Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.
Abstract
Isolierung der DNA mit Hilfe magnetischer Partikel ist ein Feld von hoher Bedeutung in der Biotechnologie und Molekularbiologie. Dieses Protokoll beschreibt die Auswertung der DNA-Magnetteilchen über dynamische Lichtstreuung (DLS) und elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) verbindlich. Analyse von DLS liefert wertvolle Informationen über die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel wie Partikelgröße, Polydispersität und Zetapotenzial. Letzterer beschreibt die Oberflächenladung des Teilchens die Hauptrolle in elektrostatische Bindung von Materialien wie DNA spielt. Eine vergleichende Analyse nutzt hier drei chemische Modifikationen von Nanopartikeln und Mikropartikel und ihre Auswirkungen auf die DNA-Bindung und Elution. Chemische Veränderungen durch verzweigte Polyethylenimine, Tetraethylblei Orthosilicate und (3-Aminopropyl) Triethoxysilane untersucht werden. Da DNA eine negative Ladung aufweist, ist zu erwarten, dass Zeta-Potential der Partikeloberfläche bei der Bindung von DNA sinkt. Bildung von Clustern sollte auch Auswirkungen auf die Partikelgröße. Um die Effizienz dieser Partikel isoliert und Elution der DNA zu untersuchen, werden die Partikel mit DNA in niedrigen pH-Wert (~ 6), hohe Ionenstärke und Dehydrierung Umwelt gemischt. Partikel werden auf Magneten gewaschen und dann ist die DNA von Tris-HCl-Puffer eluiert (pH = 8). DNA-Kopienzahl ist anhand quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geschätzt. Zeta-Potential, Partikelgröße, Polydispersität und quantitative PCR-Daten werden ausgewertet und verglichen. DLS ist eine aufschlussreiche und die Unterstützung der Analysemethode, die eine neue Perspektive auf den Prozess der Überprüfung der Partikel für die DNA-Isolierung hinzufügt.
Introduction
DNA-Isolierung ist einer der wichtigsten Schritte in der molekularen Biologie. Die Entwicklung von Nukleinsäure-Extraktionsmethoden hat großen Einfluss auf den aufstrebenden Bereichen Genomik, Metagenomik, Epigenetik und Transkriptom. Es gibt eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen für die DNA-Isolierung einschließlich medizinische (forensische/Diagnose-Tools und prognostische Biomarker) und Umweltanwendungen (metagenomische Biodiversität, Erreger Prävalenz und Überwachung). Steigende Nachfrage, zu reinigen und DNA zu isolieren, aus verschiedenen Materialien und in unterschiedlichen Maßstäben wie Blut, Urin, Boden, Holz und andere Arten von Proben stattgefunden hat. 1 , 2 , 3 , 4
Und Mikro-Nanopartikel eignen sich für DNA-Isolierung aufgrund ihrer großen Oberfläche und vor allem, wenn sie durch ein Magnetfeld immobilisiert werden können. Physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel, z. B. Größe oder Ladung, können großen Einfluss auf ihre Fähigkeit, Ziel Biomoleküle zu binden. 5 zur weiteren Verbesserung Bindung von Biomolekülen und Partikel zu stabilisieren, können verschiedene chemische Modifikationen (Oberflächenbeschichtung) genutzt werden. Viele verschiedenen Strategien für die Bindung sind nach kovalente und nicht-kovalente Wechselwirkungen klassifiziert. 6 die Größe der Partikel wirkt sich direkt auf ihre Magnetisierung Eigenschaften, während Partikelzusammensetzung zugeschnitten werden kann, durch Einbau von Metall, Legierung oder andere Materialien, die Dichte, Porosität und Oberfläche beeinflussen können. 7 gibt es keine zuverlässige Möglichkeit, Oberflächenladung kleiner Teilchen zu messen. Stattdessen kann elektrische Potential an das Verrutschen Flugzeug (einiger Entfernung von Nanopartikel-Oberfläche) gemessen werden. 8 dieser Wert heißt Zeta potential und es ist ein starkes Werkzeug, die in der Regel für die Bewertung von Nano- und Mikropartikel Stabilität über DLS verwendet wird. 9 da sein Wert hängt nicht nur der pH-Wert und die Ionenstärke der dispersive Umwelt, sondern auch auf die Oberflächenbeschaffenheit der Partikel ist, es kann auch zu beweisen die Änderungen in dieser Oberfläche, verursacht durch die Wechselwirkung zwischen den Partikel und Molekül des Interesses. 10
Auf der anderen Seite vorkommenden DNA-Struktur in trockene Bedingungen (A-DNA Form) Exponate verdichteten Konformationen, die seinen Niederschlag (Aggregation) ermöglichen im Vergleich zu häufig B-DNA-Form. Elektrostatische (Ionische und H-Bindung) sind die wichtigsten Kräfte kontrollieren die Bindung von DNA an anderen Materialien aufgrund ihrer sterisch zugänglich Phosphat und Stickstoff Basen (besonders Guanin). 7 , 10
In dieser Arbeit werden drei repräsentative chemische Modifikationen von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel analysiert (Abbildung 1A). Die Methode der Synthese und chemische Modifikation von Nanopartikeln und Mikropartikel werden beschrieben. Eine verbindliche Lösung, dieses Abkommen zu theoretischen Grundlagen der DNA Niederschlag (pH-Wert, Ionenstärke und Dehydrierung), wird verwendet, um DNA-Bindung und Elution zu bewerten. Quantitative PCR wird verwendet, um die Effizienz der Elution der DNA aus dem repräsentativen Nanopartikel und Mikropartikel (Abbildung 1 b) bewerten. Partikelgröße, Polydispersität Index und Zetapotenzial sind wichtige Parameter, die verwendet werden, um die physikalisch-chemischen Veränderungen zu visualisieren, die auf der Partikeloberfläche (Abbildung 1) auftreten. Es ist wichtig zu betonen, auf die chemische Charakterisierung der Magnetpartikel Oberfläche. Während dieser Schritt würde den Rahmen dieses Protokolls war, können mehrere moderne Techniken angewendet werden, um die Effizienz der chemischen Veränderungen zu untersuchen. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier Transform Infrarotspektroskopie (FTIR) lässt sich das Infrarotspektrum der Partikeloberfläche zu bewerten und vergleichen Sie es mit dem Spektrum der freien chemische Modifikatoren. Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) ist eine weitere Technik, die verwendet werden kann, um die elementare Zusammensetzung der Materialoberfläche zu identifizieren. Anderen elektrochemischen, mikroskopische und spektroskopischen Methoden können verwendet werden, die Aufschluss über die Qualität der Partikelsynthese. Diese Arbeit zeigt eine neue Perspektive für die Analyse von DNA-magnetische Partikel Interaktionen über DLS.
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Protocol
1. magnetische Nanopartikel-Synthese
- fügen Sie 20 Mmol FeCl 3 Synthese von magnetischen Nanopartikeln mit Citrat (MNPs) stabilisiert ∙ 6 H 2 O (5,406 g) und 10 Mmol FeCl 2 ∙ 4 H 2 O-(1,988 g) in 20 mL sauerstoffarmes doppelt destilliertes Wasser (Ddd). Rühren, die Lösung kräftig im Becherglas unter N 2 Atmosphäre mit einem mechanischen Rührwerk bis eine transparente Lösung erzielt wird.
- Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 150 mL 1 M NH 4 OH, Tropfen für Tropfen mit Tropftrichter (nehmen Sie 1 h oder je nach Bedarf). Übertragen Sie die Lösung in ein Gefäß abschraubbar, nachdem alle NH 4 OH hinzugefügt wird. Schrauben Sie die Schiff und Wärme-Lösung bei 75 ° C für 30 min.
Achtung: NH 4 OH ist so ätzend und gefährlich für die Umwelt eingestuft.
Hinweis: Bereiten Sie NH 4 OH-Lösung aus hochwertigem 28 % NH 4 OH im Wasser mit sauerstoffarmes Wasser. - Erfassen den schwarzen Niederschlag mit Magnet und waschen es mit 100 mL Wasser Ddd. Wiederholen Sie 3 Mal. Hinzugeben Sie 50 mL 0,5 M Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat ausgefällt. Schrauben Sie das Schiff.
Hinweis: Verwenden Sie sauerstoffarmes Lösung von Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat. - Neu zerstreuen den Niederschlag über Beschallung (35 kHz, Amplitude von 100 %) und Hitze Schiff bei 80 ° C für 1 h
Hinweis: Ein Sonikator ausreichend Strom wird benötigt. - Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Niederschlag mit einem Magneten zu sammeln und überstand zu entfernen. Neu zerstreuen schwarzen Schlamm in 50 mL Ddd Wasser mit Sonikator (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Aliquote (~ 25 mL) in 50 mL Zentrifuge Röhren übertragen und 20 mL Aceton. Bei 2400 X g für 10 min Zentrifugieren und Überstände entfernen.
- Neu zerstreuen Niederschlag und Dialyse Lösung gegen Wasser mit niedrigem Molekulargewicht Cut-off Dialyse Gerät (500-1.000 Da) der angemessene Lautstärke für 24 h
Hinweis: Bereiten Sie das Dialyse-Gerät laut Hersteller ' s Anforderungen.
- Synthese von magnetischen Nanopartikeln modifiziert mit verzweigten Polyethylenimine (MNPs_PEI)
- fügen Sie 2 mL der erhaltenen MNPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 38 mL Ddd Wasser hinzugeben und beschallen (35 kHz, Amplitude von 100 %) die Aussetzung (10 min).
- Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 10 mL 10 % verzweigte Polyethylenimine (durchschnittlich 25 kDa). Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
- Sammeln Niederschlag mit Magneten und überstand zu entfernen. Niederschlag in 20 mL Ddd Wasser neu zu verteilen. 5 Mal wiederholen dann beschallen die endgültige Aufhebung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Synthese von magnetischen Nanopartikeln Partikeln modifiziert mit Kieselsäure (MNPs_TEOS)
- fügen Sie 10 mL der erhaltenen MNPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 60 mL Wasser und 130 mL Ethanol zugeben. Lösung zu beschallen und 6 mL 28 % NH 4 OH.
- Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 1 mL Tetraethylblei Orthosilicate. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 12 h.
- Schwarze Niederschlag mit Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Neu zerstreuen Partikel in 10 mL Ddd Wasser und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Synthese von magnetischen Nanopartikeln modifiziert mit Aminogruppen (MNPs_APTES)
- fügen Sie 5 mL der erhaltenen MNPs_TEOS Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 45 mL Wasser und 50 mL Ethanol zugeben. Beschallen Lösung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 0,5 mL (3-Aminopropyl) Triethoxysilane. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
- Schwarze Niederschlag mit Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Neu verteilen Partikel in Ddd 5 mL Wasser und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
2. Magnetischer Mikropartikel Synthese
- fügen Sie 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH und 205,875 mL Ddd Wasser in ein Gefäß abschraubbar Synthese von magnetischen Mikropartikeln mit Citrat (MMPs) stabilisiert. 6,675 mL 1 M FeSO 4 während magnetische rühren hinzugeben. Sofort Überweisung Schiff in einen vorgeheizten Wasserbad (90 ° C) für 2 h
Hinweis: Bereiten Sie KNO 3 und KOH-Lösungen in Ddd Wasser. - Die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Sammeln Sie schwarze Niederschlag mit Magnet und waschen es mit 50 mL Wasser Ddd (5 Mal). Hinzugeben Sie 50 mL 0,5 M Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat ausgefällt. Schrauben Sie das Schiff.
- Redisperse den Niederschlag über Beschallung (35 kHz, Amplitude von 100 %) und Hitze Schiff bei 80 ° C für 1 h sammeln schwarzen Niederschlag mit Magnet und waschen es mit 50 mL Wasser Ddd (10mal).
- Ändern MMPs mit verzweigten Polyethylenimine (MMPs_PEI), Kieselsäure (MMPs_TEOS) und Aminogruppen (MMPs_APTES) ähnlich wie MNPs Protokoll. Siehe Details im Kapitel 2.2, 2.3 und 2.4, bzw. mehr.
- fügen Sie 25 mL 2 M KNO 3, 12,5 mL 1 m KOH und 205,875 mL Ddd Wasser in ein Gefäß abschraubbar Synthese von magnetischen Mikropartikeln mit Citrat (MMPs) stabilisiert. 6,675 mL 1 M FeSO 4 während magnetische rühren hinzugeben. Sofort Überweisung Schiff in einen vorgeheizten Wasserbad (90 ° C) für 2 h
- Synthese von magnetischen Mikropartikeln modifiziert mit verzweigten Polyethylenimine (MMPs_PEI)
- fügen Sie 5 mL der MMPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. Geben Sie 38 mL Ddd Wasser hinzu und beschallen Sie die Lösung (35 kHz, Amplitude von 100 %, 10 min). Fügen Sie unter schnelle mechanische Rühren 10 mL 10 % Polyethylenimine (durchschnittlich 25 kDa) verzweigt. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
- Niederschlag mit einem Magneten zu sammeln und überstand zu entfernen. Redisperse Niederschlag in 20 mL doppelt destilliertem Wasser. 5 Mal wiederholen dann beschallen die endgültige Lösung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Synthese von magnetischen Mikropartikeln modifiziert mit Kieselsäure (MMPs_TEOS)
- fügen Sie 5 mL der MMPs Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 60 mL Wasser und 130 mL Ethanol zugeben. Beschallen Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %) und 6 mL 28 % NH 4 OH.
- Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 1 mL Tetraethylblei Orthosilicate. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 12 h.
- Schwarze Niederschlag mit einem Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Redisperse Partikel in 5 mL Wasser Ddd und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Synthese von magnetischen Mikropartikeln modifiziert mit Aminogruppen (MMPs_APTES)
- fügen Sie 3 mL MMPs_TEOS-Lösung (~0.1 g/mL) in ein Becherglas. 45 mL Wasser und 50 mL Ethanol zugeben. Beschallen Sie die Suspension (35 kHz, Amplitude von 100 %).
- Unter schnelle mechanische Rühren hinzufügen 0,5 mL (3-Aminopropyl) Triethoxysilane. Rühren Sie die Lösung für nachfolgende 3 h
- Schwarze Niederschlag mit Magneten zu sammeln und waschen Sie es mit 50 mL Ethanol (3 Mal) und 50 mL Wasser (3 Mal). Redisperse Partikel in 3 mL Ddd Wasser und beschallen die Aussetzung (35 kHz, Amplitude von 100 %).
3. Magnetische Partikel Größe Analyse mittels DLS
- Partikelgröße in Wasser
- Verwendung eine DLS-Instrument, das gilt eine hintere Streuwinkel der Detektor (173 °) und ein Strahl Wellenlänge von 633 nm.
Hinweis: Rücken Streuung DLS ist geeignet für konzentrierte Proben wo Mehrfachstreuung vermieden werden kann. Seite Streuung (Detektor Winkel 90°) und Vorwärtsstreuung (Detektor Winkel 15°) DLS eignen sich für kleinere Partikel und Teilchen, bzw. gemischt. - Vor der Messung im Wasser, beschallen Partikel für 3 min.
Hinweis: Verwenden Sie verdünnte Lösung der Partikel. Zu diesem Zweck 9,6 µL von Partikeln mit 96 µL Wasser mischen. - Pipette vorsichtig 50 µL der Partikel-Lösung in Polystyrol latex Küvetten und Blasenbildung zu vermeiden.
Hinweis: Für jede Probe verwenden Einweg-Küvette (siehe Tabelle der Werkstoffe). - Beachten Sie die Klarheit der Küvette und die Richtung des Lichtstrahls. Legen Sie die Zelle in der Probenhalter und schließen die Kammer.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Messung: Temperatur: 25 ° C; Brechungsindex dispersive Phase (Eisen): 2.344; Brechungsindex dispersive Umgebung (Wasser): 1,333
Hinweis: Führen Sie die Messung des Brechungsindex mit einem Refraktometer für genauere Ergebnisse, insbesondere bei der Entwicklung von Roman oder hybride Materialien.
- Verwendung eine DLS-Instrument, das gilt eine hintere Streuwinkel der Detektor (173 °) und ein Strahl Wellenlänge von 633 nm.
4. Vorbereitung von DNA-Lager, magnetische Partikel und Binding Buffer
- DNA-Lager
- Einsatz 10 mM Tris-HCL-Puffer (pH = 8) zur Verdünnung und Lagerung von DNA. Verwenden Sie eine standard DNA-Probe, die verstärkt werden kann, speziell mit einem direkten PCR-Protokoll im Labor (siehe Abschnitt 5.2 Reaktion Einstellungen und Bedingungen). Um 498 Basenpaare (bp) des Gens Xis von Bakteriophagen λ Kontrolle zu verstärken, verwenden Sie die folgenden Primer. Grundierung zu übermitteln: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverse Primer: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
- reinigen PCR-Produkt mit kommerziellen DNA Reinigung Kit.
Hinweis: Kommerzielle Kits mit Kieselsäure spaltenbasierten Verfahren ergeben > 100 ng/µL gereinigte DNA. - Maß Konzentration der DNA mit photometrische Methode (Absorption bei 260 nm). Verdünnen den DNA bestand von 10 11 Kopien/µL, wie oben beschrieben, funktionierende Lösungen von 10 10 10 9 10 8 und 10 7 Kopien/µL.
Hinweis: Die Anzahl der Kopien des PCR-Produktes kann berechnet werden, nach der folgenden Gleichung, vorausgesetzt, mittleres Molekulargewicht ist 650 Da für jede bp:
DNA-Kopien/µL = (Menge in ng/µL * 6.022x10 23 Kopien/Mol) / (498 bp * 650 g/Mol von bp * 1 x 10 9 ng/g)
- Magnetpartikel
- Partikel zu sedimentieren ohne Magneten ermöglichen und überstand zu entfernen. Mischen Sie 01:20 V/V-Verhältnis von magnetischen Partikeln mit Ddd Wasser (Partikel: Wasser).
Hinweis: Volumen-basierten Ansatz wird verwendet, um Mengen von magnetischen Partikeln zu beschreiben, da gleiche Massen von MNPs und MMPs leicht schwer zu vergleichen waren.
- Partikel zu sedimentieren ohne Magneten ermöglichen und überstand zu entfernen. Mischen Sie 01:20 V/V-Verhältnis von magnetischen Partikeln mit Ddd Wasser (Partikel: Wasser).
- Verbindlich Puffer
- für die schnelle Zubereitung von 0,75 M Natrium Acetat-HCL-Lösung (pH = 6), mischen Sie 1 mL Natriumacetat 3 M mit 3 mL HCL 1 mM.
Hinweis: Alle Lösungen, die für die Bindung können gespeichert werden, bei 4 ° C. beachten Sie, dass Niedertemperatur Bindung vor allem bei Ethanol-Lösung erhöht. Sorgfältig zu kontrollieren, die Temperatur der Lösungen für bessere Reproduzierbarkeit und Genauigkeit des Screenings.
- für die schnelle Zubereitung von 0,75 M Natrium Acetat-HCL-Lösung (pH = 6), mischen Sie 1 mL Natriumacetat 3 M mit 3 mL HCL 1 mM.
5. Effizienz der DNA-Isolierung mittels quantitativer PCR Tests
- DNA-Isolierung durch geänderte MMPs oder MNPs
- verwenden eine 96-Well-Platte und ein Magnet für 96-Well-Platte für kleinvolumige Experimente angepasst.
- Verwenden Sie die folgende verbindliche Lösung Mischung: 8 µL geändert MMPs oder MNPs, 10 µL Natrium Acetat-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL von 85 % Ethanol, 10 µL DNA (10 10 Kopien Lösung).
- Mix nun durch pipettieren und platzieren Sie die Platte auf den Magneten für 3 min. Während die Platte auf den Magneten, die Lösung entfernen und hinzufügen 100 µL von 85 % Ethanol zum Waschen.
- Entfernen Ethanol.
Hinweis: Lassen Sie das Ethanol für einige Sekunden trocknen lassen aber nicht lassen Sie zu, dass die Partikel zu trocknen oder Risse zu zeigen. Wenn die Partikel über trocknen werden sie schwerlich mit Elution Lösung auflösen. - Die Platte aus der Magnet entfernen und Hinzufügen von 40 µL Elution Lösung. Mischen Sie gut durch pipettieren. Die Platte wieder auf den Magneten und sammeln eluierten DNA (~ 37 µL). Laufmittel bei-20 ° C bis zur weiteren Analyse zu speichern.
- Quantitative PCR
- verwenden die Primer, die verwendet wurden, bestand DNA im Schritt 4.1.1 zu quantifizieren, Kopien des Gens Xis vorbereiten nach dem Protokoll von Haddad Et Al. 10
- master-Mix Lösung entsprechend dem Umfang der zu testenden Proben vorbereiten, dann verteilen Sie die Mischung in PCR-Röhrchen oder einen weißen Hintergrund 96-Well-Platte.
- Verwenden Sie die folgenden Mengen für ein komplettes Volumen von 20 µL PCR Mischung: 10 µL Polymerase / verschuppen Farbstoff Gemisch (siehe Tabelle der Materialien), 2 µL DNA-Probe, 2 µL forward Primer (10 µM), 2 µL rückwärts-Primer (10 µM)
- Richten Sie die Thermocycler nach dem folgenden Programm: 95 ° C für 120 s, 40 Zyklen (95 ° C für 15 s, 64 ° C für 15 s, 68 ° C für 45 s), 68 ° C für 5 min.
- Mit Triplicates für Standards und Proben, die Zyklus-Schwelle zu berechnen und konstruieren eine Standardkurve zur Schätzung der Anzahl der Kopien der DNA in jeder Probe abgerufen. Das hier verwendete Gerät führt dies automatisch.
- Hier wird die Anzahl der Kopien der DNA für insgesamt Elution Volumen (~ 40 µL) geschätzt. Prozentsatz der DNA abgerufen, die ursprünglichen Betrag hinzugefügt, um verbindliche Lösung (total 10 11 Exemplare) kann darüber hinaus das Intervall von 0 bis 100 variieren.
6. DNA-magnetische Partikel Bindung Analyse mittels DLS
- Bindung der DNA
- für großvolumige Experimente (in 1,5 mL-Tube), verwenden Sie die folgende verbindliche Lösung Mischung: 96 µL MMPs oder MNPs, 120 µL Natrium Acetat-HCl geändert (0,75 M, pH = 6), 720 µL von 85 % Ethanol, 120 µL DNA (10 10 Kopien Lösung) oder 120 µL Tris-HCL-Puffer (10 mM, pH = 8) für die Steuerung.
- Zeta-potential-Analyse
- bereiten zwei verbindliche Lösungen, mit DNA und ein weiteres mit Tris-HCL-Puffer für die Kontrolle, wie in Schritt 6.1.1 angewiesen. Zur Vermeidung von Blasenbildung pipette vorsichtig 800 µL der Bindung Mischung in einer Einwegzelle.
Hinweis: Verwenden Sie Einweg-Küvette zur Messung der Oberfläche das Zetapotenzial (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- bereiten zwei verbindliche Lösungen, mit DNA und ein weiteres mit Tris-HCL-Puffer für die Kontrolle, wie in Schritt 6.1.1 angewiesen. Zur Vermeidung von Blasenbildung pipette vorsichtig 800 µL der Bindung Mischung in einer Einwegzelle.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Messung auf DLS Instrument: Smoluchowski-Modell mit einem F(ka) von 1,5, Temperatur: 25 ° C, Brechungsindex dispersive Phase (Eisen): 2.344, Brechungsindex dispersive Umgebung (Wasser): 1,333.
Hinweis: Die Rate der DNA-magnetische Partikel Wechselwirkung wirkt sich direkt auf die Messung von Wiederholungen. Eine Einzelmessung durch das Instrument dauert 60-70 s. Hier wurde das Instrument angewiesen, 10 Messungen mit 1 min Verzögerung Abstand nehmen. Der Einfachheit halber werden die Ergebnisse wieder eingeblendet werden = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 min aus der ersten Lesung.
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Representative Results
Über das Protokoll beschriebenen chemischen Synthese und Modifizierung der Magnetpartikel, wurden sechs magnetische Partikel synthetisiert und analysiert für DNA-Bindung. Eine Zusammenfassung der Analyse ist in Tabelle 1dargestellt. Durch den Vergleich der Partikelgröße im Wasser und in verbindliche Lösung, ist es klar, dass alle Partikel in verbindlichen Lösung durch 2-22 Falten aggregiert. Einige Partikel weiter zu mehr Falten im Beisein von DNA aggregiert; jedoch war dies nicht direkt korreliert mit DNA-Abruf erkannt durch quantitative PCR (Tabelle 1). Vergleich des Zetapotenzials (10 Messungen in ~ 2 min Abständen) der Partikel in Steuerelementen im Vergleich mit DNA zeigte starken Rückgang der drei Teilchen; nämlich: MNPs_APTES, MMPs_TEOS und MMPs_APTES (Abbildung 2). Trends im Zetapotenzial im Laufe der Zeit wurden auch beobachtet, Variationen in den ersten drei Lesungen zeigt, bevor sie in den meisten Fällen (Abbildung 3) stabilisiert werden. Variation nach Exposition gegenüber DNA verzeichneten vor allem MMPs (Abbildung 2). Unteren Standardabweichung wurde beobachtet, durch den Verzicht auf der ersten drei Lesungen vertreten ersten 5 min nach der Exposition der Partikel an der DNA (Tabelle 1).
Insgesamt zeigt die Analyse in Tabelle 1 die unterschiedlichen Eigenschaften der DNA-Partikel Bindung wie magnetische Partikelgröße und chemischen Veränderungen zugeschrieben. Kurz nach der Bindung der DNA durch vier Falten mit keine signifikante Veränderung in Polydispersität Index oder das Zetapotenzial MNPs_PEI Nanopartikel an Größe zugenommen. Allerdings war die DNA nicht abrufbar in diesem Verfahren. MNPs_TEOS Nanopartikel in der Größe erhöht und verringert in Polydispersität Index mit unauffälligen Änderung in das Zetapotenzial nach DNA-Exposition, doch sie die besten Partikel in ihren Abruf Preise bei 20,3 waren %. MNPs_APTES Nanopartikel ging leicht zurück und spürbar in das Zetapotenzial nach DNA-Exposition. MMPs_PEI Mikropartikel zeigte keine Veränderung in der Größe nach DNA-Exposition, aber sie Polydispersität Index stieg und sank leicht in das Zetapotenzial. MMPs_TEOS Mikropartikel zeigte alternative Größe Eigenschaften der Nanopartikel Pendants also MNPs_TEOS. Überraschend, sank sie spürbar in das Zetapotenzial aber nicht außerhalb des Bereichs von MNPs_TEOS angezeigt. MMPs_APTES der Partikelgröße auf DNA-Exposition erhöht und auch in das Zetapotenzial verringert. Es ist wichtig zu beachten, dass sowohl MNPs_APTES als auch MMPs_APTES ähnliche Größen beibehalten, nachdem chemische Modifikation trotz der Tatsache, dass sie aus verschiedenen waren Vorläufer Größe. Sie haben auch ähnliche Bindungseigenschaften angezeigt. MNPs_TEOS zeigten keine signifikante Veränderung in das Zetapotenzial nach ihren Werten erkannt wurden in die unterste Spitze in dieser Studie.
Die Follow-up im Laufe der Zeit für das Zetapotenzial zeigte stabilisierende Werte nach 5-10 min, vor allem bei MNPs (Abbildung 3A, 3 C und 3E). Ein kontinuierlicher Trend in das Zetapotenzial fand in einigen MMPs Lesungen (Abb. 3 b, 3D und 3F). In einigen Fällen entsprach Variationen in das Zetapotenzial Variationen im Polydispersität Index und Partikel Größe aber nicht mit DNA-Entnahme durch Elution.
Abbildung 1: Protokollschema. (A) chemische Modifikationen von magnetischen Partikeln verzweigten Polyethyleneimine, Siliziumdioxid, Aminogruppen. (B) DNA-Isolierung Schritte mit Bindung Puffer und magnetische Partikel auf Magneten, gefolgt von quantitativen PCR immobilisiert. (C) DNA-Bindung Partikelanalyse mit DLS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Zeta-Potential von repräsentativen magnetischen Partikeln in an- und Abwesenheit von DNA. Exposition gegenüber DNA verursacht sichtbare Abnahme des Zetapotenzials in MNPs_APTES, MMPs_TEOS und MMPs_APTES. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung (N = 10). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Zeta-Potential von repräsentativen magnetischen Partikeln im Laufe der Zeit in an- und Abwesenheit von DNA. Zeta-Potential von Partikeln in verbindlichen Lösung wurde zur Zeit gemessen = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 min. Abstand zwischen den Zeta potential Kurven der Kontrolle vs. mit DNA liegen auf der Hand im Falle von MMPs_TEOS, MNPs_APTES und MMPs_APTES. (A) Zeta-Potential von MNPs_PEI ist sehr positiv, zeigt keine Wechselwirkungen. (B) Zeta-Potential des MMPs_PEI sank im Laufe der Zeit, was auf eine sehr langsame Interaktion zwischen Partikeln und DNA. (C) Zeta-Potential von MNPs_TEOS war sehr negativ in Abwesenheit und Anwesenheit von DNA. (D) Zeta-Potential von MMPs_TEOS zeigt niedrigere Werte in Anwesenheit der DNA im Vergleich zu Kontrollen. (E) Zeta-Potential von MNPs_APTES zeigt niedrigere Werte in Anwesenheit der DNA im Vergleich zu Kontrollen. (F) Zeta-Potential von MMPs_APTES zeigt niedrigere Werte in Anwesenheit der DNA im Vergleich zu Kontrollen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Merkmale | MNPs_PEI | MNPs_TEOS | MNPs_APTES | MMPs_PEI | MMPs_TEOS | MMPs_APTES |
| Partikelgröße (nm) | ||||||
| im Wasser | 141,8 | 91,3 | 1106.4 | 825.0 | 1281.3 | 1281.3 |
| in verbindliche Lösung | 531.2 | 1990.1 | 3091.0 | 2669.0 | 2669.0 | 1990.1 |
| in bindin |
Tabelle 1: Charakterisierung der repräsentativen Magnetpartikel und ihre Fähigkeiten zum binden und Abrufen von DNA. Bei Kontakt mit verbindlichen Lösung zeigten alle Partikel Aggregation (Erhöhung der Partikelgröße). Wenn DNA in verbindlichen Lösung vorhanden war, war Partikel Größenzuwachs in MNPs_PEI, MNPs_TEOS und MMPs_APTES sichtbar. Teilchen waren Polydisperse Systeme in verbindlichen Lösung, besonders MNPs_TEOS, weniger Polydispersed bei der Bindung von DNA wurde. MNPs_APTES zeigte Polydispersität Index Zunahme und Abnahme Zetapotenzial bei Kontakt mit DNA. MMPs_TEOS und MMPs_APTES zeigten große Rückgang Zetapotenzial bei Kontakt mit DNA. MNPs_TEOS und MMPs_TEOS zeigte die höchsten DNA Abruf Raten von 20,3 % und 7,5 %, bzw., wie gezeigt durch quantitative PCR. MNPs_APTES und MMPs_APTES zeigten 0,1 % DNA-Entnahme Preise.
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Discussion
In diesem Protokoll wurden die theoretischen Grundlagen, die DNA-Bindung an Magnetpartikel über das Zetapotenzial erklären in Frage gestellt. Das Protokoll beschreibt die Synthese und Modifizierung von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel. Methode für die Erstellung von DNA-Kontrolle und verbindliche Lösung werden ebenfalls beschrieben. Zwei Strategien sind hier für das Screening der DNA-Partikel-Wechselwirkungen gezeigt: quantitative PCR und DLS nähert. DLS bietet drei Indikatoren für die physikalisch-chemischen Veränderungen der Partikel: Partikelgröße, Polydispersität Index und Zetapotenzial. Größenänderungen Partikel zeigen direkt Aggregation oder Zerfall. Polydispersität-Index-Wert beschreibt die Verteilung der Partikel-Arten in das System von Prozess (Index < 0,05) zu hoch Polydispersed (Index > 0,7). Das Zetapotenzial kann klassifiziert werden Partikel nach Oberflächenladung wo sehr positive Teilchen Werte größer zeigen als 30 mV und äußerst negativen Teilchen Werte niedriger als-30 zeigen mV. Wie vorhergesagt verringert das Zeta-Potential von Polycharged magnetischen Partikeln in verbindlichen Lösung relativ, wenn die Partikel DNA ausgesetzt waren. Die Ausnahme von dieser Regel ist MNPs_TEOS. Diese Teilchen unterscheiden sich nur insofern sie eine einzigartige äußerst negativen Oberflächenladung (Abbildung 2 besitzen). Dies deutet darauf hin, dass Ionenstärke eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Partikel, die DNA und die positiven Ionen. Auf der anderen Seite können die Änderungen der Partikelgröße besonders in Gegenwart von längeren DNA-Stränge die Rolle der Niederschlag/Aggregation der DNA-Partikel während des Bindevorgangs angeben.
Bei der Synthese von magnetischen Partikeln und chemischen Modifikationen gibt es mehrere wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern: Erstens die Reproduzierbarkeit der Methode der Synthese hängt stark von genaue Mengen chemischer Grundstoffe verwendet Synthese sowie gut rühren und rechtzeitige kontrollierte Zugabe von NH4OH. Um eine homogenisierte Bevölkerung von Teilchen (ähnliche Größe, Form, Dichte und Zusammensetzung) zu erwerben, ist es wichtig, Beschallung und mitreißende Schritte sorgfältig nach Anweisung zu folgen. Zweitens realistische vielfach die chemischen Modifikationen nicht vorhersagen, die Realität dessen, was auf der Oberfläche des magnetischen Partikeln. Ein umfassende Charakterisierung Schritt ist erforderlich, um die chemische Zusammensetzung der Oberfläche der Partikel zu bestätigen, wie in der Einführung beschrieben. Unter den gängigen Techniken setzen Forscher auf FTIR, XPS, Elektrochemie, Spektroskopie, sowie DLS.
Darüber hinaus sind mehrere kritische Schritte während der DLS-Messungen und Analysen erforderlich: Erstens die Auswahl der verbindlichen Lösung beeinflusst verschiedene Schritte einschließlich der chemischen Kompatibilität mit Partikeln und DNA und auch spektralen Eigenschaften. Wahl der Brechungsindizes von verbindlichen Lösung und Partikel Material kann basierend auf früheren Studien oder durch Refraktometrie ausgewertet werden. Zweitens, Wechselwirkungen zwischen den Teilchen und die Elektroden in die Küvetten sollten sorgfältig überwacht werden, da die Oxidation/Reduktion Messung beeinflussen kann. Drittens, wie in Abbildung 3dargestellt, die Rate der Bindung eine Funktion der Zeit sein. Es ist entscheidend für die Stabilität der Interaktion zu beobachten, und dies ist ein großer Vorteil für die Anwendung der DLS in solchen Studien. Hier wird der Beobachter Partikel Aggregation und physiochemische Änderungen in Echtzeit überwacht. Viertens kann Polydispersität des Systems auf den Umfang der Analyse Einschränkungen festlegen. Polydispersität Indexwert unter 0,05 beschreibt ein System, Prozess, während Werte über 0,7 ein Polydispersed System in verschiedenen Größen von Teilchen zu beschreiben. Die Größe der Partikel und Verteilung der verschiedenen Teilchen, die Arten untersucht werden können, mit verschiedenen Arten von DLS, einschließlich zurückgestreute, Seite verstreut und vorwärts verstreut, wie im Protokoll Abschnitt 3.1 erwähnt. Zu guter Letzt Beschallung von Teilchen vor dem Test kann natürlich beeinflussen ihre physikalischen Eigenschaften (z. B. Größe und Fläche) und übermäßig geschieht kann es Freisetzung von einigen chemischen Modifikationen.
In diesem Protokoll Informationen über DLS erworben im Vergleich zu Daten, die durch quantitative PCR, auch bekannt als Real-Time PCR. Letzteres ist der Goldstandard für Erkennung und Quantifizierung von DNA. 15 PCR-Technik ist in Labors, Krankenhäuser und Universitäten verbreitet. DNA-Exposition gegenüber Roman und synthetisierten Materialien zu testen ist es jedoch wichtig, die Chemie der PCR in Betracht zu nehmen. Polymerase-Enzym, das zentrale Element der Polymerase-Kettenreaktion, reagiert empfindlich auf bestimmte chemische Inhibitoren und Geschmacksverstärker. Neben der internen Kontrollen, Prüfung der Kunststoffe und gute Laborpraxis kann dazu beitragen, Vorurteile in PCR-Ergebnisse. Wirkmechanismen für Inhibitoren und Enhancer unterscheiden sich Chemikalien, die direkt an Polymerase binden und andere, die Ionen aus der Mg2 +Chelat-abhängige Polymerase in Lösung. Einige Erkenntnisse über DNA-Isolierung sind schwer zu PCR-Screening mit Hilfe bekommen. DLS zeigen Fälle, wenn DNA an Teilchen bindet, sondern eher gewaschen oder nicht eluieren (DNA durch PCR nicht erkannt). Zum Beispiel MNPs_APTES und MMPs_APTES zeigten eine signifikante Abnahme der Zetapotenzial auf DNA-Exposition (Tabelle 1), aber die DNA in Elution nachgewiesen korrelierte nicht mit diesen Ergebnissen. Es ist möglich, die Bindung, Waschlösungen, Elution, kontrollieren die Freisetzung von DNA aus Partikeln zu ändern. DLS ist ein relativ schneller Methode zur Auswertung der DNA-Partikel-Wechselwirkungen. Die Stabilität und Geschwindigkeit der Interaktion können auch beobachtet werden durch diese Methode (Abbildung 3), die Auswirkungen haben kann, dass die Zeit für die magnetischen Partikel - DNA-Isolierung-Protokolle basierend.
Die Herausforderungen für die Verwendung von DLS in der Analyse sind geradlinig. Diese Technik erfordert eine relativ große Probenmenge für die Analyse (~ 1 mL) im Vergleich zur PCR. Einige Parameter wie Brechungsindizes erfordern sorgfältigen Auswertung, wenn neue Lösungen in den Proben mit. Darüber hinaus ist es sehr üblich, Oxidation/Reduktion Reaktionen an den Elektroden der Küvetten zu beobachten, wenn Roman Werkstoffprüfung. Sorgfältig geprüft und das Wissen über die chemische Zusammensetzung der Probe können helfen, die Tiere wieder mit der gleichen Küvette zu bewerten. Es ist erwähnenswert, dass DLS Analyse beschränkt sich auf die Spezifität und Sensitivität von PCR zur Verfügung gestellt, aber es verschiedene Arten von Einblick in der DNA-Partikel Bindevorgang bietet.
Wie alle spektroskopischen Techniken Modifikationen und Fehlerbehebung von DLS streben Entwicklung genauer und empfindliche Messungen. Dies kann erreicht werden durch die Bereitstellung von besseren Verständnis der Natur des Materials getestet, physikalisch und chemisch. Das heißt, sind optische Eigenschaften und Details der chemischen Zusammensetzung der Schlüssel, präzise und sensible Daten von DLS zu gewinnen. Optische Eigenschaften können durch Refraktometrie, während chemische Zusammensetzung der Partikel erworben werden / Partikel Oberfläche kann durch verschiedene Techniken wie FTIR, XPS, Elektrochemie und anderen spektroskopischen Methoden untersucht werden. In diesem Protokoll kann verbindliche Lösung verbessert werden, mithilfe von verschiedenen Ionischen stärken, andere entwässernde Mittel (z.B. Isopropanol), verschiedene pH und niedrigen Temperaturen. Auf der anderen Seite sind die chemischen Veränderungen der Partikeloberfläche die Chemiker Phantasie überlassen.
Die Entwicklung von Materialien für die Isolierung der DNA werden weiterhin in den nächsten Jahrzehnten mit mehr Fokus auf Spezifität, Reinheit und Nachweisgrenze steigen. Die Qualität der Extraktionsmethoden spielt wichtige Rolle in den Studien der einzelligen Skala, mEtagenomic Skalen und Proben von ungewöhnlichen Ursprung. In der heutigen Zeit ist es wichtig, DLS-Analyse von Nanopartikeln und Mikropartikel modifiziert mit verschiedenen Arten von Materialien durchführen. Dieser Schritt ist erforderlich, vor der Gründung eines starke theoretischen Modells, das beschreibt das Verhalten der DNA-Partikel-Wechselwirkungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die finanzielle Unterstützung von tschechischen Wissenschaftsstiftung (GA CR 17-12816S-Projekt) und CEITEC 2020 (LQ1601) ist sehr anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
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