrifuge bei 150 X g für 5 min und aspirieren überstand.
  7. Bereiten Sie Kulturmedium (CM) durch Mischen niedrige Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium (LG-DMEM) mit fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % P/S. sterilisieren das Medium durch Filtration.
  8. Aufschwemmen Sie angespannte Zellen in 10 mL von CM auf 37 ° C vorgewärmt, durch Pipettieren mischen Sie, in eine 25 cm2 Gewebekultur Kolben übertragen Sie und 5 % CO2 bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 37,0 ° c inkubieren Änderung CM alle 3 Tage, bis die Kultur 70 – 80 % Zusammenfluss erreicht, wenn die Kultur passagiert werden wird.
  9. Um die Kultur die passage, aspirieren Sie CM vom Kolben, zweimal mit 5 mL der Raumtemperatur PBS waschen Sie und mit 3 mL 0,25 % Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) bei 37 ° C für 5 min zu lösen.
  10. Neutralisieren Trypsin/EDTA mit 6 mL CM 37,0 ° c vorgewärmt, mischen, indem Sie pipettieren, übertragen in eine 15 mL-Tube, Zentrifuge bei 150 X g für 5 min und aspirieren überstand. Freistehende Zellen in 1 mL CM Aufschwemmen, Mischen von pipettieren. Zählen der lebensfähigen Zellen verwenden Trypan blau und Hemocytometer. Neu säen in einem 25 cm2 Gewebekultur Kolben bei 5.000 Zellen/cm2, und 5 % CO2 bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 37,0 ° c inkubieren

2. Vorbereitung der Sphäroide mit UCM-MSCs kultiviert auf Chitosan Filme

  1. Um 100 mL 1 % (w/V) Chitosan Lösung vorzubereiten, 1 g Chitosan in 99 mL destilliertem Wasser (dH2O), und mischen Sie gut mit einem Magnetrührer.
  2. 670 µL Eisessig hinzufügen und weiter mischen, bis Chitosan löst sich und wird zähflüssig. Dies dauert in der Regel 3 – 4 h.
  3. Fügen Sie 500 µL Chitosan-Lösung in jede Vertiefung der Gewebekultur 12-Well Platte ein und wirbeln Sie die Platte, um Chitosan Lösung gleichmäßig verteilen und alle von der Bodenfläche.
  4. Trocknen Sie Chitosan Lösung beschichtete Platte unter Laminar-Flow Schrank ohne Deckel über Nacht für 24 h. Sobald getrocknet, wird Dünnschicht gebildet und Platte eingehalten werden.
  5. Chitosan-Film durch Zugabe von 1 mL 0,5 N Natriumhydroxid (NaOH) Lösung in jede Vertiefung zu neutralisieren und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren NaOH aus jedem Brunnen und waschen jeweils mit 1 mL dH2O dreimal so gut. Waschen Sie jeweils einmal mit 1 mL 70 % igem Ethanol (EtOH) gut.
  6. Um Chitosan Film sterilisieren, fügen Sie 1 mL 70 % EtOH in jedem gut und inkubieren Sie über Nacht in Laminar-Flow Kabinett. Aspirieren Sie verbleibende EtOH aus jedem Brunnen am folgenden Tag. Waschen Sie jeweils mit 1 mL sterile PBS dreimal gut. Sterilisieren Sie Chitosan-Film mit UV-Licht unter Laminar-Flow Kabinett über Nacht ohne Deckel.
  7. Form-Sphäroide der UCM-MSCs Samen erweitert passagiert Zellen in jedem Bohrloch bei 5.000 Zellen/cm2und 5 % CO2 bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 37,0 ° c inkubieren
    Hinweis: Zellen können unter Hypoxie oder Normoxiezustand, je nach Interesse der Ermittler inkubiert werden.

3. Ausdruck der Oberflächenmarker über Durchflusszytometrie analysiert

  1. Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension
    1. Standard-Platte
      1. Entfernen Sie Medium aus jedem Brunnen zu und waschen Sie zweimal mit Raumtemperatur PBS.
      2. Lösen Sie Zellen mit 500 µL einer Zelle Dissoziation Reagenz in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte für 5 – 10 min bei Raumtemperatur.
      3. Nach der Inkubation 1 ml Puffer (PBS mit 0,5 % BSA) Färbung in jede Vertiefung und Mischen von pipettieren, um Zellen zu lösen.
      4. Übertragen Sie Zellsuspension in 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 150 X g für 5 min.
    2. Chitosan-Platte
      1. Sammeln Sie alle Sphäroide durch Absaugnadeln Medium mit einer Pipette mit 1.000 µL Spitze. Gesammelten Übertragungsmedium in ein 15 mL konische Röhrchen. Nach dem Medium sammeln, gut durch Hinzufügen von 1 mL PBS waschen und gewaschenen PBS in den gleichen 15 mL konische Rohr übertragen.
      2. Sphäroide bei 150 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand zu entfernen.
      3. Fügen Sie 500 µL der Zelle Dissoziation Reagenz (z.B. Accutase) und 5 – 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen von Pipettieren mit einer 1 mL-Spitze bis Sphäroide distanzieren und sind nicht mehr sichtbar.
      4. Fügen Sie 1 mL der Färbung Puffer in die einzelnen Zellsuspension und Zentrifuge bei 150 X g für 5 min.
  2. Waschen der Zellen
    1. Entfernen Sie den Überstand aus dem konischen Rohr zu und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 3 mL kaltem Puffer Färbung. Halten Sie Zellen auf dem Eis im gesamten Experiment von diesem Schritt.
    2. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 min (waschen).
    3. Zweimal waschen.
  3. Färbung von Zellen
    1. 300 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand zu entfernen.
    2. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen mit einem Trypan blau und Hemocytometer. Wieder auszusetzen, 1 x 106 Zellen in 50 µL blocking-Puffer (PBS mit 10 % Pferd Serum) und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
    3. Fügen Sie 10 µL Fluorescein erfolgt (FITC) konjugierten Antikörpern (CD44, CD90, CD105, CD34, großen Histocompatibility complex (MHC)-Klasse II oder Isotype Kontrolle für jeden Antikörper) und 40 µL Puffer Färbung, dann brüten Sie lichtgeschützt für 1 h auf dem Eis.
    4. 3 mL kaltem Puffer Färbung hinzufügen und mischen, Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min und aspirieren überstand (waschen).
    5. Wiederholen Sie zweimal waschen.
    6. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 0,5 mL Puffer Färbung
    7. Fügen Sie 5 µL 7-AAD (Lebensfähigkeit Farbstoff) und inkubieren Sie für 30 min auf Eis
    8. Analysieren Sie gebeizt Zellproben von Durchflusszytometer. Verunreinigungen durch ihre kleinere SSC und FSC ausschließen, und entwicklungsfähigen Zellen mit niedriger Aufnahme von 7-AAD identifizieren. Plot-FL1- und FL2 auf die y und X-Achse bzw.. Verwenden Sie Isotype-Steuerelement, um ein Tor über die Diagonale Linie zu erstellen. Messen Sie den Anteil der positiv gefärbten Zellen im Bereich. Zählen Sie mindestens 20.000 Veranstaltungen/Probe (ergänzende Abbildung1).
    9. Messen Sie den Anteil der Zellen befleckt mit Antikörpern von Anspritzung lebensfähige Zellen und Auto-Fluoreszenz zu und subtrahieren Sie Anteil an Zellen befleckt mit Isotype Kontrolle.

(4) bilaterale Patellasehne defekt-Modell bei der Ratte

  1. Wählen Sie Sprague-Dawley Ratten (Erwachsene männlich, 4 – 5 Monate alt, Körpergewicht 350-375 g). Beachten Sie die relativ umfangreich die Ratten für dieses Modell verwendet.
  2. Zu betäuben Sie und wenden Sie Kunstauge Schmiermittel die Ratte mit 8 % Sevofluran in 2 L/min 100 % Sauerstoff über Maske, bis zum Verschwinden der Pinch-Zehe Reflex in der Induktion Kammer geliefert.
  3. Eine intramuskuläre Injektion von Meloxicam (1 mg/kg) als präemptive Analgesie zu verwalten.
  4. Legen Sie die Ratte zwischen zwei 0,5 L Wasserflaschen mit warmem Wasser gefüllt und mit einem Tuch, Körpertemperatur und Position beizubehalten und gleichzeitig die Prävention von Hautverletzungen. Kleben Sie jede Extremität an den Tisch. Um das Risiko von Unterkühlung, Abdeckung des Körpers mit Luftpolsterfolie (Abbildung 1).
  5. Anästhesie mit kontinuierlichen Strom von 5 % Sevofluran im 1 L-100 %-Sauerstoff-Gemisch über Bugnase mit dem Tier auf dorsal liegen auf dem Wasser Heizkissen zu erhalten.
  6. Befestigen Sie die chirurgische Sites nicht zur Vermeidung von Hauttrauma. Stattdessen tragen Sie Haar Entferner Creme über beide Kniegelenke. Verwenden Sie eine Zunge Depressor, um die Creme und die Haare zu entfernen.
  7. Scheuern Sie der Operationsstelle mit Chlorhexidin Digluconate Peeling, und spülen Sie mit 70 % Ethanol 3 Mal.
  8. Die Haut mit einer sterilen #15 Skalpellklinge proximal nach distal Richtung, auf den Craniomedial Aspekt der das Kniegelenk einzuschneiden. Starten des Schnittes ca. 1 cm proximal auf das Niveau der Patella, und ca. 5 mm distal der tibiale Tuberkel zu verlängern.
  9. Die Haut um die Patellasehne verfügbar zu machen, indem er befreit die zugrunde liegende Unterhaut mit einem #15 Skalpellklinge zu reflektieren.
  10. Mit der Skalpellklinge #15, Verbrauchsteuern Sie mittleren Drittel der einzelnen Patellarsehne (1 mm) vom distalen Aspekt der Patella, Tibia Tuber.
    1. Richten Sie 0,99 mm Durchmesser Kirschner Draht gegen die Sehne als Vorlage, um die Größe des Defektes in jede Extremität (Abbildung 2) zu standardisieren.
    2. Stellen Sie 2 volle dicke Einschnitte auf jeder Seite der Kirschner-Draht mit einem #15 Skalpellklinge zu isolieren, den zentralen Teil der Sehne (Abbildung 3). Resezieren Sie Mittelteil proximal und distal mit feinen Iris-Schere (Abbildung 4).
    3. Vor dem Schließen der Faszie der Knie, legen Sie das Gerinnsel (gemischte Zellsuspension und AKP-Staaten) für die entsprechende Behandlungsgruppen wie in 5.5 beschrieben. Schließen Sie die Faszie mit einem Kreuzband Muster und Haut mit einem intradermale Muster mit 5: 0 Polyglactin 910 Nähte (Abbildung 5).
  11. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen ersticken.
    Hinweis: Ein Mangel ist eine Behandlung (Stammzellen konditioniert auf Chitosan oder kultiviert auf standard Platten) nach dem Zufallsprinzip zugewiesen. Der kontralaterale defekt bleibt leer, als interne Kontrolle dienen.
  12. Nach der Operation, Verwalten von Enrofloxacin 4 Tabletten (2 mg/Tablette, oral, einmal täglich) und eine Tablette mit Meloxicam (2 mg/Tablette, oral, einmal täglich) für 7 Tage. Diese Dosen waren von einem Labor Tier Tierarzt empfohlen und in das IACUC-Protokoll.

5. Lieferung von MSCs innerhalb der Patellasehne defekt

  1. Betäuben Sie eine gesunde Ratte die Patellasehne defekt-Kreation mit 8 % Sevofluran in 2 L/min 100 % Sauerstoff über Maske, bis zum Verschwinden der Pinch-Zehe Reflex in der Induktion Kammer geliefert nicht benutzt wird.
  2. Sammeln Sie 5 mL Blut durch Herzpunktion von narkotisierten Sprague-Dawley Ratten (Erwachsene männlich, 4 – 5 Monate alt, Körpergewicht 350-375 g), in einer 5 mL Spritze mit einer 20 G-Nadel mit 1 mL Säure-Citrat-Dextrose (5:1 V/V).
  3. Einzuschläfern Sie die Ratte nach Herzpunktion und Blutentnahme, durch Intracardial Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg), während in der gleichen Narkose.
  4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 350 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie überstand und speichern Sie Aliquote (120 µL) bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.
  5. Unmittelbar vor der in Vivo Implantation tauen die oben genannten aliquoten und mischen 20 µL mit 0,5 x 106 MSCs (von 1,9 oder 3.1.2.1) losgelöst von Standardplatten mit Trypsin/EDTA oder sammeln von Chitosan Platten durch Spülen (mit PBS/Medium).
  6. Die restlichen 100 µL der aufgetauten Plasma in einem Brunnen der 96-Well-Platte zur Aktivierung des Plasmas und induzieren die Bildung eines Gerinnsels 6 µL 10 % Calciumchlorid (CaCl2) hinzufügen (konditionierte Plasma aktiviert: ACP).
  7. Zellsuspension (20 µL) mischen und AKP-Staaten (100 µL) bilden ein Blutgerinnsel (Abbildung 6). Legen Sie das Gerinnsel innerhalb der Patellasehne Defekt vor dem Schließen der Faszie des die Knie erstellt (siehe Schritt 4.10.3).

6. funktionelle Ergebnis

  1. Überwachen Sie Ratten zweimal täglich auf Anzeichen von Schmerzen, basierend auf die Ratte Grimasse Skala (RGS)37,38 und Schwellung über die Implantation Websites.
    Hinweis: Ein scoring-System (0 – 6) wurde entwickelt, um ambulante Funktion basierend auf 3 Aktivitäten, einschließlich zeitlich Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (0-3) auszuwerten, zeitlich ohne fremde Hilfe Hind Gliedmaßen stehen (0: 2) und die Fähigkeit, ein 17 cm Kunststoffkäfig Wand (0 – 1) (Klettern ( Tabelle 1).
  2. Bewerten Sie Ratten für die beiden hinteren Extremität stehenden Aktivitäten, morgens und abends jeden Zeitpunkt um einen Durchschnittswert zu berechnen.
  3. Bewerten Sie Ratten für die Fähigkeit, erfolgreich eine 17 cm Kunststoffkäfig Wand mit beide Hinterbeine erreichen die Spitze klettern.

7. gross aussehen und Histopathologie der Patellasehne

  1. Einschläfern Ratten 7 Tage (auszuwertende Entzündung) oder 28 Tage (um die Heilung des Gewebes zu bewerten) Nachbehandlung durch Intracardial Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg) unter Narkose mit 8 % Sevofluran und 2 L 100 % Sauerstoff über Maske geliefert.
  2. Patella-Sehne-Tibia Tuber Einheiten mit Skalpell und Schere nach Sterbehilfe zu ernten. Weichteile und Bänder um das Knie, mit Ausnahme der Patellasehne zu entfernen.
  3. Prüfen Sie jede Probe für gröbere Erscheinung und Verdickung der Sehne (Abbildung 7).
  4. Richten Sie die Probe indem ein Chirurg der Knoten der 5.0 Polydioxanon auf den proximalen und seitlichen Aspekt der Sehne. Jede Probe in 10 % neutral gepuffertem Formalin-Lösung zu beheben und Querschnitte (5 µm) aus dem mittleren Teil des jede Sehne erhalten.
  5. Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin und Masson Trichrome Färbung, Anschluss an standard-Protokolle.
  6. Abschnitt, um das Vorhandensein von Hämatom innerhalb der Defekt sowie krankhafte Veränderungen wie Entzündungen zu untersuchen.
  7. Bewerten Sie die histologischen Partitur der Abschnitte mit der zuvor veröffentlichten scoring-System, basierend auf Kollagen Grade, Grad der Angiogenese und Knorpel Bildung (Tabelle 2)39.

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Representative Results

In der aktuellen Studie werden Ergebnisse präsentiert, da ± SD (Standardabweichung) bedeuten. Zellen wurden isoliert von der Nabelschnur 6 Stuten und Prozentsatz der isolierten Zelllinien mit dem Ausdruck jeder Zelle Oberfläche Marker unter Standard- oder Chitosan Klimaanlage verglichen mit Friedman-Test als eine nicht-parametrische Varianzanalyse mit wiederholt Maßnahmen. Für die Sehne defekt Modellerstellung 8 Ratten dienten für 7 Tage nach der Operation Bewertung und 12 Ratten wurden für 28 Tage Bewertung verwendet. Ergebnisse der funktionellen Ergebnisse werden dargestellt als ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) bedeuten und im Vergleich mit dem t-Test. UCM wurde als zelluläre Quelle aufgrund seiner Fülle, einfache Sammlung und überlegene Verbreitung im Vergleich zu anderen fetalen Adnexe Quellen40ausgewählt. Zellen isoliert von UCM kultiviert auf Standardteller gepflegt eine Fibroblasten-ähnliche Form in den Ausbau. Zellen gebildet Sphäroide wenn auf Chitosan Platte (Abbildung 8) kultiviert.

Der Großteil der Zellen unter Standardbedingungen kultiviert Ausdruck CD44 (98,6 ± 1,62 %), CD90 (88,7 ± 3,04 %), und CD105 (77,9 ± 6,84 %) zwar Ausdruck der CD34 (0,07 ± 0,17 %) und MHC II (1,33 ± 1,12 %) waren sehr niedrig. Unter konditionierten Kultur, die Ausdruck Niveaus von CD44 (97,0 ± 2,12 %) und CD34 (1,13 ± 1,58 %) Unterschied sich nicht von standard Kulturen, während der Ausdruck Niveaus der CD90 (33,3 ± 37,1 %) und CD105 (54,0 ± 19,0 %) zurückgegangen und MHC-II (2,84 ± 0,98 %) erhöht35.

Nach Isolierung und Charakterisierung von UCM-MSCs in Vitrowar das biologische Verhalten von konditionierten Zellen mit der Zellen kultiviert unter Standardbedingungen in einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell bei Ratten verglichen. Unbehandelte Mängel in jede Ratte diente als interne Kontrollen. Postoperative Schwellung war minimal in alle Ratten und innerhalb von 48 h behoben. Entsprechend der RGS angezeigt keine der Ratten Anzeichen von Schmerzen oder Stress wie Orbital anziehen, Nase/Wange Abflachung oder Ohr/Whisker Änderungen. Alle Ratten verbraucht einen normalen Bereich von 3 – 4 Pellets oder 15 – 20 Gramm Futter täglich während der gesamten Studie. Funktionale Gesamtpunktzahl, einschließlich unterstützt und ohne fremde Hilfe Hind Gliedmaßen stehen sowie Klettern Partituren lag bei normalen Ratten im Vergleich zu der betriebenen Ratten 7 Tage (n = 8, p < 0,0001, Tabelle 3). Jedoch die funktionelle Gesamtpunktzahl normalisiert innerhalb von 28 Tagen nach der Operation (n = 12, p = 0,78). Ratte bilaterale Patellasehne defekt Modelle ist daher nachweislich wirksam zur Begrenzung des interindividuelle Variation und reduziert die erforderliche Anzahl von Tieren ohne signifikanten Morbidität (Video 1–5).

Etwa 37 % der Sehnen an 28 Tagen gesammelt erschienen deutlich verdickte (Abbildung 7). Diese Verdickung war zwischen leer und behandelten Fehlern gleichmäßig verteilt. Histologische Gesamtnoten erhöht mit der Zeit in unbehandelten Mängel (n = 20, p = 0.0034). Wenn jede Komponente der heilenden Partitur der einzige Parameter ändern mit der Zeit unabhängig voneinander bewertet wurde bestand aus Knorpel-Formation, die zwischen 7 und 28 Tagen erhöht (n = 20, p < 0,0001). Angiogenese tendenziell mit der Zeit zugenommen (p = 0.3), aber die Kollagenbildung nicht unterscheiden (p = 0,69). Bei der histologischen Untersuchung wurde Entzündung aller die Sehnen Gewebeschnitte untersucht 7 Tage nach der Operation, unabhängig von der Anwesenheit der Behandlung beobachtet. Ein Hämatom war in allen behandelten Mängel vorhanden. Histologischen Angiogenese Partituren (Tabelle 2, Abbildung 9) lag zwischen 0 und 1, schlägt moderate Arteriola und Kapillare Infiltration, während Kollagen Grade (Tabelle 2, Abbildung 10) punktet reichte von 2 bis 3 insgesamt, was darauf hindeutet mäßige bis umfangreiche Kollagenbildung. Knorpel Bildung Partituren (Tabelle 2, Abbildung 11) reichten von 0 bis 2 schlägt keine Knorpel-Formation, um Knorpel Bildung von 25 % bis 50 % der Querschnittsfläche der Sehne zu moderieren. Alle histologische Zahlen orientieren sich mit der linken Seite der vorderen Aspekt, und die Spitze als der mediale Aspekt der Querschnitt des mittleren Teils der Sehne.

Figure 1
Abbildung 1: Positionierung der Ratten und aseptische Vorbereitungsgespräche. Jede Ratte war zwischen zwei 0,5 L Wasserflaschen mit warmem Wasser gefüllt und mit einem Tuch, Körpertemperatur und Position beizubehalten und gleichzeitig die Prävention von Hautverletzungen platziert. Die Extremitäten der jede Ratte wurden mit Klebeband an den Tisch, und sein Körper war bedeckt mit Luftpolsterfolie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: chirurgische Modell der Patellasehne defekt (Alignment). Ein 0,99 mm Durchmesser Kirschner Draht orientiert sich gegen die Sehne als Vorlage, um die Größe des Defektes in jede Extremität zu standardisieren.

Figure 3
Abbildung 3: chirurgische Modell der Patellasehne defekt (Einschnitte). Auf jeder Seite der Kirschner-Draht werden zwei volle dicke Hautschnitte vorgenommen, um einen zentralen Teil der Sehne zu isolieren.

Figure 4
Abbildung 4: chirurgische Modell der Patellasehne defekt (Resektion). Der Mittelteil ist proximal und distal, reseziert Erstellen eines Mangels passender Größe der Kirschner-Draht. Resezierten Bereich ist innerhalb der gepunkteten Linie Kasten dargestellt.

Figure 5
Abbildung 5: postoperative Aussehen der operierten Kniegelenken. Faszie war mit einem Kreuzband Muster und Haut mit einem intradermale Muster geschlossen wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Vorbereitung der aktivierten konditionierten Plasma für die Lieferung der UCM-MSCs. Stammzellen wurden im konditionierten Plasma vor Aktivierung ausgesetzt. Das daraus resultierende Gerinnsel wurde in Patellasehne Mängel eingefügt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Grobe Darstellung der Normal (C, D) und (A, B) verdickt sehnen. (A, C) Posterior Ansichten; (B, D) Seitliche Ansichten; Blockpfeile die Tibia und dünne Pfeile identifizieren die Sehnen.

Figure 8
Abbildung 8: Morphologie der Zellen kultiviert auf Gewebekultur Platte unter 19 % Sauerstoffgehalt (standard-Gruppe: (A) und Chitosan film unter 5 % Sauerstoffgehalt (konditionierte Gruppe: B). isolierte Zellen wurden Spindel auf standard-Gruppe (A) geformt und gebildet Sphäroide auf konditionierte Gruppe (B). Maßstabsleiste = 400 µm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: repräsentative Licht Mikrographen verwendet für die Angiogenese Benotung. Nach 7 Tage der Heilung erhielt sehnen ohne Behandlung eine Note von 0 (A, D), während diejenigen mit konditionierten Zellen (C, F) oder Standardzellen (B, E) eine Note von 0,5 und 0, bzw. erhalten. Mit 28 Tagen erhielt unbehandelte Sehnen (G, J) eine Note von 0, während diejenigen mit Zellen (ich,L klimatisierten) oder Standardzellen (H,K) Resultate von 1,0 und 0,5, bzw. erhaltenen. Die Pfeile kennzeichnen Blutgefäße in die Sehne Probe vorhanden. Die Pfeile zeigen auf die Blutgefäße im 100 X Vergrößerung entsprechen den gleichen Pfeile an den Blutgefäßen in die 400 X Vergrößerung. Normale Sehne Gewebe (M, N). Masson trichrome Fleck (A, B, C, G, H, I, M); Hämatoxylin und Eosin Fleck (D, E, F, J, K, L, N); Maßstabsleiste = 100 µm (A-N). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10: repräsentative Licht Mikrographen für Kollagen Verschneidung verwendet. Nach 7 Tage der Heilung erhielt sehnen ohne Behandlung eine Note von 2,5 (A, D), während diejenigen mit Behandlung (B, C, E, F) eine Note von 3.0 erhalten. Mit 28 Tagen erhielt unbehandelte Sehnen (G, J) eine Note von 3.0, während diejenigen mit Zellen (I, L) oder Standardzellen (H, K) erhaltenen Resultate von 1.0 und 3.0, bzw. konditioniert. Die Desorganisation der Sehne Fasern kann in 400 X Einsätze (H, K) geschätzt. Normale Sehne Gewebe (M, N). Masson trichrome Fleck (A, B, C, G, H, I, M); Hämatoxylin und Eosin Fleck (D, E, F, J, K, L, N); Maßstabsleiste = 100 µm (A-N). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11: repräsentative Licht Mikrographen für Knorpel Verschneidung verwendet. Nach 7 Tagen der Heilung sehnen ohne Behandlung (A, D), die entweder mit bedingt Zellen (C, F) oder standard (B, E), alle erhalten eine Note von 0. Mit 28 Tagen erhielt unbehandelte Sehnen (G, J) eine Note von 1,0, während diejenigen mit Zellen (I, L) oder Standardzellen (H, K) erhaltenen Resultate von 0 und 2.0, bzw. konditioniert. Die Pfeile sind Chondrozyten in der Sehne Probe gerichtet. Die Pfeile zeigen auf die Chondrozyten in 100 X Vergrößerung entsprechen den gleichen Pfeilen zeigen die Chondrozyten in 400 X Vergrößerung. Normale Sehne Gewebe (M, N). Masson trichrome Fleck (A, B, C, G, H, I, M); Hämatoxylin und Eosin Fleck (D, E, F, J, K, L, N); Maßstabsleiste = 100 µm (A-N). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1: Beurteilung der ambulanten Funktion bei Ratten. Ohne fremde Hilfe Hind Gliedmaßen stehen zeitlich (1 – 5 s: score 1) 4 h postoperativ beobachtet wurde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Video 2: Beurteilung der ambulanten Funktion in Ratten. Zeitgesteuerte Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (0 – 5 s: score 0) wurde festgestellt, dass 4 h post operativ. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Video 3: Beurteilung der ambulanten Funktion bei Ratten. Ohne fremde Hilfe Hind Gliedmaßen stehen zeitlich (1 – 5 s: score 1), zeitgesteuerte Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (5 – 10 s: score 1) wurde festgestellt, dass 14 Tage post-operativ. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Video 4: Beurteilung der ambulanten Funktion in Ratten. Zeitgesteuerte Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (10 – 15 s: score 2), ohne die Fähigkeit, eine 17 cm Kunststoffkäfig Wand zu durchsteigen (kein Klettern: score 0) wurde festgestellt, 27 Tage post-operativ. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Video 5: Bewertung der ambulanten Funktion in Ratten. Zeitgesteuerte Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (5 – 10 s: score 1), mit der Fähigkeit, eine 17 cm Kunststoffkäfig Wand zu durchsteigen (ja: Tor 1) wurde festgestellt, dass 14 Tage post-operativ. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Funktionstest 0 1 2 3 Partitur
Hind Gliedmaßen stehen assistierten 0 – 5 s > 5 – 10 s > 10-15 s > 15 s
Hind Gliedmaßen Stand ohne fremde Hilfe 0 – 1 s > 1 – 5 s > 5 s
Steigfähigkeit Nein Ja
Insgesamt

Tabelle 1: Scoring-System zur Bewertung von ambulanten Funktion bei Ratten. Ein scoring-System (0 – 6) wurde entwickelt, um ambulante Funktion basierend auf 3 Aktivitäten einschließlich zeitgesteuerte Hind Gliedmaßen stehend mit Vorderbeine unterstützt (0 – 3) auszuwerten, zeitlich ohne fremde Hilfe Hind Gliedmaßen stehen (0: 2) und die Fähigkeit, eine 17 cm Kunststoffkäfig Wand (0 – 1) hinauf zu klettern.

Kollagen-Klasse
0 Normale Kollagen tangential orientiert
1 Leichte Veränderungen mit Kollagenfasern weniger als 25 % unorganisiert
2 Moderate Änderungen mit Kollagenfasern zwischen 25 % und 50 % unorganisiert
3 Deutliche Veränderungen mit mehr als 50 % unorganisiert Kollagen
Grad der Angiogenese
0 Mäßige Infiltration des Gewebes mit Arteriolen
1 Vorhandensein von Kapillaren
2 Kein Gefäßsystem infiltration
Knorpel-Bildung
0 Keine Bildung von Knorpel
1 Isolierte hyalinem Knorpel Knötchen
2 Moderate Knorpel Bildung von 25 % bis 50 %
3 Umfangreiche Knorpel Bildung, mehr als 50 % des Feldes beteiligt

Tabelle 2: Histologie erzielte Noten. Histologischen Ergebnis der Abschnitte wurden bewertet, basierend auf Kollagen Grade, Grad der Angiogenese und Knorpel Bildung (adaptiert von Rosenbaum Et al. ( 39)

Gruppe Meine ± SEM
Normal (n = 3) 6,00 ± 0,48
7 Tage nach der Operation (n = 8) 2.25 ± 0,30
28 Tage nach der Operation (n = 12) 5,83 ± 0,24

Tabelle 3: Funktionelle Resultate von normalen Ratten und unbehandelten Ratten. Funktionelle Resultate von normalen Ratten und unbehandelten Ratten 7 und 28 Tagen wurden postoperativ bewertet. n = Anzahl der Ratten.

Ergänzende Abbildung1: Gating Strategie und Beispiel für Surface Marker Ausdruck: Rückstand wurde basierend auf kleinen FSC und SSC (A) ausgeschlossen. Lebenden Zellen wurden ausgewählt, basierend auf negative Färbung mit 7-AAD von FL3 erkannt (B). Isotype abgestimmte Steuerung (C) als Negativkontrolle verwendet wurde, um ein Tor von CD44-FITC positive Zellen (D) zu erstellen.

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Discussion

Equine Zellen wurden für dieses Projekt ausgewählt, weil wir wollen schließlich Kandidat Ansätze bei der Verwaltung der natürlichen Sehnenpathologien bei Pferden zu testen. In der Tat sind Sehnenverletzungen bei Pferden wegen der biologischen Ähnlichkeit zwischen dem equine oberflächlichen Beugesehne und Achillessehne Menschen41ansprechend als natürlichen Vorbildern der Sehnenerkrankung im Menschen. Die Zelle Oberflächenmarker CD44, CD90, CD105, CD34 und MHC-II wurden für die Immunphänotypisierung der Zellen, nach den Kriterien, die von der internationalen Gesellschaft für Zelltherapie42empfohlen ausgewählt. In einer aktuellen Studie wurden EqUCM-MSCs für CD44 positive und negative CD34 und MHC-II, unabhängig von der Kulturbedingungen. Zellen, die unter normalen Bedingungen kultiviert wurden auch positiv für CD90 und CD105, damit die Kriterien für MSCs in Bezug auf Ausdruck der Oberflächenmarker. Darüber hinaus ist diese Studie den ersten Bericht über die Bildung der Sphäroide, wenn EqUCM-MSCs auf Chitosan Film, bestätigen frühere Berichte über menschliche MSCs19,20kultiviert werden. 3D Zelle Kulturtechniken haben jahrzehntelang mit dem Ziel zur Schaffung eines Umfelds, ähnlich der physiologischen Nische ausgiebig erforscht worden. In der Tat zeigten diese Studie verbesserte Stemness gen Ausdruck Oct4, Sox2und Nanog, und verbesserte Differenzierung Potenzial, das steht im Einklang mit anderen Berichte19,20. Andere berichteten verbesserte immunmodulatorische Eigenschaften43 und hyalinem Knorpel Regeneration44 mit MSCs Sphäroide. Unter den verschiedenen 3D Kulturtechniken wie Spinner Fläschchen, rotierende Zelle Bioreaktoren, nicht anhaftende Platte offenbar natürliche und synthetische Matrizen, Chitosan Filme aus mehreren Gründen attraktiv. Dieser Ansatz erfordert keine teure Ausrüstung und ist kostengünstig im Vergleich zu nicht-anhaftende Platten mit synthetischen Matrizen, da Chitosan ein Nebenprodukt der Fischindustrie ist. Kultivierung von Zellen auf Chitosan Filme ist technisch einfach. Kombiniert, würde diese Vorteile klinischen Anwendung auf einer großen Skala45ermöglichen.

Das bilaterale Patellasehne Modell vorgeschlagen hier im Hinblick auf Morbidität akzeptabel erscheint. Keine Komplikation wurde in einer neueren Studie Studie beobachtet. Wir waren besonders besorgt über die Gefahr von belastenden Effekte induziert durch defekte groß genug nachweisbare biomechanische und histologische Veränderungen zuzulassen. Diese Bedenken aufgefordert, die Auswahl von Ratten über Mäuse für diese Studie, basierend auf früheren Studien in Bezug auf die Größe und Reife der Sehne für die präklinische Verletzungen Modelle. Ein "Fenster defekt" oder Mittel-Drittel Patellasehne defekt wurde bei Kaninchen46 und Ratten30,31 beschrieben um Sehne Heilung und Augmentation zu studieren. Der Patellasehne "Fenster defekt" Modell wurde für das Studium Sehne Reparatur bei Ratten mit Histologie31,39, biomechanische Tests30,31, und ex-Vivo Fluoreszenz reproduzierbar gefunden Imaging-31. In dieser Studie die Größe des Defektes entsprach, die mittleren Drittel der Patellarsehne und wurde mit 0,99 mm Durchmesser Kirschner Draht als Vorlage standardisiert. Diese Dimensionen waren ausreichend, um die Sehne Heilung ohne postoperative Bruch zu studieren. Aufgrund ihrer anatomischen Größe im Vergleich zu Mäusen fasst Ratten größere Defekte, die Reproduzierbarkeit der Verletzung, Behandlung Lieferung und Maßnahmen des Ergebnisses zu verbessern.

Die Analgesie Protokoll verabreicht, um die Ratten in dieser Studie war wirksam bei der Kontrolle der postoperativen Schmerzen, wie mit dem RGS37,38bewertet. Dieses scoring-System wurde hier ausgewählt, weil es zuvor als erkennen von postoperativen Verhaltensänderungen reflektieren Schmerzen in Ratten37,38validiert wurde. Die RGS basiert auf Anzeichen relativ einfach zu ermitteln, wie orbital anziehen, Abflachung der Nase/Wange und Ohr/Whisker Änderungen. Ratten unterhielt auch eine normale Nahrungsaufnahme während dieser Studie, die die Wirksamkeit dieses Protokolls Analgesie weiter unterstützt. In der Tat fanden frühere Berichten eine Korrelation zwischen postoperativen Schmerzen und Gewichtsveränderungen in Ratten, die mit nicht-steroidalen Entzündungshemmer, wie Meloxicam47behandelt. Dieses Mittel wurde in dieser Studie ausgewählt und präemptiven Verwaltung wurde abgeleitet aus Studien an Ratten37,Hunde und48 49, wo die Verwaltung der entzündungshemmende Mittel unmittelbar vor der Operation zu gefunden wurde chirurgisch induzierte Schmerzen zu vermindern. Funktion wurde als zusätzlicher Indikator für postoperative Schmerzen, ein scoring-System entwickelt, um die Nutzung der beiden Becken Gliedmaßen auszuwerten bewertet. Die hier ausgewählten drei Aktivitäten bieten eine allgemeine Bewertung des Bereichs der Bewegung und die Bereitschaft zu tragen Gewicht auf den Beckenbereich Gliedmaßen. Dieses scoring-System wurde aus beiden statischen und dynamischen funktionelle Wiederherstellung Studien an Ratten50,51 abgeleitet und wurde entwickelt, um den zeitlichen Verlauf der funktionellen Ergebnisse beobachtet zu vergleichen. Resultate zeigen, dass der bilateralen Sehne Mangel einen vorübergehenden Rückgang der Funktion nach 7 Tagen, mit einer Rückkehr zur normalen innerhalb von 28 Tagen induziert. Die Funktion Punktzahl erscheint bei der Aufdeckung von Schmerz sekundär zu orthopädische Bedingungen als die RGS empfindlicher. Ähnliche funktionelle Tests wurden zur Sehne Heilung wie Achilles funktionalen Index28zu bewerten, Pfote und schreiten Maßnahmen51oder anderen makroskopischen scoring Systeme52.

Dieses Modell wurde entwickelt, um die Zahl der Tiere, die in die Studie, bei der Differenzierung der Ergebnisse zwischen unbehandelten Sehnen und zwei stammzellbasierte Therapien aufgenommen. Die Wirkung der Behandlungen getestet in dieser Studie werden in einer anderen Publikation36diskutiert. Das hier verwendete Modell erlaubt Erkennung unterschiedlicher Behandlung durch den Einsatz einer internen Kontrolle jede Ratte, kombiniert mit der zerstörungsfreien biomechanische Prüfung der Sehnen mit 28 Tagen (Daten, die hier nicht aufgeführt).

Aktivierte konditionierten Plasma wurde ausgewählt, weil seine häufige Verwendung als Träger für Stammzellen, Biokompatibilität, Zugänglichkeit und aktuelle klinische Anwendungen in der Verwaltung der Sehnenpathologien53,54. Es haben dazu beigetragen, die Heilung der behandelten sehnen, aber lokale Speicherung von Stammzellen erlaubt, und es stört nicht mit dem Vergleich der Behandlungsgruppen ähnlich, da beide die gleiche Menge an aktivierten konditionierten Plasma enthalten. Die histologischen Merkmale des unbehandelten sehnen stehen im Einklang mit früheren Beschreibungen der Sehne zu heilen, wo nekrotischen Gewebes und gestörte Kollagen Bundles entfernt sind durch Phagozytose und lytischen Enzymen durch Makrophagen in der Phase der Entzündung, die dauert bis zu 10 Tagen post Verletzungen54,55,56. In der proliferativen Phase ist Zellproliferation und Vaskularität des Standortes Reparatur am größten bei 28 Tage nach der Sehne zu reparieren57,58. Wir fanden einen Zusammenhang zwischen der scheinbare Verdickung der Sehnen, Querschnittsflächen und niedriger Elastizitätsmodul von Exemplaren. Basierend auf diesen Ergebnissen scheint das histologische Ergebnis Gewebeveränderungen zu reflektieren, die möglicherweise nicht wünschenswert und führen nicht zu biomechanische Festigkeit, wie z. B. Desorganisation der Kollagenfasern, Angiogenese und werden. In der Zukunft die Fähigkeit dieses Modells Behandlungen basierend auf histologischen Merkmalen zu unterscheiden durch die Integration von zusätzlichen Kriterien wie Anwesenheit von Tenocytes, extrazelluläre Matrix-Organisation, Proteoglykan Inhalt, verbessert werden kann und Vertrieb von Elastin Fasern52,59.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Dr. Su, PhD, für ihre statistische Analyse der Daten zu bestätigen. Die Autoren danken auch Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, für ihre Beratung auf die Anästhesie und Schmerz-Management-Protokolle in der Studie verwendet. Dieses Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Western University of Health Sciences Amt des Vizepräsidenten für Forschung (12678v) und USDA Abschnitt 1433 Mittel (2090).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 10x Hyclone SH30258.01 Consumable
Collagenase type IA Worthington LS004197 Consumable
DMEM low glucose Hyclone SH30021.FS Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03 Consumable
Penicillin/Streptomycin 100x Hyclone SV30010 Consumable
Trypsin 0.25% Hyclone SH30042.01 Consumable
Accutase Innovative Cell Technologies AT104 Consumable
Trypan blue Hyclone SV30084.01 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 Consumable
Chitosan Sigma C3646 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma S8045 Consumable
Bovine Serum Albumin Hyclone SH30574.01 Consumable
Round bottom polystyrene tube Corning 149591A Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC) AbD serotec MCA1082F Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC) AbD serotec MCA47FT Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC) AbD serotec MCA1085F Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control AbD serotec MCA928F Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) abcam ab11415 Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control abcam ab91356 Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC) BD BDB560942 Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC) BD BDB555748 Consumable
7-AAD BD BDB559925 Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Equipment
Vacutainer 5 mL Med Vet International RED5.0 Consumable
Acid-citrate-dextrose Sigma C3821 Consumable
Calcium Chloride Sigma C5670 Consumable
Sevoflurane JD Medical 60307-320-25 Consumable
Rats Charles River Strain code: 400 Experimental animal
Rat surgical kit Harvard apparatus 728942 Equipment
Surgical Blade #15 MEDLINE MDS15115 Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		 Bio Serv F06801 Consumable
Polyglactin 910, 5-0 Ethicon J436G Consumable
Eosin alchol shandon Thermo scientific 6766007 Consumable
Harris Hematoxylin Thermo scientific 143907 Consumable

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Medizin Ausgabe 133 Rattenmodell Sehne Verletzungen Modell mesenchymale Stammzellen Chitosan Sphäroide Patellarsehne Fenster defekt
Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten
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Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J.… More

Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. J. Vis. Exp. (133), e56810, doi:10.3791/56810 (2018).

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