Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Phthalic syre Ester-bindende DNA Aptamer utvalg, karakterisering og programmet en elektrokjemisk Aptasensor

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for i vitro valg og karakterisering av gruppespesifikke phthalic syre ester-bindende DNA aptamers presenteres. Anvendelsen av den valgte aptamer i en elektrokjemisk aptasensor er også inkludert.

Abstract

Phthalic syre estere (PAEs) areone av de store gruppene av Persistente organiske miljøgifter. Gruppespesifikke påvisning av PAEs er svært ønskelig på grunn av rask vokser kongenere. DNA aptamers har blitt stadig mer brukt som anerkjennelse elementer på biosensor plattformer, men velge aptamers mot svært hydrofobe små molekyl mål som PAEs, er sjelden rapportert. Dette verket beskriver en perle-basert metode for Velg gruppespesifikke DNA aptamers til PAEs. Gruppen amino functionalized Dibutylftalat (DBP-NH2) som anker målet ble syntetisert og immobilisert på epoxy-aktivert agarose perler, at visningen av gruppen phthalic ester på overflaten av immobilisering matrise, og Derfor valg av gruppespesifikke bindemidler. Vi bestemt dissosiasjon konstantene i aptamer kandidater av kvantitative polymerisasjon kjedereaksjon kombinert med magnetiske separasjon. Den relative slektskap og selektivitet av aptamers til andre PAEs ble fastsatt av de konkurransedyktige analyser, der aptamer kandidatene var pre avgrenset til DBP-NH2 knyttet magnetiske perler og frigitt til nedbryting på inkubasjon med de testet PAEs eller andre potensielle forstyrrende stoffer. Konkurransedyktige analysen ble brukt fordi det ga en lettvinte affinitet sammenligning mellom PAEs som hadde ingen funksjonelle grupper for overflate immobilisering. Endelig vi viste fabrikasjon av en elektrokjemisk aptasensor og brukte den for ultrasensitive og selektiv påvisning av bis(2-ethylhexyl) ftalat. Denne protokollen gir innsikt for aptamer å andre hydrofobe små molekyler.

Introduction

Rask økonomisk vekst er akselerasjon av industrialisering og urbane konstruksjon, miljøforurensning mer alvorlig enn noensinne. Typisk miljøgifter inkluderer heavy metall ioner, toksiner, antibiotika, plantevernmidler, endokrine disruptors og Persistente organiske miljøgifter (kommer). Dessuten metall ioner og giftstoffer, andre miljøgifter er små molekyler at ganske ofte består av en rekke kongenere. De mest giftige dukker inkluderer for eksempel polyklorerte bifenyler (PCB), Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), polybromert biphenyl etere (PBDEs), polyklorerte dibenzo-p-dioksin (PCDDs), polyklorerte dibenzofuran (PCDFs), og phthalic Acid estere (PAEs)1,2, som består av mange kongenere. Små molekyl gjenkjenning er hovedsakelig utført av Ture/mass massespektrometri-baserte teknikker på grunn av sitt mangfold programmer3,4,5,6. For på stedet detektorer, har antistoff-baserte metoder nylig vært utviklet7,8,9. Men siden disse metodene er svært spesifikke for en bestemt congener, må flere tester utføres. Hva er mer alvorlig er at romanen kongenere vokser så fort at deres antistoffer ikke kan genereres i tid. Derfor kan utviklingen av gruppespesifikke biosensors å overvåke den totale nivået av alle kongenere i en test gi en uvurderlig beregning for å vurdere miljøforurensning status.

Nylig har nukleinsyre aptamers vært mye brukt som anerkjennelse elementer i ulike biosensing plattformer på grunn av deres evne til å gjenkjenne en rekke mål, fra ioner og små molekyler proteiner og celler10,11 ,12. Aptamers er identifisert gjennom en i vitro metode kalt systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse (SELEX)13,14. SELEX begynner med tilfeldig syntetiske enkelt tråd oligonucleotide biblioteket, som inneholder ca 1014-1015 sekvenser. Størrelsen på tilfeldig biblioteket sikrer mangfoldet av RNA eller DNA kandidat strukturer. Typisk SELEX prosessen består av flere runder berikelse til biblioteket er beriket i sekvenser med høy affinitet og spesifisiteten til målet. Siste beriket bassenget er deretter sekvensielt og dissosiasjon konstanter (Kd) og selektivitet mot potensielle forstyrrende stoffer bestemmes av ulike teknikker som filtrerer bindende, affinitet Ture, overflate Plasmon resonans (SPR), etc. 15

Svært dårlig vannløselighet og mangel på funksjonelle grupper for overflate immobilisering er aptamer utvalget av dukker teoretisk vanskelig. Betydelige fremskritt for SELEX har fart oppdagelsen av aptamers. Men blitt valg av gruppespesifikke aptamers for dukker ikke har rapportert. Så langt har bare PCB-bindende DNA aptamers med høy spesifisitet for en viss congener vært identifisert16. PAEs brukes hovedsakelig i polyvinylklorid materialer, endre polyvinylklorid fra en hard plast til en elastisk plast, dermed fungerer som en plasticizer. Noen PAEs har blitt identifisert som endokrine disruptors, kan forårsake alvorlig skade leveren og nyrefunksjon, redusere motilitet i mannlige sperm, og kan føre til unormal sperm morfologi og testikkelkreft17. Verken sammensatte- eller gruppespesifikke PAE-bindende aptamers har rapportert.

Målet med dette arbeidet er å gi en representant protokoll for å velge gruppespesifikke DNA aptamers til svært hydrofobe små molekyler som PAEs, en representant gruppe dukker. Vi viser også anvendelsen av den valgte aptamer for gjenkjenning av miljøforurensning. Denne protokollen gir veiledning og innsikt for aptamer å andre hydrofobe små molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bibliotek og Primer og syntese

  1. Utforme de første bibliotek og primere.
    Biblioteket (Pool0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3 "
    Videresende primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3 "
    Fosforylert omvendt primer (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3 "
  2. Syntetisere bassenget0, FP og PO4- RP bruker standard phosphoramidite kjemi18,19,20, og rense alle DNAs av standard høyytelses flytende kromatografi (HPLC)21.
  3. Rekonstituer bassenget0, FP og PO4- RP i nuclease-gratis klasse vann på 100 µM, aliquot, og lagre dem på -20-80 ° c i opptil ett år.
    Merk: Det anbefales sterkt for å lagre bassenget0, FP og PO4- RP i 10-20 µL dele å unngå mulige krysskontaminering.

2. synthesizer anker målet og dens immobiliseringsløsninger til Epoxy-aktivert Agarose perle

  1. Syntetisere amino gruppe functionalized Dibutylftalat (DBP-NH2) anker for målet.
    Merk: Eksperimentell detaljene på syntese og karakterisering av DBP-NH2 har blitt beskrevet i litteraturen22.
  2. Forberede ankeret målet lager løsninger i et medium som passer for målet løselighet. For denne studien, forberede 100 mM DBP-NH2 lagerløsning i dimethyl sulfoxide (DMSO) og lagre løsningen på 4-20 ° c i opptil ett år.
  3. Nakkens DBP-NH2 på epoxy-aktivert agarose perler ifølge en endret protokoll fra produsenten.
    1. Veie ut 0,1 g fryse tørket pulver for epoxy-aktivert agarose perler og avbryte den destillert vann. Vask mediet 1t med 20 mL destillert vann lagt i flere dele. Vask mediet med 0,2 M Na2CO3 (pH 12).
      Merk: Medium svulmer umiddelbart etter at vannet inn i den.
    2. Oppløse DBP-NH2 (46.7 mg, 0,15 mmol) i 500 µL kopling bufferen (0,2 M Na2CO3 buffer).
    3. Bland kobling løsningen inneholder ligand med mediet. Bruk en shaker på 5 rpm for 48 timer ved romtemperatur.
    4. Gjenta vaske produktet tre ganger, sekvensielt ved hjelp av 0.1 M acetate buffer (0,5 M NaCl, pH 4.5) og 0,2 M karbonat buffer (0,5 M NaCl, pH 12) i hver vaskesyklusen. Vask og suspendere produktet i vann for å lage det siste bindet 500 µL.
    5. Lagre produktet på 4 ° C før bruk.
    6. Bekrefte suksessen med målet immobilisering av grunnleggende analyse.

