Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול כדי להפוך את הבחירה במבחנה אפיון של חומצה פתלית המיועדות לקבוצות אסתר-איגוד ה-DNA aptamers מוצג. היישום של aptamer שנבחר ב aptasensor אלקטרוכימי נכלל גם.

Abstract

חומצה פתלית והפרופסור אסטרים (פאיס) של הקבוצות הגדולות של מזהמים אורגניים מתמיד. זיהוי המיועדות לקבוצות פאיס רצוי מאוד עקב גידול מהיר של congeners. DNA aptamers הוחלו יותר ויותר כרכיבים זיהוי בפלטפורמות ביוסנסור, אך בחירת aptamers לעבר מטרות מולקולה קטנה מאוד הידרופוביות, כגון פאיס, לעתים נדירות דווח. עבודה זו מתאר שיטה המבוססת על חרוז תוכנן כדי לבחור קבוצה ספציפית aptamers ה-DNA אל פאיס. קבוצת אמינו functionalized dibutyl פתלאט (DBP-NH2) המטרה עוגן היה מסונתז, ותשמרו על החרוזים מופעל אפוקסי agarose, מאפשר את התצוגה של קבוצת אסתר phthalic על פני השטח של המטריצה הנייח, ו לכן הבחירה של קלסרים קבוצה ספציפית. אנחנו נקבע את קבועי דיסוציאציה של המועמדים aptamer על ידי תגובת שרשרת הפילמור כמותיים בשילוב עם הפרדה מגנטית. הזיקות היחסי ואת מידת הבררנות של aptamers אל פאיס אחרים נקבעו על ידי מבחני תחרותי, שבו המועמדים aptamer היו ותחום מראש ל DBP-NH2 המצורפת beads מגנטי, שוחרר תגובת שיקוע על דגירה עם פאיס שנבדקו או חומרים מפריעות פוטנציאליים אחרים. וזמינותו תחרותי הוחל משום שסיפקה השוואה נתיישב זיקה בין פאיס שהיה אין קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח. לבסוף, אנו הפגינו הזיוף של aptasensor אלקטרוכימי, השתמשו בו על זיהוי העדינה, סלקטיבי של פתלאט bis(2-ethylhexyl). פרוטוקול זה מספק תובנות על גילוי aptamer של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות.

Introduction

יחד עם התפתחות כלכלית מהירה, האצה של ה תיעוש, הבנייה העירונית, זיהום סביבתי הוא חמור יותר מאי פעם. טיפוסי מזהמים סביבתיים כוללים יונים של מתכות כבדות, רעלים, אנטיביוטיקה, חומרי הדברה, משבשים האנדוקרינית ו מזהמים אורגניים מתמיד (אבא). מלבד יונים מתכתיים, רעלים, מזהמים אחרים הם מולקולות קטנות לעיתים קרובות מכילים מגוון רחב של congeners. לדוגמה, הטיילת הרעילים ביותר לכלול polychlorinated biphenyls (PCBs), פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAHs), polybrominated biphenyl קטונים (PBDEs), dibenzo-p-דיוקסין polychlorinated (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs), ו phthalic חומצה אסטרים (פאיס)1,2, אשר כולם מורכב congeners רבים. גילוי מולקולה קטנה בוצעה בעיקר על-ידי טכניקות מבוססות ספקטרומטר מסה/כרומטוגרפיה בשל מגוון של יישומים3,4,5,6. עבור גילויים באתר, נוגדן מבוססי שיטות לאחרונה היה מפותח7,8,9. עם זאת, מאז שיטות אלה הם מאוד ספציפי congener מסוימים, יש לבצע בדיקות מרובות. מה זה חמור יותר הוא כי הרומן congeners לגדול כל כך מהר, כי לא ניתן ליצור נוגדנים שלהם בזמן. לכן, ההתפתחות של קבוצה ספציפית ביולוגיים כדי לנטר את רמות סך כל congeners במבחן אחד עשוי לספק מדד לא בפז להערכת מצב זיהום סביבתי.

לאחרונה, חומצת גרעין aptamers נרחב הוחלו כרכיבים זיהוי של פלטפורמות שונות biosensing עקב שלהם יכולת זיהוי מגוון רחב של מטרות, יונים ומולקולות קטנות חלבונים ותאים10,11 ,12. Aptamers מזוהים באמצעות שיטה במבחנה בשם האבולוציה שיטתית של ליגנדים מאת העשרה מעריכית (SELEX)13,14. SELEX מתחיל עם הספרייה oligonucleotide אקראיים סינתטי לחוט אחד, אשר מכיל כ רצפים15 14-10 10. הגודל של הספרייה אקראי מבטיחה את המגוון של המבנים המועמד RNA או DNA. תהליך SELEX טיפוסי מורכב מספר סיבובים של העשרה עד הספרייה מועשר ברצפים עם זיקה גבוהה וספציפיות אל המטרה. מועשר בבריכה הסופי אז הוא רציף, ולסנן קבועי דיסוציאציה (דK) ואת סלקטיביות נגד פוטנציאל חומרים מפריעות נקבעים על-ידי טכניקות שונות כגון איגוד, כרומטוגרפיית זיקה משטח פלזמון תהודה (SPR), וכו '. 15

בשל מסיסות המים ירודה ביותר וחוסר קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח, הבחירה aptamer של סבא קשה באופן תיאורטי. התקדמויות משמעותיות עבור SELEX יש speeded את הגילוי של aptamers. עם זאת, הבחירה של קבוצה ספציפית aptamers עבור סבא יש וטרם דווחו. עד כה, רק מחייב PCB DNA aptamers עם ירידה לפרטים גבוה עבור congener מסוימים כבר מזוהה16. פאיס משמשים בעיקר בחומרים פוליוויניל כלוריד, שינוי במבנהו מפלסטיק קשיח לפלסטיק גמיש, ובכך כסוכנות מרכך ומגמיש. כמה פאיס זוהו משבשים האנדוקרינית, יכול לגרום נזק חמור בכבד, תפקוד כליות, להפחית את תנועתיות הזרע הגברי, עלול לגרום סרטן האשכים17ומורפולוגיה זרע לא תקין. המתחם - וגם המיועדות לקבוצות PAE מחייב aptamers דווחו.

מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול ייצוגית לבחירת המיועדות לקבוצות aptamers דנ א כדי מאוד הידרופובי מולקולות קטנות כגון פאיס, קבוצה ייצוגית של אבא. אנחנו גם להוכיח את היישום של aptamer שנבחר לגילוי זיהום סביבתי. פרוטוקול זה מספק הדרכה ותובנות על גילוי aptamer של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ספריית ועיצוב פריימר סינתזה

  1. לעצב את הספריה הראשונית ואת צבעי יסוד.
    ספריה (בריכת0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    קדימה פריימר (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Phosphorylated תחל הפוכה (PO4- RP): 5'-פו4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3... '
  2. לסנתז בריכה0FP, פו4- RP באמצעות תקן phosphoramidite כימיה18,19,20, ולטהר את כל DNAs על ידי תקן ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC)21.
  3. לשקם בריכה0FP, פו4- RP בכיתה ללא נוקלאז מים ב 100 מיקרומטר, aliquot, ואחסן אותם ב-20 או -80 ° C עד שנה אחת.
    הערה: הוא הציע בתוקף לאחסון בריכה0FP, פו4- RP ב 10-20 µL aliquots כדי למנוע זיהום אפשרי לחצות.

2. לסנתז המטרה עוגן, שלה הנייח על חרוז Agarose מופעל אפוקסי

  1. לסנתז את קבוצת אמינו functionalized dibutyl פתלאט (DBP-NH2) כיעד עוגן.
    הערה: פרטי ניסיוני על סינתזה, אפיון DBP-NH2 תוארו בספרות22.
  2. הכינו העוגן יעד פתרונות מניות במדיום מתאים המסיסות היעד. במחקר זה, להכין פתרון 100 מ מ DBP-NH2 מניות ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולאחסן את הפתרון ב-4 או-20 ° C עד שנה אחת.
  3. לשתק DBP-NH2 על גבי חרוזים מופעל אפוקסי agarose לפי פרוטוקול ששונה מהיצרן.
    1. שוקלים לצאת 0.1 גר' אבקת להקפיא מיובש של חרוזים agarose מופעל אפוקסי, להשעות אותו במים מזוקקים. לשטוף המדיום מאובטח באמצעות מים 20 מ"ל מזוקקים מוסיפים מספר aliquots. לשטוף את המדיום עם 0.2 מ' נה2CO3 (pH 12).
      הערה: המדיום מתנפח מיד לאחר הוספת המים לתוכו.
    2. להמיס DBP-NH2 (46.7 mg, 0.15 mmol) המאגר צימוד µL 500 (0.2 מ' נה2CO3 מאגר).
    3. מערבבים את הפתרון צימוד המכיל את ליגנד עם המדיום. השתמש מטרף-5 rpm 48 שעות בטמפרטורת החדר.
    4. חזור על נטילת המוצר שלוש פעמים, באופן רציף באמצעות מאגר אצטט 0.1 M (0.5 M NaCl, pH 4.5), 0.2 מ' קרבונט מאגר (0.5 M NaCl, pH 12) בכל מחזור השטיפה. רוחצים את להשעות את המוצר במים כדי להפוך את הנפח הסופי של 500 µL.
    5. לאחסן את המוצר לפי 4 ° C לפני השימוש.
    6. לאשר ההצלחה של קיבעון המטרה ידי לניתוח.

3. SELEX

  1. הכנת 500 מ"ל של PAE מחייב מאגר מים אולטרא טהורים או כיתה ללא נוקלאז מים עם 20 מ מ Tris· HCl, 100 מ מ NaCl, 2 מ מ MgCl2, 5 מ מ אשלגן כלורי, CaCl 1 מ2, 1% polyoxyethy-לין monolaurate sorbaitan (20) ו- 0.03% משטח ללא יונית פעיל הסוכן (pH 7.9). לסנן את המאגר דרך מסנן סטרילי ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.22 ואחסן אותו בטמפרטורה גבוהה יותר 20 ° C במשך חודשים.
    הערה: חיוני כדי לשמור על מצב פיזור טוב של פאיס במאגר PAE מחייב. מספר סוגים של פיתחה נחוצים כדי לשפר את המסיסות פאיס בתמיסה המימית. עם זאת, יש לשמור את המספר של פיתחה עד למינימום כדי למנוע היווצרות של חומרים פעילי שטח הקזאין הכומסים מולקולות PAE. Non-יוניים, משטח הסוכן הפעיל הוא קל לזרז בטמפרטורה נמוכה יותר מאשר 20 ° C, ולכן צריך להיות מאוחסן המאגר בטמפרטורה גבוהה יותר 20 º C.
  2. לדלל µL 10 100 מיקרומטר בריכה0(~1.0 nmol עבור 10 רצפים15 14-10) ב- µL 490 PAE מחייב המאגר. לחמם הבריכה aliquots0 (5 × 100 µL) במנורות קיר דק צנטריפוגה בערכת אמבט מים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במקום הצינורות על קרח למשך 5 דקות, לאחר מכן דגירה של הצינורות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C בעבודה זו).
  3. בסיבוב הראשון של בחירה: דגירה של הבריכה0 ו- DBP−NH2−coated בינונית.
    1. לשטוף 200 µL DBP−NH2−coated בינוני שלוש פעמים עם µL 500 PAE מחייב המאגר. מיקס DBP−NH2−coated בינוני עם בריכה0 , דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 1 h תחת רועד מתון.
    2. נפרד המדיום −coated2DBP−NH מחוייב עם aptamers מ DNAs לא מאוגד אולטראפילטרציה והשתמש אולטראפילטרציה שפופרת ניתוק מולקולרית של 100 kDa. לשטוף את המדיום שלוש פעמים עם 500 µL של PAE מחייב מאגר, צנטריפוגה ב 9,168 g × 10 דקות ב 4 º C.
  4. בסיבוב הראשון של בחירה: • תנאי aptamer מ- DBP−NH2−coated בינונית.
    1. להוסיף µL 50 PAE מחייב מאגר בינוני שטף של חום התערובת ב 90 מעלות צלזיוס במשך 9 דקות תחת רועדת.
    2. לאסוף את תגובת שיקוע המכילה את DNAs eluted על-ידי אולטראפילטרציה. חזור על תהליך זה • תנאי שלוש פעמים כדי לשחזר יותר מאוגדים DNAs.
  5. בסיבוב הראשון של בחירה: ה-PCR
    1. בקנה מידה קטן PCR
      1. ביצוע של מידה קטן PCR23 (4 × 20 µL aliquots) באמצעות ~ 15-30 מחזורים. להגדיר את התגובה של ה-PCR24 כדלקמן: µL 6.5 RNase ללא מים, µL 1 של 10 מיקרומטר פריימר (FP, פו4- RP, 0.01 nmol), 1.5 µL eluted בריכה סעיף 3.4 (או מים נטולי RNase כפקד שלילי) ו- 10 µL של premixed המכילה תערובת התגובה dNTPs, חם להתחיל פולימראז, ו 2 × PCR התגובה מאגר (20 מ מ tris· HCl, 100 מ מ אשלגן כלורי, 3 מ מ MgCl2, pH 8.3).
      2. להפעיל את ה-PCR באמצעות הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: מחזור 1 של 95 ° C, 1 דקות; 30 מחזורים של [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; מחזור 1 של 72 מעלות צלזיוס, 2 דקות ו להחזיק על 4 מעלות צלזיוס. כאשר המכשיר פועל שה sה 20 של המדרגות סיומת ה-15, 20, 25, 30 מחזורים, הקש על מקש pause, פתח את המכסה כלי, קח שפופרת אחת החוצה ולאחר מכן הקש על מקש pause שוב כדי לחדש את ה-PCR.
      3. להכין 12% שפגע בסימני לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד)25,26. לערבב 4.8 גרם אוריאה, 6 מ של מים אולטרא טהורים, 1 מ"ל של 10 × טריס/boric חומצה/אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (TBE), 3 מ"ל של אקרילאמיד 40%, µL 10 tetramethylethylenediamine (TEMED), 100 µL 10% קירור (APS), לפי הסדר הזה. מערבבים היטב והמתן 1.5-2 h כדי להבטיח שהג'ל עפור לחלוטין.
      4. לנתח את התוצאות אופטימיזציה מחזור: לשלב 1 µL של כל מוצר ה-PCR עם 5 µL RNA טעינת מאגר (62.5% formamide, פורמלדהיד 0.4 מ', מאגר החומצה propansulfonic 1.25×3-(N-morpholino), 0.02% קסילן cyanol FF, bromophenol 0.02% כחול), 4 µL של ללא RNase מים; מחממים את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, במהירות את תירגע עד 0 ° C-קרח; תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר; נוסיף 5 בארות נפרדים של 12% שפגע בסימני עמוד; בהנהלת אלקטרופורזה מערכת אלקטרופורזה אנכי במאגר TBE 1 × ב-170 V למשך 45 דקות.
      5. לאחר אלקטרופורזה, הכתם הג'ל עם 3 µL של 1 × חומצת גרעין ג'ל כתם ב30 מ"ל 1 מאגר TBE × 10 דקות, וקח תמונה של הג'ל.
    2. גדול קנה המידה של ה-PCR: בחר מספר מתאים של מחזורי כדי לייצר את הלהקה בעוצמה הגבוהה ביותר ב דה מרקר בגודל הנכון ללא תוצרי לוואי לא רצויות. לבצע בקנה מידה גדול PCR (20 × 100 µL aliquots) ניצול את התנאים ואת מספר מחזורים נקבע סעיף 3.5.1 המתאים.
      הערה: הסכום הסופי של ספריית חד גדילי שניתן להשיג הוא יחסי הנפח הכולל של PCR, לא את הריכוז של תבנית. בדרך כלל, כדי להשיג nmol 1 של הספרייה, הבריכה חד גדילי צריך 2 מ ל PCR. PCR הוא מאוד רגיש, מזוהמים בקלות על-ידי DNAs בחוץ. צעדים יש לנקוט כדי להקטין את הסיכוי לזיהום, כגון לבש כפפות, באמצעות טיפים מעוקר, לא לירוק את החצוצרות שלה, לא פותחים את הפקק של הצינור PCR לפני צנטריפוגה.
  6. בסיבוב הראשון של בחירה: טיהור של מוצר ה-PCR על ידי משקעים אתנול.
    1. לשלב שני צינורות של תערובת PCR שפופרת אחת (200 µL כל אחד). חזור על הפעולה עבור כל הצינורות.
    2. להוסיף µL 15 של סודיום אצטט (3 מ', pH 5.2) פתרון µL 4 של ה-DNA/RNA משקעים המוביל פתרון, פי 2.5 הנפח של אתנול טרום מקורר ב-20 ° C לתוך כל שפופרת. מערבבים אותם באופן שווה.
      הערה: ה-DNA/RNA משקעים המוביל הוא בשימוש נרחב בניסויים משקעים אתנול לשפר באופן משמעותי את אחוזי ההחלמה DNA/RNA בריכוזים נמוכים. זה לא מפריע במורד יישומים כגון PCR ורצף.
    3. Centrifuge את התערובת ב g × 20,627 למשך 20 דקות ב 4 ° C ו בקפידה למחוק את תגובת שיקוע ולהשאיר התמיסה לבן.
    4. להוסיף 400 µL של 70% מראש קירור אתנול פתרון ב-20 ° C לתוך כל שפופרת לשטוף את המשקעים. Centrifuge את התערובת ב g × 20,627 במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו בקפידה למחוק את תגובת שיקוע ולהשאיר התמיסה לבן. חזור על השלב לשטוף פעמיים נוספות.
    5. פתח את המכסה צינור; שמוק קרום איטום; תן אתנול התנדפות ב 40 מעלות צלזיוס על הבלוק חימום עד התמיסה לבן הופך שקוף. לאחסן את התמיסה ב-20 ° C.
      הערה: המוצר PCR מטוהרים ניתן לאחסן ב-20 ° C.
  7. בסיבוב הראשון של בחירה: דור דנ א חד גדילי (הדור של הבריכה מועשר1) על-ידי ביצוע התגובה אקסונוקלאז λ לעכל סטרנד הפוכה phosphorylated.
    1. בקנה מידה קטן λ אקסונוקלאז התגובה
      1. להוסיף 100 µL של מים נטולי RNase שפופרת אחת המכילה את המוצר PCR מטוהרים מהסעיף 3.6. מערבולת צינור כדי נמסים לחלוטין את התמיסה בצינור.
      2. הכן טורפדו צנטריפוגה חמש ולהוסיף 5 µL של הפתרון שלעיל, µL 11 של RNase - מים חינם, µL 2 × 10 תגובה מאגר (670 מ מ גליצין-KOH, 25 מ מ MgCl2 , 0.1% (v/v) טריטון X-100 pH 9.4) לתוך כל שפופרת.
      3. להוסיף 2 µL של מים או λ מדולל אקסונוקלאז בתמיסה המכילה 2 U, 5 U, 8 U ו 10 U λ אקסונוקלאז לתוך צינורות אלה, בהתאמה. מערבבים את הפתרון על ידי בעדינות pipetting. המאגר תגובה × 10 מסופק עם λ exonucleasefrom המתווכת.
      4. דגירה הצינורות במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 15 דקות ב 80 ° C, ולהחזיק ב 4 º C.
      5. להכין את הילידים 12% דף. מערבבים 6 מ של מים אולטרא טהורים, 1 מ"ל של 10 × TBE, 3 מ"ל של אקרילאמיד 40%, 10 µL של TEMED µL 100 10% APS, לפי הסדר הזה. מערבבים היטב והמתן 60-90 דקות על מנת להבטיח שהג'ל עפור לחלוטין.
      6. לנתח את התוצאות של התגובות על-ידי שילוב 5 µL של כל תגובה עם µL 1 של טעינת צבע ו- 4 µL של מים נטולי RNase, loading תערובות אלה 5 בארות נפרדים של 12% ילידי עמוד (150 V למשך 45 דקות).
        הערה: סולם ה-DNA גדילי כפול 20 bp גם ניתן לטעון על הג'ל, אבל זה לא יהיה נחוץ מאז הלהקות ברורים של מוצר ה-PCR, הספרייה נטושים יחיד שנוצר להראות על הג'ל.
        הערה: התגובה אקסונוקלאז λ החינמי של סלקטיביות מבניים מעולה. המוצר PCR גדילי כפול (סטרנד אנטי-תחושה מסומן עם קבוצת פוספט בקצה 5') יכול להיות מתעכל לחלוטין לתוך ספרייה חד גדילי בנוכחות λ אקסונוקלאז במגוון רחב מאוד ריכוז (איור 4). הכמות המינימלית של אקסונוקלאז λ שיכולות לייצר לגמרי חד גדילי DNA ב התגובה אקסונוקלאז λ בקנה מידה קטן משמש גם עבור התגובה אקסונוקלאז λ בקנה מידה גדול. ריכוז גבוה יותר של אקסונוקלאז λ עשוי לשמש גם, מאז λ אקסונוקלאז עובד טוב בטווח רחב ריכוז מבלי לאבד את התשואה סלקטיביות והמוצר שלה מבנה. התגובה אקסונוקלאז λ מעוכבת על ידי ריכוז גבוה של מלח. עיכול לא שלם של המוצר PCR בדרך כלל מרמז על כי מדי מלח קיימת במוצר ה-PCR. הטיהור של מוצרי ה-PCR על ידי משקעים אתנול (סעיף 3.6) נמצא בדרך כלל תואם עם שלב זה, בעוד המוצר PCR מטוהרת על-ידי אלכוהול איזופרופיל משקעים לעתים קרובות מכיל יותר מדי מלח.
    2. בקנה מידה גדול λ אקסונוקלאז התגובה: בחר את הכמות המינימלית של אקסונוקלאז λ שיכולות לייצר לגמרי חד גדילי DNAs עבור התגובה אקסונוקלאז λ בקנה מידה גדול. התגובה תוגדל באופן פרופורציונלי לפי תנאי זה. לדוגמה: אם 2 U היא הכמות המינימלית של אקסונוקלאז λ הנדרש, לערבב µL 38 Rnase ללא מים, µL 10 של 10 x מאגר, µL 50 של מאגר דנ א1 ו- 2 µL של אקסונוקלאז λ U/µL 10.
  8. בסיבוב הראשון של בחירה: טיהור של הבריכה חד גדילי1 על ידי משקעים אתנול.
    1. בצע את ההוראות של צעד 3.6.
    2. לקבוע הריכוז מטוהרת בריכה1 על-ידי ספיגת UV ב-260 ננומטר.
    3. לשקם את בריכת 90% טהור1 בתוך אמצעי אחסון המתאים PAE מחייב המאגר. אם אין מספיק דנ"א שהושג לסיבוב הבא של בחירה, חזור על סעיפים 3.5-3.8.2.
      הערה: הנפח של PAE מחייב מאגר בדרך כלל משתנה מ- 200 500 µL על פי מידת הריכוז הסופי הרצוי של ספריית בסיבוב הבא של SELEX וספרייה.
  9. השני, שלישי, וחמישי סיבובים של SELEX.
    1. התנהלות השנייה, השלישית, הרביעית, החמישית סיבובים של SELEX לאחר מכן בעקבות ההליך אותו שתוארו לעיל (סעיף 3.2-3.8), פרט לכך הספרייה pmol ~ 300 היה קלט כדי להגביר את הבחירה לכתחילה.
    2. כדי למזער את הספיגה לא ספציפית של DNAs על בינוני, דגירה הבריכה בינונית שלא שונתה על מטרף רוטרי למשך 30 דקות השלישי, בסיבוב הרביעי של בחירה לפני הדגירה עם המדיום −coated2DBP−NH.
      הערה: תהליך SELEX הסתיימה בשעה הסיבוב החמישי בשל crosslink רציני בין DNAs על ידי כמות גדולה של המוצר משקל מולקולרי גבוה שלא הועברו לתוך הג'ל.

4. רצף תפוקה גבוהה

  1. להכין בריכה4 מהסעיף 3.9.2 רצף על ידי הגברה PCR עם תחל תואם.
    1. עיצוב ולסינתזה של פריימר לפנים אינדקס עם 6 nt בסוף יונקות כדי להקל על הניתוח רצף.
      אינדקס פריימר לפנים (FP-רצף): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. להגדיר את תגובת 1,000 µLPCR כדלקמן: µL 380 RNase ללא מים, 50 µL של כל תחל 10 מיקרומטר (FP-רצף, פו4- RP, 0.5 nmol), µL 20 eluted ביליארד מהסעיף 3.9.2 ולאחר 500 µL של premixed תערובת התגובה המכיל dNTPs, לגיטימי פולימראז , 2 × PCR התגובה חיץ. Aliquot התערובת לתוך 10 המבחנות. השתמש באותם תנאים PCR כמתואר בסעיף 3.5.1.2.
  2. לטהר את המוצר PCR כדי לעמוד בדרישות של המתקן רצף. לדוגמה, השתמש ערכת שחזור דף-ג'ל הדנ א על פי הוראות היצרן.
  3. לשלוח את המוצר PCR מטוהרים (~ 2 µg) מתקן רצף בתנאים משלוח הנדרש על-ידי המתקן רצף. לדוגמה, לשלוח את המוצר PCR בשפופרת צנטרפוגה עם בקבוקים חתומים ביסודיות עם שקיות קרח על המתקן רצף.
    הערה: קיבל את התוצאות דירגו את רצפי לפי המספר עותק של כל רצף כדי להעריך את העשרת של הבריכה ברצף. הרצף העליון נקרא DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). שלו זיקה, סלקטיביות נמדדו באמצעות פרוטוקול הבאים (סעיף 5 ו- 6). היישום שלה, ביו-חישה אלקטרוכימי הודגם בהמשך בסעיף 7.

5. Kd נחישות של נבחרת Aptamer מועמדים באמצעות PCR כמותי Magnetic Bead-Based (qPCR)

  1. לסנתז DBP-1-qPCR, תחל באמצעות הכימיה phosphoramidite סטנדרטי, יש לטהר אותה HPLC סטנדרטי.
    המועמד Aptamer (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    קדימה למתחילים qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    הפוך למתחילים qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    הערה: האזורים פריימר של הרצף שנבדקו שונים מאלה של הבריכה0 השתמשו בסעיף 3. המטרה של שינוי האזורים פריימר היא לבחון את הזיקה של הרצף ליבה בלבד, למעט האזורים פריימר.
  2. לשתק DBP-NH2 על גבי beads מגנטי מצופה חומצה קרבוקסילית ההוראות של היצרן.
    1. לשטוף את החרוזים מגנטי מצופה חומצה קרבוקסילית פעמיים עם 25 מ מ 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) (pH 5.0), באמצעות אמצעי אחסון שווה של beads מגנטי (100 µL) pipetted החוצה המבחנה, 10 דקות עם ערבוב טוב (מעל קצה- או דומה).
    2. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג/מ"ל של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) פתרון עם קר 25 מ מ MES (pH 5.0).
    3. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג/מ"ל של N-hydroxysuccinimide (NHS) פתרון עם קר 25 מ מ MES (pH 5.0).
    4. לערבב 100 µL של פתרון EDC, 100 µL של פתרון NHS עם החרוזים שטף, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב איטי הטיה.
    5. לשים את הצינורית על מגנט 4 דקות לאחר דגירה, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף חרוזים פעמיים עם µL 100 מ מ 25 קר MES (pH 5.0).
    6. דגירה µL 6 של פתרון מניות 100 מ מ DBP-NH2 ו- 25 מ מ MES (pH 5.0, 290 µL) עם החרוזים מופעל תחת סיבוב במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר או h 2-4 ° C, עם סיבוב איטי הטיה ב 5 סל ד.
    7. לשים את הצינורית על המגנט במשך 4 דקות לאחר דגירה וזורקים את תגובת שיקוע. רוחצים את החרוזים מצופה 4 פעמים את resuspend חרוזים עם 200 µL של PAE מחייב מאגר וחנות ב 4 ° C עד השימוש.
  3. לאסוף טיטור עקומה כדי לקבוע Kd.
    1. להכין סדרה של פתרונות DBP-1 (500 µL) בריכוזים שונים במאגר PAE מחייב בין השעות 1 ל- 300 ננומטר.
    2. להוסיף 10 µL של DBP-NH2-מצופה beads מגנטי כמתואר בסעיף 5.2.7 פתרון לכל DBP-1. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר תחת סיבוב.
    3. במקום הצינורות על מגנט 4 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף את החרוזים 4 פעמים באמצעות µL 200 PAE מחייב המאגר.
    4. להוסיף µL 60 PAE מחייב מאגר כל שפופרת. דגירה הצינורות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף תגובת שיקוע המכילה את eluted DBP-1 על-ידי הפרדה מגנטית. חזור על תהליך זה • תנאי להשיג DBP יותר מאוגד-1.
    5. לדלל את הפתרון elute 100-fold ולקחת µL 3 עבור qPCR בזמן אמת. להגדיר את תגובת qPCR כדלקמן: µL 3 RNase ללא מים, 2 µL של 10 מיקרומטר פריימר (FP, פו4- RP, 0.01 nmol) 3 µL של eluted, מדולל DBP-1, 10 µL של premixed תערובת התגובה המכיל dNTPs פולימראז, מאגר התגובה x PCR 2.
    6. לקבוע את המספרים של DBP-1 בכל מדגם על-ידי הפעלת qPCR באמצעות הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: מחזור 1 של 95 ° C, 30 s; 30 מחזורים של [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; מחזור 1 של 72 מעלות צלזיוס, 30 s ו להחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
    7. התווה את עקומת טיטור ולקבוע Kd על ידי התאמה לא-ליניאריות של העקומה בהנחה יחס של 1:1 מחייב27.

6. יחסי אהדה ובדיקה ירידה לפרטים על ידי מבחני תחרותי

  1. להוסיף 10 µL של DBP-NH2-מצופה beads מגנטי לפתרון DBP-1 (500 µL, 1 מיקרומטר). תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר תחת סיבוב. במקום הצינורות על מגנט 4 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. רוחצים את החרוזים 4 פעמים באמצעות µL 200 PAE מחייב המאגר את resuspend אותו ב- µL 10 PAE מחייב המאגר.
  2. להוסיף 10 µL של DBP-NH2-מאוגד בינונית מצופה עם DBP-1 כדי µL 110 של כל 10 מיקרומטר נבדק מדגם (DBP-NH2, DBP, DEHP, בוטיל בנזיל phthalate(BBP), יונים של מתכות כבדות, וכו '.) דגירה בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לאסוף תגובת שיקוע על ידי הפרדה מגנטית.
  3. לדלל את תגובת שיקוע 100-fold ולקחת µL 3 על כימות qPCR. להגדיר את תגובת qPCR כדלקמן: µL 3 RNase ללא מים, 2 µL של 10 מיקרומטר פריימר (FP, פו4- RP, 0.01 nmol) 3 µL של eluted, מדולל DBP-1, 10 µL של premixed תערובת התגובה המכיל dNTPs פולימראז, מאגר התגובה x PCR 2.
  4. לקבוע את המספרים של DBP-1 בכל מדגם על-ידי הפעלת qPCR באמצעות הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: מחזור 1 של 95 ° C, 30 s; 30 מחזורים של [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; מחזור 1 של 72 מעלות צלזיוס, 30 s ו להחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
  5. לחשב את הזיקה היחסי על-ידי חלוקת מספר DBP-1 שוחרר את החרוזים בנוכחות המדגם לפי מספר DBP-1 שוחרר את החרוזים במאגר איגוד PAE: זיקה יחסית = Nמדגם/Nמאגר.

7. ייצור ומדידות אלקטרוכימי של DEHP ביולוגיים אלקטרוכימי

  1. לסנתז את רצף ליבה thiolated (HS-DBP-1), החללית איתות (DBP-1-C-Fc) באמצעות תקן phosphoramidite כימיה, יש לטהר אותה HPLC סטנדרטי.
    HS-DBP-1: 5' - HS - (CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT - (CH2)6Fc-3'
    הערה: עיצוב רציונלית הגששים חיישן תוארה שלנו18,הקודם pbulications22.
  2. לשקם HS-DBP-1, DBP-1-C-Fc במים נטולי נוקלאז כיתה ב 100 מיקרומטר, aliquot, ואחסן אותם ב-20 או -80 ° C עד שנה אחת.
  3. הפולני. האלקטרודה זהב בקפידה על משטח דמוי מראה עם 1, 0.3 ו- 0.05 מיקרומטר Al2O3 אבקת על microcloth עבור 5 דקות, sonicate אותו במים הנדסה גנטית למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות אל2O3. ואז לנקות האלקטרודה על ידי ליטוש אלקטרוכימי עם סריקות וולטמטריה רצופים (CV) 35 מ 0.4 ל +1.2 V (לעומת Hg-Hg2אז4) 0.5 M H2אז4 -mV 100/s.
  4. להכין תערובת של 0.5 מיקרומטר HS-DBP-1 ו- 0.5 מיקרומטר DBP-1-C-Fc 100 µL 10 מ מ פוספט מאגר המכיל 1 M NaCl, pH 7.4 (PBS). מחממים את התערובת בצינור דק-קיר צנטריפוגה בערכת אמבט מים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ומגניב לאט את התערובת לטמפרטורת החדר.
  5. להוסיף 1 µL של טריס הידרוכלוריד-(2-carboxyethyl)-פוספין (TCEP, 10 מ מ, פתרון מניות) לתוך התערובת. לשמור בטמפרטורת החדר מאובטח.
  6. לטבול האלקטרודה זהב נקי בפתרון לעיל במשך 12 שעות, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  7. לשטוף את האלקטרודה עם PBS, לטבול האלקטרודה 1 מ"מ [S (CH2)2(2CH ו2)6ו3]2 (HS-למשל6- הביתה) ב- PBS עבור ה 1 לשטוף את האלקטרודה ביסודיות באמצעות התכונה PAE איגוד מאגר, לטבול האלקטרודה במאגר PAE מחייב.
  8. לקחת סריקת רקע גל מרובע voltammetry (SWV) במאגר איגוד PAE ללא מטרה.
    1. לנקות את כל הציוד ניסיוני: תאים אלקטרוליטי, זהב עובד אלקטרודה, אלקטרודת פלטינה מונה ו calomel רווי הפניה אלקטרודה (SCE).
    2. להפעיל את התוכנה המותקנת; להגדיר את הפרמטרים ניסיוני עבור מדידות SWV.
      הערה: הפרמטרים הבאים ניסיוני שימשו את הניסויים SWV: מגוון אפשריות: מ--0.2 ל 0.7 וולט; אפנון משרעת: 25 mV; רוחב פולס: 5 ms; קצב סריקה: mV 50/s; צעד פוטנציאל: 1 mV.
    3. לחבר את הזהב עובד אלקטרודת פלטינה מונה אלקטרודה, SCE כדי potentiostat והניח אלה שלוש אלקטרודות לתוך תא אלקטרוליטי המכיל מאגר PAE מחייב.
    4. הפעל SWV מדידה.
      הערה: פעם מתחילה מדידה SWV, עיקול SWV תהיה המוצג על המסך של המחשב. הסריקה חוזרת עד הסריקות נמצאים מתמדת הם נצפו שינויים נוספים שיא גובה או צורה.
  9. לטבול האלקטרודה עבודה במאגר איגוד PAE המכילה ריכוז מסויים של DEHP (למשל, 10 בבוקר) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף ביסודיות באמצעות התכונה PAE מחייב מאגר האלקטרודה, לטבול האלקטרודה במאגר PAE מחייב עם מונה אלקטרודה, SCE. לאסוף את עקומת SWV תחת באותו המצב כמתואר בסעיף 7.8.
  10. וחזור על שלב מספר 7.9, למעט ריכוז DEHP (למשל 100 pM, 1 ננומטר, 10 nM, 100 ננומטר, 1 מיקרומטר) הוגדל ברצף. התווה את עקומת טיטור.
  11. בדיקות ירידה לפרטים: חזור על שלבים 7.3-7.9, פרט לכך המאגר bind PAE המכיל DEHP מוחלף על-ידי המאגר איגוד PAE המכיל את החומר מפריעות פוטנציאליים-הריכוז הרצויה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו תוכנן, מסונתז פתלאט dibutyl את קבוצת אמינו functionalized (DBP-NH2) כיעד עוגן (איור 1F). אנחנו מכן ביצע את מבחר aptamer DNA פאיס באמצעות DBP-NH2 כיעד עוגן ובעקבות היעד הקלאסי מבוסס על הנייח השיטה (איור 2). בכל סבב, PCR פיילוט בוצעה באמצעות העמוד denatured כדי למטב את מחזור מספר PCR (איור 3). העמוד denatured, במקום דף מקורי, הוא הציע בתוקף כי אנחנו ועמיתים אחרים מצאו כי תוצרי הלוואי משקל מולקולרי גבוה חשד המוצגות של ג'לים מקורית את המספרים מחזור גבוה הם למעשה crosslinking מתחמי הנוצרת על-ידי רצפים של הגודל הנכון. לפיכך, עוצמת הלהקה של הדף denatured באמת יכול לשקף את כמות המוצר הנכון. הדור ה-DNA נטושים יחיד הוא עוד צעד קריטי, שיטות רבות בשלב זה כבר דווח על28. השיטה עיכול של אקסונוקלאז λ היא השיטה הזולה ביותר. להצלחת הדור דנ א חד גדילי יכול להבדק בנוחות על ידי הילידים, עמוד שבו מוצג המוצר PCR יחיד (הראשון. כמה סיבובים של SELEX) או מספר להקות, בעוד הלהקה היחידה מוצג לאחר העיכול (איור 4).

SELEX הופסק לאחר החמישי לסיבוב הבחירה בגלל כמות משמעותית של DNA שנצבר בחלק העליון של הדף, אפילו לאחר הטיפול דנטורציה (שבו DNAs מחוממים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באוריאה 8.3 M × TBE – המכיל 2) , אשר הציע cross-linking רציני בין DNAs, גם ציין כי רצפי היו מועשר. לכן, הבריכה4 נשלח עבור רצף תפוקה גבוהה. התוצאה תפוקה גבוהה הראה כי-100 הראשונים בתדירות הגבוהה ביותר מתרחשים רצפי היו מאוד והתפאורה היו של משפחה אחת. הרצף העליון DBP-1 מוצגת nanomolar זיקה (איור 5) וספציפיות קבוצה טובה בפני PAE congeners (DBP, לעסוק בחומרים DEHP) (איור 6) באמצעות מבחני qPCR נוח, כמתואר בסעיף פרוטוקול.

DBP-1 שימש לבניית של גדיל מבוסס-הזחה אלקטרוכימי aptasenor בהתאם כדי שלנו שדווחה בעבר לעבוד29. החיישן DEHP יכול ברגישות, באופן סלקטיבי להגיב DEHP (איור 7). מזהמים סביבתיים נפוצים כגון יונים של מתכות כבדות, אנטיביוטיקה, מולקולות קטנות עם קבוצות פונקציונליות דומה הראו תגובה חלשה מאוד ל DBP-1.

Figure 1
איור 1: מבנה כימי של פאיס (א), (ב) BBP, DBP (ג), (ד) DEHP, (ה) 4-OH-DEHP, (ו) DBP−NH2- איור זה יש הודפס באישור י' האן. et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ה-DNA ייחודיות לקבוצה aptamer הבחירה נוהל פאיס באמצעות DBP-NH2 כמו מטרה עוגן. איור זה יש הודפס באישור י' האן. et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג נובעת PCR מחזור אופטימיזציה באמצעות דף שפגע בסימני. משמאל לימין, מייצגים המסלול. ודוחפים: 20 bp DNA הסולם תקן 15 מחזורים (אין תבנית ה-DNA), 20 מחזורים (אין תבנית ה-DNA), 25 מחזורי (אין תבנית ה-DNA), מחזורים (אין תבנית ה-DNA), 15 מחזורים, 20 מחזורים, מחזורי 25, 30 מחזורים. תנאים אופטימליים נצפו ב 25 מחזורי, איפה הלהקה במוצר אחד היה בעוצמה גבוהה ללא תוצר לוואי בלתי רצויות, יתר על כן, הלהקה לא נצפתה ב הפקד המתאים ריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: אופטימיזציה של λ התגובה אקסונוקלאז לעכל סטרנד phosphorylated באמצעות דף מקורי. משמאל לימין, מייצגים המסלול. ודוחפים: 20 תקן סולם הדנ א bp שלילי (אין אקסונוקלאז λ), 2U, 5U, 8U, 10U. הכמות המינימלית של אנזים נצפתה ב- 2U, שבה המוצר PCR זוגי הופך DNAs חד-גדילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מדידות זיקה של DBP-1 על ידי מבחני מבוסס qPCR. השגיאה (סטיית תקן, SD) של Kd של מחושב מתוך שלוש מדידות של המדגם אותו. איור זה יש הודפס באישור י' האן. et al. 22

Figure 6
איור 6: מידות זיקה היחסי של DBP-1 עבור חינם DBP-NH2 (10 מיקרומטר), DBP (10 מיקרומטר), DEHP (10 מיקרומטר), BBP (10 מיקרומטר), אתיל אצטט (10 מיקרומטר), חומצה בנזואית (10 מיקרומטר), חומצה פתלית (10 מיקרומטר), ועוד באמצעות תחרות מבחני. אחרים: תערובת של הפרעות אפשריות (גלוקוז kanamycin, אמפיצילין, אתנול) בבת 10 מיקרומטר. היחס (בזיקה יחסית) מחושב על ידי חלוקת מספר aptamers שוחררו החרוזים בנוכחות המדגם לפי מספר aptamers שוחררו החרוזים במאגר איגוד PAE. העמודות מסמנות SD. זאת אומרת ± זמנים תוססים חושבו מתוך שלוש מדידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: DEHP ביוסנסור אלקטרוכימי עבור זיהוי העדינה, ultraselective של DEHP: מנגנון (א), SWV ' עקומות ' (B), עקומת כיול (ג), ויבחן סלקטיביות (ד). השגיאות (מרחביות) חושבו מתוך שלוש מדידות. איור זה יש הודפס באישור י' האן. et al. 22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחד מהיתרונות aptamers יוצא מן הכלל הוא כי הם מזוהים באמצעות השיטה במבחנה SELEX, בעוד נוגדנים נוצרים באמצעות ויוו immunoreactions. לכן, ניתן לבחור aptamers עם ירידה לפרטים היעד הרצוי בתנאים ניסיוני מעוצב היטב, ואילו נוגדנים מוגבלים בתנאים פיזיולוגיים.

כדי להקל על ההפרדה של רצפי מאוגד של רצפי חינם, מספר SELEX ששונה לאחרונה דווחו, אילו אלקטרופורזה נימי30, מיקרופלואידיקה31, חרוזים מגנטי / אקריליק / agarose חרוזים14, וכו, החלפת מסננים ניטרוצלולוזה או זיקה עמודות כדי להשיג הפרדה יעילה יותר. בין שיטות אלה, השיטות מבוססות על חרוז היה ביותר בשימוש נרחב עבור הבחירה aptamer של מטרות מולקולה קטנה עקב שלהם פשוט הקמה, הפעלה קלה, ולהיות לבצע ניתוחים מולקולה קטנה.

ישנן שתי קבוצות של שיטות הנפוצות לבחירה aptamer של מולקולה קטנה מטרות: היעד13 ו ספריית14 מבוסס הנייח השיטות. בקבוצה לשעבר של שיטות, המטרות מולקולה קטנה ותשמרו על השלב מוצק כגון functionalized beads מגנטי או חרוזים agarose ויה קוולנטיות צימוד ריאקציות. ספריות מודגרת עם חרוזים מצופים מולקולה קטנה, רצפים אלה לא לאגד או לאגד בחולשה אל המטרה על השלב מוצק יוסרו פשוט על ידי ביצוע הכביסה, צנטריפוגה או הפרדה מגנטית שלבים. רצפי מאוגד לאחר מכן eluted, מוגבר על ידי ה-PCR. המטרות מולקולה קטנה חייב להיות קבוצה פונקציונלית אחד לפחות זמין עבור התגובה צימוד. עבור אלה ללא קבוצות פונקציונליות מתאימה, הקבוצה הפונקציונלית צריך לשלב את המטרה המקורית דרך סינתזה אורגנית. הסינתזה של המטרה תוכנן בקפידה יכולה לכלול מספר השלבים, לפעמים הוא די מאתגר גם כן. השינוי המבני של המטרות עשוי להשפיע גם על אתרים איגוד, זיקה עם aptamers שלהם. כדי להימנע מבעיות אלה, פותחו שיטות מבוססות הנייח בספריה, שם הספרייה היא hybridized משלימים ל DNA לכידת רגשים על beads מגנטי, ויפלו הרצפים מחייב את החרוזים על איגוד עם המטרות. בקבוצה זו של שיטות, המטרות יתווספו למאגר מחייב, אין קבוצות פונקציונליות נדרשים. פאיס הן אסתר נגזרות של חומצה פתלאט, PAE טיפוסית מורכבת קבוצה אסתר אסיד פתלאט, שרשראות אלקיל אחד או שניים (איור 1 א'-D). פאיס יש קבוצות פונקציונליות ללא זמין עבור מעבדתי הנייח. לפיכך, השיטות מבוססות על הנייח ספריית נראה אטרקטיבי יותר עבור בחירת aptamer פאיס.

מצב פיזור ומבוקרות היטב הוא קריטי על מנת להבטיח את העשרת הרצוי של הספרייה באמצעות SELEX. עם זאת, פאיס הם מאוד הידרופוביות, בקלות ליצור צבירות בפתרונות מימית-ריכוז גבוה יותר מאשר מספר מיקרומטר, אפילו בנוכחות פיתחה מרובים כדי להקל על פיזור. לכן, מצב פיזור פאיס קשה לשלוט, זה יהיה קשה לבחור aptamers זה במיוחד לאגד מולקולות בודדות של PAE. כדי לפתור את בעיית מסיסות, המטרה-הנייח שיטות נבחרו, בפאיס אילו היו ותשמרו על החרוזים הידרופילית ויה קוולנטיות מליטה. על-ידי שימוש בטקטיקות האסטרטגיה, המטרות צריך להיות נוכח דומיננטית על פני חרוז במצב מולקולרי יחיד, במקום אגרגטים.

העיצוב מבנית של המטרה עוגן הוא גם די קריטי עבור הבחירה המוצלחת של קבוצה ספציפית aptamers. שלושה גורמים צריך להיחשב לעיצוב מבנית. הגורם הראשון הוא המטרה של הבחירה aptamer. בהתחשב המטרה של בחירת קבוצה ספציפית aptamers, זה חיוני כדי לחשוף את קבוצת משותפת של פאיס עבור איגוד aptamer ולמנוע את שאר החלקים השתתפות שהאיגוד aptamer. לכן, צריך להכיר הקבוצה הפונקציונלית במסוף של שרשרת הצד. בהתחלה, אנו תוכנן functionalized הו DEHP (4-OH−DEHP) (איור 1E) כיעד עוגן, רק עוד כמה שאלות על ה beads מגנטי של חומצה קרבוקסילית16. לפיכך, הרשתות אלקיל נחשפו על פני השטח של המטריקס. ניסינו לבחור beads מגנטי עם קבוצות carboxyl כמו המטריקס מוצק. אין שיפור זיקה ברורה נצפתה לאחר חמישה סיבובים של בחירה, קליטתם לא ספציפית על המטריקס חשופות הוחזק חזקה.

לכן, DBP-NH2 אחר כך עוצבה תוך התבססות על המחשבות הבאות: (1) הקבוצה פתלאט סביר יותר לאינטראקציה ספציפית עם aptamer דרך המחסנית π-π האג"ח מימן מאשר השרשרת אלקיל; (2) carbodiimide NHS בתיווך התגובה הוא מתון, יש יעילות של צימוד יעילה מאוד, כך -NH2 הוא הציג בסוף בשרשרת אלקיל של DBP; (3) קל לפעול עם החרוזים מגנטי כמחיצה מעבדתי, אך ספיחה לא ספציפית של הספרייה הוא חזק. למרות ההפסד של חרוזים agarose במהלך ההפרדה הוא גבוה יותר מאשר החרוזים מגנטי, ספיחה לא ספציפית של הספרייה הוא נמוך בהרבה. לפיכך, DBP-NH2 היה מרותק למיטה על החרוזים מופעל אפוקסי agarose, הקבוצה phthalic acidester נחשף על פני השטח של המטריקס.

הבחירה של מאגר בחירה היא חשוב, במיוחד עבור מטרות מולקולה קטנה עם מסיסות מגוונות. המאגר מחייב צריך להיות מוקפדות למנוע צבירת ולהבטיח מצב פיזור טוב של אבא במהלך תהליך הבחירה ואפיון כל aptamer. במחקר שלנו, מצאנו כי DEHP לא יכול להמיס במאגרי רגיל ללא פיתחה, מציג שתי שכבות נפרדות. השכבה נעלם על תוספת של פיתחה מספר בכמות ממוטבת. ברור הפתרונות צריכים להישמר בטמפרטורות גבוהות יותר מאשר 20 ° C כדי לשמור על מעמדה. הפרטים ניתנים בשלב פרוטוקול 3.1.

דור דנ א חד גדילי ממוצרים PCR גדילי כפול הוא צעד קריטי בתהליך SELEX. במספר שיטות כיום תוארו בכתבי ספרות32,33, כולל PCR אסימטרי, λ אקסונוקלאז עיכול, הפרדה מגנטית עם חרוזים מצופים streptavidin, גודל ההפרדה על ידי denaturing שתנן-לזיהוי ג'ל.

שיטות שונות יש היתרונות והחסרונות שלהם. כיום, השיטה הנפוצה ביותר עבור הדור של ssDNA הוא הפרדה מגנטית עם חרוזים מצופים streptavidin. היתרון מצטיינים של שיטה זו הוא את פעולתו לחיסכון בזמן ופשוט. החיסרון הוא עלותו הגבוהה לעומת שיטות אחרות. לעומת זאת, גודל ההפרדה בשיטה המבוססת על, באמצעות תחל הפוכה עם מבנה גזע – לולאת GC-עשיר, הוא אחד מהשיטות הזול ביותר, ואילו התשואה של דנ א חד גדילי הוא הנמוך ביותר בקרב אלה שיטות32. ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר את השימוש λ עיכול אקסונוקלאז לייצר חד גדילי הדנ א, אשר הוא אחד מהשיטות הזול ביותר. . מצאנו התשואה של דנ א חד גדילי משולה עם שתי שיטות של הפרדה מגנטית, חרוזים מצופים streptavidin. יתר על כן, מצאנו כי התגובה אקסונוקלאז היה מעוכבים על ידי ריכוז גבוה של מלח. עיכול לא שלם של המוצר PCR דיווחו בספרות33 היה ככל הנראה בגלל יותר מדי מלח הקיימת במוצר ה-PCR. בנוסף, אקסונוקלאז λ הוא פעיל מאוד ולא יקר (איור 4).

אפיון של אימות של aptamers היא מייגעת, זמן רב, מגלם שמכבידות ב aptamer הצינור גילוי, או33. רוב הטכניקות הן שיטות מסה רגיש אשר עובד היטב עבור השותפים איגוד aptamer גדול (> 10,000 אמו), אך אינם רגישים מספיק כדי למדוד את האינטראקציות עם מטרות נמוך משקל מולקולרי (< אמו 1,000)15. אפיון של אימות של aptamers של הידרופובי מולקולות קטנות כמו פאיס קשה אפילו יותר. מסיסות המים המסכן שלהם גורמת unsaturation של העקומה טיטור, אשר מונע Kdשל נחישות בתמיסה או עוצר aptamers על פני השטח. לכן, אנחנו נקבע ה sd Kשל aptamers מזוהה על ידי רצף תפוקה גבוהה על ידי שיתק DBP-NH2 על החרוזים מגנטי הידרופילית ניתן למנוע את הבעיה מסיסות. הזיקות היחסי ואת מידת הבררנות של aptamers אל פאיס אחרים היו שקבע מבחני תחרותי, שבו המועמדים aptamer היו ותחום מראש ל DBP-NH2 המצורפת beads מגנטי ואז שוחרר תגובת שיקוע על דגירה עם פאיס נבדק או חומרים אחרים שעלולים מפריעות. וזמינותו תחרותי הוחל משום שסיפקה השוואה נתיישב זיקה בין פאיס שהיה אין קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח. בנוסף, מבחני מגנטיים מבוססי חרוז פלורסנט מתאימים לצורך המחקר זיקה של מולקולה קטנה-aptamer אינטראקציות34. עם זאת, מצאנו כי beads מגנטי לפעמים לגרום פלורסצנטיות שכבתה מסיבות לא ידועות. לפיכך, מבחני qPCR שימשו את המידות זיקה.

עצה אחת טכניקה קריטי עבור ביוסנסור אלקטרוכימי המתוארים במחקר זה הוא פסיבציה משטח של אלקטרודה35. עקב hydrophobicity גבוהה של DEHP, יש נטייה חזקה להיספג nonspecifically אל האלקטרודה זהב, המוביל אל הכישלון של הזיהוי. הכי נפוץ בשימוש סוכן השטח פסיבציה, 6-mercapto-1-hexanol (MCH)36,37, אינה מספיקה כדי למנוע את ספיגת DEHP, לא ספציפית כאשר מצאנו את HS-(CH2)2-[ו2CH2 ]6- ו3 היה יעיל מספיק לאפשר זיהוי רגיש DEHP38.

הליך זה מתאר עבור בחירת קבוצה ספציפית aptamers DNA של מולקולות קטנות מאוד הידרופוביות, יישום של aptamer שנבחר ביוסנסור אלקטרוכימי פרוטוקול. הפרוטוקול מסייעת עם המבחר של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות, מספק תובנות על חיישן התפתחות מאוד הידרופובי מולקולות קטנות כמו גם. תהליך הבחירה aptamer שייך לקטגוריה של שיטות מבוססות קיבעון המטרה. המגבלות של פעולת שירות מסוג זה קיימים גם עבור פרוטוקול זה, לדוגמה לצורך סינתזה מסובך של מטרות עוגן ואת ההשפעות של השלב מוצק על איגוד aptamer. היתרונות מושכת ביולוגיים אלקטרוכימי שמתואר פרוטוקול זה כוללים עיצוב פשוט ורגישות גבוהה שלהם. החיסרון העיקרי הוא שלהם דיוק מוגבל בשל טווח דינמי רחב ביותר שלהם. לכן, ביולוגיים המתוארים כאן הם מתאימים יותר עבור בדיקות, במקום מדידות כמותיים של המטרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום עניין פיננסי מתחרות.

Acknowledgments

. אנחנו אסירי תודה על תמיכה כספית של הטבע הקרן הלאומית למדע (21675112), מפתח הפרויקט בתכנית למדע וטכנולוגיה של בייג'ינג ועדת החינוך (KZ201710028027), Yanjing הצעיר המלומד תוכנית של הון רגיל אוניברסיטת...

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

כימיה גיליון 133 Aptamer בחירה חומצה פתלית אסטרים מולקולות קטנות המיועדות לקבוצות הידרופוביות תגובת שרשרת הפילמור כמותית aptasensor אלקטרוכימי מזהמים אורגניים מתמיד
חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y.,… More

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter