Summary
Dit protocol beschrijft de synthese van magnetische deeltjes en evaluatie van hun DNA-bindende eigenschappen via dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing. Deze methode richt zich op het volgen van veranderingen in de grootte van de deeltjes, hun polydispersiteit en zeta potentieel van deeltje oppervlak die spelen belangrijke rol bij het binden van materialen zoals DNA.
Abstract
Isolatie van DNA met behulp van magnetische deeltjes is een gebied van groot belang in de biotechnologie en moleculaire biologie onderzoek. Dit protocol beschrijft de beoordeling van DNA-magnetische deeltjes bindend via Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en elektroforetische lichtverstrooiing (ELS). Analyse door DLS biedt waardevolle informatie over de fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes met inbegrip van deeltjesgrootte, polydispersiteit en zeta potentiële. De laatstgenoemde beschrijft de oppervlakte lading van de deeltjes die hoofdrol in elektrostatische binding van materialen zoals DNA speelt. Hier is een vergelijkende analyse exploiteert drie chemische wijzigingen van nanodeeltjes en microdeeltjes en hun effecten op DNA-bindende en elutie. Chemische wijzigingen door vertakt polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate en (3-aminopropyl) triethoxysilane worden onderzocht. Aangezien DNA een negatieve lading vertoont, verwacht wordt dat de zeta potentieel van deeltje oppervlak op binding van DNA zal afnemen. Vorming van clusters, moet dit ook invloed op de deeltjesgrootte. Om te onderzoeken de efficiëntie van deze deeltjes in isolatie en de elutie van DNA, worden de deeltjes vermengd met DNA in lage pH (~ 6), hoge Ionische sterkte en uitdroging milieu. Deeltjes worden gewassen op magneet en DNA wordt dan uitgewassen door Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA exemplaaraantal is geschat aan de hand van kwantitatieve polymerase-kettingreactie (PCR). Zeta potentieel, deeltjesgrootte, polydispersiteit en kwantitatieve PCR-gegevens zijn geëvalueerd en vergeleken. DLS is een inzichtelijke en ondersteuning van de analysemethode waarmee u een nieuw perspectief aan het proces van screening van deeltjes voor DNA isolatie toevoegt.
Introduction
DNA isolatie is een van de meest essentiële stappen in moleculaire biologie. De ontwikkeling van nucleïnezuur extractiemethoden heeft grote impact op het opkomende gebied van de genomica, metagenomics en epigenetica transcriptomics. Er is een breed scala van biotechnologische toepassingen voor DNA isolatie met inbegrip van medische (forensische/diagnose tools en prognostische biomarkers) en milieu-toepassingen (metagenomic biodiversiteit, pathogen prevalentie en toezicht). Er is toenemende vraag om te zuiveren en isoleren van DNA van verschillende materialen en in verschillende schalen zoals bloed, urine, bodem, hout en andere soorten monsters. 1 , 2 , 3 , 4
Nano - en micro-gerangschikte deeltjes zijn geschikt voor DNA isolatie vanwege hun hoge oppervlakte en in het bijzonder wanneer ze door een magnetisch veld kunnen worden geïmmobiliseerd. Fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes, zoals het formaat of de lading, kunnen hun vermogen om te binden doel biomoleculen sterk beïnvloeden. 5 ter verdere versterking van de binding van biomoleculen en deeltjes stabiel te houden, kunnen er verschillende chemische wijzigingen (oppervlaktecoatings) worden gebruikt. De vele verschillende strategieën voor bindende worden ingedeeld covalent en niet-covalente interacties. 6 de grootte van de deeltjes rechtstreeks van invloed is op hun magnetisatie-eigenschappen, overwegende dat deeltje samenstelling kan worden aangepast door opneming van metalen, aluminium of andere materialen die invloed op de dichtheid, porositeit en oppervlak uitoefenen kunnen. 7 is er geen betrouwbare manier om te meten oppervlak last van kleine deeltjes. In plaats daarvan, de elektrische potentiaal op het desbetreffende vliegtuig (enige afstand van nanoparticle oppervlak) kan worden gemeten. 8 deze waarde heet zeta potentiële en het is een krachtig instrument dat gewoonlijk wordt gebruikt voor de evaluatie van nano- en microparticle stabiliteit via DLS. 9 omdat de waarde ervan sterk afhankelijk zijn niet alleen van de pH en de Ionische sterkte van de verspreide omgeving, maar ook over de oppervlakte kenmerken van de deeltjes is, het kan ook blijken de veranderingen in dit oppervlak veroorzaakt door de interactie tussen de deeltjes en molecule van belang. 10
Aan de andere kant, voorkomende DNA-structuur in gedehydrateerde voorwaarden (A-DNA formulier) exposities gecomprimeerde conformaties die haar neerslag (aggregatie vergemakkelijken) in vergelijking tot vaak B-DNA formulier. Elektrostatische (Ionische en H-binding) zijn de grote krachten die beheersing van de binding van DNA met andere materialen als gevolg van hun sterically toegankelijk fosfaat en stikstof (met name guanine) baseert. 7 , 10
In dit werk, drie representatieve chemische wijzigingen van magnetische nanodeeltjes en microdeeltjes worden geanalyseerd (figuur 1A). De methode van synthese en chemische modificatie van nanodeeltjes en microdeeltjes wordt beschreven. Een bindoplossing, die akkoorden aan de theoretische principes van DNA neerslag (pH, Ionische sterkte en uitdroging), wordt gebruikt ter beoordeling van DNA-bindende en elutie. Kwantitatieve PCR wordt gebruikt ter beoordeling van de efficiëntie van de elutie van DNA van de representatieve nanodeeltjes en microdeeltjes (figuur 1B). Deeltjesgrootte, polydispersiteit index en zeta potentiële zijn belangrijke parameters die worden gebruikt voor het visualiseren van de fysisch-chemische veranderingen die op deeltje oppervlak (Figuur 1 c optreden). Het is belangrijk om te benadrukken op de chemische karakterisatie van magnetische deeltjes oppervlak. Hoewel deze stap buiten het bestek van dit protocol was, kunnen verschillende moderne technieken worden toegepast om na te gaan van de efficiëntie van chemische wijzigingen. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform infrarood spectroscopie (FTIR) kan worden gebruikt voor het infraroodspectrum van deeltje oppervlak te evalueren en te vergelijken met het spectrum van gratis chemische modifiers. X-Ray photoelectron spectroscopy (XPS) is een andere techniek die kan worden gebruikt voor het identificeren van de elementaire samenstelling van materiële oppervlak. Andere elektrochemische, microscopische en spectroscopische methoden kunnen worden gebruikt de licht werpen op de kwaliteit van deeltje synthese. Dit werk markeert een nieuw perspectief te analyseren DNA-magnetische deeltjes interacties via DLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. magnetische nanodeeltjes synthese
- synthese van magnetische nanodeeltjes gestabiliseerd met citraat (MNPs)
- toevoegen 20 mmol van FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) en 10 mmol van FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) in 20 mL gedeoxygeneerd dubbel gedestilleerd water (ddd water). Roer verkregen oplossing krachtig in het bekerglas onder N 2 sfeer met behulp van een mechanische schudinrichting totdat een transparante oplossing wordt verkregen.
- Toevoegen onder snelle mechanische roeren, 150 mL 1 M NH 4 OH, druppel voor druppel met trechter (Neem 1 h of meer indien nodig). Breng de oplossing kwantitatief in een schroefbare schip nadat alle NH 4 OH is toegevoegd. Schroef de vaartuig en warmte oplossing bij 75 ° C gedurende 30 min.
Let op: NH 4 OH is ingedeeld als bijtend en voor milieu gevaarlijke.
Opmerking: Bereid NH 4 OH oplossing van hoge rang 28% NH 4 OH in water met behulp van gedeoxygeneerd water. - Verzamelen de zwarte neerslag met magneet en wassen met 100 mL water ddd. Herhaal dit 3 keer. Voeg 50 mL 0,5 M tri-natrium citraat (dihydraat) p.a. neerslaan. Schroef de schip.
Opmerking: Gebruik gedeoxygeneerd oplossing van tri-natrium citraat dihydraat. - Opnieuw verspreiden de neerslag via ultrasoonapparaat (35 kHz, amplitude van 100%) en warmte vaartuig bij 80 ° C gedurende 1 h.
Opmerking: Een ultrasoonapparaat van voldoende energie nodig is. - Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Verzamelen van neerslag met behulp van een magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Opnieuw verspreiden zwarte modder in ddd water ultrasoonapparaat (35 kHz, amplitude van 100%) met 50 mL.
- Pipetteer aliquots (~ 25 mL) in 50 mL centrifuge buizen en Voeg 20 mL aceton. Centrifugeer bij 2400 x g gedurende 10 minuten en verwijder supernatant.
- Opnieuw verspreiden neerslag en dialyze oplossing tegen water laag molecuulgewicht cut-off dialyse apparaat (500-1000 Da) van geschikt volume gebruikt voor 24 h.
Opmerking: Bereiden de dialyse apparaat volgens fabrikant ' s eisen.
- Synthese van magnetische nanodeeltjes bewerkt met vertakte polyethylenimine (MNPs_PEI)
- , voeg 2 mL van de verkregen MNPs-oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 38 mL ddd water toe en bewerk ultrasone trillingen ten (35 kHz, amplitude van 100%) de schorsing (10 min).
- Onder snelle mechanische roeren, voeg toe 10 mL 10% vertakt polyethylenimine (gemiddelde 25 kDa). Roer de oplossing voor latere 3 h.
- Collect precipiteren met behulp van magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Opnieuw verspreiden neerslag in 20 mL ddd water. Herhaal dit 5 keer dan bewerk ultrasone trillingen ten de definitieve opschorting (35 kHz, amplitude van 100%).
- Synthese van magnetische nanodeeltjes deeltjes bewerkt met siliciumdioxide (MNPs_TEOS)
- Voeg 10 mL van de verkregen MNPs-oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 60 mL water en 130 mL ethanol. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing en voeg 28% NH 4 OH 6 mL.
- Onder snelle mechanische roeren, voeg 1 mL tetraethyl orthosilicate. Roer de oplossing voor de daaropvolgende 12 h.
- Zwarte neerslag met magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Opnieuw verspreiden deeltjes in 10 mL voor ddd water en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).
- Synthese van magnetische nanodeeltjes bewerkt met amino groepen (MNPs_APTES)
- Voeg 5 mL van de verkregen oplossing van de MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. 45 mL water en 50 mL ethanol toevoegen. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing (35 kHz, amplitude van 100%).
- Onder snelle mechanische roeren, Voeg 0,5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane. Roer de oplossing voor latere 3 h.
- Zwarte neerslag met magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Opnieuw verspreiden deeltjes in ddd 5 mL water en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).
2. Magnetische deeltjes synthese
- synthese van magnetische deeltjes gestabiliseerd met citraat (MMP)
- Voeg toe 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 M KOH en 205.875 mL van ddd water in een schroefbare vaartuig. Voeg 6.675 mL 1 M FeSO 4 tijdens het magnetische schudden. Onmiddellijk overdracht schip een voorverwarmde waterbad (90 ° C) voor 2 h.
Opmerking: Bereiden KNO 3 en KOH oplossingen in ddd water. - Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Verzamelen van zwarte neerslag met magneet en wassen met behulp van 50 mL ddd water (5 keer). Voeg 50 mL 0,5 M tri-natrium citraat (dihydraat) p.a. neerslaan. Schroef de schip.
- Redisperse van de neerslag via ultrasoonapparaat (35 kHz, amplitude van 100%) en warmte vaartuig bij 80 ° C gedurende 1 h. verzamelen zwarte neerslag met magneet en wassen met behulp van 50 mL ddd water (10 keer).
- Wijzigen MMP met vertakte polyethylenimine (MMPs_PEI), siliciumdioxide (MMPs_TEOS) en de amino groepen (MMPs_APTES) vergelijkbaar met MNPs-protocol. Verwijzen naar secties 2.2, 2.3 en 2.4, respectievelijk voor meer details.
- Voeg toe 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 M KOH en 205.875 mL van ddd water in een schroefbare vaartuig. Voeg 6.675 mL 1 M FeSO 4 tijdens het magnetische schudden. Onmiddellijk overdracht schip een voorverwarmde waterbad (90 ° C) voor 2 h.
- Synthese van magnetische deeltjes bewerkt met vertakte polyethylenimine (MMPs_PEI)
- Voeg 5 mL van MMP oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 38 mL ddd water toe en bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing (35 kHz, amplitude van 100%, 10 min). Voeg toe 10 mL 10% vertakt polyethylenimine (gemiddelde 25 kDa) onder snelle mechanische roeren. Roer de oplossing voor latere 3 h.
- Verzamelen neerslag met behulp van een magneet en bovendrijvende vloeistof verwijderen. Redisperse neerslag in 20 mL dubbel gedestilleerd water. Herhaal dit 5 keer dan bewerk ultrasone trillingen ten de eindoplossing (35 kHz, amplitude van 100%).
- Synthese van magnetische deeltjes bewerkt met siliciumdioxide (MMPs_TEOS)
- Voeg 5 mL van MMP oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. Voeg 60 mL water en 130 mL ethanol. Bewerk ultrasone trillingen ten schorsing (35 kHz, amplitude van 100%) en voeg 28% NH 4 OH 6 mL.
- Onder snelle mechanische roeren, voeg 1 mL tetraethyl orthosilicate. Roer de oplossing voor de daaropvolgende 12 h.
- Zwarte neerslag met behulp van een magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Redisperse van deeltjes in 5 mL water voor ddd en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).
- Synthese van magnetische deeltjes bewerkt met amino groepen (MMPs_APTES)
- Voeg 3 mL MMPs_TEOS oplossing (~0.1 g/mL) in een bekerglas van glas. 45 mL water en 50 mL ethanol toevoegen. Bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).
- Onder snelle mechanische roeren, Voeg 0,5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane. Roer de oplossing voor latere 3 h.
- Zwarte neerslag met magneet verzamelen en wassen met behulp van 50 mL ethanol (3 keer) en 50 mL water (3 keer). Redisperse van deeltjes in 3 mL ddd water en bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing (35 kHz, amplitude van 100%).
3. Magnetische deeltjes grootte analyse met behulp van DLS
- grootte van de deeltjes in water
- gebruik een DLS-instrument waarvoor een terug verstrooiing detector hoek (173 °) en een bundel golflengte van 633 nm.
Opmerking: Achterwaarts-verstrooiing DLS is geschikt voor geconcentreerde monsters waar meerdere verstrooiing kan worden vermeden. Kant verstrooiing (detector hoek 90°) en forward-verstrooiing (detector hoek 15°) DLS zijn geschikt voor kleinere deeltjes en deeltjes, respectievelijk gemengd. - Voorafgaande aan meten in water, bewerk ultrasone trillingen ten deeltjes voor 3 min.
Opmerking: Gebruik verdunde oplossing van de deeltjes. Voor dit doel, meng u 9,6 µL van deeltjes met 96 µL van water. - Zorgvuldig Pipeteer 50 µL van deeltje oplossing in polystyreen latex cuvettes en de vorming van luchtbellen vermijden.
Opmerking: Voor elk monster, gebruikt wegwerp cuvette (zie tabel van materialen). - Merk op de duidelijkheid van de meetcel en de richting van de lichtbundel. De cel ingevoegd in de monsterhouder en sluiten de kamer.
- De volgende parameters gebruiken voor het meten: temperatuur: 25 ° C; refractive index van dispersief fase (ijzer): 2.344; refractive index van dispersief milieu (water): 1,333
Opmerking: Uitvoeren van meting van het gebruik van een refractometer voor meer accurate resultaten, met name bij het ontwikkelen van nieuwe of hybride materialen brekingsindex.
- gebruik een DLS-instrument waarvoor een terug verstrooiing detector hoek (173 °) en een bundel golflengte van 633 nm.
4. Voorbereiding van DNA Stock, magnetische deeltjes en bindende Buffer
- DNA voorraad
- gebruik 10 mM Tris-HCL buffer (pH = 8) voor verdunning en opslag van DNA. Gebruik een standaardmonster van DNA die kan worden versterkt, specifiek met een directe PCR protocol in het laboratorium (verwijs naar punt 5.2 voor reactie instellingen en omstandigheden). Om te vullen 498 basenpaar (bp) van het gen xis van bacteriofaag lambda controle, gebruikt u de volgende inleidingen. Toekomen primer: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Omgekeerde primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
- zuiveren PCR product met behulp van commerciële DNA zuivering kit.
Opmerking: Commerciële kits met behulp van silica kolom gebaseerde procedure opbrengst > 100 ng/µL gezuiverd DNA. - Maatregel concentratie van DNA spectrofotometrische methode (absorptie bij 260 nm). Verdun de DNA-voorraad van 10 11 kopieën/µL zoals hierboven geïnstrueerde tot werkende oplossingen van 10 10, 10 9, 10, 8 en 10 7 kopieën/µL.
Opmerking: Het aantal exemplaren van het PCR-product kan worden berekend volgens de volgende vergelijking, ervan uitgaande dat gemiddeld molecuulgewicht 650 Da voor elke bp:
DNA-kopieën/µL = (aantal in ng/µL * 6.022x10 23 kopieën/mol) / (498 bp * 650 g/mol van bp * 1 x 10 9 ng/g)
- magnetische deeltjes
- toestaan deeltjes sediment zonder de magneet en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Mix 1:20 v/v-verhouding van magnetische deeltjes met ddd water (deeltjes: water).
Opmerking: Volume gebaseerde benadering is gebruikt om te beschrijven van hoeveelheden van magnetische deeltjes aangezien gelijke massa's MNPs en MMP gemakkelijk moeilijk waren te vergelijken.
- toestaan deeltjes sediment zonder de magneet en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Mix 1:20 v/v-verhouding van magnetische deeltjes met ddd water (deeltjes: water).
- Bindend buffer
- voor snelle bereiding van 0,75 M natrium acetaat-HCL-oplossing (pH = 6), meng 1 mL 3 M Natriumacetaat met 1 mM HCL 3 mL.
Opmerking: Alle oplossingen in bindende gebruikt kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C. opmerking dat lage temperatuur binden met name in het geval van ethanol oplossing aanzienlijk verhoogt. Zorgvuldig controleren van de temperatuur van oplossingen voor betere reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van screening.
- voor snelle bereiding van 0,75 M natrium acetaat-HCL-oplossing (pH = 6), meng 1 mL 3 M Natriumacetaat met 1 mM HCL 3 mL.
5. Testen van de efficiëntie van DNA isolatie met behulp van kwantitatieve PCR
- DNA isolatie door gewijzigde MMP of MNPs
- gebruiken een 96-wells-plaat en een magneet aangepast voor 96-wells-plaat voor klein volume experimenten.
- Gebruik het volgende bindende oplossing mengsel: 8 µL bewerkt MMP of MNPs, 10 µL natrium acetaat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL van 85% ethanol, 10 µL DNA (10 10 exemplaren-oplossing).
- Mix goed door pipetteren en laat de plaat op de magneet voor 3 min. Terwijl de plaat op de magneet, verwijderen van de oplossing en voeg 100 µL van 85% ethanol voor wassen.
- Verwijderen ethanol.
Opmerking: Laat de ethanol te drogen voor een paar seconden maar laat niet de deeltjes te drogen of Toon van scheuren. Als de deeltjes te drogen ze zullen moeilijk te ontbinden met elutie oplossing. - Verwijderen de plaat uit de magneet en voeg 40 µL van elutie oplossing. Meng goed door pipetteren. Plaats de plaat terug op de magneet en verzamelen geëlueerd DNA (~ 37 µL). Eluens bij-20 ° C bewaren tot nadere analyse.
- Kwantitatieve PCR
- gebruiken de inleidingen die werden gebruikt voor het bereiden van voorraad DNA in stap 4.1.1 te kwantificeren van kopieën van het gen xis, volgens het protocol door Haddad et al.. 10
- master mix oplossing volgens de hoeveelheid monsters moeten worden getest voor te bereiden, dan het mengsel over PCR buizen of een witte achtergrond 96-wells-plaat verdelen.
- De volgende hoeveelheden gebruiken voor een volledig volume van 20 µL PCR mengsel: 10 µL polymerase / intercalating kleurstof mengsel (zie tabel van materialen), 2 µL DNA-monster, 2 µL voorste primer (10 µM), 2 µL omgekeerde primer (10 µM)
- Instellen de thermocycler volgens het volgende programma: 95 ° C gedurende 120 s, 40 cycli (95 ° C gedurende 15 s, 64 ° C gedurende 15 s, 68 ° C gedurende 45 s), 68 ° C gedurende 5 min.
- Using triplicates voor normen en monsters, de drempel van de cyclus berekenen en construeren van een standaard curve voor het inschatten van het aantal kopieën van het DNA in elk monster opgehaald. Het instrument hier dit automatisch uitgevoerd.
- Hier, het aantal kopieën van het DNA wordt geschat voor totale elutievolume (~ 40 µL). Percentage van DNA ontvangen overeenkomt met het oorspronkelijke bedrag toegevoegd aan de oplossing (totaal 10 11 exemplaren) bindend kan variëren buiten het interval van 0 tot 100.
6. DNA-magnetische deeltjes bindende analyse met behulp van DLS
- Binding van DNA
- voor grote volume experimenten (in 1,5 mL tube), gebruik de volgende bindende oplossing mengsel: 96 µL bewerkt MMP of MNPs, 120 µL natrium acetaat-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL van 85% ethanol, 120 µL DNA (10 10 exemplaren oplossing) of 120 µL Tris-HCL buffer (10 mM, pH = 8) voor besturingselement.
- Zeta onderzoek naar de potentiële
- voorbereiden twee bindoplossingen, één met DNA en een ander met Tris-HCL buffer voor controle volgens de instructies in stap 6.1.1. Voorkom de vorming van luchtbellen, zorgvuldig Pipetteer 800 µL van het mengsel van bindende in een wegwerp cel.
Opmerking: Gebruik wegwerp cuvette voor meting van oppervlakte zeta potentiële (zie tabel van materialen).
- voorbereiden twee bindoplossingen, één met DNA en een ander met Tris-HCL buffer voor controle volgens de instructies in stap 6.1.1. Voorkom de vorming van luchtbellen, zorgvuldig Pipetteer 800 µL van het mengsel van bindende in een wegwerp cel.
- De volgende parameters gebruiken bij de meting op DLS instrument: Smoluchowski model met een F(ka) van 1,5, temperatuur: 25 ° C, brekingsindex van dispersief fase (ijzer): 2.344, brekingsindex van dispersief milieu (Water): 1,333.
Opmerking: Het aantal DNA-magnetische deeltjes interactie is direct invloed op de meting van replicaat-organismen. Een enkele meting door het instrument neemt 60-70 s. Hier, werd het instrument opgedragen te nemen 10 metingen met 1 min vertraging intervallen. Voor de eenvoud, de resultaten worden getoond op moment 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 min uit de eerste lezing =.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol beschreven hier voor chemische synthese en wijziging van magnetische deeltjes, werden zes magnetische deeltjes gesynthetiseerd en geanalyseerd voor het DNA binden. Een samenvatting van de analyse wordt weergegeven in tabel 1. Door vergelijking van de grootte van de deeltjes in water en in bindoplossing, is het duidelijk dat alle deeltjes in oplossing bindend door 2-22 plooien samengevoegd. Sommige deeltjes verder samengevoegd tot meer plooien in de aanwezigheid van DNA; maar dit was niet direct gecorreleerd met DNA ophalen gedetecteerd door kwantitatieve PCR (tabel 1). Vergelijking van zeta potentiële (10 metingen in intervallen van ~ 2 min) van deeltjes in besturingselementen versus met de scherpe daling van de DNA toonde in drie deeltjes; namelijk: MNPs_APTES, MMPs_TEOS en MMPs_APTES (Figuur 2). Trends in zeta potentiële na verloop van tijd werden ook waargenomen, variaties in de eerste drie lezingen te tonen voordat ze worden gestabiliseerd in de meeste gevallen (Figuur 3). Variatie na blootstelling aan DNA werd meestal waargenomen in MMP (Figuur 2). Lagere standaarddeviatie werd waargenomen door het weglaten van de eerste drie lezingen als eerste 5 min na blootstelling van deeltjes aan DNA (tabel 1).
Totale toont weergave van de analyse in tabel 1 de verschillende kenmerken van DNA-deeltjes bindende zoals toegeschreven aan magnetische deeltjesgrootte en chemische wijzigingen. Kort, MNPs_PEI nanodeeltjes groter geworden na het binden van DNA door vier plooien met geen significante verandering in polydispersiteit index of zeta potentiële. DNA was echter niet opvraagbaar in deze procedure. MNPs_TEOS nanodeeltjes in grootte toegenomen en daalde in polydispersiteit index met onmerkbaar verandering in zeta potentiële na DNA blootstelling, maar ze de beste deeltjes in hun tarieven ophalen op 20,3 waren %. MNPs_APTES nanodeeltjes daalde licht in grootte en merkbaar in zeta potentiële bij DNA blootstelling. MMPs_PEI microdeeltjes toonde geen verandering in grootte bij DNA blootstelling, echter zij stegen in polydispersiteit index en daalde licht in zeta potentiële. MMPs_TEOS microdeeltjes toonde alternatieve grootte kenmerken aan hun nanoparticle tegenhangers d.w.z. MNPs_TEOS. Verrassend, daalde ze aanzienlijk in zeta potentiële maar niet buiten het bereik weergegeven door MNPs_TEOS. MMPs_APTES in deeltjesgrootte bij DNA blootstelling toegenomen en ook daalde in zeta potentiële. Het is belangrijk op te merken dat zowel MNPs_APTES als MMPs_APTES vergelijkbare capaciteit behouden nadat chemische wijziging ondanks het feit dat ze werden gemaakt van verschillende precursoren grootte. Ze hebben ook soortgelijke bindende eigenschappen weergegeven. MNPs_TEOS toonde geen significante verandering in zeta potentiële door hun waarden in het laagste uiterste geconstateerd in deze studie.
De follow-up na verloop van tijd voor zeta potentiële toonde stabiliserende waarden na 5-10 min, met name in het geval van MNPs (figuur 3A, 3 C en 3E). Een continue tendens in zeta potentiële werd gevonden in sommige MMP lezingen (figuur 3B, 3D en 3F). In sommige gevallen overeenkwam variaties in zeta potentiële met variaties in polydispersiteit index en deeltje grootte maar niet met DNA ophalen door elutie.
Figuur 1: Protocol regeling. (A) chemische wijzigingen van magnetische deeltjes met inbegrip van vertakte polyethyleneimine, silica en amino groepen. (B) DNA isolatie stappen met behulp van bindende buffer en magnetische deeltjes geïmmobiliseerd op magneet, gevolgd door kwantitatieve PCR. (C) DNA-deeltjes bindende analyse met behulp van Distributielijsten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Zeta potentieel van representatieve magnetische deeltjes in de aanwezigheid en afwezigheid van DNA. Zichtbare daling van zeta potentiële veroorzaakt blootstelling aan DNA in MNPs_APTES, MMPs_TEOS en MMPs_APTES. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (N = 10). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Zeta potentieel van representatieve magnetische deeltjes na verloop van tijd in de aanwezigheid en afwezigheid van DNA. Zeta potentieel van deeltjes in oplossing bindend werd gemeten op tijd = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 min. kloof tussen de potentiële curven van zeta van besturingselement vs. met DNA zijn duidelijk in gevallen van MMPs_TEOS, MNPs_APTES en MMPs_APTES. (A) Zeta potentieel van MNPs_PEI is zeer positief dat aangeeft geen interacties. (B) Zeta potentieel van MMPs_PEI daalde na verloop van tijd suggereren een zeer trage interactie tussen deeltjes en DNA. (C) Zeta potentieel van MNPs_TEOS was zeer negatief afwezigheid en aanwezigheid van DNA. (D) Zeta potentieel van MMPs_TEOS geeft lagere waarden in aanwezigheid van DNA in vergelijking met besturingselementen. (E) Zeta potentieel van MNPs_APTES geeft lagere waarden in aanwezigheid van DNA in vergelijking met besturingselementen. (F) Zeta potentieel van MMPs_APTES geeft lagere waarden in aanwezigheid van DNA in vergelijking met besturingselementen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Kenmerken | MNPs_PEI | MNPs_TEOS | MNPs_APTES | MMPs_PEI | MMPs_TEOS | MMPs_APTES |
| Deeltjesgrootte (nm) | ||||||
| in water | 141,8 | 91,3 | 1106.4 | 825.0 | 1281.3 | 1281.3 |
| in bindoplossing | 531.2 | 1990.1 | 3091.0 | 2669.0 | 2669.0 | 1990.1 |
| in bindin |
Tabel 1: karakterisering van representatieve magnetische deeltjes en hun capaciteiten om te binden en DNA halen. Bij blootstelling aan bindoplossing toonden alle deeltjes aggregatie (stijging van deeltjesgrootte). Toen DNA aanwezig in oplossing bindend was, was de verhoging van de grootte van het deeltje zichtbaar in MNPs_PEI, MNPs_TEOS en MMPs_APTES. Deeltjes waren polydisperse systemen in bindende oplossing, met name MNPs_TEOS die werd minder polydispersed bij binding van DNA. MNPs_APTES toonde toename polydispersiteit index en zeta potentiële bij blootstelling aan DNA afname. MMPs_TEOS en MMPs_APTES toonde grote afname zeta potentiële bij blootstelling aan DNA. MNPs_TEOS en MMPs_TEOS toonde de hoogste percentages van de herwinning van de DNA van 20,3% en 7,5%, respectievelijk, zoals blijkt uit kwantitatieve PCR. MNPs_APTES en MMPs_APTES toonde 0,1% DNA ophalen tarieven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol werden de theoretische principes die DNA binding met magnetische deeltjes via zeta potentiële verklaren onder vraag. Het protocol beschrijft de synthese en de wijziging van magnetische nanodeeltjes en microdeeltjes. Methode voor de bereiding van DNA controle en bindende oplossing worden ook beschreven. Twee strategieën worden hier weergegeven voor screening van DNA-deeltjes interacties: kwantitatieve PCR en DLS benadert. DLS biedt drie indicatoren van fysisch-chemische veranderingen in deeltjes: deeltjesgrootte, polydispersiteit index en zeta potentiële. Deeltje formaatwijzigingen aangeven direct aggregatie of desintegratie. Polydispersiteit indexwaarde beschrijft de verdeling van de deeltjesgrootte soorten in het systeem variërend van monodispersed (index < 0.05) tot zeer polydispersed (index > 0.7). Zeta potentiële kunt classificeren deeltjes volgens oppervlakte kosten waar zeer positieve deeltjes waarden groter tonen dan 30 mV en zeer negatieve deeltjes Toon waarden lager dan -30 mV. Zoals voorspeld daalde het potentieel van de zeta van polycharged magnetische deeltjes in oplossing relatief bindend wanneer de deeltjes werden blootgesteld aan DNA. De uitzondering op deze regel is MNPs_TEOS. Deze deeltjes verschillen alleen in dat zij beschikken over een unieke zeer negatieve oppervlakte lading (Figuur 2). Dit suggereert dat Ionische sterkte een belangrijke rol speelde in de deeltjes, DNA en positieve ionen bijeen te houden. De veranderingen in de deeltjesgrootte kunnen aan de andere kant, de rol van neerslag/aggregatie van DNA-deeltjes aangeven tijdens het bindende vooral in aanwezigheid van langere DNA-strengen.
Tijdens de synthese van magnetische deeltjes en chemische wijzigingen, zijn er verschillende kritische stappen die aandacht vragen: ten eerste, de reproduceerbaarheid van de methode van synthese is sterk afhankelijk van de nauwkeurige hoeveelheid chemische precursoren gebruikt synthese en goed roeren en tijdige gecontroleerde toevoeging van NH4OH. Om te krijgen een gehomogeniseerde bevolking van deeltjes (van vergelijkbare grootte, vorm, dichtheid en samenstelling), is het belangrijk om ultrasoonapparaat en opzwepende stappen grondig wanneer geïnstrueerd te volgen. Ten tweede, realistisch vaak doen de chemische wijzigingen niet voorspellen de realiteit van wat er op het oppervlak van magnetische deeltjes. Een karakterisering van het uitgebreide stap is vereist voor het bevestigen van de chemische samenstelling van het oppervlak van de deeltjes, zoals beschreven in de sectie Inleiding. Onder de gebruikte technieken, zijn onderzoekers afhankelijk van FTIR, XPS, elektrochemie, spectroscopie, evenals DLS.
Daarnaast zijn verschillende kritische stappen vereist tijdens de DLS metingen en analyse: ten eerste, de keuze van bindende oplossing van invloed is op verschillende stappen waaronder chemische mengbaarheid met deeltjes, DNA en ook de spectrale eigenschappen. Keuze van de brekingsindices van bindende oplossing en deeltje materiaal kan worden gebaseerd op eerdere studies of geëvalueerd door refractometrie. Ten tweede moeten interactie tussen de deeltjes en de elektroden in de cuvettes zorgvuldig worden gecontroleerd zoals oxidatie/vermindering proces van invloed kan zijn op de meting. Ten derde, zoals blijkt uit Figuur 3, kunnen het tempo van de bindende functie van de tijd. Het is essentieel voor het observeren van de stabiliteit van de interactie, en dit is een groot voordeel voor toepassing van Distributielijsten in dergelijke studies. De waarnemer houdt hier toezicht deeltje aggregatie en physiochemical veranderingen in real-time. Ten vierde, polydispersiteit van het systeem kunt instellen beperkingen op het toepassingsgebied van de analyse. Polydispersiteit indexwaarde lager is dan 0,05 beschrijft een monodispersed systeem, terwijl waarden boven de 0,7 een polydispersed systeem van verschillende grootte van de deeltjes beschrijven. De grootte van de deeltjes en verdeling van de verschillende deeltjes soorten kunnen worden bestudeerd met behulp van verschillende soorten DLS, met inbegrip van achterwaarts-verstrooid, kant-verstrooid en verder verspreid, zoals vermeld in sectie 3.1 protocol. Ten slotte, ultrasoonapparaat van deeltjes vóór de test kan uiteraard invloed hebben op hun fysische eigenschappen (b.v. de grootte en oppervlakte) en overdreven gedaan kan leiden tot vrijlating van sommige chemische wijzigingen.
In dit protocol wordt informatie verkregen via DLS vergeleken met gegevens overgenomen door kwantitatieve PCR, ook bekend als real-time PCR. De laatste is de gouden standaard voor detectie en kwantificatie van DNA. 15 PCR techniek wordt veel gebruikt in laboratoria, ziekenhuizen en universiteiten. Bij het testen van DNA blootstelling aan roman en samengestelde materialen is het echter belangrijk dat de chemie van PCR in aanmerking nemen. Polymerase enzym, het belangrijkste element van de Kettingreactie van de polymerase, is gevoelig voor bepaalde chemische inhibitoren en versterkers. Toevoeging van interne controles, testen van de synthetische materialen, en goede laboratoriumpraktijken kan helpen verminderen vooroordelen in PCR-resultaten. Mechanismen van actie voor remmers en versterkers variëren tussen chemicaliën die rechtstreeks aan de polymerase binden en anderen die ionen uit de Mg2 chelaat +-afhankelijke polymerase in oplossing. Sommige inzichten over DNA isolatie zijn moeilijk te krijgen met behulp van PCR screening. Distributielijsten kunt weergeven wanneer DNA aan deeltjes bindt maar eerder wordt gewassen of doet niet Elueer (DNA niet gedetecteerd door PCR) gevallen. Bijvoorbeeld, zowel MNPs_APTES als MMPs_APTES toonde significante afname zeta potentiële bij DNA blootstelling (tabel 1) maar het DNA ontdekt in elutie deed niet correleren met deze resultaten. Het is mogelijk om te wijzigen de binding, wassen, elutie oplossingen om het vrijkomen van DNA uit deeltjes. DLS is een relatief sneller methode voor de evaluatie van DNA-deeltjes interacties. De stabiliteit en de snelheid van interactie kunnen ook worden waargenomen door deze methode (Figuur 3), die kan invloed hebben op de tijd gebruikt in magnetische deeltjes - op basis van de protocollen van de isolatie van DNA.
De uitdagingen voor het gebruik van Distributielijsten in analyse zijn ongecompliceerd. Deze techniek vereist een relatief grote monstervolume p.a. (~ 1 mL) in vergelijking met PCR. Sommige parameters zoals brekingsindices vereisen zorgvuldige evaluatie wanneer u nieuwe oplossingen voor de monsters. Bovendien is het heel gebruikelijk om oxidatie/vermindering van reacties op de elektroden van cuvettes observeren bij het testen van nieuwe materiaal. Zorgvuldige beoordeling en kennis van de chemische samenstelling van het monster kunnen helpen bij het evalueren van de haalbaarheid van het hergebruik van de dezelfde cuvette. Het is vermeldenswaard dat DLS analyse beperkt tot de specificiteit en de gevoeligheid geboden door PCR is, maar het biedt verschillend soort inzicht aan het DNA-deeltjes bindend proces.
Zoals alle spectroscopische technieken, wijzigingen en probleemoplossing van Distributielijsten streven naar ontwikkeling van nauwkeuriger en gevoelige metingen. Dit kan worden bereikt door middel van beter begrip van de aard van het materiaal getest fysisch en chemisch. Met andere woorden, zijn optische eigenschappen en details van chemische samenstelling de sleutel tot het krijgen van nauwkeurige en gevoelige gegevens van Distributielijsten. Optische eigenschappen kunnen worden verworven door refractometrie, terwijl de chemische samenstelling van deeltjes / deeltjes oppervlak kan bestudeerd worden door verschillende technieken zoals FTIR, XPS, elektrochemie en andere spectroscopische methoden. In dit protocol kan bindoplossing worden verbeterd met behulp van verschillende Ionische sterktes, andere dehydraterend agentia (bijvoorbeeld isopropanol), diverse pH en lage temperaturen. Aan de andere kant, worden de chemische wijzigingen van deeltje oppervlak overgelaten aan de verbeelding van de de chemici.
De ontwikkeling van materialen voor isolatie van DNA zullen blijven stijgen in de komende decennia met meer nadruk op specificiteit, zuiverheid en aantoonbaarheidsgrens. De kwaliteit van extractiemethoden speelt belangrijke rol in de studies van eencellige schaal, metagenomic schalen en monsters van ongebruikelijke oorsprong. Op dit moment is het belangrijk om DLS analyses van nanodeeltjes en microdeeltjes bewerkt met verschillende soorten materialen uit te voeren. Deze stap is vereist voordat een sterk theoretisch model dat het gedrag van DNA-deeltjes interacties beschrijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De financiële steun van de Tsjechische Science Foundation (project GA CR 17-12816S) en CEITEC 2020 (LQ1601) wordt sterk erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
