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Chemistry

Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

생체 외에서 선택 및 그룹 관련 phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA aptamers의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 전기 aptasensor에서 선택 된 aptamer의 응용 프로그램이 포함 되어 있습니다.

Abstract

지속적인 유기 오염 물질의 주요 그룹의 phthalic 산 에스테 르 (PAEs) areone. PAEs의 그룹 전용 탐지는 congeners의 급속 한 성장으로 인해 매우 원한다. 점점 더 인식 요소 바이오 센서 플랫폼에 적용 된 DNA aptamers 하지만 선택 aptamers PAEs, 등 매우 소수 성 분자 표적으로 보고 거의. 이 작업 그룹-특정 DNA aptamers PAEs 선택 하도록 설계 된 비드 기반 방법을 설명 합니다. 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH2) 앵커 대상 합성 했 고 에폭시 활성화 agarose 구슬에 움직일 immobilization 매트릭스의 표면에서 phthalic 에스테 르 그룹의 표시를 허용 하 고 따라서 그룹 전용 바인더의 선택. 자력 분리와 결합 하는 정량적 중 합 연쇄 반응에 따라 aptamer 후보자의 분리 상수 하 고. 상대 선호도 다른 PAEs에 aptamers의 선택도 경쟁 분석 실험에 의해 결정 되었다 aptamer 후보 DBP NH2 미리 경계 했다 연결 된 자석 구슬, 가진 외피에 상쾌한에 발표 테스트 PAEs 또는 다른 잠재적인 간섭 물질입니다. 경쟁 분석 결과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹이 했다 PAEs 중 손쉬운 선호도 비교를 제공 하기 때문에 적용 되었다. 마지막으로 우리 전기 aptasensor의 제작을 시연 하 고 bis(2-ethylhexyl) 프 탈 레이트의 磁 및 선택적 검출을 위해 사용. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 통찰력을 제공합니다.

Introduction

급속 한 경제 발전, 함께 산업화, 그리고 도시 건설, 환경 오염의 가속 그 어느 때 보다 더 심각 하다. 일반적인 환경 오염 물질 중 금속 이온, 독 소, 항생제, 농약, 내 분 비 분리기와 지속적인 유기 오염 물질 (Pop)을 포함합니다. 금속 이온과 독 소, 외 다른 오염 물질은 작은 분자는 꽤 congeners의 다양 한 구성 됩니다. 가장 독성 Pop 비페닐 (PCBs), 다 환 방향족 탄화수소 (PAHs), 폴 리 브롬 화 비페닐 에테르 (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-다이옥신 (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs)를 포함 하는 예를 들어 고 phthalic 산 에스테 르 (PAEs)1,-2모든 많은 congeners의 구성. 작은 분자 검출 크로마토그래피/질량 분석 기반 기술을 응용 프로그램3,4,,56의 그들의 다양성 때문에 의해 주로 수행 되었습니다. 사이트 검색에 대 한 항 체 기반 방법을 최근 개발된7,,89되었습니다 합니다. 그러나, 이러한 방법은 특정 느리기에 대 한 매우 구체적인 이기 때문에, 여러 테스트를 수행 합니다. 더 심각한 것은 소설 congeners 성장 빠른 시간에 그들의 항 체를 생성할 수 없습니다. 따라서, 한 테스트에 모든 congeners의 총 레벨 모니터링 하 그룹 관련 바이오 센서의 개발 환경 오염 상태를 평가 하기 위한 귀중 한 통계를 제공할 수 있습니다.

최근, 핵 산 aptamers 널리 적용 된 다양 한 바이오 센 싱 플랫폼 다양 한 이온과 단백질 및 세포10,11 작은 분자에서 대상 인식의 그들의 기능 때문에 인식 요소 ,12. Aptamers는 시험관에 의해 호출 된 메서드 ligands의 체계적인 발전 지 수 농축 (SELEX)13,14을 통해 식별 됩니다. SELEX는 약 1014-1015 시퀀스 포함 임의의 합성 단일 가닥 oligonucleotide 도서관으로 시작 합니다. 무작위 라이브러리의 크기는 RNA 또는 DNA 후보 구조의 다양성을 보장합니다. 전형적인 SELEX 프로세스 라이브러리는 높은 친 화력 및 특이성 대상 시퀀스에 농축 될 때까지 농축의 여러 라운드로 구성. 최종 농축된 수영장 다음 시퀀스와 분리 상수 (Kd) 및 간섭 물질과 같은 다른 기술에 의해 결정 하는 잠재력에 대 한 선택 필터 바인딩, 친화성 크로마토그래피, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 등. 15

매우 빈약한 물 가용성과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹의 부족, pop aptamer 선택은 이론적으로 어렵습니다. SELEX에 대 한 중요 한 발전 aptamers 발견 가속화 했습니다. 그러나, 팝에 대 한 그룹별 aptamers의 선택은 하지 아직 알려졌다. 지금까지 특정 느리기에 대 한 높은 특이성으로 PCB 바인딩 DNA aptamers만 확인 된16되었습니다. PAEs는 주로 폴 리 염화 비닐 물자, 탄력 있는 플라스틱, 따라서 가소제 역할 하드 플라스틱에서 폴 리 염화 비닐을 변경에 사용 됩니다. 일부 PAEs 내 분 비 분리기로 확인 되었습니다, 심각한 손상을 일으킬 수 간 및 신장 기능, 남성 정자의 운동 성 감소 하 고 비정상적인 정자 형태와 고환 암17발생할 수 있습니다. 화합물-도 그룹 전용 PAE 바인딩 aptamers 보고 되었습니다.

이 작품의 목표 그룹-특정 DNA aptamers PAEs, 팝의 대표 그룹 등 매우 소수 작은 분자를 선택 하기 위한 대표적인 프로토콜을 제공 하는 것입니다. 우리는 또한 환경 오염 감지를 위한 선택 된 aptamer의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 지침과 통찰력을 제공합니다.

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Protocol

1. 라이브러리 및 뇌관 설계 및 합성

  1. 디자인 초기 라이브러리 및 뇌관.
    라이브러리 (풀0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-n 40를 자동차-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    뇌관 (FP)를 전달: 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    반전 뇌관 phosphorylated (포4-라인란트): 5'-포4-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. 합성 풀0, FP, 및 포4-RP 표준 phosphoramidite 화학18,,1920를 사용 하 여 표준-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)21에 의해 모든 DNAs를 정화.
  3. 수영장0, FP, 및 포 reconstitute4-RP nuclease 무료 학년에서 100 µ M, aliquot에서 물 및-20에서 그들을 저장 또는 최대 1 년-80 ° C.
    참고:이 좋습니다 수영장0, FP, 및 포 저장 하4-RP 10-20 µ L aliquots에 가능한 교차 오염을 방지.

2. 합성 앵커 대상 및 에폭시 활성화 Agarose 구슬에 그것의 동원 정지

  1. 앵커 대상으로 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH2) 음성 합성.
    참고: 합성 및 DBP NH2 의 실험 내용은 문학22에서 설명 되었습니다.
  2. 앵커 대상 용 해도 대 한 적절 한 매체 대상 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 연구를 위해 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 100 m m DBP NH2 재고 솔루션을 준비 하 고 4에서 솔루션을 저장 또는 최대 1 년 동안-20 ° C.
  3. DBP NH2 제조 업체에서 수정 된 프로토콜에 따라 에폭시 활성화 agarose 구슬에 고정
    1. 그리고 0.1 g 동결 건조 분말 에폭시 활성화 agarose 구슬의 밖으로 무게 증류수에 중단. 20 mL 증 류 물 여러 aliquots에 추가 사용 하 여 1 시간을 위한 매체를 씻어. 씻어 0.2 M 나2CO3 (pH 12) 매체.
      참고: 매체 그것에 물을 추가한 후 즉시 부을.
    2. 500 µ L 커플링 버퍼 (0.2 M 나2CO3 버퍼)에 DBP NH2 (46.7 m g, 0.15 mmol)을 용 해.
    3. 혼합 매체를 가진 ligand를 포함 하는 결합 솔루션. 5 rpm에서 통을 사용 하 여 실 온에서 48 h에 대 한.
    4. 세척 제품 세 번 0.1 M 아세테이트 버퍼 (0.5 M NaCl, pH 4.5)을 사용 하 여 순차적으로 반복 하 고 0.2 M에서 각 씻어 주기 버퍼 (0.5 M NaCl, pH 12) 탄산염. 워시와 500 µ L의 최종 볼륨을 물에 제품을 일시 중단 합니다.
    5. 사용 하기 전에 4 ° C에서 제품을 저장 합니다.
    6. 원소 분석 대상 동원 정지의 성공 여부를 확인 합니다.

3입니다. SELEX

  1. 매우 순수한 물 또는 20 mm Tris· nuclease 무료 학년 물에 PAE 바인딩 버퍼의 500 mL를 준비 HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 m KCl m, 1mm CaCl2, 1 %polyoxyethy-레네 (20) sorbaitan monolaurate, 및 0.03% 비 이온 성 표면 활성 에이전트 (pH 7.9). 개월 동안 20 ° C 보다 높은 온도에서 저장 및 살 균 0.22 μ m nitrocellulose 필터를 통해 버퍼를 필터링 합니다.
    참고: 그것은 PAE 바인딩 버퍼에서 PAEs의 좋은 분산 상태를 유지 하기 위해 중요 한입니다. 여러 종류의 계면 활성 제 용액에 PAEs의 가용성을 향상 시키기 위해 필요 합니다. 그러나, 계면의 수는 PAE 분자를 캡슐화 하는 계면 활성 제 micelles의 형성을 피하기 위해 최소한으로 유지 되어야 한다. 비 이온, 표면 활성 제 쉽습니다 20 ° C 보다 낮은 온도에서 침전 하 고 따라서 버퍼는 높이 온도 보다 20 ° c.에 저장 한다
  2. PAE 바인딩 버퍼의 490 µ L에서 100 µ M 풀0(1014-1015 시퀀스 ~1.0 nmol) 10 µ L를 희석. 95 ° C 10 분 장소에서 물 목욕 세트에 얇은 원심 분리기 튜브에 5 분 동안 얼음에 튜브 수영장0 aliquots (5 × 100 µ L)를 열 고 후 실 온 (25 ° C이이 작품에서)에서 5 분 동안 튜브를 품 어 합니다.
  3. 선택의 첫 번째 라운드: 수영장0 과 DBP−NH2−coated 매체의 부 화.
    1. DBP−NH2−coated 매체의 200 µ L PAE 바인딩 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척. 혼합 DBP−NH2−coated 매체와0 수영장 하 고 가벼운 떨고 아래 1 시간 실 온에서 혼합물을 품 어.
    2. 별도 DBP−NH2−coated 매체 aptamers와 언바운드 DNAs에서에 의해 구속 한 usingan 한 튜브 100 kDa의 분자 잘라. 4 ° c.에서 10 분 동안 9,168 × g에서 매체 PAE 바인딩 버퍼 및 원심 분리기의 500 µ L로 세 번 세척
  4. 선택의 첫 번째 라운드: DBP−NH2−coated 매체에서 aptamer 차입.
    1. 씻어 매체 및 열 떨고 아래 9 분 동안 90 ° C에 혼합물 PAE 바인딩 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.
    2. 한에 의해 eluted DNAs를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다. 세 번 더 바인딩된 DNAs를 복구 하려면이 차입 프로세스를 반복 합니다.
  5. 선택의 첫 번째 라운드: PCR
    1. 작은 규모 PCR
      1. 소규모 PCR23 (4 × 20 µ L aliquots) ~ 15-30을 사용 하 여 수행 주기. PCR 반응24 를 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 6.5 µ L, 10 µ M 뇌관의 1 µ L (FP, 포4-RP, 0.01 nmol), 1.5 µ L eluted 풀 섹션 3.4 (또는 부정적인 컨트롤로 RNase 무료 물), 및 10 µ L의 혼합 반응 혼합물을 포함 하 중 합 효소, 및 2 × PCR 반응 버퍼 (20 m m tris· dNTPs, 뜨거운 시작 HCl, 100 m m KCl, 3 m m MgCl2, pH 8.3).
      2. 다음 설정을 가진 열 cycler를 사용 하 여 PCR을 실행: 95 ° c, 1 분; 1 주기 30의 주기 [95 ° C, 30 s. 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 2 분 및 4 ° c.에서 개최의 1 주기 악기의 15, 20, 25, 확장 단계 20일 s 및 30 주기 일시 중지 키를 눌러 실행 하는, 경우 악기 덮개를 열고, 한 튜브를 타고 PCR 재개를 다시 일시 중지 키를 누릅니다.
      3. 12% 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)25,26준비. 혼합 요소, 초 순수한 물, 10 × 트리 스/붕 소 산의 1 mL 6 mL의 4.8 g/에틸렌 diamine tetraacetic 산 (TBE), 40% 아크릴 3 mL, 10 µ L tetramethylethylenediamine (TEMED), 및 100 µ L 10% 염화 persulfate (AP)의 순서 대로. 잘 저 어을 1.5-2 h 젤 완전히 굳은 되도록 기다립니다.
      4. 사이클 최적화의 결과 분석: 각 PCR 제품의 1 µ L를 결합 하 여 RNA 선적 버퍼 (62.5 %formamide, 0.4 M 포름알데히드, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic 산 버퍼, 0.02% 자일 렌 cyanol FF, 0.02 %bromophenol 파랑)의 5 µ L와 4 µ L의 RNase 무료 물; 10 분 동안 95 ° C에 혼합물을가 열 하 고 신속 하 게 얼음; 0 ° C에 냉각 실내 온도;에 5 분 동안 품 어 12%의 5 별도 우물으로 부하 변성 페이지; 수직 전기 시스템 1 × TBE buffer 170 V 45 분에에서 의해 전기를 실행 합니다.
      5. 전기 이동 법, 얼룩 1 × 핵 산 젤의 3 µ L로 젤 10 분, 1 × TBE 버퍼의 30 mL에 얼룩 그리고 젤의 이미지 후.
    2. 대형 규모 PCR: 원치 않는 부산물 없이 올바른 크기 표시에서 높은 강도 밴드를 생산 하는 사이클의 적절 한 수를 선택 합니다. 대규모 PCR (20 × 100 µ L aliquots) 조건 및 적절 한 수의 사이클 3.5.1 단원에 결정을 활용 하 여 수행 합니다.
      참고: 얻을 수 있는 단일 가닥 라이브러리의 최종 금액은 PCR, 아니라 서식 파일의 농도의 전체 볼륨에 비례 합니다. 일반적으로, 라이브러리의 1 nmol를, 단일 가닥 풀 2 mL PCR 필요 합니다. PCR은 매우 민감하고 외부 DNAs에 의해 쉽게 오염. 오염, 장갑을 끼고, 멸 균된 팁을 사용 하 여, 하지는 튜브에 뱉 고 원심 분리 이전 PCR 튜브의 뚜껑을 열지 않는 등의 기회를 줄이기 위해 조치를 취해야 한다.
  6. 선택의 첫 번째 라운드: 에탄올 강수량으로 PCR 제품의 정화.
    1. PCR 혼합물의 2 개의 튜브를 결합 하 여 하나의 관 (200 µ L 각)으로. 모든 튜브에 대해 이것을 반복 합니다.
    2. 나트륨 아세테이트 (3 M, pH 5.2) 솔루션의 15 µ L, DNA/RNA 강수량 캐리어 솔루션, 4 µ L 및 2.5 배 사전 냉각된 에탄올의 볼륨-20 ° C에서 각 관에 추가 합니다. 균등 하 게 그들을 믹스.
      참고: DNA/RNA 강수량 운반대는에서 널리 이용 에탄올 강수량 실험 크게 낮은 농도에서 DNA/RNA의 복구 비율을 개선 하기 위해. 그것은 PCR 및 시퀀싱과 같은 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 하지 않습니다.
    3. 4 ° C에서 20 분 동안 20,627 × g에서 혼합물을 원심 신중 하 게는 상쾌한 삭제 하 고 백색 침전을 떠나.
    4. 전 강 수를 씻어 각 관으로-20 ° C에서의 에탄올 용액을 냉각 하는 70%의 400 µ L를 추가 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 20,627 × g에서 혼합물을 원심 신중 하 게는 상쾌한 삭제 하 고 백색 침전을 떠나. 두 번 더 세척 단계를 반복 합니다.
    5. 열고 튜브 커버; 녀석이 봉인 막; 투명 한 백색 침전 될 때까지 열 블록에 40 ° C에서 volatilize 에탄올을 하자. -20 ° c.에 침전을 저장
      참고: 순화 된 PCR 제품-20 ° c.에 저장 될 수 있다
  7. 선택의 첫 번째 라운드: λ exonuclease 반응 phosphorylated 역방향 가닥 소화를 수행 하 여 단일 가닥 DNA 생성 (풍부한 풀1세대).
    1. 작은 규모 λ exonuclease 반응
      1. 섹션 3.6에서에서 순화 된 PCR 제품을 포함 하는 1 개의 관에 RNase 무료 물 100 µ L를 추가 합니다. 와 동 튜브를 튜브에 침전을 완전히 해산.
      2. 5 원심 분리기 튜브를 준비 하 고 각 관으로 무료 물, 그리고 2 µ L 10 × 반응 버퍼 (670 m m 글리신-코, 25 m m MgCl2 , 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100 pH 9.4)의 위의 솔루션의 RNase-11 µ L의 5 µ L를 추가 합니다.
      3. 물 또는 희석된 λ exonuclease 포함 된 솔루션 2 U, 5 U, U, 8 및 10 U λ exonuclease이이 튜브에 각각의 2 µ L를 추가 합니다. 잘 부드럽게 pipetting으로 솔루션을 믹스. 10 × 반응 버퍼 공급자 λ exonucleasefrom 함께 제공 됩니다.
      4. 37 ° C, 80 ° C에서 15 분에서 35 분에 대 한 튜브를 품 어 및 4 ° c.에서 개최
      5. 12% 기본 페이지를 준비 합니다. 매우 순수한 물, 10 × TBE, 40% 아크릴, 10 µ L TEMED의 그리고 10%의 100 µ L의 3 mL의 1 mL 6 mL를 혼합 AP, 그 순서 대로. 잘 저 어 하 고 젤 완전히 굳은 것을 보장 하기 위해 60-90 분을 기다립니다.
      6. 5 µ L 각 반응의 염료와 물의 RNase 무료, 4 µ L을 로드 하 고 12% 기본 페이지 (45 분 150 V)의 5 별도 우물으로이 혼합물을 로드의 1 µ L와 결합 하 여 반응의 결과 분석 합니다.
        참고: 20 bp 이중 가닥 DNA 사다리는 젤에 적재 될 수 있다도 하지만 그것은 필요 하지 않을지도 때문에 젤에 PCR 제품 및 생성 된 단일 좌초 라이브러리의 독특한 밴드 쇼.
        참고: λ exonuclease 반응은 우수한 구조 선택도 있다. (반대로 감각 가닥 5' 끝 인산 염 그룹으로 표시 됩니다) 더블-좌초 PCR 제품 꽤 넓은 농도 범위 (그림 4)에서 λ exonuclease의 단일 가닥 도서관으로 완전히 소화 될 수 있다. Λ exonuclease 완전히 작은 규모 λ exonuclease 반응에서 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있는 최소 금액은 대규모 λ exonuclease 반응에도 사용 됩니다. Λ exonuclease의 구조 선택과 제품 수율을 잃지 않고 넓은 농도 범위에서 잘 작동 하는 이후, λ exonuclease의 높은 농도 또한 사용할 수 있습니다. Λ exonuclease 반응 소금의 높은 농도 의해 억제 됩니다. PCR 제품의 불완전 한 소화는 일반적으로 너무 많은 소금을 PCR 제품에서 존재 한 ㄴ 다는 것을 의미 합니다. 에탄올 강수량 (섹션 3.6)에 의해 PCR 제품의 정화 소 프로 파 놀 강수량에 매우 자주에 의해 순화 하는 PCR 제품 너무 많은 소금을 포함 하는 동안 일반적으로이 단계와 호환 됩니다.
    2. 대규모 λ exonuclease 반응: Λ exonuclease 완전히 대규모 λ exonuclease 반응에 대 한 단일 좌초 된 DNAs를 생성할 수 있는 최소 금액을 선택 합니다. 반응 비율이 조건에 따라 축척 됩니다. 예: 2 U λ exonuclease 필요한 최소 금액 인 경우에, 혼합 Rnase 무료 물 38 µ L, 버퍼 x 10의 10 µ L, DNA 풀1 의 50 µ L, 2 µ L 10 U / µ L λ exonuclease의.
  8. 선택의 첫 번째 라운드: 에탄올 강 수에 의해 단일 가닥 풀1 의 정화.
    1. 3.6 단계의 지시를 따릅니다.
    2. 농도 260에 UV 흡수에 의해 풀1 정화 결정 nm.
    3. PAE 바인딩 버퍼의 적절 한 볼륨에 90% 정화 풀1 reconstitute 선택의 다음 라운드에 대 한 얻은 충분 한 DNA 없는 경우 섹션 3.5 3.8.2 반복 합니다.
      참고: PAE 바인딩 버퍼의 볼륨 보통 다릅니다 200에서 500 µ L 도서관과 SELEX의 다음 라운드에서 라이브러리의 원하는 최종 농도의 양에 따라.
  9. 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 SELEX의 라운드.
    1. 셋째, 넷째, 두 번째, 실시 그리고 ~ 300 pmol 라이브러리 선택 엄중을 증가 하기 위하여 입력 했다를 제외 하 고 동일한 절차를 수행 하는 이후 SELEX의 다섯 번째 라운드 (섹션 3.2-3.8), 위에서 설명한.
    2. 매체에 DNAs의 일반적인 흡수를 최소화 하기 위해 세 번째에서 30 분 동안 회전 통에 수정 되지 않은 매체와 수영장을 품 어 그리고 DBP−NH2−coated 매체를 가진 외피 이전 선택 4 라운드.
      참고: SELEX 프로세스 때문에 젤으로 마이그레이션할 않았다 높은 분자량 제품의 다량에 의해 밝혀 DNAs 사이 심각한 crosslink 다섯 번째 라운드에서 종료.

4. 높 처리량 연속

  1. 호환 뇌관으로 PCR 증폭에 의해 풀4 섹션 3.9.2에서에서 시퀀싱 준비.
    1. 디자인과 합성 6 인덱싱된 앞으로 뇌관 순서 분석을 촉진 하기 위하여 5 ' 끝에 nt.
      앞으로 뇌관 (FP-시퀀싱) 색인: 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. 1000 µLPCR 반응을 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 380 µ L, 각 10 µ M 뇌관의 50 µ L (FP-시퀀싱, 포4-RP, 0.5 nmol), eluted 풀 섹션 3.9.2에서 20 µ L 고의 500 µ L dNTPs를 포함 하는 반응 혼합물을 혼합, 뜨거운 시작 하는 중 합 효소 그리고 2 × PCR 반응 버퍼. 약 수 10 PCR 튜브로 혼합물입니다. 3.5.1.2 섹션에 설명 된 대로 동일한 PCR 상태를 사용 합니다.
  2. 시퀀싱 시설 요구 사항에 맞게 PCR 제품을 정화. 예를 들어, 제조업체의 지침에 따라 페이지 젤 DNA 복구 키트를 사용 하 여.
  3. 시퀀싱 시설에 필요한 운송 조건 하에서 시퀀싱 시설 정화 PCR 제품 (~ 2 µ g)를 보냅니다. 예를 들어 철저 하 게 시퀀싱 시설에 얼음 팩으로 밀봉 하는 모자와 원심 분리기 튜브에 PCR 제품 배.
    참고: 시퀀스 시퀀스 된 수영장의 농축을 평가 하기 위해 각 시퀀스의 복사본 수에 따라 평가 결과 받았다. 최고 시퀀스 DBP-1 선정 됐다 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). 그것의 친 화력 및 선택 다음 프로토콜 (섹션 5, 6)에 의해 측정 되었다. 전기 화학 바이오 센서에 응용 프로그램의 이후 섹션 7에서에서 시연 했다.

5. Kd 결정의 선정 Aptamer 후보자 Magnetic Bead-Based 정량 PCR (정량)를 사용 하 여

  1. DBP-1-정량과 표준 phosphoramidite 화학을 사용 하 여 뇌관 synthesize 하 고 표준 HPLC에 의해 그것을 정화.
    Aptamer 후보 (DBP-1-정량): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    앞으로 정량 (FP-정량)에 대 한 입문서: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    반전 뇌관 정량 (라인란트-정량)에 대 한: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    참고: 테스트 시퀀스의 뇌관 지역 수영장0 섹션 3에서에서 사용 된 그들에서 다르다. 뇌관 지역 변경의 목적은 혼자, 뇌관 영역을 제외한 핵심 시퀀스의 선호도 테스트 하는.
  2. DBP NH2 carboxylic 산 코팅 자석 구슬 제조 업체의 지침에 고정
    1. 워시 25 m m 2-(N-morpholino)로 두 번 carboxylic 산 코팅 자석 구슬 ethanesulfonic 산 (MES) (pH 5.0)를 사용 하 여 자석 구슬 (100 µ L)의 동일한 볼륨 pipetted 유리병, 중 (이상 끝 또는 이와 유사한) 좋은 혼합과 10 분.
    2. 즉시 사용 하기 전에, 50 mg/mL 찬 25 mM MES (pH 5.0)와 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 솔루션의 준비.
    3. 즉시 사용 하기 전에, 50 mg/mL 찬 25 mM MES (pH 5.0)와 N-hydroxysuccinimide (NHS) 솔루션의 준비.
    4. 씻어 구슬 100 µ L의 EDC 솔루션 및 보 건국 솔루션의 100 µ L를 혼합 하 고 느린 기울기 회전 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    5. 부 화 후 4 분에 대 한 자석에 튜브를 넣어, 상쾌한, 삭제 하 고 구슬 찬 25 mm MES (pH 5.0) 100 µ L로 두 번 세척.
    6. 100 mM DBP NH2 재고 솔루션 및 느린 기울기 회전 5 rpm에서 실내 온도에 또는 4 ° C에서 2 시간 30 분 이상에 대 한 회전에서 활성화 된 구슬 25 m m MES (pH 5.0, 290 µ L) 6 µ L를 품 어.
    7. 부 화 후 4 분에 대 한 자석에 튜브를 넣어 고는 상쾌한 삭제. 워시 코팅된 구슬 4 번와 PAE 바인딩 버퍼 및 상점 4 ° C에서의 200 µ L와 구슬 사용까지 resuspend.
  3. Kd를 결정 하기 위해 적정 곡선을 수집 합니다.
    1. 300에 1 오후에서 PAE 바인딩 버퍼에 다양 한 농도에서 DBP-1 솔루션 (500 µ L)의 시리즈를 준비 nM.
    2. DBP NH2의 10 µ L 추가-자석 구슬 각 DBP-1 솔루션 5.2.7 섹션에 설명 된 대로 코팅. 회전에서 실 온에서 1 h에 품 어.
    3. 4 분에 대 한 자석에 튜브를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. 씻어 4 번을 사용 하 여 PAE 바인딩 버퍼의 200 µ L 구슬.
    4. 각 튜브를 PAE 바인딩 버퍼의 60 µ L를 추가 합니다. 자기 분리에 의해 eluted DBP-1를 포함 하는 상쾌한 95 ° C 15 분 수집에서 튜브를 품 어. 복구 더 바인딩된 DBP-1 하이 차입 과정을 반복 합니다.
    5. 약 elute 솔루션을 희석 하 고 실시간 정량 pcr 3 µ L. 정량 Pcr 반응에 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 3 µ L, 10 µ M 뇌관의 2 µ L (FP, 포4-RP, 0.01 nmol), 3 µ L의 eluted DBP-1, 희석 및 10 µ L의 혼합 dNTPs, 중 합 효소, 및 2 x PCR 반응 버퍼를 포함 하는 반응 혼합물.
    6. 정량 Pcr 열 cycler를 사용 하 여 다음 설정으로 실행 하 여 각 샘플에서 DBP-1의 숫자를 결정: 95 ° C, 30의 1 사이클 s; 30의 주기 [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 30 s 및 4 ° c.에서 개최의 1 주기
    7. 적정 곡선을 플롯 하 고 1:1 바인딩 비율27가정 곡선의 비선형 피팅 하 여 Kd 를 결정 합니다.

6. 상대적 선호도 및 경쟁 분석 실험에 의해 특이성 시험

  1. DBP NH2의 10 µ L 추가-자석 구슬 DBP-1 솔루션 (500 µ L, 1 µ M) 코팅. 회전에서 실 온에서 1 h에 품 어. 4 분에 대 한 자석에 튜브를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. 4 번 PAE 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 구슬을 세척 하 고 PAE 바인딩 버퍼의 10 µ L에서 resuspend.
  2. DBP NH2의 10 µ L를 추가-각 10 µ M의 110 µ L DBP 1 코팅된 중간 연결 테스트 샘플 (DBP-NH2, DBP, DEHP, 부 틸 벤 질 phthalate(BBP), 중 금속 이온, 등.) 자기 분리에 의해 1 h. 수집에 상쾌한에 대 한 실 온에서 품 어.
  3. 약은 상쾌한을 희석 하 고 정량 정량화에 대 한 3 µ L. 정량 Pcr 반응에 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 3 µ L, 10 µ M 뇌관의 2 µ L (FP, 포4-RP, 0.01 nmol), 3 µ L의 eluted DBP-1, 희석 및 10 µ L의 혼합 dNTPs, 중 합 효소, 및 2 x PCR 반응 버퍼를 포함 하는 반응 혼합물.
  4. 정량 Pcr 열 cycler를 사용 하 여 다음 설정으로 실행 하 여 각 샘플에서 DBP-1의 숫자를 결정: 95 ° C, 30의 1 사이클 s; 30의 주기 [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 30 s 및 4 ° c.에서 개최의 1 주기
  5. DBP-1 샘플의 구슬에서 DBP-1 PAE 바인딩 버퍼에 비즈에서 출시 수 출시의 수를 나누어 상대적 선호도 계산: 상대적 선호도 N샘플/N버퍼=.

7. 제조 및 DEHP 전기 화학 바이오 센서의 전기 화학 측정

  1. Thiolated 코어 시퀀스 (HS-DBP-1)과 표준 phosphoramidite 화학을 사용 하 여 신호 감지기 (DBP-1-C-Fc) synthesize 하 고 표준 HPLC에 의해 그것을 정화.
    HS-DBP-1: 5'-HS-(CH2)6-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3 '
    DBP-1-C-Fc: 5'-GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc-3 '
    참고: 센서 프로브의 합리적인 디자인은 우리의 이전 pbulications18,22에 설명 했다.
  2. HS-DBP-1 및 DBP-1-C-Fc 100 µ M, aliquot에서 nuclease 무료 학년 물에서 다시 구성 하 고-20에서 그들을 저장 또는 최대 1 년-80 ° C.
  3. 신중 하 게 5 분 동안 microcloth에 1, 0.3, 0.05 µ m Al2O3 가루와 거울 같은 표면에 금 전극 폴란드어 그리고 초순 잔여 Al2O3제거 5 분에서 그것을 sonicate. 다음 1.2 V 0.4에서 35 연속 순환 voltammetry (CV) 검사와 전기 화학 연마 하 여 전극을 청소 (Hg Hg2대 등4) 0.5 M H2에서 100 mV/s 등4 .
  4. 0.5 µ M의 HS-DBP-1과 0.5 µ M의 혼합물 준비 DBP-1-C-Fc 100 µ L 10 m m 인산 염 버퍼 1 M NaCl, pH 7.4 (PBS)를 포함 하. 10 분 동안 95 ° C에 물 목욕 세트에 얇은 원심 분리기 튜브에 혼합물을가 열 하 고 천천히 실내 온도에 혼합물을 냉각 하십시오.
  5. 혼합물으로 트리 스-(2-carboxyethyl) phosphine 염 (TCEP, 10 m m, 재고 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실내 온도에서 보관.
  6. 12 h, 위의 솔루션에 깨끗 한 금 전극을 담가 또는 실 온에서 하룻밤.
  7. PBS 가진 전극 헹 구 고 담가 1 m m [(채널2)2(그리고2채널2)6및3]2 전극 (HS 예6-오메) 1 헤에 대 한 PBS에 전극 PAE를 사용 하 여 철저 하 게 린스 버퍼 바인딩 및 PAE 바인딩 버퍼에 전극을 담가.
  8. 대상 무료 PAE 바인딩 버퍼에서 백그라운드 구형 파 voltammetry (SWV) 검색을 가져가 라.
    1. 모든 실험 장비 청소: 전해 셀, 골드 작업 전극, 플래티넘 카운터 전극, 및 포화 calomel 참조 전극 (SCE).
    2. 설치 된 소프트웨어; SWV 측정에 대 한 실험적인 매개 변수를 설정 합니다.
      참고: 다음 실험 매개 변수 SWV 실험을 위해 사용 되었다: 잠재적인 범위: 0.7 V; 하-0.2에서 진폭 변조: 25 mV; 펄스 폭: 5 ms; 스캔 속도: 50 mV/s; 잠재적인 단계: 1 mV.
    3. 골드 전극, 플래티넘 카운터 전극과 SCE는 potentiostat를 작업을 연결 하 고 PAE 바인딩 버퍼를 포함 하는 전해에 넣어 이들 3 개의 전극.
    4. SWV 측정을 실행 합니다.
      참고: 한 번 SWV 측정 시작 SWV 곡선 됩니다 컴퓨터의 화면에 표시. 검사 검사는 일정 하 고 피크 높이 또는 모양에 더 변경 관찰 때까지 반복 됩니다.
  9. 담가 DEHP의 특정 농도 포함 하는 PAE 바인딩 버퍼에 작업 전극 (예를 들어, 10 오후) 실 온에서 30 분. 전극 PAE 바인딩 버퍼를 사용 하 여 철저 하 게 헹 구 고 담가 PAE 바인딩 버퍼 카운터 전극과 SCE 전극. 7.8 섹션에 설명 된 대로 동일한 조건 하에서 SWV 곡선을 수집 합니다.
  10. 제외 하 고 반복 단계 7.9, DEHP의 농도 (예를 들어 100 오후, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ M) 순차적으로 증가 했다. 적정 곡선을 플롯.
  11. 특이성 테스트: 제외 하 고는 DEHP를 포함 하는 PAE 바인딩 버퍼 PAE 바인딩 버퍼 원하는 농도에서 잠재적인 간섭 물질을 포함 하 여 대체 7.3-7.9, 단계를 반복 합니다.

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Representative Results

우리는 설계 및 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH2) 앵커 대상 (그림 1 층)으로 합성. 우리는 다음 PAEs 클래식 대상 immobilization 기반 방법 (그림 2)에 따라는 DBP NH2 앵커 대상으로 사용 하 여 DNA aptamer 선택을 수행 합니다. 각 라운드에서 파일럿 PCR PCR (그림 3)의 주기 수를 최적화 하는 변성된 페이지를 사용 하 여 수행 되었다. 변성된 페이지, 기본 페이지 대신이 우리와 다른 동료 들을 발견 했다 높은 사이클 숫자에서 네이티브 젤에 의심 되 고 분자량 부산물 실제로 가교 복합물에 의해 형성 하기 때문에 좋습니다. 적당 한 크기의 시퀀스입니다. 따라서, 변성된 페이지의 밴드 강도 진정으로 올바른 제품의 금액을 반영할 수 있습니다. 단일 좌초 DNA 세대는 또 다른 중요 한 단계, 그리고이 단계에 대 한 많은 방법이 보고28. Λ exonuclease 소화 방법은 가장 저렴 한 방법입니다. 단일 가닥 DNA 생성의 성공 기본 페이지, PCR 제품으로 표시 되어 편리 하 게 확인할 수 있습니다 (SELEX의 처음 몇 라운드) 단일 또는 다중 밴드, 소화 (그림 4) 후 표시 되는 하나의 밴드.

(어떤 점에서 DNAs는가 열 2 × TBE-포함 된 8.3 M 요소에 10 분 동안 95 ° C에) 변성 치료 후에 페이지의 상단에 축적 하는 DNA의 중요 한 양 때문에 선택의 다섯 번째 라운드 후는 SELEX 중지 는 DNAs 사이 심각한 cross-linking 제안 하 고 또한 표시 시퀀스 농축 했다. 따라서, 수영장4 높은 처리량 시퀀싱에 대 한 발송 되었다. 높은 처리량 결과 시퀀스를 가장 자주 발생 하는 최고 100 높은 보존 했다 고 한 가족에서 했다 보여주었다. DBP-1 최고 시퀀스 표시 nanomolar 선호도 (그림 5)와 좋은 그룹-특이성 PAE congeners (DBP, BBP, DEHP) (그림 6) 편리한 정량 분석 실험, 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 통해.

DBP 1 가닥 변위 기반의 전기 aptasenor를 적절 하 게 구성 하는 데 사용 되었습니다 우리의 이전에 보고 된29일. DEHP 센서 과민 하 게 그리고 선택적으로에 응답할 수 DEHP (그림 7). 중 금속 이온, 항생제, 및 유사한 기능 그룹을 가진 작은 분자와 같은 일반적인 환경 오염 물질 DBP-1에 매우 약한 반응을 보였다.

Figure 1
그림 1: (A) PAEs, BBP (B), (C) DBP, DEHP, (E) 4-오-DEHP, (F) DBP−NH2의 (D)의 화학 구조. 이 그림 한 영 외 에서 허가로 증 쇄 되는 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 그룹-특정 DNA aptamer 선택 절차 PAEs DBP NH2 를 사용 하 여 앵커 대상으로. 이 그림 한 영 외 에서 허가로 증 쇄 되는 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표 변성된 페이지를 사용 하 여 PCR 주기 최적화에서 결과. 왼쪽에서 오른쪽, 레인 대표: 20 bp DNA 사다리 표준, 15 사이클 (DNA 서식 파일), 20 주기 (DNA 서식 파일), 25 사이클 (DNA 서식 파일), 30 사이클 (DNA 서식 파일), 15, 20 주기, 25 주기, 주기와 30 주기. 최적의 조건은 단일 제품 밴드 있던 원치 않는 부산물 없이 고 강도에 또한, 밴드 없음 해당 하는 빈 컨트롤에서 관찰 되었다 25 주기에서 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: phosphorylated 가닥 기본 페이지를 사용 하 여 소화 λ exonuclease 반응의 최적화. 왼쪽에서 오른쪽, 레인 대표: 20 bp DNA 사다리, 네거티브 (λ exonuclease 제외), 2U, 5U, 8U, 표준과 10U. 효소의 최소 금액 이중 PCR 제품 되 단일 좌초 된 DNAs 2U에서 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 정량 기반 분석 실험에 의해 DBP-1의 선호도 측정. Kd 의의 오차 (표준 편차, SD) 동일한 샘플의 3 측정에서 산출 되었다. 이 그림 한 영 외 에서 허가로 증 쇄 되는 22

Figure 6
그림 6: 무료 DBP NH2 (10 µ M), DBP DBP-1의 상대적 선호도 측정 (10 µ M), DEHP (10 µ M), 비트 (10 µ M), 초 산 에틸 (10 µ M), 벤조산 (10 µ M), phthalic 산 (10 µ M), 및 경쟁 분석을 통해 기타. 기타: 혼합 10 µ M에서 모든 잠재적인 방해 (포도 당, 대, 암 피 실린, 및 에탄올)의. 비율 (상대적 선호도) aptamers 샘플의 구슬에서 발표 aptamers PAE 바인딩 버퍼에 구슬에서 발표의 수로의 수를 나누어 계산 됩니다. 바 대표 평균 ± sd. SDs는 3 개의 개별 측정에서 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: DEHP 磁 및 ultraselective DEHP의 검출을 위한 전기 화학 바이오 센서: 메커니즘 (A), SWV 곡선 (B), 보정 곡선 (C), 및 선택도 테스트 (D). 오류 (SDs)는 3 개의 개별 측정에서 계산 했다. 이 그림 한 영 외 에서 허가로 증 쇄 되는 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Aptamers의 뛰어난 이점 중 하나입니다 vivo에서 immunoreactions를 통해 항 체를 생성 하는 동안 그들은 체 외에서 방법을 SELEX 통해 식별 됩니다. 따라서, 항 체는 생리 적 조건에 제한 하는 반면 aptamers 잘 설계 된 실험 조건에서 원하는 대상으로 선택할 수 있습니다.

무료 시퀀스에서 바운드 시퀀스의 분리를 촉진 하기 위하여 몇 가지 수정 된 SELEX 최근 보고 되었습니다, 어떤 모 세관 전기 이동 법30, 마이크로31, 자석 / 아크릴 구슬 / agarose 구슬14, 등, nitrocellulose 필터 또는 선호도 열 보다 효율적인 분리를 달성을 대체 했다. 이러한 기법 중 구슬 기반 방법을 가장 널리 사용 된 aptamer 선택 때문에 그들의 간단한 작은 분자 목표의 설정, 쉬운 가동, 그리고 작은 분자 분석 의무가 되 고.

작은 분자 대상 aptamer 선택에 일반적으로 사용 되는 방법의 두 그룹이 있다: 대상13 및 라이브러리14 immobilization 기반 방법. 방법의 전 그룹, 작은 분자 목표는 기능성된 자석 구슬 또는 공유 결합 반응을 통해 agarose 구슬 같은 단단한 단계에 움직일 수 있습니다. 라이브러리는 작은 분자 코팅 구슬, 알을 품을 하 고 그 시퀀스를 바인딩할 하지 않거나 약하게 대상에 단단한 단계에 바인딩할 세척 및 원심 분리 또는 자력 분리 단계 수행 하 여 제거 됩니다. 바운드 시퀀스는 연속적으로 eluted 그리고 PCR에 의해 증폭 된다. 작은 분자 표적 이상의 기능 그룹 커플링 반응에 사용할 수 있어야 합니다. 그 적당 한 기능 그룹 없이, 기능 그룹 유기 합성을 통해 원래 목표에 통합 될 수 있다. 신중 하 게 설계 된 대상의 합성 여러 단계를 포함할 수 있었다 고 때로는 또한 매우 도전 이다. 대상의 구조적 수정 수 바인딩 사이트와 그들의 aptamers와 선호도도 강력 하 게 영향을 미칩니다. 이러한 문제를 방지 하려면 라이브러리 immobilization 기반 방법은 개발 되었다, 도서관을 보완 때 교배는 DNA 캡처 자성 구슬에 프로브 그리고 바인딩 시퀀스는 목표와 바인딩 따라 구슬 떨어지. 방법의이 그룹에 대상 바인딩 버퍼에 추가 되 고 기능 그룹이 필요 합니다. PAEs는 프 탈 산의 에스테 르 유도체 그리고 일반적인 PAE 프 탈 산 에스테 르 그룹 및 하나 또는 두 개의 알 킬 체인 (그림 1A-D) 이루어져 있다. PAEs 단단한 단계 동원 정지에 사용할 수 있는 기능 그룹이 있다. 따라서, 라이브러리 immobilization 기반 방법 PAEs aptamer 선택에 대 한 더 매력적인 것.

잘 제어 된 분산 상태 SELEX 통해 도서관의 원하는 농축을 보장 하기 위해 중요 하다. 그러나, PAEs는 매우 소수 고 쉽게 분산을 촉진 하기 위하여 여러 계면의 존재도 여러 µ M 보다 높은 농도에서 수성 해결책에서 집계를 형성 한다. 따라서, PAEs의 분산 상태 제어 하기 어렵다 그리고 그것은 특히 개별 PAE 분자에 묶는 aptamers 선택 하기 어려운 것. 가용성 문제를 해결 하려면 대상-동원 정지 방법 공유 결합을 통해 친수성 구슬에 움직일 수 있었다 어떤 PAEs에 선정 됐다. 이 동원 정지 전략을 사용 하 여 대상 집계 대신 단일 분자 상태에서 비드 표면에 대부분 존재 해야 합니다.

앵커 대상의 구조적 디자인 그룹-특정 aptamers의 성공적인 선택에 대 한 매우 중요 한 이기도합니다. 세 가지 요소는 구조 설계에 대 한 고려 필요. 첫 번째 요인은 aptamer 선택의 목적입니다. 그룹 전용 aptamers 선택의 목적을 고려 하면 aptamer 바인딩 PAEs의 일반적인 그룹을 노출 하 고 aptamer 바인딩에 참여에서 부품의 나머지를 방지 필수적 이다. 따라서, 기능 그룹 사이드 체인의 터미널에 도입 되어야 합니다. 처음부터, 우리는 오 기능성된 DEHP (4-OH−DEHP) (그림 1E) 앵커 대상으로 설계 하 고 carboxylic 산 자석 구슬16에 그것을 움직일 수 있습니다. 따라서, 알 킬 체인 행렬의 표면에 노출 되었다. 단단한 매트릭스로 자석 구슬 carboxyl 그룹을 선택 하 여 보았습니다. 분명 한 선호도 개선의 선택, 5 라운드 후 관찰 되었다 그리고 맨 매트릭스에 일반적인 흡수 강한 유지 했다.

따라서, DBP-NH2 다음과 같은 생각에 따라 설계 나중 되었다: (1) 탈 그룹은 π-π 스택 및 알 킬 체인; 보다 수소 결합을 통해 aptamer 구체적으로 작용할 확률이 (2) 보 건국 중재 carbodiimide 반응과 온화-NH2 DBP;의 알 킬 체인의 끝에 도입 하는 그래서 매우 효율적인 커플링 효율을가지고 (3) 그것은 단단한 단계의 파티션으로 자석 구슬 운영 하 게 쉬운 하지만 라이브러리의 일반적인 흡착 강하다. 분리 하는 동안 agarose 구슬의 손실 자석 구슬 보다 높은 이지만, 라이브러리의 일반적인 흡착 훨씬 낮습니다. 따라서, DBP-NH2 에폭시 활성화 agarose 구슬에 움직일 했다 그리고 phthalic acidester 그룹은 모 체의 표면에 노출 되었다.

선택의 다양 한 가용성을 가진 작은 분자 표적을 위해 특히 중요 하다. 바인딩 버퍼 집계를 피하기 위해 전체 aptamer 선택 및 특성화 과정 아빠의 좋은 분산 상태를 확인 하는 신중 하 게 준비 해야 합니다. 우리의 연구에서 우리는 DEHP 두 가지 레이어를 계면 활성 제 없이 정규 버퍼에 녹 수는 다는 것을 발견. 레이어는 최적화 된 수량에 여러 계면의 추가 따라 사라집니다. 명확한 솔루션의 상태를 유지 하기 위해 20 ° C 보다 높은 온도에서 저장 될 필요가 있다. 자세한 내용은 프로토콜 단계 3.1에서에서 제공 됩니다.

더블-좌초 PCR 제품에서 단일 가닥 DNA 생성 SELEX 과정에 하나의 중요 한 단계입니다. 여러 가지 다른 방법은 현재는 문학32,33, 변성 시키기 의해 비대칭 PCR, λ exonuclease 소화, streptavidin 입히는 구슬 자석 분리 및 크기 분리를 포함 한 설명 되었습니다. 요소-polyacrylamide 젤입니다.

다른 방법을 그들의 자신의 강 약점 있다. 현재, ssDNA의 세대에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법은 streptavidin 입히는 구슬 자석 분리 이다. 이 방법의 뛰어난 장점은 그것의 시간-절약 및 간단한 작업입니다. 단점은 다른 방법에 비해 높은 비용입니다. 반면, 크기 분리 기반 방법, 역방향 뇌관을 사용 하 여 GC 풍부한 줄기-루프 구조 함께입니다 가장 저렴 한 방법 중 하나 단일 가닥 DNA의 수익률은 이러한 방법을32중 최저. 이 프로토콜에서 우리는 가장 저렴 한 방법 중 하나는 단일 가닥 DNA를 생성 하 λ exonuclease 소화의 사용 설명. 우리는 단일 가닥 DNA의 수익률은 자력 분리와 streptavidin 입히는 구슬의 두 가지 방법으로 비교 발견. 또한, 우리는 소금의 높은 농도 의해 exonuclease 반응 저해 했다 발견. 문학33 에 PCR 제품의 불완전 한 소화가 했다 PCR 제품에서 존재 하는 너무 많은 소금으로 인해. 또한, λ exonuclease은 매우 적극적이 고 저렴 한 (그림 4).

특성화 및 검증 aptamers 힘 드는, 시간이 걸리는, 이며 aptamer 디스커버리 파이프라인33에서 주요 병목을 구현. 대부분 기술은 큰 aptamer 바인딩 파트너를 위해 잘 작동 하는 질량 구분 방법 (> 10000 amu), 하지만 충분히 낮은 분자량 목표와 상호 작용을 측정 하는 구분 하지 않습니다 (< 1000 amu)15. 특성화 및 검증 aptamers PAEs 같은 소수 작은 분자의 훨씬 더 어렵습니다. 그들의 빈약한 물 가용성 솔루션에서 Kd의 결정을 방지 하거나 표면에 aptamers 움직이게 적정 곡선의 unsaturation에서 발생 합니다. 따라서, 우리 immobilizing DBP NH2 용 해도 문제를 방지 하려면 친수성 자성 구슬에 의해 높은 처리량 연속 식별된 aptamers의 Kds 결정. 상대적 선호도 및 다른 PAEs에 aptamers의 선택 다음 경쟁 분석 실험에 의해 결정, aptamer 후보 DBP NH2 미리 경계 했다 자석 구슬 연결 되었고 외피에 상쾌한에 발표 테스트 PAEs 또는 다른 잠재적으로 방해 하는 물질. 경쟁 분석 결과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹이 했다 PAEs 중 손쉬운 선호도 비교를 제공 하기 때문에 적용 되었다. 또한, 자석 구슬 기반 형광 분석 실험은 작은 분자 aptamer 상호 작용34의 선호도 연구에 적합 합니다. 그러나, 우리는 자석 구슬 가끔 알 수 없는 이유로 형광 냉각 원인 발견. 따라서, 정량 분석 실험 선호도 측정을 위해 사용 되었다.

이 연구에서 설명 하는 전기 화학 바이오 센서에 대 한 하나의 중요 한 기술 팁35전극 표면 패 시 베이 션 이다. DEHP의 높은 hydrophobicity 인 nonspecifically 검출의 실패에 이어지는 골드 전극에 흡수 될 수 있는 강한 경향이 있다. 가장은 일반적으로 표면 보호막 처리 에이전트, 6 mercapto 1 hexanol (MCH)36,37을 사용, 우리는 HS-(CH2)2-[OCH2CH2 발견 동안 DEHP의 일반적인 흡수를 방지 하기 위해 충분 하지 않습니다. ]6-그리고3 DEHP38의 민감한 감지 충분히 효과적 이었습니다.

이 절차는 전기 화학 바이오 센서에 매우 소수 작은 분자의 그룹-특정 DNA aptamers 및 선택한 aptamer의 응용 프로그램을 선택 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 선택과 수 고 뿐만 아니라 높은 소수 작은 분자의 센서 개발에 통찰력을 제공 합니다. Aptamer 선택 과정 대상 immobilization 기반 방법의 범주에 속한다. 이 유형의 방법의 한계는 또한이 프로토콜, 예를 들어 앵커 목표의 복잡 한 합성에 대 한 필요성 및 aptamer 바인딩에 단단한 단계에 미치는 영향에 대 한 존재합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 전기 화학 바이오 센서의 매력적인 장점은 그들의 단순한 설계 및 높은 감도 포함 합니다. 주요 단점은 그들의 매우 넓은 동적 범위로 인해 그들의 제한 된 정밀도입니다. 따라서, 여기에 설명 된 바이오 센서는 더 테스트 대상의 양적 측정 대신 심사 적합 합니다.

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Disclosures

저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 국립 자연 과학 재단 (21675112), 베이징 교육 위원회 (KZ201710028027)와 Yanjing 젊은 학자 프로그램의 수도 사범 대학의 과학 및 기술 계획의 프로젝트에서에서 재정 지원에 대 한 감사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

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References

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화학 문제 133 Aptamer 선택 phthalic 산 에스테 르 그룹별 소수 작은 분자 정량적 중 합 연쇄 반응 전기 화학 aptasensor 지속적인 유기 오염 물질
Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램
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Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).

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