3. SELEX

  1. Forberede 500 mL PAE bindende buffer i svært rent vann eller nuclease-gratis klasse vann med 20 mM Tris· HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene (20) sorbaitan monolaurate og 0,03% ikke-ioniske overflaten aktive agent (pH 7.9). Filtrere bufferen gjennom et sterilt 0.22 µm nitrocellulose filter og lagre den på en temperatur høyere enn 20 ° C i måneder.
    Merk: Det er viktig å opprettholde en god dispersjon status for PAEs PAE bindende buffer. Flere typer tensider for å øke Løseligheten av PAEs i vandig løsning. Imidlertid bør antall tensider holdes på et minimum for å unngå dannelse av surfactant micelles som vil kapsle PAE molekyler. Ikke-ioniske, overflate aktive agent er lett å utløse ved temperaturer lavere enn 20 ° C og derfor bufferen skal lagres ved en temperatur høyere enn 20 ° C.
  2. Fortynne 10 µL 100 µM bassenget0(~1.0 nmol for 1014-1015 sekvenser) i 490 µL PAE bindende bufferen. Varme bassenget0 dele (5 × 100 µL) i tynne vegger sentrifuge rørene i vann bad settet i 95 ° C i 10 min. sted rørene på is 5 min og senere ruge rør i 5 minutter ved romtemperatur (~ 25 ° C i dette arbeidet).
  3. Den første runden av utvalg: inkubasjonstiden for Pool0 og DBP−NH2−coated medium.
    1. Vask 200 µL DBP−NH2−coated middels tre ganger med 500 µL PAE bindende bufferen. Blanding DBP−NH2−coated medium med basseng0 og ruge blandingen ved romtemperatur 1t under mild risting.
    2. Separat DBP−NH2−coated mediet bundet med aptamers fra de ubundne DNAs av ultrafiltrasjon usingan ultrafiltrasjon rør med en molekylær cut-off av 100 kDa. Vask mediet tre ganger med 500 µL av PAE bindende buffer og sentrifuger 9,168 × g i 10 min på 4 ° C.
  4. Den første runden av valget: aptamer elueringsrør fra DBP−NH2−coated medium.
    1. Legge til 50 µL PAE bindende bufferen vasket medium og varme blandingen ved 90 ° C i 9 min under risting.
    2. Samle nedbryting som inneholder de eluted DNAs ved ultrafiltrasjon. Gjenta denne elueringsrør prosessen tre ganger for å gjenopprette mer bundet DNAs.
  5. Den første runden av utvalg: PCR
    1. Småskala PCR
      1. Utføre en småskala PCR23 (4 × 20 µL dele) bruker ~ 15-30 sykluser. Definere en PCR reaksjon24 som følger: 6,5 µL RNase uten vann, 1 µL av 10 µM primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol hver), 1,5 µL elut bassenget fra avsnitt 3.4 (eller RNase-fritt vann som negativ kontroll) og 10 µL av Forhåndsblandet reaksjonen blanding som inneholder dNTPs, varmt start utvalg og 2 × PCR reaksjon buffer (20 mM tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. Kjøre PCR med en termisk cycler med følgende innstillinger: 1 syklus av 95 ° C, 1 min; 30 sykluser [95 ° C, 30 s, 56 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s]; 1 syklus av 72 ° C, 2 min og hold på 4 ° C. Når maskinen kjører 20th s utvidelse trinnene 15, 20, 25 og 30 sykluser, trykk pause-tasten, åpne instrument dekselet og ta en tube ut, så trykk på pause-tasten igjen for å gjenoppta PCR.
      3. Forberede 12% denaturert polyakrylamid gel geleelektroforese (side)25,26. Bland 4.8 g urea, 6 mL av svært rent vann, 1 mL av 10 × tris/boric syre/ethylene diamine tetraacetic syre (TBE), 3 mL av 40% akrylamid, 10 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) og 100 µL 10% ammonium persulfate (APS), i den rekkefølgen. Rør godt og vente på 1,5-2 h å sikre gel helt stivner.
      4. Analysere resultatene av syklusen optimalisering: Kombiner 1 µL av hvert PCR produkt med 5 µL av RNA lasting buffer (62,5% formamide, 0.4 M formaldehyd, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic syre buffer, 0.02% xylen cyanol FF, 0.02% bromophenol blå), og 4 µL av RNase-fritt vann; varm blandingen ved 95 ° C i 10 min og raskt avkjøle den 0 ° c på is; Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur; Last i 5 forskjellige brønner på 12% denaturert siden. Kjør geleelektroforese av vertikal geleelektroforese 1 × TBE buffer på 170 V for 45 min.
      5. Etter geleelektroforese, beis gel med 3 µL av 1 × nukleinsyre gel stain i 30 mL 1 × TBE bufferen for 10 min, og ta et bilde av gel.
    2. Stor skala PCR: velge riktig antall sykluser for å produsere det høyeste intensitet bandet på riktig størrelse markøren uten uønskede biprodukter. Utføre en storskala PCR (20 × 100 µL dele) utnytte forhold og riktig antall sykluser i delen 3.5.1.
      Merk: Sluttbeløpet single-strandet bibliotek som kan fås er proporsjonal med det totale volumet av PCR, ikke konsentrasjonen av malen. Vanligvis for å få 1 nmol biblioteket, trenger enkelt-strandet bassenget 2 mL PCR. PCR er veldig følsom og lett forurenset ved utenfor DNAs. Trinn bør tas for å redusere sjansen for kontaminering, som bruker hansker, bruke steriliserte tips, ikke spytte i rør og ikke åpning hetten PCR røret før sentrifugering.
  6. Den første runden av utvalg: rensing av PCR produkt av etanol nedbør.
    1. Kombinere to rør av PCR blandingen i en tube (200 µL hver). Gjenta dette for alle rør.
    2. Legge til 15 µL av natrium acetate (3 M, pH 5.2) løsning 4 µL av DNA/RNA nedbør carrier løsning og 2,5 ganger volumet av pre-avkjølt etanol på 20 ° C i hver retning. Bland dem jevnt.
      Merk: DNA/RNA nedbør bærer er mye brukt i etanol nedbør eksperimenter for å forbedre utvinning prosentandelen av DNA/RNA i lave konsentrasjoner. Det forstyrrer ikke nedstrøms programmer som PCR og sekvenser.
    3. Sentrifuge blandingen 20,627 × g for 20 min på 4 ° C og nøye forkaste nedbryting og la hvite utløse.
    4. Legge til 400 µL av 70% pre kjøling etanol løsning på 20 ° C til hver rør å vaske nedbør. Sentrifuge blandingen 20,627 × g i 5 min på 4 ° C, og nøye forkaste nedbryting og la hvite utløse. Gjenta vask trinn to ganger.
    5. Åpne tube dekselet; stikk tetting membranen; La etanol volatilize ved 40 ° C på oppvarming blokk til den hvite bunnfall blir gjennomsiktige. Lagre bunnfall på 20 ° C.
      Merk: Renset PCR produktet kan lagres på 20 ° C.
  7. Den første runden av utvalg: single-strandet DNA generasjon (generasjon av beriket Pulje1) ved å utføre λ exonuclease reaksjonen å fordøye den phosphorylated omvendte stranden.
    1. Småskala λ exonuclease reaksjon
      1. Legge til 100 µL RNase-gratis vann en tube med renset PCR produktet fra delen 3.6. Vortex røret å løse bunnfall i røret.
      2. Forberede fem sentrifuge rør og Legg 5 µL av ovenstående løsning, 11 µL av RNase - gratis vann og 2 µL av 10 × reaksjon buffer (670 mM glycine-KOH, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) Triton X-100 pH 9.4) i hver retning.
      3. Legg 2 µL eller utvannet λ exonuclease løsning som inneholder 2 U, 5 U, 8 U og 10 U λ exonuclease i disse rør, henholdsvis. Bland løsningen godt ved forsiktig pipettering. 10 × reaksjon bufferen tilbys sammen med λ exonucleasefrom leverandøren.
      4. Ruge rør for 35 min ved 37 ° C, 15 minutter til 80 ° C, og holde på 4 ° C.
      5. Forberede den 12% innfødt siden. Bland 6 mL av svært rent vann, 1 mL av 10 × TBE, 3 mL 40% akrylamid, 10 µL av TEMED og 100 µL av 10% APS, i den rekkefølgen. Rør godt og vent 60-90 min å sikre gel helt stivner.
      6. Analysere resultatene av reaksjonene ved å kombinere 5 µL av hver reaksjon med 1 µL lasting fargestoff og 4 µL RNase uten vann, og legge disse blandinger i 5 forskjellige brønner på 12% Opprinnelig side (150 V for 45 min).
        Merk: En 20 bp double-strandet DNA stige kan også lastes på gel, men det kan ikke være nødvendig siden forskjellige bånd PCR produkt og genererte enkelt strandet biblioteket Vis på gel.
        Merk: Λ exonuclease reaksjonen har en utmerket strukturelle selektivitet. Double-strandet PCR produktet (anti-følelse strand er merket med fosfatgruppe på 5' slutten) kan være helt fordøyd i et enkelt-strandet bibliotek i nærvær av λ exonuclease i et ganske bredt konsentrasjon område (Figur 4). Minimum av λ exonuclease som helt kan generere én-strandet DNA i liten skala λ exonuclease reaksjonen brukes også for storskala λ exonuclease reaksjonen. En høyere konsentrasjon av λ exonuclease kan også brukes, siden λ exonuclease fungerer bra i mange bredt konsentrasjon uten å miste sin struktur selektivitet og produkt avkastning. Λ exonuclease reaksjonen er hemmet av en høy konsentrasjon av salt. Ufullstendig fordøyelsen av PCR produktet innebærer vanligvis at for mye salt finnes i PCR produktet. Rensing av PCR produkter av etanol nedbør (delen 3.6) er vanligvis kompatibel med dette trinnet mens PCR produktet renset ved isopropanol nedbør ofte inneholder for mye salt.
    2. Store λ exonuclease reaksjon: Velg minimum av λ exonuclease som kan helt generere én-strandet DNAs for storskala λ exonuclease reaksjonen. Reaksjonen skaleres proporsjonalt i henhold til dette. For eksempel: Hvis 2 U er minimum av λ exonuclease kreves, blande 38 µL Rnase uten vann, 10 µL av 10 x buffer, 50 µL av DNA Pulje1 og 2 µL av 10 U/µL λ exonuclease.
  8. Første runde av valg: rensing av enkelt-strandet Pulje1 av etanol nedbør.
    1. Følg instruksjonene i trinn 3.6.
    2. Bestemme konsentrasjonen av renset Pulje1 ved UV absorpsjon på 260 nm.
    3. Rekonstituer 90% renset Pulje1 i en passende mengde PAE bindende buffer. Hvis det ikke er nok DNA innhentet for neste runde av valg, gjenta deler 3,5-3.8.2.
      Merk: Volumet av PAE bindende buffer vanligvis varierer fra 200 til 500 µL ifølge bibliotek og ønsket endelige konsentrasjonen av biblioteket i neste runde av SELEX.
  9. Den andre, tredje, fjerde og femte runder av SELEX.
    1. Gjennomføre andre, tredje, fjerde og femte runder av SELEX deretter følge samme fremgangsmåte beskrevet ovenfor (delen 3.2-3.8), bortsett fra at ~ 300 pmol biblioteket var inngangen til å øke utvalg stringens.
    2. For å minimere uspesifikke absorpsjon av DNAs på mediet, ruge bassenget med uforandret mediet på en roterende shaker i 30 min i tredje og fjerde runde utvalg før inkubasjon med DBP−NH2−coated mediet.
      Merk: SELEX prosessen endte på femte runden på grunn av den alvorlige krysskobling mellom DNAs avslørt av den store mengden av høy molekylvekt produkt som ikke migrere til gel.

4. høy gjennomstrømming sekvensering

  1. Forberede bassenget4 fra delen 3.9.2 sekvensering av PCR forsterkning med kompatibel primere.
    1. Design og syntetisere en indeksert frem primer med 6 nt nederst 5 ' å gjøre sekvens analysen.
      Indeksert frem primer (FP-sekvensering): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3 "
    2. Definere en 1000 µLPCR reaksjon som følger: 380 µL RNase uten vann, 50 µL av hver 10 µM primer (FP-sekvensering, PO4- RP, 0,5 nmol hver), 20 µL av elut fra 3.9.2-delen, og 500 µL av Forhåndsblandet reaksjonsblandingen som inneholder dNTPs, varmt start utvalg , og 2 × PCR reaksjon buffer. Aliquot blandingen i 10 PCR-rør. Bruk samme PCR vilkår som beskrevet under 3.5.1.2.
  2. Rense PCR produktet for å møte sekvensering innretningen krav. For eksempel bruk side-gel DNA recovery kit i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Sende renset PCR produktet (~ 2 µg) til et sekvensering under Fraktomkostninger kreves av funksjonen sekvensering. For eksempel skipet PCR produktet i en sentrifuge tube med caps grundig forseglet med kjøleelementer til sekvensering anlegget.
    Merk: Fikk resultatene som rangert sekvenser av antall kopier hvert forløp å vurdere anriking av sekvensert bassenget. Topp sekvensen het DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3 "). Sin tilhørighet og selektivitet ble målt av følgende protokollen (del 5 og 6). Anvendelsen i en elektrokjemisk bio-sensing ble senere demonstrert i § 7.

5. Kd fastsettelse av valgt Aptamer kandidater med Magnetic Bead-Based kvantitative PCR (qPCR)

  1. Syntetisere DBP-1-qPCR og primere med standard phosphoramidite kjemi og rense det av standard HPLC.
    Aptamer kandidat (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3 "
    Videresende grunning for qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3 "
    Omvendt grunning for qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3 "
    Merk: Primer regionene testet sekvensen er forskjellige fra bassenget0 brukes i avsnitt 3. Formålet med endre regionene primer er å teste slektskap av kjernen sekvensen alene, unntatt regionene primer.
  2. Nakkens DBP-NH2 på karboksylsyre-belagt magnetiske perler følge instruksjonene fra produsenten.
    1. Vask karboksylsyre-belagt magnetiske perler to ganger med 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) (pH 5.0), med en lik mengde magnetiske perler (100 µL) pipetted av ampullen, for 10 min med god blanding (over-gjennomgående eller lignende).
    2. Umiddelbart før bruk, forberede 50 mg/mL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) løsning med kaldt 25 mM MES (pH 5.0).
    3. Umiddelbart før bruk, forberede 50 mg/mL av N-hydroxysuccinimide (NHS) løsning med kaldt 25 mM MES (pH 5.0).
    4. Bland 100 µL av EDC-løsningen og 100 µL av NHS løsning med vasket perler og ruge i 30 min ved romtemperatur med langsomt rotasjon.
    5. Legge røret på en magnet for 4 min etter inkubasjon forkaste nedbryting og vaske perler to ganger med 100 µL av kaldt 25 mM MES (pH 5.0).
    6. Inkuber 6 µL av 100 mM DBP-NH2 lagerløsning og 25 mM MES (pH 5.0 290 µL) med aktivert perler under rotasjon i minst 30 min ved romtemperatur eller 2t 4 ° c, med langsomt rotasjon på 5 rpm.
    7. Sett røret på magneten i 4 min etter inkubasjon og forkaste nedbryting. Vask belagt perlene 4 ganger og resuspend perler med 200 µL av PAE bindende buffer og butikk på 4 ° C før bruk.
  3. Samle titrering kurve for å fastslå Kd.
    1. Forberede en rekke DBP-1 løsninger (500 µL) i ulike konsentrasjoner i PAE bindende buffer fra 1 pM til 300 nM.
    2. Legge til 10 µL av DBP-NH2-belagt magnetiske perler som beskrevet i delen 5.2.7 til hver DBP-1-løsning. Inkuber 1t ved romtemperatur under rotasjon.
    3. Plassere rør på en magnet for 4 min og fjerne nedbryting. Vask perlene 4 ganger med 200 µL PAE bindende bufferen.
    4. Legg til 60 µL PAE bindende bufferen hver rør. Inkuber rørene på 95 ° C i 15 min. samle nedbryting som inneholder den eluted DBP-1 av magnetiske separasjon. Ey tilsettes for å gjenopprette mer bundet DBP-1.
    5. Fortynne den elute løsningen 100-fold og ta 3 µL for sanntids qPCR. Sette opp en qPCR reaksjon som følger: 3 µL RNase uten vann, 2 µL av 10 µM primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol) 3 µL av elut og fortynnet DBP-1 og 10 µL av Forhåndsblandet reaksjonsblandingen inneholder dNTPs, utvalg og 2 x PCR reaksjon buffer.
    6. Bestemme antall DBP-1 i hver prøve ved å kjøre qPCR med en termisk cycler med følgende innstillinger: 1 syklus av 95 ° C, 30 s; 30 sykluser [95 ° C, 30 s, 45 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s]; 1 syklus av 72 ° C, 30 s og hold på 4 ° C.
    7. Tegn titrering kurve og bestemme Kd av lineære montering kurve forutsatt en 1:1 bindende forholdet27.

6. relativt tilhørighet og spesifisitet Test av konkurransedyktige analyser

  1. Legge til 10 µL av DBP-NH2-belagt magnetiske perler til DBP-1-løsning (500 µL, 1 µM). Inkuber 1t ved romtemperatur under rotasjon. Plassere rør på en magnet for 4 min og fjerne nedbryting. Vask perlene 4 ganger med 200 µL PAE bindende bufferen og resuspend det i 10 µL PAE bindende bufferen.
  2. Legge til 10 µL av DBP-NH2-belagt middels grense DBP-1 110 µL av hver 10 µM testet utvalg (DBP-NH2DBP, DEHP, butyl benzyl phthalate(BBP), tung metall ioner, etc.) Inkuber ved romtemperatur for 1 h. samle nedbryting av magnetiske separasjon.
  3. Fortynne nedbryting 100-fold og ta 3 µL for qPCR kvantifisering. Sette opp en qPCR reaksjon som følger: 3 µL RNase uten vann, 2 µL av 10 µM primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol) 3 µL av elut og fortynnet DBP-1 og 10 µL av Forhåndsblandet reaksjonsblandingen inneholder dNTPs, utvalg og 2 x PCR reaksjon buffer.
  4. Bestemme antall DBP-1 i hver prøve ved å kjøre qPCR med en termisk cycler med følgende innstillinger: 1 syklus av 95 ° C, 30 s; 30 sykluser [95 ° C, 30 s, 45 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s]; 1 syklus av 72 ° C, 30 s og hold på 4 ° C.
  5. Beregne relative affinitet ved å dele antall DBP-1 løslatt fra perlene i nærvær av prøven på antall DBP-1 fra perlene i PAE bindende bufferen: Relative affinitet = Nprøve/Nbuffer.

7. fabrikasjon og elektrokjemiske målinger av DEHP elektrokjemisk Biosensors

  1. Syntetisere thiolated kjernen sekvensen (HS-DBP-1) og signalnettverk sonden (DBP-1-C-Fc) bruker standard phosphoramidite kjemi og rense det av standard HPLC.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 "
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3"
    Merk: Rasjonell utformingen av sensoren sonder ble beskrevet i vår forrige pbulications18,22.
  2. Rekonstituer HS-DBP-1 og DBP-1-C-Fc i nuclease-gratis klasse vann på 100 µM, aliquot, og lagre dem på -20-80 ° c i opptil ett år.
  3. Polsk gold elektroden nøye til en speilblanke overflate med 1 og 0,3 0,05 µm Al2O3 pulver på en microcloth i 5 min og sonicate det i ultrapure vann i 5 min å fjerne gjenværende Al2O3. Rengjør elektroden av elektrokjemiske polering med 35 påfølgende syklisk voltammetry (CV) skanner fra 0,4 til +1.2 V (vs Hg-Hg2SO4) i H 0,5 M2SO4 på 100 mV/s.
  4. Forbered en blanding på 0,5 µM HS-DBP-1 og 0,5 µM DBP-1-C-Fc i 100 µL 10 mM fosfat bufferen som inneholder 1 M NaCl, pH 7.4 (PBS). Varm blandingen i tynne vegger sentrifuge røret i vann bad settet i 95 ° C i 10 min, og sakte avkjøle blandingen til romtemperatur.
  5. Legg 1 µL av tris hydrochloride med-(2-carboxyethyl)-phosphine (TCEP, 10 mM, lagerløsning) inn i blandingen. Holde ved romtemperatur 1t.
  6. Fordype rent gull elektroden i ovenstående løsning for 12 h, eller over natten i romtemperatur.
  7. Skyll elektroden med PBS og fordype elektroden i 1 mM [S (CH2)2(OCH2lm2)6OCH3]2 (HS-F.eks6- OMe) i PBS for 1 h. skyll elektroden grundig benytter PAE bindende buffer og fordype elektroden PAE bindende buffer.
  8. Ta en bakgrunnsskanning for firkantbølge voltammetry (SWV) i målet uten PAE bindende buffer.
    1. Rengjør alle eksperimentelle utstyr: elektrolytisk celler, gull arbeider elektrode, platina counter elektrode og mettet calomel referanse elektrode (SCE).
    2. Aktivere den installert programvaren. Angi eksperimentelle parametere for SWV-målinger.
      Merk: Følgende eksperimentelle parametere ble brukt for SWV eksperimenter: potensielle utvalg: fra-0.2 til 0,7 V; modulasjon amplituden: 25 mV; puls bredde: 5 ms; søke pris: 50 mV/s; trinn potensial: 1 mV.
    3. Koble gull arbeider elektrode, platina counter elektrode og SCE til en potentiostat, og sette disse tre elektrodene i en elektrolytisk celle inneholder PAE bindende buffer.
    4. Kjør SWV måling.
      Merk: Når den SWV måling starter, en SWV kurve skal vises på skjermen på datamaskinen. Skanningen gjentas til skanner er konstant og ingen flere endringer i topp høyde eller figur er observert.
  9. Fordype arbeider elektroden i PAE bindende bufferen som inneholder en viss konsentrasjon av DEHP (f.eks 10 pM) i 30 min ved romtemperatur. Skyll elektroden grundig bruker PAE bindende buffer og fordype elektroden PAE bindende buffer med counter elektrode og SCE. Samle SWV kurven under samme stand som beskrevet i kapittel 7.8.
  10. Gjenta trinn 7.9, bortsett fra at konsentrasjonen av DEHP (f.eks 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) sekvensielt økt. Tegn titrering kurve.
  11. Spesifisitet tester: Gjenta trinn 7.3-7.9, bortsett fra at PAE bind bufferen som inneholder DEHP erstattes av PAE bindende bufferen som inneholder mulige forstyrrende stoffet på ønsket konsentrasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi designet og syntetisk aminosyre gruppe functionalized Dibutylftalat (DBP-NH2) som anker mål (figur 1F). Vi har utført DNA aptamer valg av PAEs bruker DBP-NH2 anker for målet og følge klassisk målet immobilisering-basert metode (figur 2). Hver runde, ble en pilot PCR utført ved hjelp av siden denaturert for å optimalisere syklus antall PCR (Figur 3). SIDEN denaturert i stedet for opprinnelig side, anbefales sterkt fordi vi og andre kolleger har funnet at mistanke om høy molekylvekt biprodukter vises på de opprinnelige gels på høyere syklus tallene er faktisk crosslinking komplekser dannet av sekvenser av riktig størrelse. Dermed kan bandet intensiteten på siden denaturert virkelig gjenspeile det riktige produktet. Den eneste strandede DNA generasjonen er et kritisk steg, og mange metoder for dette trinnet har vært rapportert28. Metoden λ exonuclease fordøyelsen er den billigste metoden. Suksessen av enkelt-strandet DNA generasjon kan kontrolleres enkelt av innfødte side, der PCR produktet vises som enkelt (første flere runder med SELEX) eller flere band, mens bare ett band vises etter fordøyelsen (Figur 4).

SELEX ble stoppet etter femte runde valg på grunn av betydelig antall DNA akkumuleres øverst på siden, selv etter rødsprit behandling (hvor DNAs er oppvarmet ved 95 ° C i 10 min i 2 × TBE inneholder 8.3 M urea) , som foreslo alvorlig cross-linking mellom DNAs og også indikert at sekvensene var beriket. Derfor ble bassenget4 sendt for høy gjennomstrømming sekvensering. Høy gjennomstrømming resultatet viste at topp 100 hyppigst forekommende sekvenser var svært bevart og var fra en familie. Topp sekvensen DBP-1 vises nanomolar affinitet (figur 5) og god gruppe-spesifisitet for PAE kongenere (DBP, BBP, DEHP) (figur 6) via praktisk qPCR analyser, som beskrevet i delen protokollen.

DBP-1 er brukt til å konstruere en strand forskyvning-baserte elektrokjemisk aptasenor henhold til vår tidligere rapportert arbeid29. DEHP sensoren kan omhyggelig og selektivt svare på DEHP (figur 7). De vanlige miljøgifter som heavy metal ioner, antibiotika og små molekyler med lignende funksjonsgrupper viste svært svake respons til DBP-1.

Figure 1
Figur 1: Kjemiske strukturer av (A) PAEs, (B) BBP, (C) DBP, (D) DEHP, (E) 4-OH-DEHP, (F) DBP−NH2. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Han Y. et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Gruppespesifikke DNA aptamer utvalg prosedyre for PAEs bruker DBP-NH2 som et anker. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Han Y. et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant resultat PCR syklus optimalisering denaturert siden. Fra venstre til høyre, banene representerer: 20 bp DNA stigen standard, 15 sykluser (ingen DNA mal), 20 sykluser (ingen DNA mal), 25 sykluser (ingen DNA mal), 30 sykluser (ingen DNA mal), 15 sykluser, 20 sykluser, 25 sykluser og 30 sykluser. Optimale forhold ble observert på 25 sykluser, der ett produkt bandet var på høy intensitet uten uønskede biprodukter, videre ingen band ble observert i tilsvarende tomt kontrollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: optimalisering av λ exonuclease reaksjon å fordøye den phosphorylated stranden innfødt siden. Fra venstre til høyre, banene representerer: 20 bp DNA stigen standard, negative (ingen λ exonuclease), 2U, 5U, 8U og 10U. Minimum av enzym ble observert på 2U, der dobbel PCR produktet blir enkelt-strandet DNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: affinitet målinger av DBP-1 av qPCR-baserte analyser. Feilen (standardavvik, SD) Kd's beregnet fra tre målinger på samme utvalget. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Han Y. et al. 22

Figure 6
Figur 6: Relative affinitet målinger av DBP-1 for gratis DBP-NH2 (10 µM), DBP (10 µM), DEHP (10 µM), BBP (10 µM), ethyl acetate (10 µM), benzosyre (10 µM), phthalic syre (10 µM) og andre via konkurranse analyser. Annet: en blanding av potensielle forstyrrelser (glukose, kanamycin, ampicillin og etanol) på 10 µM. Forholdet (relativ affinitet) ble beregnet ved å dele antall aptamers fra perlene i nærvær av prøven på antall aptamers fra perlene i PAE bindende bufferen. Stolpene angir gjennomsnittlig ± SD. SDs ble beregnet fra tre enkeltmål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: DEHP elektrokjemisk biosensor ultrasensitive og ultraselective deteksjon av DEHP: mekanisme (A), SWV kurver (B), kalibreringskurven (C), og selektivitet tester (D). Feilene (SDs) ble beregnet fra tre enkeltmål. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Han Y. et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fremragende fordelen med aptamers er at de er identifisert gjennom metoden i vitro SELEX, mens antistoffer genererte via i vivo immunoreactions. Derfor kan aptamers velges med ønsket mål spesifisitet under velutformede eksperimentelle forhold, mens antistoffer er begrenset til fysiologiske forhold.

For å lette separasjon av bundet sekvenser fra frie sekvenser, flere modifisert SELEX nylig er rapportert, som kapillær geleelektroforese30, microfluidics31, magnetiske / akryl perler / agarose perler14, etc., har erstattet nitrocellulose filtre eller affinitet til oppnå mer effektiv separasjon. Blant disse teknikkene, har perle-baserte metoder er mest brukt for aptamer valg av små molekyl mål på grunn av sin enkle oppsett, enkel betjening og blir mottakelig for små molekyl analyser.

Det er to grupper av metodene som er brukt for aptamer utvalg av små molekyl mål: mål13 og biblioteket14 immobilisering-baserte metoder. I gruppen tidligere metoder er små molekyl målene immobilisert på solid fasen som functionalized magnetiske perler eller agarose perler via kovalente kopling reaksjoner. Biblioteker er ruges med små molekyl belagt perler, og de sekvensene som ikke binde eller binder svakt til målet på solid fasen fjernes ved vask og sentrifugering eller magnetiske separasjon trinnene. Bundet sekvensene er senere elut og forsterket av PCR. Små molekyl målene må ha minst én funksjonsgruppe tilgjengelig for kopling reaksjonen. For de uten passende funksjonelle grupper har funksjonsgruppen kan legges til det opprinnelige målet gjennom Organisk syntese. Syntese av nøye utformet målet kan omfatte flere trinn, og noen ganger er ganske utfordrende også. Strukturelle endringen av mål kan også sterkt påvirke bindende og slektskap med deres aptamers. Å unngå disse problemene, bibliotek immobilisering-baserte metoder har blitt utviklet, der biblioteket er hybridiserte til komplementære DNA fange sonder på magnetiske perler, og bindende sekvensene faller perler ved binding med målene. I denne gruppen av metoder, målene legges i bindingen bufferen og ingen funksjonsgrupper kreves. PAEs er ester derivater av ftalat syre, og en typisk PAE består av en ftalat syre ester gruppe og en eller to alkyl kjeder (figur 1A-D). PAEs har ingen funksjonelle grupper tilgjengelig for solid fase immobilisering. Dermed synes biblioteket immobilisering-baserte metoder mer attraktiv for aptamer valg av PAEs.

Godt kontrollerte spredning statusen er kritiske for å oppnå ønsket anriking av biblioteket via SELEX. Imidlertid PAEs er ekstremt hydrofobe og lett aggregat i en konsentrasjon som er høyere enn flere µM, selv i nærvær av flere tensider å lette spredningen løsninger. Dermed spredning PAEs er vanskelig å kontrollere, og det ville være vanskelig å velge aptamers som spesifikt binder til PAE molekyler. For å oppklare problemet løselighet, er mål-immobilisering metoder valgt, i hvilken PAEs var immobilisert på hydrofile perler via kovalente bånd. Ved denne immobilisering strategien bør mål være nesten kun på perle overflaten i en enkelt molekylær tilstand, i stedet for mengdefunksjoner.

Den strukturelle utformingen av anker målet er også ganske viktig for vellykket valg av gruppespesifikke aptamers. Tre faktorer må vurderes for strukturelle design. Det første er hensikten med det aptamer området. Vurderer formålet å velge gruppe-spesifikke aptamers, er det viktig å utsette vanlige gruppe PAEs for aptamer bindingen og hindre at resten av deler fra å delta i aptamer bindingen. Dermed bør funksjonsgruppen introduseres i terminalen til side kjede. I begynnelsen, vi designet OH-functionalized DEHP (4-OH−DEHP) (figur 1E) anker for målet og immobilisert det på karboksylsyre magnetiske perler16. Dermed ble alkyl kjedene utsatt på overflaten av matrisen. Vi prøvde å velge magnetiske perler med carboxyl grupper som solid matrix. Ingen åpenbare affinitet forbedring ble observert etter fem runder med valg og uspesifikke opptaket på nakne matrisen ble holdt sterk.

Derfor DBP-NH2 senere ble designet basert på følgende betraktninger: (1) ftalat gruppen er mer sannsynlig å samhandle med aptamer gjennom π-π stakken og hydrogen bånd enn alkyl kjeden; (2) NHS-mediert carbodiimide reaksjon er mild og har en svært effektiv kobling effektivitet, så -NH2 er introdusert på slutten av en alkyl DBP; (3) det er lett å betjene med magnetiske perler som en solid fase partisjon, men uspesifikke opptak av biblioteket er sterk. Selv om tapet av agarose perler under separasjon er høyere enn de magnetiske perlene, er uspesifikke opptak av biblioteket mye lavere. Dermed DBP-NH2 var immobilisert på epoxy-aktivert agarose perler, og phthalic acidester gruppen ble eksponert på overflaten av matrisen.

Valget utvalg bufferen er viktig, spesielt for små molekyl mål med mangfoldig oppløselighet. Bindende bufferen må være nøye forberedt å unngå aggregering og sikre en god dispersjon delstaten dukker under hele aptamer utvalg og karakteristikk. I vår studie fant vi at DEHP ikke kan løses i vanlig buffere uten tensider, viser to forskjellige lag. Laget forsvinner etter tillegg av flere tensider i optimalisert mengden. Klart løsningene må lagres ved temperaturer høyere enn 20 ° C til å opprettholde sin status. Detaljer er gitt i protokoll trinn 3.1.

Single-strandet DNA generasjon fra double-strandet PCR produkter er en kritisk trinn i SELEX prosessen. Flere forskjellige metoder er for øyeblikket beskrevet i den litteratur32,33, inkludert asymmetrisk PCR, λ exonuclease fordøyelsen, magnetiske separasjon med streptavidin-belagt perler og størrelse separasjon av denaturing urea-polyakrylamid gel.

Ulike metoder har sine egne styrker og svakheter. Foreløpig er den mest brukte metoden for generering av ssDNA magnetisk separasjon med streptavidin-belagt perler. Enestående fordelen med denne metoden er tidsbesparende og enkel drift. Ulempen er høy kostnadene sammenlignet med andre metoder. Derimot er størrelse separasjonsbaserte metoden med omvendt primere med GC-rik stilk-løkke struktur, en av de billigste metodene, avkastningen av enkelt-strandet DNA er den laveste disse metodene32. I denne protokollen beskrev vi bruk av λ exonuclease fordøyelsen å generere én-strandet DNA, som er en av de billigste metodene. Vi fant at avkastningen av enkelt-strandet DNA er sammenlignbare med de to metodene av magnetiske separasjon og streptavidin-belagt perler. Videre fant vi at exonuclease reaksjonen var hemmet av den høye konsentrasjonen av salt. Ufullstendig fordøyelsen av PCR produktet rapportert i litteraturen33 var sannsynlig på grunn av for mye salt eksisterende PCR produktet. I tillegg λ exonuclease er svært aktiv og billig (Figur 4).

Karakterisering og validering av aptamers er arbeidskrevende, tidkrevende, og bærer en alvorlig flaskehals aptamer funnet rørledning33. De fleste teknikker er masse-sensitive metoder som fungerer godt for større aptamer binding partnere (> 10 000 amu), men er ikke tilstrekkelig sensitive til å måle interaksjonene med lav molekylvekt mål (< 1000 amu)15. Karakterisering og validering av aptamers av hydrofobe små molekyler som PAEs er enda vanskeligere. Deres dårlig vannløselighet resulterer i unsaturation av titrering kurve, som hindrer Kd'sbestemmelse i løsning eller immobilizes aptamers på overflaten. Derfor bestemt vi Kds av den identifiserte aptamers av høy gjennomstrømning sekvensering av immobilizing DBP-NH2 på hydrofile magnetiske perler å unngå løselighet problemet. Den relative slektskap og selektivitet av aptamers til andre PAEs var så bestemmes av de konkurransedyktige analyser, der aptamer kandidatene var pre avgrenset til DBP-NH2 knyttet magnetiske perler og frigitt til nedbryting på inkubasjon med de testet PAEs eller andre potensielt forstyrrende stoffer. Konkurransedyktige analysen ble brukt fordi det ga en lettvinte affinitet sammenligning mellom PAEs som hadde ingen funksjonelle grupper for overflate immobilisering. I tillegg er magnetiske perle-baserte fluorescerende analyser egnet for affinitet studiet av små molekyl-aptamer vekselsvirkningene34. Vi fant imidlertid at de magnetiske perlene noen ganger føre til fluorescens slukke av ukjente grunner. Dermed ble qPCR analyser brukt for affinitet målingene.

En kritisk teknikken tips for den elektrokjemiske biosensor beskrevet i denne studien er den overflaten passivation elektrode35. På grunn av den høye hydrophobicity av DEHP har den en kraftig tendensen å bli nonspecifically absorbert på gull elektroden, fører til svikt i gjenkjenning. Mest vanligvis brukte overflate passivation agent, 6-mercapto-1-hexanol (MCH)36,37, er ikke tilstrekkelig til å hindre uspesifikke absorpsjon av DEHP, mens vi fant at HS-(CH2)2-[OCH2lm2 ]6- OCH3 var effektiv nok til å aktivere følsom påvisning av DEHP38.

Denne prosedyren beskriver en protokoll for å velge gruppespesifikke DNA aptamers svært hydrofobe små molekyler og bruk av den valgte aptamer i en elektrokjemisk biosensor. Protokollen hjelper med valg av andre hydrofobe små molekyler og gir innsikt i sensor utviklingen av svært hydrofobe små molekyler også. Utvelgelsesprosessen aptamer tilhører kategorien mål immobilisering-baserte metoder. Det finnes også begrensningene for denne type metode for denne protokollen, for eksempel behovet for komplisert syntese av anker mål og virkningene av solid fasen aptamer bindingen. Attraktive fordelene av elektrokjemisk biosensors som beskrives i denne protokollen inkludere sine enkel design og høy følsomhet. Den store ulempen er deres begrensede presisjon på grunn av deres svært bredt dynamisk område. Biosensors som er beskrevet her er derfor mer egnet for screening tester, i stedet for kvantitativ måling av målene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for økonomisk støtte fra National Natural Science Foundation (21675112), Key prosjektet av vitenskap og teknologi plan Beijing utdanning provisjon (KZ201710028027) og Yanjing ung forsker Program av hovedstaden Normal University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

Kjemi problemet 133 Aptamer valg phthalic syre estere gruppespesifikke hydrofobe små molekyler kvantitativ polymerisasjon kjedereaksjon elektrokjemisk aptasensor Persistente organiske miljøgifter
Phthalic syre Ester-bindende DNA Aptamer utvalg, karakterisering og programmet en elektrokjemisk Aptasensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y.,… More

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter