Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Phthalater syre Ester-bindende DNA Aptamer udvalg, karakterisering og ansøgning til en elektrokemisk Aptasensor

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

En protokol til in vitro- udvælgelse og karakterisering af gruppespecifikke phthalater syre ester-bindende DNA aptamers præsenteres. Anvendelsen af den valgte aptamer i en elektrokemisk aptasensor er også inkluderet.

Abstract

Phthalater acid estere (PAEs) areone i de store grupper af persistente organiske miljøgifte. Gruppe-specifik påvisning af PAEs er meget eftertragtede på grund af den hurtige voksende kongeneres. DNA aptamers er blevet i stigende grad anvendt som anerkendelse elementer på biosensor platforme, men at vælge aptamers mod stærkt hydrofobe lille molekyle mål, såsom PAEs, er sjældent rapporteret. Dette arbejde beskriver en perle-baserede metode designet til Vælg gruppe-specifikke DNA aptamers til PAEs. Aminogruppen functionalized dibutylphthalat (DBP-NH2) som anker mål blev syntetiseret og immobiliseret på epoxy-aktiveret Agarosen perler, tillader visning af gruppen phthalic ester på overfladen af matrixen immobilisering og Derfor valget af gruppespecifikke bindemidler. Vi bestemt dissociation konstanter aptamer kandidater af kvantitative polymerisering kædereaktion kombineret med magnetisk separation. Den relative tilhørsforhold og selektivitet af aptamers til andre PAEs blev bestemt af de konkurrencedygtige assays, hvor aptamer kandidater var pre afgrænset til DBP-NH2 knyttet magnetiske perler og frigivet til supernatanten ved inkubering med de testede PAEs eller andre potentielle interfererende stoffer. Konkurrencedygtige analysen blev anvendt, fordi den gav en letkøbt affinitet sammenligning blandt PAEs, der havde ingen funktionelle grupper for overflade immobilisering. Endelig, vi viste fabrikation af en elektrokemisk aptasensor og brugte den til ultrasensitive og selektiv påvisning af bis(2-ethylhexyl) phthalat. Denne protokol giver indsigt aptamer opdagelsen af andre hydrofobe små molekyler.

Introduction

Sammen med hurtig økonomisk udvikling er acceleration af industrialisering og bybygning, miljøforurening mere alvorlige end nogensinde. Typiske miljøforurenende omfatter heavy metal ioner, toksiner, antibiotika, pesticider, endokrine disruptorer og persistente organiske miljøgifte (pop). Udover metal-ioner og toksiner, andre forurenende stoffer er små molekyler der ganske ofte består af en række forskellige kongenere. For eksempel, de mest giftige POP'er omfatter polychlorerede biphenyler (PCB), polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH), polybromerede diphenyl ethere (PBDE), polychlorerede dibenzo-p-dioxiner (PCDD), polychlorerede dibenzofuraner (PCDF), og phthalic Acid estere (PAEs)1,2, som alle består af mange kongenere. Lille molekyle opdagelse er blevet primært udført af kromatografi/masse massespektrometri-baseret teknikker på grund af deres mangfoldighed af programmer3,4,5,6. For on-site opdagelser, er antistof-baserede metoder for nylig blevet udviklet7,8,9. Men da disse metoder er meget specifikke for en bestemt kongeners, flere prøver skal udføres. Hvad er mere alvorligt er at de roman kongenere vokser så hurtigt at deres antistoffer ikke kan oprettes i tid. Derfor kan udviklingen af gruppespecifikke biosensorer til at overvåge de samlede niveauer af alle kongenere i én test udgør en uvurderlig metrikværdi for at vurdere miljøforurening status.

For nylig, nukleinsyre aptamers er blevet bredt anvendt som anerkendelse elementer i forskellige biosensing platforme på grund af deres evne til erkendelse af en bred vifte af mål, fra ioner og små molekyler til proteiner og celler10,11 ,12. Aptamers er identificeret gennem en in vitro- metode, der kaldes systematisk udvikling af ligander af eksponentielle berigelse (SELEX)13,14. SELEX begynder med tilfældige syntetiske enkelt streng oligonukleotid bibliotek, som indeholder ca 1014-1015 sekvenser. Størrelsen af den tilfældige bibliotek sikrer mangfoldighed af RNA eller DNA kandidat strukturerne. Den typiske SELEX proces består af flere runder af berigelse indtil biblioteket er beriget i sekvenser med høj affinitet og specificitet til målet. Den endelige beriget pool er derefter sekventeret, og dissociation konstanter (Kd) og selektivitet mod potentielle interfererende stoffer bestemmes ved hjælp af forskellige teknikker såsom filter bindende affinitet kromatografi, overflade Plasmon resonans (SPR), osv. 15

På grund af ekstremt fattige vandopløselighed og manglen på funktionelle grupper for overflade immobilisering er aptamer Udvalget af dukker teoretisk vanskeligt. Betydelige fremskridt for SELEX har fremskyndet opdagelsen af aptamers. Dog har udvalg af gruppe-specifikke aptamers for pop ikke endnu blevet rapporteret. Hidtil har kun PCB-bindende DNA aptamers med høj specificitet for en bestemt kongeners blevet identificeret16. PAEs anvendes hovedsageligt i polyvinylchlorid materialer, skiftende polyvinylchlorid fra en hård plast til en elastisk plast, dermed fungere som en blødgører. Nogle PAEs er blevet identificeret som hormonforstyrrende stoffer, kan forårsage alvorlige skader til lever- og nyrefunktion, reducere motilitet af mandlige sædceller, og kan resultere i abnorm sperm morfologi og testikelkræft17. Hverken stof- eller gruppe-specifikke PAE-bindende aptamers er blevet rapporteret.

Målet med dette arbejde er at give en repræsentativ protokol for at vælge gruppe-specifikke DNA aptamers til yderst hydrofobe små molekyler såsom PAEs, en repræsentativ gruppe af dukker. Vi viser også anvendelsen af de valgte aptamer til registrering af miljøforurening. Denne protokol giver vejledning og indsigt for aptamer opdagelsen af andre hydrofobe små molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bibliotek og Primer Design og syntese

  1. Designe det første bibliotek og primere.
    Bibliotek (Pool0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Videresende primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforyleret omvendt primer (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Syntetisere Pool0, FP og PO4- RP ved hjælp af standard phosphoramidite kemi18,19,20, og rense alle DNAs af standard high-performance væskekromatografi (HPLC)21.
  3. Rekonstruere Pool0, FP og PO4- RP i nukleasen-fri klasse vand på 100 µM, alikvot, og gemme dem på -20 eller-80 ° C i op til et år.
    Bemærk: Det er kraftigt antydet for at gemme Pool0, FP og PO4- RP i 10-20 µL delprøver at undgå mulig krydskontaminering.

2. syntetisere anker mål og dens immobilisering på Epoxy-aktiveret Agarosen perle

  1. Syntetisere aminogruppen functionalized dibutylphthalat (DBP-NH2) som anker mål.
    Bemærk: De eksperimentelle detaljer på syntese og karakterisering af DBP-NH2 er blevet beskrevet i litteraturen22.
  2. Forberede ankeret target stamopløsninger i en medium passer til målsætning oploeselighed. For denne undersøgelse, forberede 100 mM DBP-NH2 stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) og gemme løsningen på 4 eller -20 ° C i op til et år.
  3. Immobilisere DBP-NH2 på epoxy-aktiveret Agarosen perler efter en modificeret protokol fra producenten.
    1. Afvejes 0,1 g frysetørret pulver af epoxy-aktiveret Agarosen perler og suspendere det i destilleret vand. Vask medium for 1 h ved hjælp af 20 mL destilleret vand tilsat i flere delprøver. Vask medium med 0,2 M Na2CO3 (pH 12).
      Bemærk: Medium svulmer umiddelbart efter tilsætning af vand ind i det.
    2. Opløse DBP-NH2 (46,7 mg, 0,15 mmol) i den 500 µL kobling buffer (0,2 M Na2CO3 buffer).
    3. Bland den kobling løsning indeholdende ligand med mediet. Bruge en shaker på 5 rpm i 48 timer ved stuetemperatur.
    4. Gentag vask produktet tre gange, sekventielt ved hjælp af 0,1 M acetat buffer (0,5 M NaCl, pH 4.5) og 0,2 M carbonat buffer (0,5 M NaCl, pH 12) i hver vask. Vask og suspendere produkt i vand for at lave den endelige mængden af 500 µL.
    5. Gemme produktet ved 4 ° C før brug.
    6. Bekræft succes af target immobilisering af elementært analyse.

3. SELEX

  1. Forberede 500 mL af PAE binding buffer i ultra-rene vand eller nukleasen-fri klasse vand med 20 mM Tris· HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene (20) sorbaitan monolaurate og 0,03% nonioniske overfladeaktive agent (pH 7,9). Filtrer bufferen gennem en steril 0,22 µm nitrocellulose filter og opbevar den ved en temperatur på 20 ° c for måneder.
    Bemærk: Det er afgørende at opretholde en god dispersion status af PAEs i PAE binding buffer. Flere typer af overfladeaktive stoffer er nødvendig for at forbedre opløseligheden af PAEs i vandig opløsning. Dog bør antallet af overfladeaktive stoffer holdes på et minimum for at undgå dannelsen af overfladeaktive micelles, der vil indkapsler PAE molekyler. Ikke-ionisk, overflade aktiv agent er let at faelde ved temperaturer lavere end 20 ° C, og derfor bufferen skal opbevares ved en temperatur på over 20 ° C.
  2. Fortyndet 10 µL af 100 µM Pool0(~1.0 nmol for 1014-1015 sekvenser) i 490 µL af PAE binding buffer. Varm Pool0 delprøver (5 × 100 µL) i de tynde væg centrifugeglas i vand Bad sæt ved 95 ° C i 10 min. sted rør i isbad i 5 min og derefter inkuberes rør for 5 min. ved stuetemperatur (~ 25 ° C i dette arbejde).
  3. Den første runde af valg: inkubation af Pool0 og DBP−NH2−coated medium.
    1. Vask 200 µL af DBP−NH2−coated medium tre gange med 500 µL af PAE binding buffer. Mix DBP−NH2−coated medium med Pool0 og inkuberes blanding ved stuetemperatur for 1 h under milde ryster.
    2. Separat DBP−NH2−coated medium bundet med aptamers fra de ubundne DNAs ved ultrafiltrering usingan ultrafiltrering tube med molekylær afskæring af 100 kDa. Vask medium tre gange med 500 µL af PAE binding buffer, og der centrifugeres ved 9,168 × g i 10 min. ved 4 ° C.
  4. Den første runde af valg: aptamer eluering fra DBP−NH2−coated medium.
    1. Tilsæt 50 µL af PAE binding buffer til vasket medium og varme blanding ved 90 ° C i 9 min under omrystning.
    2. Indsamle supernatanten indeholdende de eluted DNAs ved ultrafiltrering. Gentag denne eluering proces tre gange for at inddrive mere bundne DNAs.
  5. Den første runde af valg: PCR
    1. Lille skala PCR
      1. Udføre en lille skala PCR23 (4 × 20 µL delprøver) ved hjælp af ~ 15-30 cykler. Oprette en PCR reaktion24 som følger: 6,5 µL af RNase-fri vand, 1 µL af 10 µM primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol), 1,5 µL elueret pool fra afsnit 3.4 (eller RNase-fri vand som negativ kontrol) og 10 µL af forblandet reaktion blanding indeholdende dNTP'er, hot starter polymerase og 2 × PCR reaktion buffer (20 mM tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. Køre PCR ved hjælp af en termisk cycler med følgende indstillinger: 1 cyklus på 95 ° C, 1 min; 30 cykler af [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cyklus af 72 ° C, 2 min og hold ved 4 ° C. Når instrumentet kører den 20th s udvidelse trin på 15, 20, 25 og 30 cykler, skal du trykke på tasten pause, Åbn dækslet instrument og tage et rør ud, så tryk på pause-tasten igen for at genoptage PCR.
      3. Forberede 12% denatureret polyacrylamid gel elektroforese (side)25,26. Bland 4,8 g urea, 6 mL af ultra rent vand, 1 mL af 10 × tris/borsyre syre/ethylendiamin tetraacetic acid (TBE), 3 mL 40% acrylamid, 10 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED) og 100 µL 10% ammonium persulfat (APS), i nævnte rækkefølge. Rør godt rundt og vente på 1,5-2 h til sikre gelen helt størknet.
      4. Analysere resultaterne af cyklus optimering: Kombiner 1 µL af hver PCR produkt med 5 µL af RNA loading bufferen (62,5% formamid, 0,4 M formaldehyd, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic syre buffer, 0,02% xylen cyanol FF, 0,02% bromophenol blå), og 4 µL af RNase-fri vand; Opvarm blandingen ved 95 ° C i 10 min, og hurtigt afkøles det til 0 ° C på isen; Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur; belastning i 5 separate brønde i 12% denatureret side; køre elektroforese af en lodret elektroforese system i 1 × TBE-buffer på 170 V i 45 min.
      5. Efter elektroforese, pletten gel med 3 µL 1 × nukleinsyre gel pletten i 30 mL af 1 × TBE buffer i 10 minutter, og tage et billede af gelen.
    2. Large skala PCR: vælge den passende antal cyklusser til at producere den højeste intensitet band pæl korrekte størrelse uden uønskede biprodukter. Udføre en storstilet PCR (20 × 100 µL delprøver) udnytte betingelser og passende antal cyklusser bestemt i punkt 3.5.1.
      NOTE: Den endelige mængden af enkeltstrenget bibliotek, der kan opnås er proportional med den samlede mængde af PCR, ikke koncentrationen af skabelon. Typisk, for at få 1 nmol bibliotek, enkeltstrenget pool behov 2 mL PCR. PCR er meget følsomme og let forurenet af uden for udpegede nationale myndigheder. Bør tages skridt til at mindske risikoen for forurening, som iført handsker, ved hjælp af steriliseret tips, ikke spytte i rør og ikke åbningen hætten af PCR rør inden centrifugering.
  6. Den første runde af valg: oprensning af PCR produkt ved ethanol fældning.
    1. Kombinere to rør af PCR blandingen ind i et rør (200 µL). Gentag dette for alle rør.
    2. Tilføje 15 µL (3 M, pH 5,2) natriumacetatopløsning, 4 µL DNA/RNA nedbør carrier løsning og 2,5 gange mængden af præ afkølede ethanol ved-20 ° C i hvert rør. Bland dem jævnt.
      Bemærk: DNA/RNA nedbør luftfartsselskab er meget udbredt i ethanol nedbør eksperimenter til en betydelig forbedring inddrivelse procentdel af DNA/RNA ved lave koncentrationer. Det interfererer ikke med downstream applikationer såsom PCR og sekventering.
    3. Centrifugeres blandingen på 20,627 × g i 20 min. ved 4 ° C og omhyggeligt supernatanten og forlade hvidt bundfald.
    4. Tilføj 400 µL af 70% Pre-køling ethanol løsning på-20 ° C i hvert rør til at vaske nedbøren. Centrifugeres blandingen ved 20,627 × g i 5 min. ved 4 ° C, og omhyggeligt supernatanten og forlade hvidt bundfald. Gentag trinnet vaskes to gange mere.
    5. Åbn dækslet til rør; punktere den forsegling membran; Lad ethanol flygtiggøres ved 40 ° C på den varme blok, indtil det hvide bundfald bliver gennemsigtig. Butik bundfaldet ved-20 ° C.
      Bemærk: Renset PCR produktet kan opbevares ved-20 ° C.
  7. Den første runde af valg: enkeltstrenget DNA generation (generation af beriget pulje1) ved at udføre λ exonuclease reaktion for at fordøje den fosforyleres omvendt strand.
    1. Lille skala λ exonuclease reaktion
      1. Tilføje 100 µL af RNase-fri vand til en tube med renset PCR produktet fra afsnit 3.6. Vortex rør til at opløse bundfaldet i røret.
      2. Udarbejde fem centrifugeglas og tilsæt 5 µL af ovenstående løsning, 11 µL af RNase - gratis vand og 2 µL af 10 × reaktion buffer (670 mM glycin-KOH, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) Triton X-100 pH 9.4) i hver tube.
      3. Tilføj 2 µL vand eller fortyndet λ exonuclease løsning indeholdende 2 U, 5 U, 8 U og 10 U λ exonuclease i disse rør, henholdsvis. Bland opløsningen godt ved forsigtigt pipettering. 10 × reaktion bufferen er leveres sammen med λ exonucleasefrom provideren.
      4. Inkuber rør til 35 min ved 37 ° C, 15 min. ved 80 ° C, og holde ved 4 ° C.
      5. Forberede 12% indfødt side. Bland 6 mL af ultra rent vand, 1 mL af 10 × TBE, 3 mL 40% acrylamid, 10 µL af TEMED og 100 µL af 10% APS, i nævnte rækkefølge. Rør godt rundt og vente i 60-90 min. at sikre gelen helt størknet.
      6. Analysere resultaterne af reaktioner ved at kombinere 5 µL af hver reaktion med 1 µL af lastning farvestof og 4 µL af RNase-fri vand, og indlæse disse blandinger i 5 separate brønde på 12% indfødte side (150 V for 45 min).
        Bemærk: En 20 bp dobbelt-strenget DNA ladder kan også indlæses på gel, men det kan ikke være nødvendigt, da de forskellige bands af PCR produkt- og genererede enkelt strandede biblioteket Vis på gelen.
        Bemærk: Λ exonuclease reaktion har en fremragende strukturelle selektivitet. Dobbelt-strenget PCR produktet (anti-sense strand er mærket med en fosfat gruppe på 5'-enden) kan fordøjes fuldstændigt i et enkeltstrenget bibliotek i nærværelse af λ exonuclease i et ganske bredt koncentrationsområde (figur 4). Minimumsbeløbet for λ exonuclease, der helt kan generere enkeltstrenget DNA i lille skala λ exonuclease reaktion bruges også til storstilet λ exonuclease reaktion. En højere koncentration af λ exonuclease kan også bruges, da λ exonuclease fungerer godt i et bredt koncentrationsområde uden at miste sin struktur selektivitet og produkt afkast. Λ exonuclease reaktion er hæmmet af en høj koncentration af salt. Ufuldstændige fordøjelsen af PCR-produktet indebærer normalt, at for meget salt findes i PCR produktet. Oprensning af PCR produkter af ethanol nedbør (afsnit 3.6) er normalt kompatible med dette trin, mens PCR produktet renset af isopropanol nedbør ganske ofte indeholder for meget salt.
    2. Stor skala λ exonuclease reaktion: Vælg det minimumsbeløb for λ exonuclease, der helt kan generere enkeltstrenget DNAs for storstilet λ exonuclease reaktion. Reaktionen er proportionalt skaleres op efter denne betingelse. For eksempel: Hvis 2 U er det mindste beløb af λ exonuclease kræves, bland 38 µL af Rnase-fri vand, 10 µL af 10 x buffer, 50 µL DNA pulje1 og 2 µL af 10 U/µL λ exonuclease.
  8. Den første runde af valg: rensning af enkeltstrenget pulje1 ved ethanol fældning.
    1. Følg instruktionerne i trin 3.6.
    2. Bestemme koncentrationen af renset pulje1 af UV absorption på 260 nm.
    3. Rekonstruere 90% renset pulje1 i et passende volumen af PAE binding buffer. Hvis der ikke er nok DNA, der er opnået for den næste runde af valg, Gentag afsnit 3.5-3.8.2.
      Bemærk: Mængden af PAE binding buffer normalt varierer fra 200 til 500 µL efter mængden af bibliotek og den ønskede slutkoncentration på bibliotek i den næste runde af SELEX.
  9. Andet, tredje, fjerde og femte runder af SELEX.
    1. Gennemføre andet, tredje, fjerde og femte runder af SELEX efterfølgende efter samme procedure beskrevet ovenfor (afsnit 3.2-3.8), bortset fra at biblioteket ~ 300 pmol var indgang til at øge udvælgelse strenghed.
    2. For at minimere uspecifik absorptionen af DNA'er på mellemlang, inkuberes pool med umodificerede medium på en orbitalryster for 30 min i tredje og fjerde runde af valg før inkubation med DBP−NH2−coated medium.
      Bemærk: SELEX processen endte på den femte runde på grund af den alvorlige bitmapgenkendelse mellem DNAs afsløres af den store mængde af høj molekylvægt produkt, der ikke blev overført i gelen.

4. høj overførselshastighed sekventering

  1. Forberede swimmingpool4 fra punkt 3.9.2 for sekventering af PCR-amplifikation med kompatible primere.
    1. Designe og syntetisere en indekseret fremad primer med 6 nt for 5 ' enden at lette Sekvensanalyse.
      Indekseret fremad primer (FP-sekventering): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Oprette en 1.000 µLPCR reaktion som følger: 380 µL af RNase-fri vand, 50 µL af hver 10 µM primer (FP-sekventering, PO4- RP, 0,5 nmol) elueres pool fra punkt 3.9.2 20 µL og 500 µL af forblandet reaktionsblandingen indeholdende dNTP'er, hot start polymerase , og 2 × PCR reaktion buffer. Alikvot blandingen i 10 PCR rør. Brug de samme PCR betingelser, som beskrevet i punkt 3.5.1.2.
  2. Rense PCR produktet til sekvensering facilitetens behov. For eksempel bruge side-gel DNA opsving kit ifølge producentens anvisninger.
  3. Send renset PCR produktet (~ 2 µg) til en sekvensering facilitet på shipping betingelser kræves af sekventering facilitet. For eksempel, skibet PCR produkt i et centrifugeglas med caps grundigt forseglet med isposer til sekvensering facilitet.
    Bemærk: Modtaget de resultater, der rangeret sekvenser efter kopi antallet af hver sekvens vurdere berigelse af den omkostningsstyring pool. Den øverste sekvens blev opkaldt DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Dets affinitet og selektivitet blev målt ved følgende protokol (afsnit 5 og 6). Dens anvendelse i en elektrokemisk bio-sensing blev efterfølgende påvist i afsnit 7.

5. Kd bestemmelse af valgt Aptamer kandidater ved hjælp af Magnetic Bead-Based kvantitativ PCR (qPCR)

  1. Syntetisere DBP-1-qPCR og primere ved hjælp af standard phosphoramidite kemi og rense det af standard HPLC.
    Aptamer kandidat (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Videresende primer for qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Vende primer for qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Bemærk: Primer regioner af de testede sekvens er forskellige fra dem af pool0 anvendes i afsnit 3. Formålet med skiftende regionerne primer er at teste affinitet af core sekvensen alene, undtagen regionerne primer.
  2. Immobilisere DBP-NH2 på carboxylsyre-belagt magnetiske perler efter fabrikantens anvisninger.
    1. Vaske de carboxylsyre-belagt magnetiske perler to gange med 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) (pH 5,0), ved hjælp af et lige saa stort volumen af magnetiske perler (100 µL) pipetted ud af hætteglasset, for 10 min med god blanding (slut over eller lignende).
    2. Umiddelbart før anvendelsen, forberede 50 mg/mL af 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) løsning med kolde 25 mM MES (pH 5,0).
    3. Umiddelbart før anvendelsen, forberede 50 mg/mL af N-hydroxysuccinimide (NHS) løsning med kolde 25 mM MES (pH 5,0).
    4. Blandes 100 µL af EDC løsning og 100 µL af NHS løsning med vasket perlerne og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur med langsom tilt rotation.
    5. Lægge røret på en magnet for 4 min efter inkubation, supernatanten fjernes, og vaske perlerne to gange med 100 µL koldt 25 mm MES (pH 5,0).
    6. Inkuber 6 µL af 100 mM DBP-NH2 stamopløsning og 25 mM MES (pH 5,0, 290 µL) med de aktiveret perler under rotation i mindst 30 min. ved stuetemperatur eller 2 h ved 4 ° C, med langsom tilt rotation på 5 rpm.
    7. Lægge røret på magnet til 4 min. efter inkubation, og supernatanten. Vask de belagte perler 4 gange og resuspend perler med 200 µL af PAE binding buffer og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  3. Indsamle titreringskurven Bestem Kd.
    1. Forberede en serie af DBP-1 løsninger (500 µL) ved forskellige koncentrationer i PAE binding buffer fra 1 pM til 300 nM.
    2. Tilsæt 10 µL af DBP-NH2-belagt magnetiske perler, som beskrevet i afsnit 5.2.7 til hver DBP-1 løsning. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur under rotation.
    3. Sted rør på en magnet for 4 min og Fjern supernatanten. Vaske perlerne 4 gange med 200 µL af PAE binding buffer.
    4. Tilsættes 60 µL PAE binding buffer til hver tube. Inkuber rør ved 95 ° C i 15 min. indsamle supernatanten indeholdende den eluted DBP-1 ved magnetisk separation. Gentag denne eluering proces for at inddrive mere bundne DBP-1.
    5. Fortynd elute løsning 100 og tage 3 µL for real-time qPCR. Oprette en qPCR reaktion som følger: 3 µL af RNase-fri vand, 2 µL af 10 µM primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol hver), 3 µL af elueret og fortyndet DBP-1 og 10 µL af forblandet reaktionsblandingen indeholdende dNTP'er, polymerase og 2 x PCR reaktion buffer.
    6. Bestemme antallet af DBP-1 i hver prøve ved at køre qPCR ved hjælp af en termisk cycler med følgende indstillinger: 1 cyklus på 95 ° C, 30 s; 30 cykler af [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cyklus af 72 ° C, 30 s og hold ved 4 ° C.
    7. Plot titreringskurven og bestemme Kd af ulineære montering af kurven antages en 1:1 bindende forholdet27.

6. relative affinitet og specificitet Test af konkurrencedygtige Assays

  1. Tilsæt 10 µL af DBP-NH2-belagt magnetiske perler til DBP-1 løsning (500 µL, 1 µM). Inkuber i 1 time ved stuetemperatur under rotation. Sted rør på en magnet for 4 min og Fjern supernatanten. Vaske perlerne 4 gange med 200 µL af PAE binding buffer og resuspend det i 10 µL af PAE binding buffer.
  2. Tilsæt 10 µL af DBP-NH2-belagt medium bundet med DBP-1 til 110 µL af hver 10 µM testet stikprøve (DBP-NH2, DBP, DEHP, butyl benzyl phthalate(BBP), heavy metal ioner, osv.) Inkuber ved stuetemperatur i 1 h. indsamle supernatanten ved magnetisk separation.
  3. Fortynd supernatanten 100 og tage 3 µL til qPCR kvantificering. Oprette en qPCR reaktion som følger: 3 µL af RNase-fri vand, 2 µL af 10 µM primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol hver), 3 µL af elueret og fortyndet DBP-1 og 10 µL af forblandet reaktionsblandingen indeholdende dNTP'er, polymerase og 2 x PCR reaktion buffer.
  4. Bestemme antallet af DBP-1 i hver prøve ved at køre qPCR ved hjælp af en termisk cycler med følgende indstillinger: 1 cyklus på 95 ° C, 30 s; 30 cykler af [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cyklus af 72 ° C, 30 s og hold ved 4 ° C.
  5. Beregne det relative affinitet ved at dividere antallet af DBP-1 udgivet fra perler i overværelse af prøven med antallet af DBP-1 udgivet fra perler i PAE binding buffer: Relative affinitet = Neksempel/Nbuffer.

7. fabrikation og elektrokemiske målinger af DEHP elektrokemiske biosensorer

  1. Syntetisere thiolated core sekvens (HS-DBP-1) og signalering sonden (DBP-1-C-Fc) ved hjælp af standard phosphoramidite kemi og rense det af standard HPLC.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Bemærk: Den rationelt design af sensor sonder var beskrevet i vores tidligere pbulications18,22.
  2. Rekonstruere HS-DBP-1 og DBP-1-C-Fc i nukleasen-fri klasse vand ved 100 µM, alikvot, og gemme dem på -20 eller-80 ° C i op til et år.
  3. Polsk guld elektrode omhyggeligt til en spejl-lignende overflade med 1, 0,3 og 0,05 µm Al2O3 pulver på en microcloth i 5 min og Læg instrumenterne i ultralydsbad det i ultrarent vand i 5 min. til at fjerne resterende Al2O3. Derefter rengøre elektroden af elektrokemiske polering med 35 successive cyklisk voltammetry (CV) scanninger fra 0,4 til 1,2 V (vs Hg-Hg2SO4) i 0,5 M H2SO4 på 100 mV/s.
  4. Forbered en blanding af 0,5 µM HS-DBP-1 og 0,5 µM DBP-1-C-Fc i 100 µL 10 mM fosfat buffer indeholdende 1 M NaCl, pH 7,4 (PBS). Opvarm blandingen i centrifugeglasset tynde væg i vand Bad sæt ved 95 ° C i 10 min, og langsomt afkøles blandingen til stuetemperatur.
  5. Tilføj 1 µL af tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochlorid (TCEP, 10 mM, stamopløsning) i blandingen. Holde ved stuetemperatur i 1 time.
  6. Nedsænke det rene guld elektrode i ovenstående løsning for 12 timer, eller natten over ved stuetemperatur.
  7. Skyl elektrode med PBS og nedsænke elektroden i 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-fx6- OMe) i PBS for 1 h. Skyl elektroden grundigt ved hjælp af PAE binding buffer og nedsænke elektroden i PAE binding buffer.
  8. Tage voltammetry (SWV) en baggrundsscanning firkantet bølge i target-fri PAE binding buffer.
    1. Rengør alle de eksperimentelle udstyr: elektrolytiske celler, guld arbejder elektrode, platin counter elektrode og mættede calomel-referenceelektrode (SCE).
    2. Aktivere den installeret programmel; Angiv de eksperimentelle parametre for SWV målinger.
      Bemærk: De følgende eksperimentelle parametre blev brugt til SWV eksperimenter: potentielle rækkevidde: fra-0.2 til 0,7 V; graduering amplitude: 25 mV; Pulse bredde: 5 ms; Skan sats: 50 mV/s; trin potentiale: 1 mV.
    3. Tilslut guld arbejder elektrode, platin counter elektrode og SCE-selskabet til en potentiostat, og sætte disse tre elektroder ind i en elektrolytiske celler indeholdende PAE binding buffer.
    4. Køre SWV måling.
      Bemærk: Når SWV måling starter, en SWV kurve vil være displayed oven på raster af computeren. Scanningen gentages indtil scanninger er konstant og ikke yderligere ændringer i figuren eller tophøjde overholdes.
  9. Fordyb arbejder elektrode i PAE binding buffer indeholdende en vis koncentration af DEHP (f.eks. 10 pM) i 30 min ved stuetemperatur. Skyl elektroden grundigt ved hjælp af PAE binding buffer og nedsænke elektroden i PAE binding buffer med counter elektrode og SCE-selskabet. Indsamle SWV kurve under samme stand, som beskrevet i afsnit 7.8.
  10. Gentag trin 7,9, bortset fra, at koncentrationen af DEHP (f.eks. 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) øgedes sekventielt. Plot titreringskurven.
  11. Specificitet tests: Gentag trin 7.3-7,9, bortset fra at PAE binde bufferen indeholder DEHP er erstattet af PAE binding buffer indeholdende den potentielle interfererende stoffer på den ønskede koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi designet og syntetiseret aminogruppen functionalized dibutylphthalat (DBP-NH2) som anker mål (figur 1F). Vi har derefter gennemført DNA aptamer udvalg af PAEs ved hjælp af DBP-NH2 som anker mål og efter klassisk mål immobilisering-baseret metode (figur 2). I hver runde, blev en pilot PCR udført ved hjælp af denatureret side for at optimere cyklus antallet af PCR (figur 3). Denatureret siden, i stedet for indfødte side, er kraftigt antydet, fordi vi og andre kolleger har fundet, at de formodede høj molekylvægt biprodukter vist på de indfødte geler på den højere cyklus tal er faktisk crosslinking komplekser dannet af sekvenser af den rigtige størrelse. Bandet intensiteten af denatureret siden kan således virkelig afspejler mængden af det rigtige produkt. Den enkelte strandede DNA generation er en anden afgørende skridt, og mange metoder til dette trin har været rapporteret28. Λ exonuclease fordøjelsen metode er den billigste metode. Succesen af enkeltstrenget DNA generation bekvemt kan kontrolleres af indfødte side, hvor PCR produkt er vist som enkelt (første flere runder af SELEX) eller flere bands, mens kun én band er vist efter fordøjelsen (figur 4).

SELEX blev stoppet efter femte runde af valget på grund af den betydelige mængde DNA akkumuleret øverst på siden, selv efter denaturering behandling (hvori DNAs er opvarmet ved 95 ° C i 10 min. i 2 × TBE-indeholdende 8,3 M urinstof) , som foreslog alvorlige cross-linking mellem udpegede nationale myndigheder og antydede, at sekvenser blev beriget. Derfor, swimmingpool4 blev sendt til høj overførselshastighed sekvensering. Høj overførselshastighed resultatet viste, at de øverste 100 hyppigst forekommende sekvenser var meget bevaret og var fra én familie. Den øverste sekvens DBP-1 vises nanomolar affinitet (figur 5) og god gruppe-specificitet PAE kongenere (DBP, BBP, DEHP) (figur 6) via praktisk qPCR assays, som beskrevet i afsnittet protokol.

DBP-1 har været anvendt til at konstruere en strand deplacement-baserede elektrokemisk aptasenor derfor til vores tidligere rapporteret arbejde29. DEHP sensoren kan præcist og selektivt reagere på DEHP (figur 7). De fælles miljøforurenende stoffer som heavy metal ioner, antibiotika og små molekyler med lignende funktionelle grupper viste meget svag reaktion på DBP-1.

Figure 1
Figur 1: Kemiske strukturer af (A) PAEs, b BBP, c DBP, (D) DEHP, (E) 4-OH-DEHP, (F) DBP−NH2. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Han Y. et al. 22 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Gruppe-specifikke DNA aptamer udvælgelsesprocedure for PAEs ved hjælp af DBP-NH2 som et anker mål. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Han Y. et al. 22 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant resultat af PCR cyklus optimering ved hjælp af denatureret side. Fra venstre mod højre, repræsenterer banerne: 20 bp DNA ladder standard, 15 cykler (ingen DNA skabelon), 20 cyklusser (ingen DNA skabelon), 25 cykler (ingen DNA skabelon), 30 cykler (ingen DNA skabelon), 15 cykler, 20 cyklusser, 25 cykler og 30 cykler. Optimale betingelser blev observeret på 25 cykler, hvor enkelt produkt bandet var ved høj intensitet uden uønskede biprodukter, derudover ingen bånd blev observeret i tilsvarende blindprøvekontrollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: optimering af λ exonuclease reaktion til at fordøje de fosforyleres strand ved hjælp af indfødte side. Fra venstre mod højre, repræsenterer banerne: 20 bp DNA ladder standard, negativ (ingen λ exonuclease), 2U, 5U, 8U og 10U. Den mindste mængde enzym blev observeret på 2U, hvor dobbelt PCR produktet bliver enkeltstrenget DNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: affinitet målinger af DBP-1 ved qPCR-baserede assays. Fejl (standardafvigelse, SD) af Kd blev beregnet ud fra tre målinger af den samme prøve. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Han Y. et al. 22

Figure 6
Figur 6: Relative affinitet målinger af DBP-1 for gratis DBP-NH2 (10 µM), DBP (10 µM), DEHP (10 µM), BBP (10 µM), ethylacetat (10 µM), benzoesyre (10 µM), phthalater syre (10 µM), og andre via konkurrence assays. Andet: en blanding af mulige interferenser (glucose, kanamycin, ampicillin og ethanol) alle på 10 µM. Ratio (det relative affinitet) blev beregnet ved at dividere antallet af aptamers frigives fra perler i overværelse af prøven med antallet af aptamers frigives fra perler i PAE binding buffer. Barer repræsenterer gennemsnit ± SD. Strategien for bæredygtig udvikling blev beregnet ud fra tre individuelle målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: DEHP elektrokemiske biosensor for ultrasensitive og ultraselective påvisning af DEHP: mekanisme (A), SWV kurver b kalibreringskurven (C), og selektivitet test (D). Fejl (SDs) blev beregnet ud fra tre individuelle målinger. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Han Y. et al. 22 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En enestående fordel ved aptamers er, at de er identificeret gennem in vitro- metoden SELEX, mens antistoffer er genereret via i vivo immunoreactions. Derfor kan aptamers vælges med ønskede mål specificitet under veldesignet forsøgsbetingelser, antistoffer er begrænset til fysiologiske tilstande.

For at lette adskillelsen af bundne sekvenser fra gratis sekvenser, flere modificerede SELEX er for nylig blevet rapporteret, i hvilke kapillær elektroforese30, mikrofluidik31, magnetisk / akryl perler / Agarosen perler14, etc., har erstattet nitrocellulose filtre eller affinitet kolonner til at opnå mere effektiv adskillelse. Blandt disse teknikker, perle-baserede metoder har været mest udbredt for aptamer Udvalget af lille molekyle mål på grund af deres simple opsætning, nem betjening og er åbne over for små molekyle analyser.

Der er to grupper af metoder, der er almindeligt anvendt til aptamer udvalg af lille molekyle mål: mål13 og bibliotek14 immobilisering-baserede metoder. I den tidligere gruppe af metoder, er lille molekyle mål immobiliseret på den faste fase som functionalized magnetiske perler eller Agarosen perler via kovalente koblingsreaktioner. Biblioteker er inkuberes med små-molekyle belagte perler, og de sekvenser, der ikke binde eller binde svagt til målet på den faste fase fjernes blot ved at udføre vask og centrifugering eller magnetisk separation trin. De bundne sekvenser er efterfølgende elueret og forstærkes ved PCR. Lille molekyle mål skal have mindst én funktionel gruppe tilgængelig for kobling reaktion. For dem uden passende funktionelle grupper har den funktionelle gruppe til at indgå i det oprindelige mål gennem organisk syntese. Syntesen af omhyggeligt designede målet kunne involvere flere trin, og undertiden er ganske udfordrende samt. Den strukturelle ændring af målene kunne også kraftigt påvirker bindingssteder og affinitet med deres aptamers. At undgå disse problemer, bibliotek immobilisering-baserede metoder er blevet udviklet, hvor biblioteket er hybridiseret til supplerende DNA capture sonder på magnetiske perler, og de bindende sekvenser falder perler på bindende med målene. I denne gruppe af metoder, mål, der er tilføjet i binding buffer og ingen funktionelle grupper er påkrævet. PAEs er ester derivater af phthalat syre, og en typisk PAE består af en phthalat syre ester gruppe og en eller to alkyl kæder (figur 1A-D). PAEs har ingen funktionelle grupper tilgængelige for faste fase immobilisering. Således synes bibliotek immobilisering-baserede metoder mere attraktiv for aptamer Udvalget af PAEs.

En velkontrollerede dispersion status er afgørende for at sikre den ønskede berigelse af biblioteket via SELEX. Men PAEs er ekstremt hydrofob og let danne aggregater i vandige opløsninger på en koncentration, der er højere end flere µM, selv i nærværelse af flere overfladeaktive stoffer til at lette spredning. Således PAEs dispersion status er svært at styre, og det ville være svært at vælge aptamers, der specifikt binder til individuelle PAE molekyler. For at løse opløselighed, blev target-immobilisering metoder valgt, i hvilke PAEs var immobiliseret på hydrofile perlerne via kovalente binding. Ved hjælp af denne immobilisering strategi, skal mål, der findes overvejende på perle overflade i en enkelt molekylære tilstand, i stedet for aggregater.

Den strukturelle design af anker mål er også helt afgørende for vellykket udvælgelse af gruppe-specifikke aptamers. Tre faktorer skal tages i betragtning ved den strukturelle design. Den første faktor er formålet med aptamer udvalget. I betragtning af formålet med at vælge gruppe-specifikke aptamers, er det vigtigt at udsætte den fælles gruppe af PAEs for aptamer bindende og forhindre resten af delene fra at deltage i aptamer binding. Således, den funktionelle gruppe bør indføres på terminal af side-kæden. I begyndelsen, vi designet OH-functionalized DEHP (4-OH−DEHP) (figur 1E) som anker mål og immobiliseret det på carboxylsyre magnetiske perler16. Således blev alkyl kæder udsat på overfladen af matrixen. Vi forsøgte at vælge magnetiske perler med carboxyl grupper som fast matrix. Ingen indlysende affinitet forbedring blev observeret efter fem runder af udvalg, og uspecifikke absorption på den nøgne matrix blev holdt stærkt.

Derfor, DBP-NH2 blev senere designet baseret på følgende tanker: (1) gruppen phthalat er mere tilbøjelige til at interagere med aptamer gennem π π stakken og brint bond end alkyl kæde; (2) NHS-medieret carbodiimide reaktion er mild og har en meget effektiv kobling effektivitet, så -NH2 er indført i slutningen af en alkyl kæde af DBP; (3) det er let at betjene med de magnetiske perler som en solid fase partition, men den uspecifikke adsorption af biblioteket er stærk. Selv om tabet af Agarosen perler under adskillelse er højere end de magnetiske perler, er uspecifik adsorption af biblioteket meget lavere. Således DBP-NH2 var usejldygtigt på epoxy-aktiveret Agarosen perler, og gruppen phthalic acidester blev udsat på overfladen af matrixen.

Valg af udvalg buffer er vigtigt, især for små molekyle mål med forskellige opløselighed. Bindende bufferen skal være omhyggeligt forberedt til at undgå sammenlægning og sikre en god dispersion tilstand af popper under hele aptamer udvælgelse og karakterisering. I vores undersøgelse fandt vi, at DEHP ikke kan opløses i regelmæssig buffere uden overfladeaktive stoffer, viser to forskellige lag. Lag forsvinder ved tilføjelsen af flere overfladeaktive stoffer i den mængde, der er optimeret. De klare løsninger skal opbevares ved temperaturer på over 20 ° C til at opretholde sin status. Nærmere oplysninger findes i protokollen trin 3.1.

Enkeltstrenget DNA generation fra dobbelt-strenget PCR produkter er et kritisk skridt i SELEX proces. Flere forskellige metoder er i øjeblikket beskrevet i den litteratur32,33, herunder asymmetrisk PCR, λ exonuclease fordøjelse, magnetisk separation med streptavidin-belagte perler og størrelse adskillelse af denaturering urea-polyacrylamid gel.

Forskellige metoder har deres egne styrker og svagheder. I øjeblikket er den mest almindeligt anvendte metode til generation af ssDNA magnetisk separation med streptavidin-belagte perler. Fremragende fordelen ved denne metode er dens tidsbesparende og simpel operation. Ulempen er dens høje omkostninger sammenlignet med andre metoder. Derimod er størrelse adskillelse-baserede metode, ved hjælp af reverse primere med GC-rige stem-loop-struktur, en af de billigste metoder, mens udbyttet af enkeltstrenget DNA er den laveste blandt disse metoder32. I denne protokol beskrevet vi brugen af λ exonuclease fordøjelsen at generere enkeltstrenget DNA, som er en af de billigste metoder. Vi fandt, at udbyttet af enkeltstrenget DNA er sammenlignelige med de to metoder til magnetisk separation og streptavidin-belagte perler. Desuden fandt vi, at exonuclease reaktion var hæmmet af den høje koncentration af salt. Ufuldstændig fordøjelse af PCR produktet rapporteret i litteraturen33 var sandsynligvis på grund af for meget salt eksisterende i PCR produktet. Derudover λ exonuclease er meget aktiv og billig (figur 4).

Karakterisering og validering af aptamers er besværlig og tidskrævende, og rummer en stor flaskehals i aptamer opdagelse pipeline33. De fleste teknikker er masse-følsomme metoder, som fungerer godt for de større aptamer bindende partnere (> 10.000 amu), men ikke er tilstrækkeligt følsomme til at måle interaktioner med lav Molekylær vægt mål (< 1000 amu)15. Karakterisering og validering af aptamers af hydrofobe små molekyler som PAEs er endnu vanskeligere. Deres ringe vandopløselighed resulterer i unsaturation af titreringskurven, hvilket forhindrer Kdbeslutsomhed i opløsning eller immobiliseres aptamers på overfladen. Derfor, vi bestemt Kds af de identificerede aptamers af høj overførselshastighed sekventering af immobilisere DBP-NH2 på de hydrofile magnetiske perler at undgå opløselighed problem. Den relative tilhørsforhold og selektivitet af aptamers til andre PAEs var så bestemmes af de konkurrencedygtige assays, hvor aptamer kandidater var pre afgrænset til DBP-NH2 knyttet magnetiske perler og frigivet til supernatanten ved inkubation med de testede PAEs eller andre potentielt interfererende stoffer. Konkurrencedygtige analysen blev anvendt, fordi den gav en letkøbt affinitet sammenligning blandt PAEs, der havde ingen funktionelle grupper for overflade immobilisering. Endvidere, er magnetiske perle-baserede fluorescerende assays egnet til affinitet undersøgelse af lille molekyle-aptamer interaktioner34. Dog fandt vi, at de magnetiske perler undertiden forårsage fluorescens quenching af ukendte årsager. Således blev qPCR assays brugt i affinitet målinger.

En kritisk teknik tip til den elektrokemiske biosensor beskrevet i denne undersøgelse er den overflade passivation elektrode35. På grund af den høje hydrophobicity af DEHP har det en stærk tendens til at være nonspecifically absorberes på guld elektrode, fører til manglende påvisning. Mest almindeligt anvendte overflade passivation agent, 6-mercapto-1-hexanol (MCH)36,37, er ikke tilstrækkelige til at forhindre den uspecifikke absorption af DEHP, mens vi fundet at HS-(CH2)2-[OCH2CH2 ]6- OCH3 var effektivt nok til at muliggøre den følsomme påvisning af DEHP38.

Denne procedure beskriver en protokol for at vælge gruppe-specifikke DNA aptamers af yderst hydrofobe små molekyler og en anvendelse af den valgte aptamer i en elektrokemisk biosensor. Protokollen hjælper med udvælgelsen af andre hydrofobe små molekyler og giver indsigt på sensor udvikling af yderst hydrofobe små molekyler som godt. Udvælgelsesprocessen aptamer hører til kategorien af target immobilisering-baserede metoder. Begrænsningerne ved denne type af metode findes også for denne protokol, for eksempel behovet for kompliceret syntese af anker mål og virkninger af den faste fase på aptamer bindende. De attraktive fordele af de elektrokemiske biosensorer beskrevet i denne protokol omfatter deres enkle design og høj følsomhed. Den store ulempe er deres begrænsede præcision på grund af deres meget bredt dynamikområde. Derfor er biosensorer beskrevet her mere egnet til screening test, i stedet for kvantitative målinger af målene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansiel interesse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for finansiel støtte fra National Natural Science Foundation (21675112), Key projekt af videnskab og teknologi plan af Beijing uddannelse Kommissionen (KZ201710028027) og Yanjing Young Scholars Program af kapital Normal University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

Kemi sag 133 Aptamer udvalg phthalater acid estere gruppespecifikke hydrofobe små molekyler kvantitative polymerisering kædereaktion elektrokemisk aptasensor persistente organiske miljøgifte
Phthalater syre Ester-bindende DNA Aptamer udvalg, karakterisering og ansøgning til en elektrokemisk Aptasensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y.,… More

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter