Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Ftalsyra Ester-bindande DNA Aptamer urval, karakterisering och för att en elektrokemisk Aptasensor

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll för in vitro- urval och karakterisering av gruppspecifika ftalsyra ester-bindande DNA aptamers presenteras. Tillämpningen av den valda aptamer i en elektrokemisk aptasensor ingår också.

Abstract

Ftalsyra estrar (PAEs) areone för de stora grupperna av långlivade organiska föroreningar. Gruppspecifika detektion av PAEs är mycket önskvärt på grund av den snabbt växande kongeners. DNA aptamers har använts alltmer som erkännande element på biosensor plattformar, men välja aptamers mot starkt hydrofoba småmolekylära mål, såsom PAEs, rapporteras sällan. Detta arbete beskriver en pärla-baserade metod utformad för att välja gruppspecifika DNA aptamers att PAEs. Den amino gruppen functionalized dibutylftalat (DBP-NH2) som ankare målet var syntetiseras och orörlig på epoxi-aktiverat agaros pärlor, vilket möjliggör visning av ftalsyra ester gruppen vid ytan av immobilisering matrisen, och därför valet av de gruppspecifika bindemedel. Vi utifrån kvantitativa polymerisation kedjereaktion tillsammans med magnetisk separering dissociation konstanterna aptamer kandidater. Den relativa tillhörighet och selektivitet i aptamers till andra PAEs bestämdes av de konkurrenskraftiga analyserna, där aptamer kandidaterna var pre avgränsas till DBP-NH2 fäst magnetiska pärlor och befriaren till supernatanten vid inkubation med de testade PAEs eller andra potentiellt interfererande substanser. Konkurrenskraftiga analysen tillämpades eftersom det gav en lättköpt affinitet jämförelse bland PAEs som hade inga funktionella grupper för surface immobilisering. Slutligen, vi visade tillverkning av en elektrokemisk aptasensor och använde den för ultrasensitive och selektiv påvisande av bis(2-ethylhexyl) ftalat. Detta protokoll ger insikter för aptamer upptäckten av andra hydrofoba små molekyler.

Introduction

Tillsammans med snabb ekonomisk utveckling är acceleration av industrialisering och stadsbyggnad, miljöföroreningar allvarligare än någonsin. Typiska miljögifter inkluderar tungmetall joner, toxiner, antibiotika, bekämpningsmedel, hormonstörande ämnen och långlivade organiska föroreningar (pop). Förutom metalljoner och toxiner, andra föroreningar är små molekyler som ganska ofta består av en mängd olika kongener. Till exempel de giftigaste dyker inkludera polycykliska aromatiska kolväten (PAH), polyklorerade dibenso-p-dioxiner (PCDD), polybromerade bifenyler etrar (PBDE), polyklorerade bifenyler (PCB), polyklorerade dibensofurankongener (PCDF), och ftalsyra syra estrar (PAEs)1,2, som alla består av många kongener. Liten molekyl upptäckt har huvudsakligen utförts av chromatography/mass spectrometry-baserade tekniker på grund av sin mångfald av program3,4,5,6. För hotellets upptäckter, har antikroppsbaserade metoder nyligen varit utvecklade7,8,9. Men eftersom dessa metoder är mycket specifika för en viss kongen, måste flera tester utföras. Allvarligare är att de nya kongenerna växer så fort att deras antikroppar inte kan genereras i tid. Därför kan utvecklingen av gruppspecifika biosensorer att övervaka de totala nivåerna av alla kongener i ett test ge en ovärderlig metriska för bedömning av miljöföroreningar.

Nyligen, nukleinsyra aptamers har tillämpats allmänt erkännande element i olika biosensing plattformar på grund av deras förmåga att känna igen en mängd olika mål, från joner och små molekyler till proteiner och celler10,11 ,12. Aptamers identifieras genom en in vitro- metod kallas systematisk utveckling av ligander av exponentiell anrikning (SELEX)13,14. SELEX börjar med slumpmässiga syntetiska enda strand oligonukleotiden biblioteket, som innehåller cirka 1014-1015 sekvenser. Storleken på slumpmässiga biblioteket garanterar mångfalden av RNA eller DNA kandidat strukturer. Den typiska SELEX-processen består av flera rundor av anrikning tills biblioteket är berikad i sekvenser med hög affinitet och specificitet till målet. Slutliga berikad poolen sedan sekvenseras och den dissociation konstanter (Kd) och selektivitet mot potentiella störande ämnen bestäms av olika tekniker såsom filtrera bindande, affinitetskromatografi, yta Plasmon resonans (SPR), etc. 15

På grund av det extremt dåliga vattenlöslighet och funktionella grupper för surface immobilisering är aptamer dyker teoretiskt svårt. Betydande framsteg för SELEX har snabbat upp upptäckten av aptamers. Men har urvalet av gruppspecifika aptamers för POPs ännu inte har rapporterats. Bara PCB-bindande DNA aptamers med hög specificitet för en viss kongen har hittills varit identifierade16. PAEs används främst i polyvinylklorid material, ändra polyvinylklorid från en hård plast till en elastisk plast, vilket fungerar som en mjukgörare. Vissa PAEs har identifierats som hormonstörande ämnen, kan orsaka allvarliga skador till lever- och njurfunktion, minska motiliteten av manliga spermier, och kan resultera i onormal spermiernas morfologi och testikelcancer17. Varken förening- eller gruppspecifika PAE-bindande aptamers har rapporterats.

Målet med detta arbete är att tillhandahålla ett representativt protokoll för att välja gruppspecifika DNA aptamers till starkt hydrofoba små molekyler som PAEs, en representativ grupp av långlivade organiska föroreningar. Vi visar även tillämpningen av den valda aptamer för miljöföroreningar upptäckt. Detta protokoll ger vägledning och insikter för aptamer upptäckten av andra hydrofoba små molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bibliotek och Primer Design och syntes

  1. Designa den inledande bibliotek och grundfärger.
    Bibliotek (Pool0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Vidarebefordra primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforyleras reverse primer (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Syntetisera Pool0, FP och PO4- RP med standard phosphoramidite kemi18,19,20, och rena alla de utsedda nationella myndigheterna genom standard högpresterande vätskekromatografi (HPLC)21.
  3. Rekonstituera Pool0, FP och PO4- RP i nuclease-fri klass vatten vid 100 µM, alikvotens, och lagra dem vid -20 eller -80 ° C i upp till ett år.
    Obs: Det är starkt antydde för att lagra Pool0, FP och PO4- RP i 10-20 µL portioner för att undvika eventuella korskontaminering.

2. syntetisera målet för ankare och dess immobilisering på epoxi-aktiverat agaros pärla

  1. Syntetisera den amino gruppen functionalized dibutylftalat (DBP-NH2) som ankare mål.
    Obs: De experimentella detaljerna på syntes och karakterisering av DBP-NH2 har beskrivits i litteraturen22.
  2. Förbereda ankaret mål stamlösningar i ett medium som är lämpliga för målet löslighet. För denna studie, förbereda 100 mM DBP-NH2 stamlösning i dimetyl sulfoxid (DMSO) och lagra lösningen vid 4 eller -20 ° C i upp till ett år.
  3. Immobilisera DBP-NH2 på epoxi-aktiverat agaros pärlor enligt en modifierad protokoll från tillverkaren.
    1. Väg upp 0,1 g frystorkade pulver av epoxi-aktiverat agaros pärlor och avbryta det i destillerat vatten. Tvätta mediet för 1 h med 20 mL destillerat vatten till i flera portioner. Tvätta på medellång med 0,2 M Na2CO3 (pH 12).
      Obs: Medium sväller omedelbart efter att lägga till vattnet in i den.
    2. Lös DBP-NH2 (46,7 mg, 0,15 mmol) i 500 µL koppling bufferten (0,2 M Na2CO3 buffert).
    3. Blanda koppling lösningen innehållande liganden med medlet. Använda en shaker på 5 varv för 48 h i rumstemperatur.
    4. Upprepa tvätta produkten tre gånger, sekventiellt med 0,1 M acetatbuffert (0,5 M NaCl, pH 4,5) och 0,2 M karbonat buffert (0,5 M NaCl, pH 12) i varje tvättcykeln. Tvätta och avbryta produkten i vatten till slutvolymen av 500 µL.
    5. Förvara produkten vid 4 ° C före användning.
    6. Bekräfta framgången för målet immobilisering av elementaranalys.

3. SELEX

  1. Bereda 500 mL PAE bindande buffert i ultrarent vatten eller nuclease-fri klass vatten med 20 mM Tris· HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene (20) sorbaitan lösning och 0,03% icke-joniska ytaktiva agent (pH 7,9). Filtrera bufferten genom en steril 0,22 µm nitrocellulosa filter och lagra den på en temperatur som är högre än 20 ° C för månader.
    Obs: Det är viktigt att behålla en bra spridning status PAEs i PAE bindande buffert. Flera typer av tensider behövs för att öka lösligheten av PAEs i vattenlösning. Antalet tensider bör dock hållas till ett minimum för att undvika bildandet av tensiden miceller som skulle inkapslar PAE molekyler. Icke-joniska, surface aktiv agent är lätt att fälla ut vid temperaturer lägre än 20 ° C, och därför bufferten ska förvaras vid en temperatur högre än 20 ° C.
  2. Späd 10 µL 100 µM Pool0(~1.0 nmol för 1014-1015 sekvenser) i 490 µL PAE bindande buffert. Värm i Pool0 portioner (5 × 100 µL) i tunnväggiga Centrifugera rören i vattenbad vid 95 ° C i 10 min. plats rören på is för 5 min och därefter Inkubera rören under 5 minuter i rumstemperatur (~ 25 ° C i detta arbete).
  3. Den första omgången av urval: inkubation av Pool0 och DBP−NH2−coated medium.
    1. Tvätta 200 µL DBP−NH2−coated medium tre gånger med 500 µL av PAE bindande buffert. Blanda DBP−NH2−coated medium med Pool0 och inkubera blandningen i rumstemperatur i 1 h under milda skakningar.
    2. Separat DBP−NH2−coated medium bunden med aptamers från de obundna DNAs genom ultrafiltrering usingan ultrafiltrering röret med en molekylär cut-off av 100 kDa. Tvätta på medellång tre gånger med 500 µL av PAE bindande buffert och centrifugera vid 9,168 × g i 10 minuter vid 4 ° C.
  4. Den första omgången av urval: aptamer eluering från DBP−NH2−coated medium.
    1. Tillsätt 50 µL av PAE bindande buffert till den tvättade medium och värm blandningen vid 90 ° C i 9 min under skakning.
    2. Samla in supernatanten innehållande de eluerade DNAs ultrafiltrering. Upprepa proceduren eluering tre gånger för att återvinna mer bundna DNAs.
  5. Den första omgången av urval: PCR
    1. Liten skala PCR
      1. Utföra en liten skala PCR23 (4 × 20 µL portioner) använder ~ 15-30 cykler. Ställ en PCR-reaktion24 enligt följande: 6.5 µL RNase-gratis vatten, 1 µL 10 µM varje primer (FP, PO4- RP, 0,01 nmol varje), 1,5 µL elueras pool från avsnitt 3.4 (eller RNase-fritt vatten som negativ kontroll) och 10 µL förblandade reaktion blandningar innehållande dNTP, hot start-polymeras och 2 × PCR-reaktion buffert (20 mM tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8,3).
      2. Köra PCR med en termocykel med följande inställningar: 1 cykel av 95 ° C, 1 min; 30 cykler av [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cykel av 72 ° C, 2 min och håll vid 4 ° C. När instrumentet körs den 20th s förlängning steg 15, 20, 25 och 30 cykler, tryck på pausknappen, öppna locket till instrumentet ta ett rör ut och tryck på pause igen för att återuppta PCR.
      3. Förbereda 12% denaturerad Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan)25,26. Blanda 4,8 g urea, 6 mL ultrarent vatten, 1 mL 10 × tris/borsyra/etylendiamintetraättiksyra (TBE), 3 mL av 40% akrylamid, 10 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) och 100 µL 10% ammonium persulfatoxidation (APS), i den ordningen. Rör om väl och vänta 1,5-2 h att säkerställa gelen stelnar helt.
      4. Analysera resultaten av cykel optimering: kombinera 1 µL av varje PCR-produkt med 5 µL RNA lastning buffert (62,5% formamid, 0,4 M formaldehyd, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic syra buffert, 0,02% xylen cyanol FF, 0,02% bromofenolblått) och 4 µL RNase-fritt vatten; Värm blandningen vid 95 ° C i 10 min och snabbt kyla det till 0 ° C på is; Inkubera i 5 min i rumstemperatur; belastning i 5 separata brunnar 12% denaturerad sida; köra elektrofores av en vertikal elektrofores system i 1 × TBE buffert på 170 V för 45 min.
      5. Efter elektrofores, fläcken gelen med 3 µL 1 × nukleinsyra gel fläcken i 30 mL 1 × TBE buffert i 10 min, och ta en bild av gelen.
    2. Stor skala PCR: Välj lämpligt antal cykler att producera högsta intensitet bandet vid rätt storlek markör utan oönskade biprodukter. Utföra storskaliga PCR (20 × 100 µL portioner) utnyttja villkor och lämpligt antal cykler som fastställs i avsnitt 3.5.1.
      Obs: Det slutliga beloppet av enkelsträngat bibliotek som kan erhållas är proportionell mot den totala volymen av PCR, inte koncentrationen av mallen. Typiskt, för att få 1 nmol av bibliotek, enkelsträngat poolen behöver 2 mL PCR. PCR är mycket känslig och lätt förorenade av utanför DNAs. Åtgärder bör vidtas för att minska risken för kontaminering, såsom handskar, med hjälp av steriliserad tips, inte spotta i rören och inte öppna locket av PCR-röret före centrifugering.
  6. Den första omgången av urval: rening av PCR-produkten av etanol nederbörd.
    1. Kombinera två rör av PCR-blandning i en tub (200 µL varje). Upprepa detta för alla rör.
    2. Tillsätt 15 µL (3 M, pH 5.2) natriumacetatlösning, 4 µL av DNA/RNA nederbörd carrier lösning och 2,5 gånger volymen av nedkylda etanol vid-20 ° C i varje rör. Blanda dem jämnt.
      Obs: DNA/RNA nederbörd bärare används ofta i etanol nederbörd experiment att avsevärt förbättra återhämtning procentandelen av DNA/RNA vid låga koncentrationer. Det stör inte nedströms tillämpningar såsom PCR och sekvensering.
    3. Centrifugera blandningen vid 20,627 × g i 20 minuter vid 4 ° C och noggrant avlägsna supernatanten och lämna vit fällning.
    4. Tillsätt 400 µL av 70% pre-Cooling etanol lösning vid-20 ° C till varje rör att tvätta nederbörden. Centrifugera blandningen på 20,627 × g i 5 minuter vid 4 ° C, och noggrant avlägsna supernatanten och lämna vit fällning. Upprepa tvättningen två gånger.
    5. Öppna locket till röret; sticka den tätning membranen; Låt etanol avdunsta vid 40 ° C i värmeblocket tills vita fällningen blir transparent. Lagra fällningen vid-20 ° C.
      Obs: Renat PCR-produkten kan förvaras vid-20 ° C.
  7. Den första omgången av urval: enkelsträngat DNA generation (generation av berikade pool1) genom att utföra λ exonuclease reaktionen att smälta den fosforylerade omvänd strand.
    1. Liten skala λ exonuclease reaktion
      1. Tillsätt 100 µL RNase-fritt vatten till en tub som innehåller renade PCR-produkten från avsnitt 3.6. Vortex röret till upplös fällningen i röret.
      2. Förbereda fem centrifugrör och tillsätt 5 µL av ovanstående lösning, 11 µL av RNase - gratis vatten och 2 µL 10 × reaktion buffert (670 mM glycin-KOH, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) Triton x-100 pH 9,4) i varje rör.
      3. Tillsätt 2 µL av vatten eller utspädd λ exonuclease lösning innehållande 2 U, 5 U, 8 U och 10 U λ exonuclease in i dessa rör, respektive. Blanda lösningen väl genom att försiktigt pipettering. 10 × reaktion bufferten ges tillsammans med λ exonucleasefrom leverantören.
      4. Inkubera rören under 35 minuter vid 37 ° C, 15 min vid 80 ° C och håll vid 4 ° C.
      5. Förbereda 12% infödingen sida. Blanda 6 mL ultrarent vatten, 1 mL 10 × TBE, 3 mL 40% akrylamid, 10 µL TEMED och 100 µL 10% APS, i den ordningen. Rör om väl och vänta på 60-90 min till säkerställa gelen stelnar helt.
      6. Analysera resultaten av reaktioner genom att kombinera 5 µL av varje reaktion med 1 µL laddning färgämne och 4 µL RNase-fritt vatten samt laddning dessa blandningar i 5 separata brunnar 12% Native sida (150 V för 45 min).
        Obs: En 20 bp dubbelsträngat DNA stege kan även läsas på gel, men det kanske inte är nödvändigt eftersom de distinkta band av PCR-produkten och det genererade enda stranded biblioteket visar på gelen.
        Obs: Λ exonuclease reaktionen har en utmärkt strukturella selektivitet. Dubbelsträngat PCR-produkten (anti känsla strand är märkt med en fosfatgrupp i slutet 5') kan smältas helt in i ett enkelsträngat bibliotek i närvaro av λ exonuclease i ett ganska brett koncentrationsintervall (figur 4). Minimibeloppet för λ exonuclease som helt kan generera enkelsträngat DNA i liten skala λ exonuclease reaktionen används också för storskaliga λ exonuclease reaktionen. En högre koncentration av λ exonuclease kan också användas, eftersom λ exonuclease fungerar bra i ett brett koncentrationsintervall utan att förlora dess struktur selektivitet och produkt avkastning. Λ exonuclease reaktionen hämmas av en hög koncentration av salt. Ofullständig nedbrytning av PCR-produkten innebär oftast att för mycket salt finns i PCR-produkten. Rening av PCR-produkter av etanol nederbörd (avsnitt 3.6) är vanligtvis kompatibel med detta steg, medan PCR-produkten renas av isopropanol nederbörd ganska ofta innehåller för mycket salt.
    2. Stor skala λ exonuclease reaktion: Välj den minsta mängden λ exonuclease som helt kan generera enkelsträngat DNAs för storskaliga λ exonuclease reaktionen. Reaktionen är proportionellt skalas upp enligt detta villkor. Till exempel: om 2 U är den minsta mängden λ exonuclease krävs, blanda 38 µL Rnase-gratis vatten, 10 µL 10 x buffert, 50 µL av DNA pool1 och 2 µL 10 U/µL λ exonuclease.
  8. Den första omgången av urval: rening av enkelsträngat Pool1 av etanol nederbörd.
    1. Följ instruktionerna i steg 3.6.
    2. Bestämma koncentrationen av renat Pool1 av UV-absorption på 260 nm.
    3. Rekonstruera den 90% renat Pool1 i en lämplig volym av PAE bindande buffert. Om det inte finns tillräckligt med DNA för nästa omgång av urval, upprepa avsnitt 3.5-3.8.2.
      Obs: Volymen av PAE bindande buffert varierar vanligtvis från 200 till 500 µL enligt mängden bibliotek och bibliotek i nästa omgång av SELEX önskade slutliga koncentration.
  9. Den andra, tredje, fjärde och femte rundor av SELEX.
    1. Genomföra andra, tredje, fjärde och femte rundor av SELEX därefter följa samma procedur som beskrivs ovan (avsnitt 3.2-3,8), förutom att ~ 300 pmol biblioteket var ingång för att öka urvalet striktheten.
    2. För att minimera ospecifik absorptionen av DNAs på medium, inkubera poolen med omodifierade medium på en roterande skakapparat i 30 min i tredje och fjärde omgången av valet innan inkubation med DBP−NH2−coated medium.
      Obs: SELEX processen slutade vid den femte omgången på grund av den allvarliga crosslink mellan DNAs avslöjade av den stora mängden hög molekylvikt produkt som inte migrera in i gelen.

4. high-Throughput sekvensering

  1. Förbereda Pool4 från punkt 3.9.2 för sekvensering av PCR-amplifiering med kompatibel grundfärger.
    1. Designa och syntetisera en indexerad framåt primer med 6 nt 5′ i slutet att underlätta sekvens analysen.
      Indexerade framåt primer (FP-sekvensering): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Ställa in en 1000 µLPCR reaktion som följer: 380 µL RNase-gratis vatten, 50 µL av varje 10 µM grundfärg (FP-sekvensering, PO4- RP, 0,5 nmol varje), 20 µL av eluerade pool från punkt 3.9.2 och 500 µL förblandade reaktionsblandningen innehåller dNTP, hot start polymeras , och 2 × PCR-reaktion buffert. Alikvot blandningen i 10 PCR-rören. Använd samma PCR-villkor som beskrivs i avsnitt 3.5.1.2.
  2. Rena PCR-produkten för att möta sekvensering anläggningens krav. Till exempel Använd sida-gel DNA recovery kit enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Skicka renat PCR-produkten (~ 2 µg) till en sekvensering anläggning på frakt villkor krävs enligt sekvensering anläggningen. Till exempel fartyget PCR-produkten i ett centrifugrör med lock ordentligt förseglad med isklampar till sekvensering anläggningen.
    Obs: Fick de resultat som rankas sekvenserna enligt kopia antalet varje sekvens att bedöma anrikningen av sekvenserade poolen. Sekvensen top utsågs DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Dess affinitet och selektivitet mättes av följande protokoll (avsnitt 5 och 6). Dess tillämpning i en elektrokemisk bio-sensing visades senare i avsnitt 7.

5. Kd bestämning av utvalda Aptamer kandidater med Magnetic Bead-Based kvantitativ PCR (qPCR)

  1. Syntetisera DBP-1-qPCR och primers använder standard phosphoramidite kemi och rena det genom standard HPLC.
    Aptamer kandidat (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Vidarebefordra primer för qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Reverse primer för qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Obs: Regionkommittén primer av testade sekvensen skiljer från de pool0 används i avsnitt 3. Syftet med ändra Regionkommittén primer är att testa frändskapet av sekvensen core ensam, exklusive Regionkommittén primer.
  2. Immobilisera DBP-NH2 på karboxylsyra-belagd magnetiska pärlor efter tillverkarens anvisningar.
    1. Tvätta karboxylsyra-belagd magnetiska pärlor två gånger med 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES) (pH 5.0), med en lika stor volym av magnetiska pärlor (100 µL) pipetteras ur injektionsflaskan, för 10 min med bra blandning (över slut eller liknande).
    2. Omedelbart före användning, förbereda 50 mg/mL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) lösning med kall 25 mM MES (pH 5.0).
    3. Omedelbart före användning, förbereda 50 mg/mL N-hydroxysuccinimide (NHS) lösning med kall 25 mM MES (pH 5.0).
    4. Blanda 100 µL av EDC lösning och 100 µL av NHS lösning med tvättade pärlor och inkubera i 30 min i rumstemperatur med långsam tilt rotation.
    5. Lägga röret på en magnet för 4 min efter inkubation, avlägsna supernatanten och tvätta pärlor två gånger med 100 µL kallt 25 mm MES (pH 5.0).
    6. Inkubera 6 µL av 100 mM DBP-NH2 stamlösning och 25 mM MES (pH 5.0, 290 µL) med aktiverade pärlor under rotation för minst 30 min i rumstemperatur eller 2 timmar vid 4 ° C, med långsam tilt rotation på 5 varv.
    7. Placera röret på magneten för 4 min efter inkubation och kasta bort supernatanten. Tvätta de belagda pärlorna 4 gånger och resuspendera pärlor med 200 µL av PAE bindande buffert och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
  3. Samla Titrerkurvan för att bestämma Kd.
    1. Bered en serie av DBP-1 lösningar (500 µL) vid varierande koncentrationer i PAE bindande buffert från 1 pM till 300 nM.
    2. Tillsätt 10 µL av DBP-NH2-belagda magnetiska pärlor som beskrivs i avsnitt 5.2.7 till varje DBP-1 lösning. Inkubera i 1 h i rumstemperatur under rotation.
    3. Placera rören på en magnet för 4 min och avlägsna supernatanten. Tvätta pärlorna 4 gånger med 200 µL PAE bindande buffert.
    4. Tillsätt 60 µL PAE bindande buffert i varje rör. Inkubera rören vid 95 ° C i 15 min. samla supernatanten innehållande den eluerade DBP-1 magnetisk separering. Upprepa proceduren eluering för att återvinna mer bundna DBP-1.
    5. Späd elute lösningen 100-fold och ta 3 µL för realtids qPCR. Ställ en qPCR reaktion enligt följande: 3 µL RNase-gratis vatten, 2 µL 10 µM varje grundfärg (FP, PO4- RP, 0,01 nmol varje), 3 µL elueras och utspädd DBP-1 och 10 µL förblandade reaktionsblandningen innehållande dNTP, polymeras och 2 x PCR reaktion buffert.
    6. Fastställa antalet DBP-1 i varje prov genom att köra qPCR med en termocykel med följande inställningar: 1 cykel av 95 ° C, 30 s; 30 cykler av [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cykel av 72 ° C, 30 s och håll vid 4 ° C.
    7. Rita titrerkurvan och bestämma Kd av ickelinjära montering av kurvan antar en 1:1 bindande baserat på27.

6. relativ affinitet och specificitet Test av konkurrenskraftiga analyser

  1. Tillsätt 10 µL av DBP-NH2-belagda magnetiska pärlor till DBP-1-lösning (500 µL, 1 µM). Inkubera i 1 h i rumstemperatur under rotation. Placera rören på en magnet för 4 min och avlägsna supernatanten. Tvätta pärlorna 4 gånger med 200 µL PAE bindande buffert och återsuspendera det i 10 µL av PAE bindande buffert.
  2. Tillsätt 10 µL av DBP-NH2-belagda medium bundet med DBP-1 till 110 µL av varje 10 µM testat prov (DBP-NH2, DBP, DEHP, butyl bensyl phthalate(BBP), tungmetall joner, etc.) Odla i rumstemperatur för 1 h. samla supernatanten genom magnetisk separering.
  3. Späd supernatanten 100-fold och ta 3 µL för qPCR kvantifiering. Ställ en qPCR reaktion enligt följande: 3 µL RNase-gratis vatten, 2 µL 10 µM varje grundfärg (FP, PO4- RP, 0,01 nmol varje), 3 µL elueras och utspädd DBP-1 och 10 µL förblandade reaktionsblandningen innehållande dNTP, polymeras och 2 x PCR reaktion buffert.
  4. Fastställa antalet DBP-1 i varje prov genom att köra qPCR med en termocykel med följande inställningar: 1 cykel av 95 ° C, 30 s; 30 cykler av [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cykel av 72 ° C, 30 s och håll vid 4 ° C.
  5. Beräkna den relativa samhörigheten genom att dividera antalet DBP-1 befrias från pärlorna i närvaro av urvalet av antalet DBP-1 släppt från pärlorna i PAE bindande bufferten: relativa affinitet = Nprov/Nbuffert.

7. tillverkning och elektrokemiska mätningar av DEHP elektrokemiska biosensorer

  1. Syntetisera thiolated core sekvensen (HS-DBP-1) och signalering sonden (DBP-1-C-Fc) med hjälp av standard phosphoramidite kemi och rena det genom standard HPLC.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Obs: Rationell utformningen av sensorn sonderna beskrevs i våra tidigare pbulications18,22.
  2. Rekonstituera HS-DBP-1 och DBP-1-C-Fc i nuclease-fri klass vatten vid 100 µM, alikvotens, och lagra dem vid -20 eller -80 ° C i upp till ett år.
  3. Polska guld elektroden noggrant till en spegelblank yta med 1, 0,3 och 0,05 µm Al2O3 pulver på en microcloth för 5 min och Sonikera det i ultrarent vatten för 5 min att ta bort kvarvarande Al2O3. Rengör sedan elektroden elektrokemiska polering med 35 successiva cyklisk voltametri (CV) skanningar från 0,4 till 1,2 V (jämfört med Hg-Hg2SO4) i 0,5 M H2SO4 på 100 mV/s.
  4. Förbereda en blandning av 0,5 µM HS-DBP-1 och 0,5 µM DBP-1-C-Fc i 100 µL 10 mM fosfatbuffert som innehåller 1 M NaCl, pH 7,4 (PBS). Värm blandningen i tunnväggiga centrifugeringsröret i vattenbad vid 95 ° C i 10 min, och långsamt kyla blandningen till rumstemperatur.
  5. Tillsätt 1 µL av tris-(2-carboxyethyl)-fosfin hydroklorid (TCEP, 10 mM, stamlösning) i blandningen. Förvara i rumstemperatur för 1 h.
  6. Fördjupa den rena guld elektroden i ovanstående lösning för 12 h, eller över natten i rumstemperatur.
  7. Skölj elektroden med PBS och sänk ned elektroden i 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-t ex6- OMe) i PBS för 1 h. Skölj elektroden noga med PAE bindande buffert och sänk ned elektroden i PAE bindande buffert.
  8. Ta en genomsökning i bakgrunden fyrkantsvåg voltametri (SWV) i målet-fri PAE bindande buffert.
    1. Rengör all experimentell utrustning: elektrolytisk celler, guld arbetselektroden, platina counter elektrod och mättade kalomelelektrod som referens (SCE).
    2. Aktivera den installerat mjukvaran; Ange de experimentella parametrarna för SWV mätningar.
      Obs: Följande experimentella parametrar användes för SWV experiment: potentiella intervall: från -0,2 till 0,7 V; modulering amplitud: 25 mV; puls bredd: 5 ms; Skanna hastighet: 50 mV/s; steg potential: 1 mV.
    3. Anslut guld arbetar elektrod, platina counter elektrod och SCE till en potentiostat och sätta dessa tre elektroder i en elektrolytisk cell som innehåller PAE bindande buffert.
    4. Kör SWV mätning.
      Obs: En gång den SWV mätning börjar, en SWV kurva kommer att visas på skärmen på datorn. Genomsökningen upprepas tills skanningar är konstant och inga ytterligare förändringar i formen eller topphöjden observeras.
  9. Fördjupa arbetselektroden i PAE bindande bufferten innehåller en viss koncentration av DEHP (t.ex. 10 pM) i 30 min i rumstemperatur. Skölj elektroden noga med PAE bindande buffert och sänk ned elektroden i PAE bindande buffert med counter elektrod och SCE. Samla SWV kurvan på samma villkor som beskrivs i avsnitt 7,8.
  10. Upprepa steg 7,9, förutom att koncentrationen av DEHP (t.ex. 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) ökades sekventiellt. Rita titrerkurvan.
  11. Specificitet tester: Upprepa steg 7,3-7,9, förutom att PAE bind bufferten som innehåller DEHP ersätts av PAE bindande bufferten som innehåller potentiellt interfererande substans på önskad koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi designade och syntetiseras den amino gruppen functionalized dibutylftalat (DBP-NH2) som ankare mål (figur 1F). Vi genomförde sedan DNA aptamer urvalet av PAEs använder DBP-NH2 som ankare mål och efter klassiskt mål immobilisering-baserade metoden (figur 2). I varje runda utfördes en pilot PCR använder denaturerad sida för att optimera cykeln antalet PCR (figur 3). Denaturerat sidan, istället för infödda sida, rekommenderas starkt eftersom vi och andra kolleger har funnit att de misstänkta hög molekylvikt biprodukterna visas på de infödda gelerna på högre cykel nummer är faktiskt crosslinking komplex bildas av sekvenser av rätt storlek. Således kan bandet intensiteten av denaturerat sidan verkligen återspeglar mängden av rätt produkt. Den enda stranded DNA-generationen är ett annat viktigt steg, och många metoder för det här steget har varit rapporterade28. Metoden λ exonuclease matsmältning är den billigaste metoden. Framgången för den enkelsträngade DNA generationen kan kontrolleras bekvämt av infödda, där PCR-produkten visas som singel (första flera omgångar av SELEX) eller flera band, medan bara ett band visas efter matsmältningen (figur 4).

SELEX stoppades efter femte rundan av valet på grund av den betydande mängden DNA ackumulerade överst på sidan, även efter denaturering behandling (vari DNAs är uppvärmd vid 95 ° C i 10 min i 2 × TBE – innehållande 8.3 M urea) , som föreslog allvarliga tvärbindning mellan DNAs och angav även att sekvenserna berikades. Därför skickades den pool4 för hög genomströmning sekvensering. Hög genomströmning resultatet visade att de toppa 100 mest frekvent förekommande sekvenser var starkt konservativa och kom från en familj. Den översta sekvensen DBP-1 visas nanomolar affinitet (figur 5) och bra grupp-specificitet för PAE kongener (DBP, BBP, DEHP) (figur 6) via bekväm qPCR analyserna, som beskrivs i avsnittet protokoll.

DBP-1 har använts för att konstruera en strand deplacement-baserade elektrokemiska aptasenor med detta till vår tidigare rapporterats fungera29. DEHP sensorn kan känsligt och selektivt svara DEHP (figur 7). De gemensamma miljömässiga föroreningarna som tungmetaller joner, antibiotika och små molekyler med liknande funktionella grupper visade mycket svaga svar till DBP-1.

Figure 1
Figur 1: Kemiska strukturer i (A) PAEs, (B) BBP, DBP (C), (D) DEHP, e 4-OH-DEHP, f DBP−NH2. Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse från Han Y. et al. 22 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Gruppspecifika DNA aptamer urvalsförfarande för PAEs använder DBP-NH2 som ett ankare mål. Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse från Han Y. et al. 22 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa resultat från PCR-cykel optimering med denaturerat sida. Från vänster till höger, representerar köer: 20 bp DNA stege standard, 15 cykler (ingen DNA-mall), 20 cykler (ingen DNA-mall), 25 cykler (ingen DNA-mall), 30 cykler (ingen DNA-mall), 15 cykler, 20 cykler, 25 cykler och 30 cykler. Optimala förhållanden observerades vid 25 cykler, där enda produkt bandet var med hög intensitet utan oönskade biprodukter, dessutom inga band observerades i motsvarande tomma kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: optimering av λ exonuclease reaktion att smälta den fosforylerade strand med infödda sida. Från vänster till höger, representerar köer: 20 bp DNA stege standard, negativ (ingen λ exonuclease), 2U, 5U, 8U och 10U. Den minsta mängden enzym observerades vid 2U, där dubbel PCR-produkten blir enkelsträngat DNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: affinitet mätningar av DBP-1 av qPCR-baserade assays. Felet (standardavvikelse, SD) Kd's beräknades från tre mätningar av samma prov. Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse från Han Y. et al. 22

Figure 6
Figur 6: relativa affinitet mätningar av DBP-1 för gratis DBP-NH2 (10 µM), DBP (10 µM), DEHP (10 µM), BBP (10 µM), etylacetat (10 µM), bensoesyra (10 µM), ftalsyra (10 µM) och andra via konkurrens analyser. Övrigt: en blandning av potentiella störningar (glukos, kanamycin, ampicillin och etanol) alla på 10 µM. Förhållandet (det relativa affinitet) var beräknas genom att dividera antalet aptamers släppt från pärlorna i närvaro av urvalet av antalet aptamers släppt från pärlorna i PAE bindande bufferten. Staplarna representerar medelvärde ± SD. SDs beräknades utifrån tre individuella mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: DEHP elektrokemisk biosensor för ultrasensitive och ultraselective påvisande av DEHP: mekanism (A), SWV kurvor (B), kalibreringskurvan (C), och selektivitet tester (D). Fel (SDs) beräknades utifrån tre individuella mätningar. Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse från Han Y. et al. 22 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En enastående fördel med aptamerer är att de identifieras genom in vitro- metoden SELEX, medan antikroppar genereras via i vivo immunoreactions. Aptamers kan därför väljas med önskat mål specificitet väldesignade experimental villkor, medan antikroppar är begränsade till fysiologiska förhållanden.

För att underlätta separering av bundna sekvenser från gratis sekvenser, har flera modifierade SELEX nyligen rapporterats, i vilka kapillärelektrofores30, mikrofluidik31, magnetiska / akryl pärlor / agaros pärlor14, etc., har ersatt nitrocellulosa filter eller affinitet kolumner att uppnå effektivare separation. Bland dessa tekniker, de pärla-baserade metoderna har använts mest för aptamer val av liten molekyl mål på grund av deras enkla set-up, enkelt handhavande och vara mottaglig för småmolekylära analyser.

Det finns två grupper av metoder som vanligen används för aptamer val av liten molekyl mål: mål13 bibliotek14 immobilisering-baserade metoderna och. I den tidigare gruppen av metoder, är liten molekyl målen orörlig i den fasta fasen såsom functionalized magnetiska pärlor eller agaros pärlor via kovalenta koppling reaktioner. Bibliotek inkuberas med småmolekylär belagda pärlor, och dessa sekvenser att inte binda eller inte binda svagt till målet i den fasta fasen tas bort enkelt genom att utföra tvätt och centrifugering eller magnetisk separering steg. De bundna sekvenserna är därefter elueras och förökas med PCR. Liten molekyl målen måste ha minst en funktionell grupp tillgängliga för koppling reaktionen. För dem utan lämplig funktionella grupper har den funktionella gruppen bör införlivas med den ursprungliga mål genom organisk syntes. Syntesen av genomtänkta målet innebära flera steg, och ibland är ganska utmanande samt. Den strukturella ändringen av målen kunde också starkt påverka bindningsställen och samhörighet med sin aptamers. Att undvika dessa problem, bibliotek immobilisering-baserade metoder har utvecklats, där biblioteket är hybridiseras till kompletterande DNA fånga sonder på magnetiska pärlor, och den bindande sekvenser falla av pärlorna vid bindning med målen. I denna grupp av metoder, målen läggs i bindande bufferten och inga funktionella grupper krävs. PAEs är ester derivat av ftalat syra, och en typisk PAE består av en ftalat acid estergrupp och en eller två alkyl kedjor (figur 1A-D). PAEs har inga funktionella grupper tillgängliga för fast fas immobilisering. Således verkar de bibliotek immobilisering-baserade metoderna mer attraktiva för aptamer urval av PAEs.

En väl kontrollerad spridning status är avgörande för att säkerställa önskad anrikningen av biblioteket via SELEX. Dock PAEs är extremt hydrofoba och lätt bilda aggregat i vattenlösningar vid en koncentration som är högre än flera µM, även i närvaro av flera tensider att underlätta spridningen. Således, dispersion status PAEs är svårt att styra, och det skulle vara svårt att välja aptamers som specifikt binder till enskilda PAE molekyler. För att lösa problemet löslighet, valdes mål-immobilisering metoder, i vilka PAEs var orörlig på hydrofila pärlor via kovalent bindning. Genom att använda denna immobilisering strategi, bör mål finnas dominant på bead ytan i en molekylär stat, i stället för aggregat.

Strukturella utformningen av målet ankare är också ganska kritisk för framgångsrika val av gruppspecifika aptamers. Tre faktorer behöver beaktas för strukturella utformning. Den första faktorn är syftet med aptamer markeringen. Med tanke på syftet med att välja gruppspecifika aptamers, är det viktigt att exponera PAEs gemensamma gruppen för aptamer bindande och hindra resten av delarna från att delta i aptamer bindning. Den funktionella gruppen bör således införas på terminalen av sidokedjan. I början, vi utformade OH-functionalized DEHP (4-OH−DEHP) (figur 1E) som ankare mål och orörlig det på karboxylsyra magnetiska pärlor16. Således exponerades de alkyl kedjorna på ytan av matrisen. Vi försökte välja magnetiska pärlor med carboxyl grupper som fasta matrisen. Inga uppenbara affinitet förbättring observerades efter fem omgångar av urval och ospecifik absorptionen på kala matrix hölls stark.

Därför, DBP-NH2 senare utformades utifrån följande tankar: (1) gruppen ftalater är mer benägna att interagera specifikt med aptamer genom π-π stacken och Väteförbindelse än den alkyl-kedjan. (2) NHS-medierad carbodiimide reaktion är mild och har en mycket effektiv koppling effektivitet, så -NH2 introduceras i slutet av en alkyl kedja av DBP; (3) det är lätt att använda med magnetiska pärlor som en fast fas partition, men ospecifik adsorption av biblioteket är stark. Även om förlusten av agaros pärlorna under separation är högre än de magnetiska pärlorna, är ospecifik adsorption av biblioteket mycket lägre. Således, DBP-NH2 var orörlig på epoxi-aktiverat agaros pärlor, och gruppen ftalsyra acidester var utsatt på ytan av matrisen.

Valet av urval buffert är viktigt, särskilt för småmolekylära mål med olika löslighet. Bindande bufferten måste vara noggrant förberedda att undvika aggregering och säkerställa en bra spridning delstaten dyker under hela aptamer urval och karakterisering. I vår studie fann vi att DEHP inte kan lösas upp i vanliga buffertar utan tensider, visar två distinkta lager. Skiktet försvinner vid tillägg av flera tensider i optimerad kvantitet. De klara lösningarna måste lagras vid temperaturer högre än 20 ° C till upprätthålla dess status. Mer information finns i protokollet steg 3.1.

Enkelsträngat DNA generation från dubbelsträngat PCR-produkter är ett kritiskt steg i processen SELEX. Flera olika metoder har för närvarande beskrivits i litteraturen32,33, inklusive asymmetrisk PCR, λ exonuclease matsmältning, magnetisk separering med streptividin-belagda pärlor och storlek separation av denaturering urea-Polyakrylamidgelen.

Olika metoder har sina egna styrkor och svagheter. För närvarande är den vanligaste metoden för generering av ssDNA magnetisk separering med streptividin-belagda pärlor. Utestående fördelen med denna metod är dess tidsbesparande och enkel drift. Nackdelen är dess höga kostnad jämfört med andra metoder. Däremot är storlek separation-baserade metoden med omvänd grundfärger med GC-rika stam – loop struktur, en av de billigaste metoderna, medan avkastningen av enkelsträngat DNA är lägst bland dessa metoder32. I detta protokoll beskrev vi användningen av λ exonuclease matsmältningen att generera enkelsträngat DNA, som är en av de billigaste metoderna. Vi hittade att avkastningen av enkelsträngat DNA är jämförbar med de två metoderna för magnetisk separering och streptividin-belagda pärlor. Vi fann dessutom att den exonuclease reaktionen hämmades av den höga koncentrationen av salt. Ofullständig nedbrytning av PCR-produkten rapporterade i den litteratur33 var sannolikt på grund av för mycket salt finns i PCR-produkten. Dessutom den λ-exonuclease är mycket aktiv och billig (figur 4).

Karakterisering och validering av aptamers är mödosam och tidskrävande, och förkroppsligar en stor flaskhals i de aptamer discovery pipeline33. De flesta tekniker är mass-känsliga metoder som fungerar väl för de största aptamer bindande partnerna (> 10 000 amu), men är inte tillräckligt känslig för att mäta interaktionen med låg molekylvikt mål (< 1000 amu)15. Karakterisering och validering av aptamers hydrofoba små molekyler som PAEs är ännu svårare. Deras dåliga vattenlöslighet resulterar i den omättade alkylkedjor Titrerkurvan, som förhindrar Kd'sbestämning i lösning eller immobilizes aptamers på ytan. Därför bestäms vi Kds av den identifierade aptamers av hög genomströmning sekvensering med immobilisera DBP-NH2 på hydrofila magnetiska pärlor att undvika löslighet problemet. Den relativa tillhörighet och selektivitet i aptamers till andra PAEs sedan fastställdes av de konkurrenskraftiga analyserna, där aptamer kandidaterna var pre avgränsas till DBP-NH2 fäst magnetiska pärlor och befriaren till supernatanten vid inkubation med de testade PAEs eller andra potentiellt interfererande substanser. Konkurrenskraftiga analysen tillämpades eftersom det gav en lättköpt affinitet jämförelse bland PAEs som hade inga funktionella grupper för surface immobilisering. Magnetiska pärla-baserade fluorescerande analyser finns dessutom lämplig för affinitet studiet av liten molekyl-aptamer interaktioner34. Vi fann dock att de magnetiska pärlorna ibland orsaka fluorescens snabbkylning av okänd anledning. Således, qPCR analyserna användes för mappning mellan mätningarna.

En kritisk teknik tips för den elektrokemisk biosensor som beskrivs i denna studie är den surface passivering av elektroden35. På grund av den höga vattenavvisande egenskaper av DEHP har den en stark tendens att absorberas nonspecifically på guld elektroden, leder till misslyckande att upptäcka. Mest vanligen används ytan passivering agent, 6-mercapto-1-hexanol (MCH)36,37, är inte tillräckliga för att förhindra ospecifik absorptionen av DEHP, medan vi hittade att HS-(CH2)2-[OCH2CH2 ]6- OCH3 var tillräckligt effektiv för att aktivera känslig detektion av DEHP38.

Denna procedur beskriver ett protokoll för att välja gruppspecifika DNA aptamers starkt hydrofoba små molekyler och en tillämpning av den valda aptamer i en elektrokemisk biosensor. Protokollet hjälper till med val av andra hydrofoba små molekyler och ger insikter om sensorn utvecklingen av starkt hydrofoba små molekyler samt. Aptamer urvalsprocessen tillhör kategorin target immobilisering-baserade metoder. Begränsningarna av denna typ av metod finns också för detta protokoll, till exempel behovet av komplicerade syntes av ankare mål och effekter av den fasta fasen på aptamer bindande. Attraktiva fördelarna med de elektrokemiska biosensorer som beskrivs i detta protokoll är deras enkla design och hög känslighet. Den stora nackdelen är deras begränsade precision på grund av sin extremt brett dynamiskt omfång. De biosensorer som beskrivs här är därför lämpligare för screeningtest, i stället för kvantitativa mätningar av målen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för finansiellt stöd från National Natural Science Foundation (21675112), nyckel projektera av vetenskap och teknik planerar av Beijing utbildningskommissionen (KZ201710028027) och Yanjing ung Scholar Program av kapital Normal University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

Kemi fråga 133 Aptamer urval estrar av ftalsyra gruppspecifika hydrofoba små molekyler kvantitativa polymerisation kedjereaktion elektrokemiska aptasensor långlivade organiska föroreningar
Ftalsyra Ester-bindande DNA Aptamer urval, karakterisering och för att en elektrokemisk Aptasensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y.,… More

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter