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Chemistry

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56815
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

Summary

Ce protocole décrit la synthèse de particules magnétiques et évaluation de leurs propriétés de liaison à l’ADN par l’intermédiaire de diffusion de la lumière dynamique et électrophorétique. Cette méthode met l’accent sur la surveillance des changements dans la taille des particules, leur polydispersité et major de potentiel zêta de surface de particules qui jouent rôle dans la fixation des matières telles que l’ADN.

Abstract

Isolement de l’ADN à l’aide de particules magnétiques est un domaine de grande importance dans la recherche de biotechnologie et biologie moléculaire. Ce protocole décrit l’évaluation de particules magnétiques ADN liaison via la diffusion de la lumière dynamique (DLS) et diffusion de la lumière électrophorétique (ELS). Analyse par DLS fournit des renseignements précieux sur les propriétés physico-chimiques des particules dont la taille des particules et polydispersité potentiel zêta. Ce dernier décrit la charge de surface de la particule qui joue le rôle majeur dans la liaison électrostatique de matériaux tels que de l’ADN. Ici, une analyse comparative exploite trois modifications chimiques des nanoparticules et de microparticules et de leurs effets sur l’attache d’ADN et d’élution. Modifications chimiques de ramifié polyéthylènimine, triéthoxysilane (3-aminopropyl) et de l’orthosilicate de tétraéthyle sont l’objet d’une enquête. Puisque l’ADN montre une charge négative, il est prévu que potentiel zêta de surface de la particule diminue lors de la liaison de l’ADN. Formant des grappes devrait également affecter la taille des particules. Afin d’étudier l’efficacité de ces particules dans l’isolement et l’élution de l’ADN, les particules sont mélangés avec de l’ADN dans pH faible (~ 6), force ionique élevée et environnement de la déshydratation. Les particules sont lavés sur aimant et ensuite l’ADN est éluée par tampon Tris-HCl (pH = 8). Nombre de copies d’ADN est estimée à l’aide de la PCR quantitative (PCR). Potentiel zêta, granulométrie, polydispersité et données quantitatives de PCR sont évaluées et comparées. DLS est un perspicace et méthode d’analyse qui ajoute une nouvelle perspective au processus de projection de particules pour l’isolement de l’ADN.

Introduction

Isolement d’ADN est une des étapes plus essentiels en biologie moléculaire. Le développement de méthodes d’extraction des acides nucléiques a grand impact sur les domaines émergents de la génomique métagénomique, épigénétique et transcriptomique. Il y a un large éventail d’applications biotechnologiques pour l’isolement de l’ADN y compris médicale (médecine légale/diagnostic tools et biomarqueurs pronostiques) et applications pour l’environnement (biodiversité métagénomique, prévalence de l’agent pathogène et surveillance). Il y a eu une demande croissante de purifier et d’isoler l’ADN de différents matériaux et à des échelles différentes telles que sang, urine, sol, bois et autres types d’échantillons. 1 , 2 , 3 , 4

Nano et micro-particules sont aptes au sectionnement de l’ADN en raison de leur grande surface et en particulier lorsqu’ils peuvent être immobilisés par un champ magnétique. Propriétés physico-chimiques des particules, comme la taille ou la charge, peuvent grandement influencer leur capacité à fixer des cibles de biomolécules. 5 afin de renforcer la liaison des biomolécules et de stabiliser les particules, différentes modifications chimiques (revêtements de surface) peuvent être utilisées. Les nombreuses stratégies différentes pour la liaison sont classés selon les interactions covalentes et non covalents. 6 la taille des particules affecte directement leurs propriétés d’aimantation, considérant que la composition des particules peut être adaptée par l’incorporation de matériaux métalliques, alliage ou autres susceptibles d’influencer sa densité, la porosité et la surface. 7 il n’y aucun moyen fiable pour mesurer la charge de surface des petites particules. Au lieu de cela, le potentiel électrique sur le plan de glissement (certaine distance de la surface des nanoparticules) peut être mesuré. 8 cette valeur s’appelle zeta potentiels et c’est un outil puissant qui est habituellement utilisé pour l’évaluation de la stabilité au moyen de microparticules et de nano - par l’intermédiaire de listes de distribution. 9 étant donné que sa valeur dépend non seulement du pH et de la force ionique du milieu dispersif, mais également sur les caractéristiques de surface des particules, il peut s’avérer les changements dans cette surface causée par l’interaction entre les les particules et la molécule d’intérêt. 10

En revanche, structure de l’ADN sous conditions déshydratés (ADN-ADN A formule) expositions conformations compactée qui facilitent sa précipitation (agrégation) comparativement à couramment survenant forme B-ADN. Électrostatique (ionique et liaison hydrogène) sont les principales forces qui contrôle la liaison d’ADN à d’autres matériaux en raison de leur encombrement stérique accessible phosphate et azote bases (surtout guanine). 7 , 10

Dans cet ouvrage, trois modifications chimiques représentante des nanoparticules magnétiques et les microparticules sont analysées (Figure 1 a). La méthode de synthèse et de la modification chimique des nanoparticules et de microparticules sont décrite. Une solution de liaison, qui accorde aux principes théoriques de la précipitation de l’ADN (pH, force ionique et la déshydratation), sert à évaluer l’élution et la fixation à l’ADN. PCR quantitative est utilisée pour évaluer l’efficacité d’élution de l’ADN des nanoparticules représentatifs et microparticules (Figure 1 b). La taille des particules, l’indice de polydispersité et potentiel zêta sont des paramètres importants qui sont utilisées pour visualiser les modifications physico-chimiques qui se produisent sur la surface des particules (Figure 1). Il est important de mettre l’accent sur la caractérisation chimique de la surface de particules magnétiques. Alors que cette étape était au-delà de la portée du présent protocole, plusieurs techniques modernes peuvent être appliquées pour étudier l’efficacité de modifications chimiques. 11 , 12 , 13 , 14 spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) peut être utilisée pour évaluer le spectre infrarouge de la surface de la particule et la comparer au spectre de modificateurs chimiques libres. Spectrométrie de photoélectrons (XPS) est une autre technique qui peut être utilisée pour identifier la composition élémentaire de la surface du matériau. Autres méthodes spectroscopiques et microscopiques et électrochimiques peuvent servir à faire la lumière sur la qualité de la synthèse de la particule. Ce travail met en évidence une nouvelle perspective à l’analyse des interactions ADN-magnétiques de particules par l’intermédiaire de listes de distribution.

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Protocol

1. synthèse de nanoparticules magnétiques

  1. synthèse de nanoparticules magnétiques stabilisé avec du citrate (MNPs)
    1. Ajouter 20 mmol de FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5,406 g) et 10 mmol de FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) dans 20 mL d’eau bidistillée désoxygéné (ddd eau). Remuez obtenu solution vigoureusement dans le bécher sous atmosphère de 2 N à l’aide d’un agitateur mécanique jusqu'à l’obtention d’une solution transparente.
    2. Sous agitation mécanique rapide, ajouter 150 mL de 1 M NH 4 OH, goutte à goutte à l’aide d’entonnoir (prendre 1 h ou plus si nécessaire). Transvaser la solution dans un récipient visser après avoir ajouté tous les NH 4 OH. Vissez la solution de navire et de la chaleur à 75 ° C pendant 30 min.
      ATTENTION : NH 4 OH est classé comme corrosifs et dangereux pour l’environnement.
      NOTE : Préparer la solution 4 OH NH de haut grade 28 % NH 4 OH dans l’eau à l’aide d’eau désoxygénée.
    3. Recueillir le précipité noir avec aimant et lavage à l’aide de 100 mL d’eau de ddd. Répéter 3 fois. Ajouter 50 mL de dihydrate de citrate trisodique 0,5 M à précipiter. Vissez le navire.
      Remarque : Utiliser une solution désoxygénée de dihydrate de citrate trisodique.
    4. Re-disperser le précipité par sonication (35 kHz, amplitude de 100 %) et le bateau thermique à 80 ° C pendant 1 h.
      Remarque : Un sonicateur d’une puissance suffisante est nécessaire.
    5. Laissez le refroidir de solution à température ambiante. Recueillir le précipité à l’aide d’un aimant et éliminer le surnageant. Re-disperser une boue noire dans 50 mL d’eau de ddd utilisant sonicateur (35 kHz, amplitude de 100 %).
    6. Transfert des aliquotes (~ 25 mL) dans des tubes à centrifuger 50 mL et ajouter 20 mL d’acétone. Centrifuger à 2400 x g pendant 10 min et enlever les surnageants.
    7. Re-disperser précipité et dialyser solution contre l’eau à l’aide de dispositif dialyse à coupure de volume approprié de faible poids moléculaire (500-1 000 Da) pendant 24 h.
      NOTE : Préparez l’appareil de dialyse selon fabricant ' exigences de s.
  2. Synthèse de nanoparticules magnétiques modifiés avec ramifiés polyéthylènimine (MNPs_PEI)
    1. Ajouter 2 mL de solution de MNPs obtenue (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 38 mL d’eau de ddd et soniquer (35 kHz, amplitude de 100 %) de la suspension (10 min).
    2. Sous agitation mécanique rapide, ajouter 10 mL de 10 % ramifiée polyéthylènimine (moyenne 25 kDa). Remuer la solution pendant les 3 h
    3. Collect précipite utilisant des aimants et éliminer le surnageant. Re-disperser précipité dans 20 mL d’eau ddd. Répétez 5 fois puis laisser agir la suspension définitive (35 kHz, amplitude de 100 %).
  3. Synthèse de nanoparticules magnétiques particules modifié avec de la silice (MNPs_TEOS)
    1. Ajouter 10 mL de la solution obtenue de MNPs (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 60 mL d’eau et 130 mL d’éthanol. Laisser agir la solution et ajouter 6 mL de 28 % NH 4 OH.
    2. Sous agitation mécanique rapide, ajouter 1 mL d’orthosilicate de tétraéthyle. Remuer la solution pour les 12 h.
    3. Recueillir le précipité noir utilisant des aimants et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Les particules re-disperse dans 10 mL de ddd d’eau et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).
  4. Synthèse de nanoparticules magnétiques modifiés avec des groupes amino (MNPs_APTES)
    1. Ajouter 5 mL de la solution obtenue de MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 45 mL d’eau et 50 mL d’éthanol. Laisser agir la solution (35 kHz, amplitude de 100 %).
    2. Sous agitation mécanique rapide, ajouter 0,5 mL de triéthoxysilane (3-aminopropyl). Remuer la solution pendant les 3 h
    3. Recueillir le précipité noir utilisant des aimants et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Les particules re-disperse dans 5 mL de ddd d’eau et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).

2. Synthèse de microparticules magnétiques

  1. synthèse de microparticules magnétiques stabilisé avec du citrate (MMP)
    1. Ajouter 25 mL de 2 M 3 KNO, 12,5 mL 1 m KOH et 205,875 mL d’eau de ddd dans un récipient de visser. Ajouter 6,675 mL de 1 M FeSO 4 pendant l’agitation magnétique. Navire de transfert immédiatement à un bain-marie préchauffé (90 ° C) pendant 2 h.
      NOTE : Préparez KNO 3 et solutions KOH dans ddd eau.
    2. Laissez le refroidir de solution à température ambiante. Recueillir le précipité noir avec aimant et lavage à l’aide de 50 mL d’eau de ddd (5 fois). Ajouter 50 mL de dihydrate de citrate trisodique 0,5 M à précipiter. Vissez le navire.
    3. Redisperse le précipité par sonication (35 kHz, amplitude de 100 %) et le bateau thermique à 80 ° C pour précipité noir frais virés de 1 h. à l’aide de magnet et le lavage à l’aide de 50 mL d’eau de ddd (10 fois).
    4. Modifier la MPM avec ramifiés polyéthylènimine (MMPs_PEI), silice (MMPs_TEOS) et les groupes amino (MMPs_APTES) qui est similaires au protocole MNPs. Reportez-vous aux sections 2.2, 2.3 et 2.4, respectivement pour plus de détails.
  2. Synthèse de microparticules magnétiques modifiés avec ramifiés polyéthylènimine (MMPs_PEI)
    1. Ajouter 5 mL de solution de MMP (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 38 mL d’eau de ddd et laisser agir la solution (35 kHz, amplitude de 100 %, 10 min). Sous agitation mécanique rapide, ajouter 10 mL de 10 % ramifiée polyéthylènimine (moyenne 25 kDa). Remuer la solution pendant les 3 h
    2. Recueillir le précipité à l’aide d’un aimant et éliminer le surnageant. Redisperse précipité dans 20 mL d’eau bidistillée. Répétez 5 fois puis laisser agir la solution finale (35 kHz, amplitude de 100 %).
  3. Synthèse de microparticules magnétiques modifiés à de la silice (MMPs_TEOS)
    1. Ajouter 5 mL de solution de MMP (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 60 mL d’eau et 130 mL d’éthanol. Soniquer suspension (35 kHz, amplitude de 100 %) et ajouter 6 mL de 28 % NH 4 OH.
    2. Sous agitation mécanique rapide, ajouter 1 mL d’orthosilicate de tétraéthyle. Remuer la solution pour les 12 h.
    3. Recueillir le précipité noir à l’aide d’un aimant et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Redisperse particules dans 5 mL d’eau de ddd et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).
  4. Synthèse de microparticules magnétiques modifiés avec des groupes amino (MMPs_APTES)
    1. Ajouter 3 mL de solution de MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 45 mL d’eau et 50 mL d’éthanol. Laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).
    2. Sous agitation mécanique rapide, ajouter 0,5 mL de triéthoxysilane (3-Aminopropyl). Remuer la solution pendant les 3 h
    3. Recueillir le précipité noir utilisant des aimants et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Redisperse particules dans 3 mL d’eau de ddd et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).

3. Magnétique particule taille analyse à l’aide de listes de distribution

  1. la taille des particules dans l’eau
    1. utiliser un DLS instrument qui s’applique à un angle de détecteur de diffusion arrière (173 °) et une longueur d’onde du faisceau de 633 nm.
      NOTE : Dos diffusion DLS est adaptée aux échantillons concentrés où diffusion multiple peut être évitée. Côté diffusion (angle 90° de détecteur) et la diffusion vers l’avant (angle 15° de détecteur) DLS sont adaptés pour les plus petites particules et mélangé les particules, respectivement.
    2. Préalable à la mesure dans l’eau, laisser agir particules pendant 3 min.
      Remarque : Utiliser une solution diluée de particules. Pour ce faire, mélanger 9,6 µL de particules avec 96 µL d’eau.
    3. Soigneusement distribuer 50 µL de solution de particules en polystyrène latex cuvettes en évitant toute formation de bulles.
      Remarque : Pour chaque échantillon, utilisez godet jetable (voir table des matières).
    4. Noter la clarté de la cuvette et la direction du faisceau lumineux. Insérer la cellule dans le porte-échantillon et fermer la chambre de.
    5. Utiliser les paramètres suivants pour la mesure : température : 25 ° C, indice de réfraction de la phase de dispersion (fer) : 2,344 ; indice de réfraction du milieu dispersif (eau) : 1.333
      Remarque : Effectuer le mesurage de l’indice de réfraction à l’aide d’un réfractomètre pour des résultats plus précis, particulièrement lors de l’élaboration de matériaux nouveaux ou hybride.

4. Préparation d’ADN Stock, particules magnétiques et tampon de liaison

    1. utilisation du stock de l’ADN un tampon 10 mM Tris-HCL (pH = 8) pour la dilution et le stockage de l’ADN. Utiliser un échantillon d’ADN standard qui peut être amplifié spécifiquement avec un protocole PCR direct en laboratoire (voir la section 5.2 pour conditions et paramètres de réaction). Pour amplifier les 498 paires de bases (bp) du gène xis de control de bactériophage λ, utiliser les amorces suivants. Apprêt en avant : 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Inverser l’apprêt : 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. produit de PCR purifier à l’aide de la trousse de purification de l’ADN commerciale.
      Remarque : Les kits commerciaux à l’aide de la procédure basée sur les colonnes de silice donnent > ADN purifiée à 100 ng/µL.
    3. Mesure de concentration de l’ADN à l’aide de la méthode spectrophotométrique (absorbance à 260 nm). Diluer le stock d’ADN de 10 11 copies/µL en suivant les instructions ci-dessus pour les solutions de travail de 10 10, 10 9, 10, 8 et 10 7 copies/µL.
      Remarque : Le nombre d’exemplaires du produit PCR peut être calculé selon l’équation suivante, en supposant que la masse moléculaire moyenne est de 650 Da pour chaque bp :
      ADN copies/µL = (quantité en ng/µL * 6.022x10 23 copies/mol) / (498 bp * 650 g/mol de bp * 1 x 10 9 ng/g)
  2. les particules magnétiques
    1. laisser les particules de sédiments sans l’aimant et éliminer le surnageant. Mélanger à 01:20 rapport v/v de particules magnétiques avec ddd eau (particules : eau).
      NOTE : Approche axée sur le Volume est utilisé pour décrire des quantités de particules magnétiques des masses égales de MNPs et MMP étant facilement difficiles à comparer.
  3. Lie tampon
    1. pour une préparation rapide de 0,75 M solution de sodium acétate-HCL (pH = 6), mélanger 1 mL d’acétate de sodium 3M avec 3 mL de HCL à 1 mM.
      Remarque : Toutes les solutions utilisées dans la liaison peuvent être conservées à 4 ° C. Note que basse température augmente de manière significative contraignant notamment dans le cas de la solution d’éthanol. Contrôler soigneusement la température des solutions pour une meilleure reproductibilité et précision du dépistage.

5. Essais d’efficacité d’Isolation utilisant Quantitative PCR de l’ADN

  1. isolement d’ADN par mis à jour le MMP ou MNPs
    1. utiliser une plaque à 96 puits et un magnet personnalisé pour plaque à 96 puits pour des expériences de petit volume.
    2. Utiliser le mélange de solution de liaison suivants : 8 µL modifiés MMP ou MNPs, 10 µL sodium acétate-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL d’éthanol de 85 %, 10 µL ADN (solution de copies 10 10).
    3. Mix bien en pipettant également et place la plaque sur l’aimant pendant 3 min. Alors que la plaque est sur l’aimant, enlever la solution et ajouter 100 µL d’éthanol de 85 % pour le lavage.
    4. Supprimer éthanol.
      Remarque : Laissez l’éthanol sécher pendant quelques secondes, mais ne laissez pas les particules trop sec ou montrer des fissures. Si les particules trop sec, ils seront difficiles à dissoudre avec solution d’élution.
    5. Enlever la plaque de l’aimant et ajouter 40 µL de solution d’élution. Mélangez bien en pipettant également. Replacez la plaque sur l’aimant et de recueillir les ADN éluée (~ 37 µL). Stocker l’éluant à-20 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.
  2. PCR Quantitative
    1. utiliser les amorces qui ont servi à préparer le stock ADN à l’étape 4.1.1 pour quantifier les copies du gène xis, conformément au protocole de Haddad et coll.. 10
    2. préparer la solution de mélange maître selon la quantité d’échantillons à tester, puis répartir le mélange dans les tubes PCR ou une plaque à 96 puits fond blanc.
    3. Utiliser les quantités suivantes pour un volume complet de 20 µL PCR mélange : 10 polymérase µL / intercalant mélange colorant (voir table des matières), l’échantillon d’ADN 2 µL, 2 µL avant l’apprêt (10 µM), 2 amorce inverse µL (10 µM)
    4. Mis en place le thermocycleur selon le programme suivant : 95 ° C pendant 120 s, 40 cycles (95 ° C pendant 15 s, 64 ° C pendant 15 s, 68 ° C pendant 45 s), 68 ° C pendant 5 min.
    5. Using réanalysés pour des normes et des exemples, calculer le seuil du cycle et de construire une courbe d’étalonnage pour estimer le nombre de copies d’ADN récupérée dans chaque échantillon. L’instrument utilisé ici effectue cela automatiquement.
    6. Ici, on estime le nombre de copies d’ADN pour le volume total d’élution (~ 40 µL). Pourcentage des ADN récupérée correspondant au montant initial ajouté à liaison solution (totalement 10 11 copies) peut varier au-delà de l’intervalle de 0 à 100.

6. ADN-magnétique des particules liaison analyse à l’aide de DLS

expériences
  1. De l’ADN de liaison
    1. pour grand volume (en tube de 1,5 mL), utiliser le mélange de solution de liaison suivants : µL 96 modifié MMP ou MNPs, 120 µL sodium acétate-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL d’éthanol de 85 %, 120 µL ADN (10 10 copies solution) ou 120 µL de tampon Tris-HCL (10 mM, pH = 8) pour la commande.
  2. Analyse du potentiel zeta
    1. Prepare deux solutions de liaison, une avec l’ADN et l’autre avec un tampon Tris-HCL pour commande en suivant les instructions à l’étape 6.1.1. Pour éviter la formation de bulles, soigneusement Pipetter 800 µL du mélange liant dans une cellule jetable.
      Remarque : Utiliser un godet jetable pour la mesure du potentiel de surface zêta (voir table des matières).
  3. Utilisez les paramètres suivants pour la mesure sur l’instrument DLS : modèle de Smoluchowski avec un F(ka) de 1,5, température : 25 ° C, indice de réfraction de la phase de dispersion (fer) : 2.344, indice de réfraction du milieu dispersif (eau) : 1.333.
    Remarque : Le taux d’interaction ADN-magnétique de particules affecte directement la mesure des répétitions. Une mesure simple de l’instrument prend 60-70 s. Ici, l’instrument a été chargé de prendre des intervalles de délai 10 mesures avec 1 min. Pour plus de simplicité, les résultats seront afficheront en temps = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 et 18 min de la première lecture.

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Representative Results

En utilisant le protocole décrit ici pour synthèse chimique et la modification des particules magnétiques, six des particules magnétiques ont été synthétisés et analysés pour fixation à l’ADN. Un résumé de l’analyse est indiqué dans le tableau 1. En comparant la taille des particules dans l’eau et en solution de liaison, il est clair que toutes les particules agrégées dans solution de liaison par des plis de 2-22. Certaines particules plus regroupées en plusieurs plis en présence de l’ADN ; Toutefois cela n’était pas directement corrélée avec la récupération de l’ADN détectée par PCR quantitative (tableau 1). Comparaison du potentiel zêta (10 mesures à intervalles d’environ 2 min) des particules chez les témoins par rapport avec la forte baisse des ADN a montré trois particules ; à savoir : MNPs_APTES, MMPs_TEOS et MMPs_APTES (Figure 2). Tendances de zeta potentiel au fil du temps ont aussi été observés, montrant les variations dans les trois premières lectures avant ils sont stabilisées dans la plupart des cas (Figure 3). Après exposition au DNA variation a été observée pour la plupart MMP (Figure 2). Écart-type inférieur a été observée en omettant les trois premières lectures, représentant les 5 premières minutes après l’exposition à des particules à l’ADN (tableau 1).

Dans l’ensemble, vue de l’analyse dans le tableau 1 montre les différentes caractéristiques de liaison de l’ADN-particule attribuée à la taille des particules magnétiques et des modifications chimiques. Brièvement, des nanoparticules de MNPs_PEI a augmenté en taille après liant l’ADN de quatre plis avec aucun changement significatif dans l’indice de polydispersité ou potentiel zêta. Cependant, l’ADN n’était pas récupérable dans cette procédure. Nanoparticules de MNPs_TEOS ont augmenté en taille et diminuent dans l’indice de polydispersité imperceptible changement de potentiel zêta après l’exposition de l’ADN, et pourtant ils étaient les meilleurs particules dans leur taux de récupération à 20,3 %. Nanoparticules de MNPs_APTES a légèrement diminué en taille et sensiblement de zeta potentiel lors de l’exposition de l’ADN. Microparticules de MMPs_PEI n’a pas montré de changement dans la taille à la lumière de l’ADN, cependant ils ont augmenté à l’indice de polydispersité et a légèrement diminué en potentiel zêta. Microparticules de MMPs_TEOS présentaient des caractéristiques de format de substitution pour leur NANOPARTICULE homologues c'est-à-dire MNPs_TEOS. Étonnamment, ils ont diminué sensiblement en potentiel zêta, mais pas au-delà de la portée affichée par MNPs_TEOS. MMPs_APTES a augmenté dans la taille des particules à la lumière de l’ADN et en potentiel zêta a aussi diminué. Il est important de noter que les MNPs_APTES et les MMPs_APTES conservé tailles similaires après que modification chimique, malgré le fait qu’ils ont été fabriqués à partir de différents précurseurs de taille. Ils ont également fait preuve de propriétés similaires de liaison. MNPs_TEOS a montré à l’extrême le plus bas, aucun changement significatif dans le potentiel de leurs valeurs zêta ont été détectés dans cette étude.

Les valeurs de stabilisation suivi au fil du temps pour le potentiel zêta a montré après 5-10 min, en particulier dans le cas de MNPs (Figure 3 a, 3C et 3E). Une tendance continue à potentiel zêta a été trouvée dans certaines lectures de MMP ( 3Fb et3 b Figure, 3D ). Dans certains cas, les variations de potentiel zêta correspondaient à variations polydispersité index et particules de taille mais pas avec la récupération de l’ADN par élution.

Figure 1
Figure 1: schéma de protocole. (A) des modifications chimiques des particules magnétiques, y compris POLYÉTHYLÈNEIMINE ramifié, de silice et de groupes aminés. Étapes (B) ADN d’isolement à l’aide du tampon de liaison et des particules magnétiques, immobilisés sur l’aimant, suivie d’une PCR quantitative. Analyse de liaison (C) DNA-particules à l’aide de listes de distribution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: potentiel zêta des particules magnétiques représentant en présence et en absence de l’ADN. Exposition à l’ADN a provoqué une diminution visible de potentiel zêta dans MNPs_APTES, MMPs_TEOS et MMPs_APTES. Barres d’erreur représentent déviation standard (N = 10). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: potentiel zêta des particules magnétiques représentant au fil du temps en présence et en absence de l’ADN. Potentiel zêta des particules dans la solution de liaison a été mesuré à temps = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 et 18 minutes écart entre les courbes de potentiel zêta de contrôle vs avec l’ADN sont évidents dans les cas de MMPs_TEOS, MNPs_APTES et MMPs_APTES. (A) le potentiel zêta des MNPs_PEI est hautement positif n’indiquant aucune interaction. (B) potentiel zêta des MMPs_PEI a diminué au fil du temps, ce qui suggère une interaction très lente entre les particules et l’ADN. (C) potentiel zêta des MNPs_TEOS a été très négative en absence et en présence de l’ADN. (D) potentiel zêta des MMPs_TEOS montre des valeurs plus faibles en présence de l’ADN par rapport aux contrôles. (E) potentiel zêta des MNPs_APTES montre des valeurs plus faibles en présence de l’ADN par rapport aux contrôles. (F) potentiel zêta des MMPs_APTES montre des valeurs plus faibles en présence de l’ADN par rapport aux contrôles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Caractéristiques MNPs_PEI MNPs_TEOS MNPs_APTES MMPs_PEI MMPs_TEOS MMPs_APTES
Taille des particules (nm)
dans l’eau 141,8 91.3 1106.4 825.0 1281.3 1281.3
en solution de liaison 531,2 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1
dans suffisammen
g de la solution avec de l’ADN 1990.1 3091.0 2669.0 2669.0 1990.1 4145.4 changement observé a augmenté a augmenté a augmenté Indice de polydispersité dans l’eau 0,237 0,240 0,219 0.410 0,281 0,206 en solution de liaison 0,225 0,773 0,090 0,107 0,374 0,397 en solution de liaison avec l’ADN 0,240 0,298 0,282 0,301 0.387 0,319 changement observé a diminué a augmenté a augmenté Potentiel zêta (mV) * en solution de liaison 42,29 -27.83 33,23 30,80 -6.86 -0.66 (±ET) 1.15 1.17 2.89 8.99 7.99 5.42 en solution de liaison avec l’ADN 41.81 -25.97 12.28 27,81 -23.67 -15.22 (±ET) 2.02 0.80 2.21 4.33 0,95 4.28 changement observé a diminué a diminué a diminué Récupération de PCR quantitative ** Nombre de copies de l’ADN Récupérée 1.22E + 03 1.01E + 09 3.18E + 06 1, 44E + 06 3.76E + 08 6.88E + 06 (±ET) 8.05E + 02 7.55E + 07 2.83E + 06 1.98E + 06 1.08E + 08 3,33 + 06 Pourcentage de récupération de l’ADN 0.0 20.3 0,1 0.0 7.5 0,1 (±ET) 0.0 1.5 0,1 0.0 2.2 0,1 * Seulement stable mesures après 5 minutes de liaison sont indiqués (N = 7). ** Le R² = 0,940 pour réanalysés des normes.

Tableau 1 : caractérisation de particules magnétiques représentatives et leurs capacités à lier et récupérer de l’ADN. Au contact de la solution de liaison, toutes les particules ont montré l’agrégation (augmentation de la taille des particules). Quand l’ADN était présent dans la solution de liaison, augmentation de taille de particules a été visible dans MNPs_PEI, MNPs_TEOS et MMPs_APTES. Les particules sont des systèmes polydispersés dans la solution, en particulier les MNPs_TEOS qui est devenu moins polydispersed lors de la liaison de l’ADN de liaison. MNPs_APTES a montré augmentation indice de polydispersité et diminution de potentiel au contact de l’ADN zêta. MMPs_TEOS et MMPs_APTES ont montré la grande diminution de potentiel au contact de l’ADN zêta. MNPs_TEOS et MMPs_TEOS ont montré les taux plus élevés de récupération de l’ADN de 20,3 % et 7,5 %, respectivement, comme indiqué par PCR quantitative. MNPs_APTES et MMPs_APTES ont montré des taux de récupération pour le DNA 0,1 %.

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Discussion

Dans le présent protocole, les principes théoriques qui expliquent la liaison de l’ADN aux particules magnétiques par l’intermédiaire de potentiel zêta étaient sous la question. Le protocole décrit la synthèse et la modification de nanoparticules magnétiques et de microparticules. Procédé de préparation de la solution de contrôle et de la liaison ADN sont également décrites. Deux stratégies sont indiqués ici pour le dépistage des interactions ADN-particules : approches PCR quantitative et listes de distribution. DLS fournit trois indicateurs des changements physico-chimiques de particules : granulométrie, indice de polydispersité et potentiel zêta. Changements de taille de particules indiquent directement d’agrégation ou la désintégration. Valeur d’index de polydispersité décrit la distribution des espèces de particules du système allant de monodisperses (indice < 0,05) à très polydispersed (indice > 0,7). Potentiel zêta peut classer les particules selon la charge de surface où des particules hautement positives indiquent les valeurs supérieures à 30 mV et particules hautement négatives indiquent des valeurs inférieures à -30 mV. Comme prévu, le potentiel zêta des particules magnétiques polycharged solennelle solution relativement diminué lorsque les particules ont été exposés à l’ADN. L’exception à cette règle est MNPs_TEOS. Ces particules diffèrent uniquement parce qu’ils possèdent une charge unique de surface très négative (Figure 2). Ceci suggère que force ionique a joué un rôle important en retenant les particules, les ADN et les ions positifs ensemble. En revanche, les changements dans la taille des particules peuvent indiquer le rôle des précipitations/agrégation de particules ADN durant le processus de liaison, surtout en présence des plus longs brins d’ADN.

Au cours de la synthèse de particules magnétiques et des modifications chimiques, il y a plusieurs étapes critiques qui nécessitent une attention : tout d’abord, la reproductibilité de la méthode de synthèse dépend beaucoup des quantités exactes des précurseurs chimiques utilisés dans la synthèse ainsi que de la bonne agitation et en temps opportun contrôlée addition de NH4OH. Pour acquérir une population homogénéisée de particules (de même taille, forme, densité et composition), il est important de suivre la sonication et étapes en remuant soigneusement quand vous êtes invité. Deuxièmement, dans de nombreux cas réalistes les modifications chimiques ne prédisent pas la réalité de ce qui est sur la surface des particules magnétiques. Une étape de caractérisation complète est nécessaire pour confirmer la composition chimique de la surface de la particule, comme décrit dans la section introduction. Parmi les techniques couramment utilisées, les chercheurs s’appuient sur FTIR, XPS, électrochimie, spectroscopie ainsi que DLS.

En outre, plusieurs étapes critiques sont tenues au cours de la DLS mesures et l’analyse : tout d’abord, le choix de la solution de liaison affecte diverses mesures telles que la compatibilité chimique avec les particules et l’ADN et aussi les propriétés spectrales. Choix des indices de réfraction de liaison de solution et particules de matériau peut être basé sur des études antérieures ou évaluée par réfractométrie. Deuxièmement, les interactions entre les particules et les électrodes dans les cuvettes doivent être surveillées soigneusement comme processus d’oxydation/réduction peut affecter la mesure. Troisièmement, comme illustré à la Figure 3, le taux de liaison peut être une fonction du temps. Il est essentiel de respecter la stabilité de l’interaction, et il s’agit d’un atout majeur pour l’application de listes de distribution dans ces études. Ici, l’observateur surveille l’agrégation des particules et des changements physico-chimiques en temps réel. Quatrièmement, polydispersité du système peut fixer des limites à la portée de l’analyse. Valeur d’index de polydispersité inférieure à 0,05 pour décrire un système monodisperses alors que les valeurs supérieures à 0,7 décrivent un système de polydispersed de différentes tailles de particules. La taille des particules et la distribution des particules différentes espèces peuvent être étudiés à l’aide de différents types de listes de distribution, y compris le dos-épars, côtéent-dispersés et dispersés vers l’avant, comme mentionné dans le protocole l’article 3.1. Enfin, sonication de particules avant l’essai peut évidemment affecter leurs propriétés physiques (p. ex. taille et surface) et si fait trop il peut causer la libération de certaines modifications chimiques.

Dans ce protocole, les renseignements obtenus par l’intermédiaire de listes de distribution sont comparées aux données acquises par PCR quantitative, également connu sous le nom de Real-time PCR. Ce dernier est l’étalon-or pour la détection et la quantification de l’ADN. 15 la technique PCR est largement utilisé dans les laboratoires, les hôpitaux et les universités. Toutefois, lors de l’essai exposition ADN à roman et matériaux de synthèse, il est important de prendre la chimie de la PCR en considération. L’enzyme polymérase, l’élément clé de la réaction en chaîne par polymérase, est sensible à certains inhibiteurs chimiques et des amplificateurs. Ajout de contrôles internes, essais des matériaux synthétiques et de bonnes pratiques de laboratoire permettent de réduire les biais dans les résultats de PCR. Mécanismes d’action des inhibiteurs et activateurs varient selon les produits chimiques qui se lient directement à la polymérase et d’autres qui chélate les ions du Mg2 +-dépendante polymérase en solution. Quelques aperçus sur l’isolement d’ADN sont difficiles à obtenir à l’aide de dépistage de la PCR. Listes de distribution peuvent montrer cas lorsque l’ADN se lie aux particules mais est plutôt lavé ou ne pas éluer (non détecté par PCR de l’ADN). Par exemple, tant MNPs_APTES que MMPs_APTES a montré significative diminution de zeta potentiel lors de l’exposition de l’ADN (tableau 1), mais l’ADN détecté dans élution n’est pas corrélé avec ces résultats. Il est possible de modifier la liaison, lavage, solutions d’élution pour contrôler les rejets de l’ADN de particules. DLS est une méthode relativement plus rapide pour l’évaluation des interactions ADN-particules. La stabilité et le taux d’interaction peuvent également être observés, par cette méthode (Figure 3), qui peut influer sur le temps utilisé dans des particules magnétiques - fonction de protocoles d’isolement de l’ADN.

Les défis pour l’utilisation de listes de distribution dans l’analyse sont vers l’avant. Cette technique nécessite un volume d’échantillon relativement important pour l’analyse (~ 1 mL) par rapport à la PCR. Certains paramètres tels que les indices de réfraction exigent une évaluation attentive lors de l’utilisation de nouvelles solutions dans les échantillons. En outre, il est très fréquent d’observer des réactions d’oxydo-réduction sur les électrodes de cuvettes lors de l’essai de nouveaux matériaux. Une évaluation minutieuse et la connaissance de la composition chimique de l’échantillon peuvent aider à évaluer la faisabilité de réutiliser la même cuve. Il est à noter que DLS analyse se limite à la spécificité et la sensibilité fournies par PCR, mais il fournit différents types de perspectives pour le processus de liaison ADN-particule.

Comme toutes les techniques spectroscopiques, modifications et dépannage de DLS visent au développement des mesures plus précises et plus sensibles. Ceci peut être réalisé en fournissant la meilleure compréhension de la nature du matériau testé physiquement et chimiquement. En d’autres termes, les propriétés optiques et les détails de la composition chimique sont la clé pour obtenir des données précises et sensibles de DLS. Propriétés optiques peuvent être acquis par réfractométrie, tandis que la composition chimique des particules / surface des particules peut être étudiée par diverses techniques telles que FTIR, XPS, électrochimie et autres méthodes spectroscopiques. Dans ce protocole, solution de liaison peut être améliorée en utilisant différentes forces ioniques, autres agents déshydratants (p. ex. isopropanol), divers pH et températures basses. En revanche, les modifications chimiques de la surface de la particule sont laissées à l’imagination de la droguerie.

Le développement de matériaux pour l’isolation de l’ADN continuera d’augmenter dans les prochaines décennies mettant davantage l’accent sur la spécificité, de pureté et de limite de détection. La qualité des méthodes d’extraction joue un rôle important dans l’étude de l’échelle de la cellule unique, metagenomic échelles et échantillons d’origines inhabituelles. À l’heure actuelle, il est important d’effectuer une analyse des listes de distribution de nanoparticules et de microparticules modifiés avec différents types de matériaux. Cette étape est nécessaire avant d’établir un modèle théorique solide qui décrit le comportement des interactions ADN-particules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le soutien financier de la Fondation tchèque pour la Science (projet GA CR 17-12816S) et CEITEC 2020 (LQ1601) est largement reconnu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 207926 Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 380024 Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich F8263 Magnetic particle synthesis
Acetone Penta 10060-11000 Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich W302600 Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate Sigma-Aldrich 131903 Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 Sigma-Aldrich 408727 Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 221228-M  Magnetic particle synthesis
Ethanol Penta 71250-11000 Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P6083 Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1.05012 Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) Spectrum labs G235063 Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer witeg Labortechnik GmbH DH.WOS01035 Magnetic particle synthesis
Waterbath Memmert GmbH + Co. 84198998 Magnetic particle synthesis
Sonicator Bandelin 795 Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro Sigma-Aldrich BR759200-100EA Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro Sigma-Aldrich BR759240-100EA Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell Malvern DTS1070 Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO
NanoQuant instrument		 Tecan 396 227 V1.0, 04-2010 device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit Sigma-Aldrich QR0100 PCR kit
Mastercycler pro S instrument Eppendorf 6325 000.013 Thermocycler
MinElute kit Qiagen 28004 DNA purification kit
Sodium acetate Sigma-Aldrich S7670 DNA binding

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References

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Chimie numéro 129 isolement d’ADN particules magnétiques des modifications chimiques dynamique light scattering PCR quantitative
ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse
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Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., … More

Haddad, Y., Dostalova, S., Kudr, J., Zitka, O., Heger, Z., Adam, V. DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering. J. Vis. Exp. (129), e56815, doi:10.3791/56815 (2017).

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