Summary
이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.
Abstract
자성 입자를 사용 하 여 DNA의 분리는 생명 공학 및 분자 생물학 연구에 높은 중요성의 필드입니다. 이 프로토콜 통해 동적 산란 (DL) 및 전기 이동 산란 (ELS) 바인딩 DNA-마그네틱 입자의 평가 설명 합니다. DL 분석 입자 크기, 증가할수록, 잠재적인 제타 등 입자의 물리 화학적 특성에 귀중 한 정보를 제공 합니다. 후자의 설명 표면 입자는 DNA와 같은 재료의 정전기 바인딩에 주요 역할을 담당을 합니다. 여기, 비교 분석 3 화학 수정 미, 나노 입자와 DNA 바인딩 및 차입에 대 한 그들의 효과 이용 한다. 화학 수정에 의해 분기 polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate 및 (3-aminopropyl) triethoxysilane 조사. 이후 DNA 음 전 전시, 입자 표면의 제타 전위의 DNA 바인딩 시 줄어 전망 이다. 클러스터의 형성 입자 크기에 영향을 또한 한다. 격리에서 이러한 입자의 효율성과 DNA의 차입을 조사 하기 위하여 입자는 낮은 pH (~ 6), 이온 강도 및 탈수 환경에 DNA와 혼합 됩니다. 입자는 자석에 세척 되 고 다음 DNA는 eluted Tris HCl 버퍼에 의해 (pH = 8). DNA 복사 번호 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 추정 된다. 제타 전위, 입자 크기, 증가할수록 및 PCR 양적 평가 하 고 비교 됩니다. DL는 통찰력과 지원 DNA 격리에 대 한 입자의 심사 과정에 새로운 관점을 추가 하는 분석 방법 이다.
Introduction
DNA 분리 분자 생물학에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 핵 산 추출 방법의 개발 유전체학, metagenomics, epigenetics, 및 transcriptomics의 신흥 분야에 큰 영향을가지고. DNA 분리 등 의료 (법의학/진단 도구와 전조 생체), 바이오 응용 프로그램 및 환경 응용 프로그램 (metagenomic 생물 다양성, 병원 체, 정도와 감시)의 넓은 범위가 있다. 정화 하 고 다른 비늘 같은 혈액, 소변, 토양, 나무, 그리고 샘플의 다른 종류와 다른 자료에서 DNA를 분리 하는 수요 증가 되었습니다. 1 , 2 , 3 , 4
나노 및 마이크로 크기의 입자는 DNA 분리 및 특히 그들의 높은 표면적 때문에 적합 때 그들은 자기장에 의해 움직일 수 있다. 입자 크기, 충전 등의 물리 화학적 특성 크게 대상 생체를 바인딩할 그들의 능력을 좌우할 수 있다. 5 추가 바인딩 생체의 향상 그리고 입자를 안정화, 다른 화학 수정 (표면 코팅) 활용할 수 있습니다. 바인딩에 대 한 많은 다른 전략 공유 및 공유 비 상호 작용에 따라 분류 됩니다. 반면 입자 구성의 금속, 합금 또는 그것의 밀도, 다공성, 고 표면에 영향을 미칠 수 있는 다른 자료에 의해 지 어질 수 있다 6 입자의 크기는 직접 그들의 자화 특성 적용 됩니다. 7 거기 방법은 신뢰할 수 있는 측정 하는 작은 입자의 표면 전 하입니다. 대신, 미 끄 러 짐을 비행기 (나노 표면에서 거리)에 전기 잠재력은 측정할 수 있습니다. 8 이 값 이라고 제타 잠재 하며 그것은 DL 통해 나노-및 microparticle 안정성의 평가 위해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 9 의 값 뿐만 아니라 pH 이온 강도 입자의 표면 특성에 뿐만 아니라 분산 환경에 매우 의존 때문에, 그것은 또한 증명할 수이 표면 사이 상호 작용으로 인 한 변화는 입자 그리고 관심사의 분자입니다. 10
다른 한편으로, 탈수 조건 (A DNA 형태) 전시 압축된 conformations 촉진 하는 그것의 강 수 (집계) 비교 하는 경우에 일반적으로에서 DNA 구조 B DNA 형태로 발생 합니다. 정전기 (이오니아와 H-본드) 그들의 sterically 액세스할 수 인산 인해 다른 자료에 DNA의 바인딩을 제어 하는 주요 세력 그리고 질소 기지 (특히 구 아닌). 7 , 10
이 작품에서 자기 나노 입자와 미의 3 개의 대표적인 화학 수정 분석 (그림 1A). 합성 방법 및 나노 입자와 미의 화학 수정 설명 합니다. 바인딩 솔루션, DNA 강 수 (pH, 이온 강도, 그리고 탈수)의 이론적인 원리에 그 협정 DNA 바인딩 및 차입을 평가 하는 데 사용 됩니다. 정량 PCR는 대표적인 나노 입자와 미 (그림 1B)에서 DNA의 차입 효율성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 입자 크기, 증가할수록 색인, 및 잠재적인 제타는 입자 표면 (그림 1C)에 발생 하는 물리 화학적 변화를 시각화 하는 데 사용 되는 중요 한 매개 변수. 그것은 자성 입자 표면의 화학 특성에 강조 해야 합니다. 이 프로토콜의 범위를 넘어이 단계 동안, 몇 가지 현대 기술은 화학 수정의 효율성 조사에 적용할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 , 14 입자 표면의 적외선 스펙트럼을 평가 하 고 무료로 화학 한정자의 스펙트럼을 비교 하는 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR)을 사용할 수 있습니다. 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 소재 표면 원소 구성 식별 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 기술입니다. 다른 전기, 현미경, 분 광 방법 입자 합성의 품질에 빛을 발산 하 게 사용할 수 있습니다. 이 작품 DL 통해 DNA-마그네틱 입자 상호 작용을 분석 하는 새로운 관점을 강조 한다.
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Protocol
1. 마그네틱 나노 입자 합성
- FeCl 3의 추가 20 mmol 시트르산 (MNPs)와 자성 나노 입자의 합성 안정화
- ∙ 6 H 2 O (5.406 g) 및 FeCl의 10 mmol 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) deoxygenated 이중 증 류 물 (ddd) 20 mL에. 투명 한 솔루션을 얻을 때까지 기계적인 교 반기를 사용 하 여 N 2 분위기에서 비 커에 적극적으로 솔루션을 얻은 볶음.
- 빠른 기계적 교 반, 아래 150 mL의 1 M NH 4 오, 드롭 들러 떨어지고 퍼 널 (1 시간 또는 더 필요한 경우)를 사용 하 여 추가. 모든 NH 4 오 추가 되는 솔루션 screwable 그릇에 전송 합니다. 30 분에 75 ° C에서 선박 및 열 솔루션을 스크류
주의: NH 4 오는으로 분류 부식성 환경에 대 한 위험.
참고: 높은 학년 28% NH 4 deoxygenated 물을 사용 하 여 물에 오에서에서 NH 4 오 솔루션 준비. - 수집 및 사용 하 여 자석 세척 ddd 물 100 mL를 사용 하 여 검은 침전. 3 회 반복 한다. 0.5 M 트라이-나트륨 시트르산이 수화물 침전을 50 mL를 추가 합니다. 배 나사.
참고: 트라이-나트륨 시트르산이 수화물의 deoxygenated 솔루션 사용. - 쥡니다 (35 kHz, 100%의 진폭)와 1 h. 80 ° C에서 열 배를 통해 다시 분산 된 침전
참고: 충분 한 힘의 sonicator 필요. - 실내 온도에 솔루션 식힙니다. 침전 한 자석을 사용 하 여 수집 하 고 상쾌한 제거. 다시 검은 진흙 sonicator (35 kHz, 100%의 진폭)를 사용 하 여 ddd 물 50 mL에 분산.
- 50 mL 원심 분리기 튜브에 aliquots (25 mL)을 전송 하 고 아세톤 20 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 2400 x g에서 원심과 supernatants 제거.
- 다시 침전을 분산 하 고 24 헤에 대 한 적합 한 볼륨의 낮은 분자량 컷오프 투 석 장치 (500-1000 다)를 사용 하 여 물에 대 한 솔루션 dialyze
참고: 준비 제조 업체에 따르면 투 석 장치 ' s 요구. - 분기 polyethylenimine (MNPs_PEI)로 자성 나노 입자의 합성
- 유리 비 커에 얻은 MNPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 2 개 mL를 추가. Ddd 물 38 mL을 추가 하 고 sonicate (35 kHz, 100%의 진폭) 서 스 펜 션 (10 분).
- 빠른 기계적 교 반, 아래 추가 10%의 10 mL 분기 polyethylenimine (평균 25 kDa). 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어
- 수집 자석을 사용 하 여 침전 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 다시 침전 20 mL ddd 물에 분산. 5 회 반복 후 마지막 정지 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.
- 자성 나노 입자의 합성 실리 카 (MNPs_TEOS) 수정
- 유리 비 커에 10 mL 취득된 MNPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 추가. 물과 에탄올의 130 mL 60 mL를 추가 합니다. 28% NH 4 오 6 mL을 추가 하 고 솔루션을 sonicate.
- 빠른 기계적 교 반, 아래 tetraethyl orthosilicate의 1 mL을 추가. 이후 12 헤에 대 한 솔루션을 저 어
- 는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). Ddd 10 mL에 다시 분산 입자 물와 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.
- 아미노 그룹 (MNPs_APTES)로 자성 나노 입자의 합성
- 유리 비 커에 얻은 MNPs_TEOS 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. 45 mL 물과 에탄올의 50 mL를 추가 합니다. (35 kHz, 100%의 진폭) 솔루션을 sonicate.
- 빠른 기계적 교 반, 따라 0.5 mL (3-aminopropyl) triethoxysilane의 추가. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어
- 는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). 다시 분산 입자의 ddd 5 mL에 물과 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)를 sonicate.
2. 마그네틱 미 합성
- 2 M 알 것 3, 1 M 코의 12.5 mL 및 screwable 그릇에 ddd 물 205.875 mL의 추가 25 mL 자기 미의 합성 시트르산 (MMPs)와 안정. 자석 교 반 중 1 M FeSO 4 6.675 mL를 추가 합니다. 2 헤에 대 한 따뜻한 물 목욕 (90 ° C)에 즉시 전송 선박
참고: 알 3와 ddd에서 코 솔루션 준비 물. - 실내 온도에 솔루션 식힙니다. 사용 하 여 자석 및 세척 ddd 물 50 mL (5 번)을 사용 하 여 검은 침전을 수집 합니다. 0.5 M 트라이-나트륨 시트르산이 수화물 침전을 50 mL를 추가 합니다. 배 나사.
- 쥡니다 (35 kHz, 100%의 진폭)와 1 h. 수집 검은 침전 자석 및 세척 (10 번) ddd 물 50 mL를 사용 하 여 그것을 사용에 대 한 80 ° C에서 열 배를 통해 침전 redisperse.
- 수정 MMPs 분기 polyethylenimine (MMPs_PEI)와 실리 카 (MMPs_TEOS) 및 아미노 그룹 (MMPs_APTES) MNPs 프로토콜에 비슷합니다. 2.2, 2.3, 2.4, 각각에 대 한 자세한 내용은 섹션을 참조 하십시오.
- 2 M 알 것 3, 1 M 코의 12.5 mL 및 screwable 그릇에 ddd 물 205.875 mL의 추가 25 mL 자기 미의 합성 시트르산 (MMPs)와 안정. 자석 교 반 중 1 M FeSO 4 6.675 mL를 추가 합니다. 2 헤에 대 한 따뜻한 물 목욕 (90 ° C)에 즉시 전송 선박
- 분기 polyethylenimine (MMPs_PEI)로 자기 미의 합성
- 유리 비 커에 MMPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. Ddd 물 38 mL을 추가 하 고 (35 kHz, 100%, 10 분의 진폭) 솔루션을 sonicate. 빠른 기계 교에서 10%의 10 mL 분기 polyethylenimine (평균 25 kDa) 추가 합니다. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어
- 침전 한 자석을 사용 하 여 수집 하 고 상쾌한 제거. 두 배 증류수 20ml에 침전 redisperse 5 회 반복 후 (35 kHz, 100%의 진폭) 최종 솔루션을 sonicate.
- 합성 실리 카 (MMPs_TEOS)로 자기 미의
- 유리 비 커에 MMPs 솔루션 (~0.1 g/mL)의 5 mL을 추가. 물과 에탄올의 130 mL 60 mL를 추가 합니다. 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)를 sonicate 고 추가 28% NH 4 오 6 mL.
- 빠른 기계적 교 반, 아래 tetraethyl orthosilicate의 1 mL을 추가. 이후 12 헤에 대 한 솔루션을 저 어
- 는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 그것을 씻어 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회) 및 물 50 mL (3 회). Ddd 물 5 mL에 입자 redisperse 고 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.
- 아미노 그룹 (MMPs_APTES)로 자기 미의 합성
- 유리 비 커에 MMPs_TEOS 솔루션 (~0.1 g/mL)의 3 개 mL를 추가. 45 mL 물과 에탄올의 50 mL를 추가 합니다. 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.
- 빠른 기계적 교 반, 따라 0.5 mL (3-Aminopropyl) triethoxysilane의 추가. 후속 3 헤에 대 한 솔루션을 저 어
- 는 자석을 사용 하 여 검은 침전을 수집 하 고 사용 하 여 에탄올의 50 mL (3 회)과 물 (3 시간) 50 mL에 그것을 씻어. Ddd 물 3 ml에서 입자 redisperse 고 서 스 펜 션 (35 kHz, 100%의 진폭)을 sonicate.
3. 자석 입자 크기 분석을 사용 하 여 DL
다시 산란 검출기 각도 (173 °) 및 633의 빔 파장 적용 되는- 물에서 입자 크기
- 는 DL 사용 하 여 악기 nm.
참고: 다시 산란 DL 여러 분산을 피할 수 있다 집중된 샘플에 적합 하다. 사이드 산란 (검출기 각도 90 °) 앞으로 산란 (검출기 각도 15 °) DL 적합 작은 입자 및 입자를 각각 혼합. - 이전 측정 물에 3 분에 대 한 입자 sonicate
참고: 입자의 희석된 솔루션을 사용 합니다. 이 위해 입자의 9.6 µ L 96 µ L의 물 혼합. - 신중 하 게에 폴리스 티 렌 라텍스 입자 솔루션의 50 µ L를 플라스틱 큐 벳 거품의 형성을 방지 하는 고.
참고: 각 샘플 사용 일회용 cuvette (자료 목차 참조). - 참고는 베트의 선명도 광선의 방향. 샘플 홀더에 셀을 삽입 하 고 챔버 닫습니다.
- 측정에 대 한 다음 매개 변수를 사용 하 여: 온도: 25 ° C, 분산 단계 (철)의 굴절률: 2.344; 분산 환경 (물)의 굴절률: 1.333
참고: 소설 또는 하이브리드 재료를 개발 하는 경우에 특히 더 정확한 결과 얻으려면 한 굴절 계를 사용 하 여 굴절률의 측정 수행.
- 는 DL 사용 하 여 악기 nm.
4. DNA, 자석 입자 및 바인딩 버퍼 준비
- DNA 주식
- 사용 10 mM Tris HCL 버퍼 (pH = 8) 희석 및 DNA의 저장. 실험실 (섹션 5.2 반응 설정 및 조건에 대 한 참조)에서 직접 PCR 프로토콜으로 증폭 될 수 있는 표준 DNA 샘플을 사용 합니다. 498 기본적인 쌍 (bp) 살 균 소 λ 컨트롤에서 xis 유전자의 증폭, 다음 프라이 머를 사용 합니다. 뇌관을 앞으로: 5 '-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3Ɔ 반전 뇌관: 5 '-TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3 '
- 정화 PCR 제품 상업적 DNA 정제 키트를 사용 하 여.
참고: 실리 카 열 기반 프로시저를 사용 하 여 상업적 키트 항복 > 100 ng / µ L 정화 DNA.
Spectrophotometric 메서드를 사용 하 여 DNA의 - 측정 농도 (260에서 흡 광도 nm). 10의 작업 솔루션 위의 지시로 10 11 복사본 / µ L의 DNA 재고 희석 10, 10 9, 10, 8 및 10 7 복사본 / µ L.
참고: PCR 제품의 복사본의 수 평균 분자량은 각 혈압에 대 한 650 다 가정 다음 방정식에 따르면 산출 될 수 있다:
DNA 복사본 / µ L = (ng / µ L에 수량 * 6.022x10 23 복사본/mol) / (498 bp * 혈압의 650 g/mol * 1 x 10 9 ng/g)
- 자석 입자
- 입자는 자석 없이 토사를 허용 하 고 상쾌한 제거. 1시 20분 믹스 ddd 물 자석 입자의 v/v 비율 (입자: 물).
참고: 볼륨 기반 접근 MNPs와 MMPs의 동등한 대 중은 쉽게 비교 하기 어려운 이후 자석 입자의 수량을 설명 하기 위해 사용 됩니다.
- 입자는 자석 없이 토사를 허용 하 고 상쾌한 제거. 1시 20분 믹스 ddd 물 자석 입자의 v/v 비율 (입자: 물).
- 버퍼 바인딩
- 0.75 M 나트륨 아세테이트 HCL 솔루션의 빠른 준비에 대 한 (pH = 6), 3m 나트륨 아세테이트의 1 mL의 1 m m HCL 3 mL 혼합.
참고: 바인딩에 사용 되는 모든 솔루션은 4에 저장 될 수 있다 ° C. 참고 낮은 온도 크게 에탄올 솔루션의 경우 특히 바인딩 증가. 더 나은 재현성에 대 한 솔루션의 온도 심사의 정확성 제어.
- 0.75 M 나트륨 아세테이트 HCL 솔루션의 빠른 준비에 대 한 (pH = 6), 3m 나트륨 아세테이트의 1 mL의 1 m m HCL 3 mL 혼합.
5. 효율의 DNA 격리를 사용 하 여 정량 PCR 테스트
- 수정 MMPs 또는 MNPs DNA 격리
- 96 잘 접시와 작은 볼륨 실험에 대 한 96 잘 접시에 맞게 자석 사용.
- 다음 바인딩 솔루션 혼합물을 사용 하 여: 8 µ L 수정 MMPs MNPs, 10 µ L 나트륨 아세테이트-HCl (0.75 M, pH = 6), 60 µ L 85% 에탄올, 10 µ L DNA의 (10 10 복사본 솔루션).
- 믹스 pipetting으로 잘 하 고 3 분에 대 한 자석에 접시를 놓습니다. 자석에 접시를 실행 하는 동안 솔루션을 제거 하 고 세척에 대 한 85% 에타 놀의 100 µ L 추가.
- 제거 에탄올.
참고: 몇 초 동안 건조 에탄올을 허용 하지만 지나치게 건조 하거나 균열 입자를 두지 마세요. 그들은 입자 이상 건조 하는 경우 차입 솔루션 디졸브 어려울 것 이다. - 자석에서 접시를 제거 하 고 차입 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. Pipetting으로 잘 섞는다. 자석에 다시 접시를 놓고 eluted DNA를 수집 (~ 37 µ L). 추가 분석까지-20 ° C에서 eluent 저장.
- 정량 PCR
- 드는 외 프로토콜에 따라 재고 단계 xis 유전자의 복사본을 계량 하기 4.1.1에서에서 DNA를 준비 하는 데 사용 된 뇌관을 사용 하 여. 10
- 마스터 믹스 솔루션 테스트 샘플의 양에 따라 준비 후 PCR 튜브 또는 흰색 배경 96 잘 접시에 혼합물을 배포.
- 20 µ L PCR 혼합의 완전 한 볼륨에 대 한 다음 수량을 사용 하 여: 10 µ L 중 합 효소 / 염료 혼합 intercalating (재료의 표 참조), 2 µ L DNA 샘플, 2 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M), 2 µ L 역 뇌관 (10 µ M)
- 다음 프로그램에 따르면 thermocycler 설정: 120 95 ° C s, 40 사이클 (15 95 ° C s, 64 ° C 15에 대 한 s, 45 ° C 68 s), 68 ° C 5 분
- 표준 및 샘플을 사용 하 여 triplicates 주기 임계값을 계산 하 고 각 샘플에서 검색 하는 DNA의 사본의 수를 추정 하는 표준 곡선을 구성. 여기에 사용 되는 악기가 자동으로 수행 합니다.
- 여기, DNA의 사본의 수 총 차입 볼륨 (~ 40 µ L)으로 추정 된다. DNA 솔루션 (완전히 10 11 부)를 바인딩 추가 원래 금액을 해당 검색의 비율 0 ~ 100 간격 넘어 다를 수 있습니다.
6. DNA-마그네틱 입자 바인딩 분석을 사용 하 여 DL
- DNA 바인딩
- 큰 볼륨에 대 한 실험 (1.5 mL 튜브)에 다음과 같은 바인딩 솔루션 혼합 사용: 96 µ L MMPs MNPs, 120 µ L 나트륨 아세테이트-HCl의 수정 (0.75 M, pH = 6), 720 85% 에탄올, 120 µ L DNA의 µ L (10 10 복사본 솔루션) 또는 120 µ L Tris HCL 버퍼 (10 m m, pH = 8) 컨트롤.
- 제타 잠재력 분석
- 준비 2 바인딩 솔루션, dna와 Tris HCL 버퍼 제어 단계 6.1.1에서에서 지시. 거품의 형성을 방지 하려면 신중 하 게 일회용 셀에 바인딩 혼합물의 800 µ L를 플라스틱.
참고: 표면 제타 잠재적인 (재료의 참조 테이블)의 측정에 대 한 일회용 cuvette 사용.
- 준비 2 바인딩 솔루션, dna와 Tris HCL 버퍼 제어 단계 6.1.1에서에서 지시. 거품의 형성을 방지 하려면 신중 하 게 일회용 셀에 바인딩 혼합물의 800 µ L를 플라스틱.
- DL 계기에 측정에 대 한 다음 매개 변수를 사용 하 여: Smoluchowski 모델은 F(ka) 1.5, 온도: 25 ° C, 분산 단계 (철)의 굴절률: 분산 환경 (물)의 2.344, 굴절률: 1.333.
참고: DNA-마그네틱 입자 상호 작용의 속도 직접 복제의 측정을 적용 됩니다. 악기에 의해 단일 측정 60-70 s를 걸립니다. 여기, 악기 1 분 10 측정 지연 간격을 지시 했다. 편의상, 결과 표시 됩니다 시간 = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18 분 첫 번째 독서에서.
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Representative Results
화학 합성 및 자성 입자의 수정에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 6 마그네틱 입자 합성 되었고 DNA 바인딩 분석. 분석 요약 표 1에 표시 됩니다. 바인딩 솔루션과 물에서 입자의 크기를 비교 하 여 그것은 분명 모든 입자 2-22 겹으로 솔루션 바인딩 집계. 어떤 입자는 더 DNA;의 더 많은 주름을 집계 그러나이 되지 직접 상관 DNA 검색 양이 많은 PCR (표 1)에 의해 감지. 제타 잠재적인 (10 ~ 2 분 간격으로 측정) 세 입자; 보여주었다 DNA 날카로운 드롭 대 컨트롤에 입자의 비교 즉: MNPs_APTES, MMPs_TEOS 및 MMPs_APTES (그림 2). 시간이 지남에 따라 잠재적인 제타 동향도 전에 그들은 대부분의 경우 (그림 3) 안정화는 처음 세 개의 수치에 변화를 보여주는, 관찰 되었다. DNA에 노출 된 후 변형 MMPs (그림 2)에서 주로 관찰 되었다. 낮은 표준 편차는 입자의 노출 후 DNA (표 1) 첫 번째 5 분을 나타내는 처음 세 개의 독서를 생략 하 여 관찰 되었다.
전반적으로 표 1 에서 분석의 보기 자석 입자 크기 및 화학 수정으로 DNA 입자 바인딩의 다른 특성을 보여 줍니다. 간단히, MNPs_PEI 나노 입자 크기가 증가할수록 인덱스 또는 zeta 잠재력에 중요 한 변화 없이 4 겹에 의해 DNA 바인딩 후 증가. 그러나, DNA는이 절차에서 검색 되지 않았습니다. MNPs_TEOS 나노 입자 크기에서 증가 하 고 감소 증가할수록 인덱스에서 제타 잠재적인 unnoticeable 변화 DNA 노출, 아직 그들은 20.3%에 그들의 검색 속도에 최고의 입자. MNPs_APTES 나노 입자 크기와 눈에 띄게 제타 DNA 노출 시 잠재적인 약간 감소. 그러나 MMPs_PEI 미 변화를 보여주지 않았다 DNA 노출 시 크기, 그들은 증가할수록 인덱스 증가 잠재적인 제타에 약간 감소. MMPs_TEOS 미 보여준 그들의 나노 입자를 대체 크기 특성 대응 즉, MNPs_TEOS. 놀랍게도, 그들은 제타 잠재 하지만 하지 MNPs_TEOS에 의해 표시 하는 범위를 넘어 눈에 띄게 감소 합니다. MMPs_APTES는 DNA 노출 시 입자 크기에서 증가 하 고 또한 잠재적인 제타에 감소. 그것은 중요 한 것을 MNPs_APTES와 MMPs_APTES 모두 비슷한 크기 후 보존 그들이 다른에서 만든 사실에도 불구 하 고 화학 수정 크기의 선구자. 그들은 또한 비슷한 바인딩 속성 표시 했습니다. MNPs_TEOS의 값에 의해 잠재적인 제타에 중요 한 변화가 최저 극단에 발견 된이 연구에서 나타났다.
특히 MNPs (3 C, 그림 3A와 3E)의 경우 5-10 분 후 후속 잠재적인 제타에 대 한 시간이 지남에 나타났다 안정화 값입니다. 잠재적인 제타에 지속적인 추세는 일부 MMPs 판독 (그림 3B, 3D 및 3 층)에서 발견 되었다. 경우에 따라 제타 잠재적인 변화 차입으로 증가할수록 인덱스 및 입자 크기 하지만 DNA 검색 하지 변화에 대응 했다.
그림 1: 프로토콜 스키마. (A) 분기 polyethyleneimine, 실리 카 및 아미노 그룹을 포함 하 여 자석 입자 화학 수정 (B) DNA 분리 단계 바인딩 버퍼와 자석, 양이 많은 PCR에 의해 뒤에 움직일 자석 입자를 사용 하 여. (C) DNA 입자 바인딩 분석 DL을 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 존재 및 DNA의 부재에 대표적인 자석 입자의 제타 전위. DNA에 노출 MNPs_APTES, MMPs_TEOS 및 MMPs_APTES에 잠재적인 제타의 표시 감소를 발생합니다. 오차 막대를 나타내는 표준 편차 (N = 10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 존재와 DNA의 부재에서 시간이 지남에 대표 자석 입자의 제타 전위. 시간에서 바인딩 솔루션에 입자의 제타 전위를 측정 했다 = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18 분 간격 제어 대 DNA의 제타 잠재적인 곡선 사이 MMPs_TEOS, MNPs_APTES 및 MMPs_APTES의 경우에 분명 한. (A) MNPs_PEI의 Zeta 잠재력은 매우 긍정적인 아무 상호 작용을 나타내는. (B) MMPs_PEI의 제타 전위는 입자와 DNA 사이 상호 작용을 매우 느린 제안 시간이 지남에 감소. (C) MNPs_TEOS의 Zeta 잠재력 DNA의 존재와 부재에 매우 부정적 이었다. (D) MMPs_TEOS의 Zeta 잠재력 컨트롤에 비교 될 때 DNA의 존재에 더 낮은 값을 보여 줍니다. (E) MNPs_APTES의 Zeta 잠재력 컨트롤에 비교 될 때 DNA의 존재에 더 낮은 값을 보여 줍니다. (F) MMPs_APTES의 Zeta 잠재력 컨트롤에 비교 될 때 DNA의 존재에 더 낮은 값을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 특성 | MNPs_PEI | MNPs_TEOS | MNPs_APTES | MMPs_PEI | MMPs_TEOS | MMPs_APTES |
| 입자 크기 (nm) | ||||||
| 물에 | 141.8 | 91.3 | 1106.4 | 825.0 | 1281.3 | 1281.3 |
| 바인딩 솔루션 | 531.2 | 1990.1 | 3091.0 | 2669.0 | 2669.0 | 1990.1 |
| bindin에서 |
표 1: 바인딩 및 DNA 검색 대표 마그네틱 입자와 그들의 능력의 특성. 노출 되 면 바인딩 솔루션, 모든 입자 집계 (입자 크기 증가) 했다. DNA 솔루션 바인딩에 때, 입자 크기 증가 MNPs_PEI, MNPs_TEOS 및 MMPs_APTES에 표시 했다. 입자는 바인딩 솔루션, 특히 MNPs_TEOS 된 DNA의 바인딩 시 적은 polydispersed에 polydisperse 시스템을 했다. MNPs_APTES 보여주었다 증가할수록 인덱스에서 증가 하 고 제타 DNA에 노출 시 잠재적인 감소. MMPs_TEOS 및 MMPs_APTES 큰 보였다 제타 DNA에 노출 시 잠재적인 감소. MNPs_TEOS와 MMPs_TEOS 각각 양이 많은 PCR에 의해 같이 20.3%와 7.5%의 가장 높은 DNA 검색 율을 보여주었다. MNPs_APTES 및 MMPs_APTES 0.1 %DNA 검색 속도 보여주었다.
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Discussion
이 프로토콜에서 제타 잠재적인 통해 자기 입자를 DNA 바인딩 설명 하는 이론적 원리 질문에서 했다. 프로토콜 합성 및 자성 나노 입자와 미의 수정에 설명합니다. DNA 제어 및 바인딩 솔루션의 준비를 위한 방법 또한 설명 합니다. 여기에 표시 된 두 가지는 DNA 입자 상호 작용의 심사에 대 한: 양이 많은 PCR 그리고 DL 접근. DL의 입자의 물리 화학적 변화 세 가지 지표를 제공 합니다: 입자 크기, 증가할수록 색인 및 잠재적인 제타. 입자 크기 변화는 직접 집계 또는 분해 작용을 나타냅니다. 증가할수록 인덱스 값 monodispersed에서 배열 하는 시스템에서 입자의 분포에 설명 합니다 (인덱스 < 0.05) 높은 polydispersed를 (색인 > 0.7). 제타 잠재적인 입자 어디 매우 긍정적인 입자 표시 값 보다 30 mV와 매우 부정적인 입자 값 표시-30 보다 큰 표면 충전에 따라 분류할 수 있다 뮤직 비디오. 예측, 상대적으로 솔루션 바인딩 polycharged 자석 입자의 zeta 잠재력 감소 때 입자는 DNA에 노출 됐다. 이 규칙에 예외는 MNPs_TEOS 이다. 이러한 입자만 다릅니다 그들이 가진 독특한 매우 부정적인 표면 충전 (그림 2). 이 이온 강도 입자, DNA 및 긍정적인 이온을 함께 잡고 있는 중요 한 역할을 했다 나왔다. 다른 한편으로, 입자 크기의 변화 특히 긴 DNA 가닥의 존재에서에서 바인딩 과정에서 DNA 입자의 강 수/집단의 역할을 나타낼 수 있습니다.
마그네틱 입자와 화학 수정 합성, 동안 주의 요구 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있다: 첫째로, 합성 방법의 재현성에 따라 크게 화학 선구자에 사용의 정확한 수량 좋은 감동 뿐만 아니라 합성 적시 NH4오의 추가 제어. (비슷한 크기, 모양, 밀도 및 구성)의 입자의 무 균된 인구를 얻으려고 쥡니다 및 교 반 단계 지시 하는 경우에 철저 하 게 중요 하다. 둘째, 많은 현실적인 경우에 화학 수정 예언 하지 않는다 자석 입자의 표면에 무엇의 현실. 포괄적인 특성화 단계는 소개 섹션에 설명 된 대로 입자 표면의 화학 성분 확인 해야 합니다. 일반적으로 사용 되는 기법으로, 연구원은 연결, XPS, 전기 화학, 분광학으로 DL에 의존합니다.
또한, 몇 가지 중요 한 단계는 DL 측정 및 분석 하는 동안 필요: 첫째, 다양 한 단계와 입자와 DNA 또한 스펙트럼 속성 화학 호환성 등을 바인딩 솔루션의 선택. 바인딩 솔루션 및 입자 물질의 굴절율의 선택 이전 연구에 기반 하거나 refractometry에 의해 평가 될 수 있습니다. 둘째, 입자와는 큐 벳에 전극 간의 상호 작용 한다 모니터링 신중 하 게 산화/감소 프로세스 측정에 영향을 미칠 수 있습니다. 셋째, 그림 3에서 보듯이 바인딩의 속도 시간의 기능 될 수 있습니다. 상호 작용의 안정성을 관찰 하는 것이 중요 하 고이 같은 연구에 DL의 응용 프로그램에 대 한 주요 장점입니다. 여기, 관찰자는 입자 집계 및 physiochemical 변화 실시간 모니터링입니다. 넷째, 증가할수록 시스템의 분석의 범위에 제한 사항을 설정할 수 있습니다. 증가할수록 인덱스 값 0.05 값 0.7 이상 입자의 다양 한 크기의 polydispersed 시스템을 설명 하는 동안 monodispersed 시스템을 설명 합니다. 입자의 크기와 종 DL, 다시 흩어져, 등의 다양 한 종류를 사용 하 여 공부 될 수 있다 다양 한 입자의 분포 측면에 흩어져 고 앞으로 흩어져, 프로토콜 섹션 3.1에서에서 언급 한 대로. 마지막으로, 테스트 이전 입자의 쥡니다 분명히 그들의 물리적 특성 (예: 크기와 표면적)에 영향을 미칠 수와 지나치게 할 자료의 어떤 화학 수정 발생할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 DL을 통해 습득 하는 정보 양이 많은 PCR로 알려진 또한 실시간 PCR에 의해 수집 된 데이터와 비교 됩니다. 후자는 검색 및 DNA의 정량에 대 한 황금 표준입니다. 15 PCR 기술 실험실, 병원 및 대학에서 널리 사용 됩니다. 그러나, DNA에 노출 소설 및 합성된 재료를 테스트할 때 고려 사항으로 PCR의 화학을 중요 하다. 효소 중 합 효소 연쇄 반응의 핵심 요소는 특정 화학 억제제 및 강화에 민감합니다. 추가 내부 제어, 합성 물질의 테스트 및 좋은 실험실 연습 PCR 결과에 편견 줄일 수 있습니다. 저 해제 및 강화에 대 한 행동의 메커니즘 다릅니다 화학 중 합 효소에 직접 바인딩되는 다른 사람에서 마그네슘2 +이온을 킬레이트-솔루션에 따라 중 합 효소. DNA 분리에 대 한 몇 가지 통찰력은 PCR 검사를 사용 하 여 얻을 어렵다. DL을 보여줄 수 있는 DNA 입자를 하지만 오히려 세탁 하거나 (DNA PCR에 의해 인식 되지)을 elute 하지 않습니다 경우. 예를 들어 MNPs_APTES 및 MMPs_APTES 중요 한 보여 제타 DNA 노출 (표 1)에 따라 잠재적인 감소 하지만 DNA 차입에 감지 이러한 결과와 연관 되지 않았다. 세척, 차입 솔루션 입자에서 DNA의 릴리스를 제어 하는 바인딩을 수정 가능 하다. DL는 DNA 입자 상호 작용의 평가 상대적으로 빠른 방법입니다. 안정성과 상호 작용의 속도 또한 관찰할 수 있습니다 (그림 3), 영향을 미칠 수 있는이 방법으로 시간에 자석 입자-사용 DNA 격리 프로토콜을 기반으로.
DL을 사용 하 여 분석에 대 한 과제는 곧장 앞으로. 이 기술은 PCR에 비해 비교적 큰 샘플 볼륨을 분석 (~ 1 mL)에 대 한 필요 합니다. 굴절율 같은 몇 가지 매개 변수 샘플에서 새로운 솔루션을 사용 하는 경우 주의 깊은 평가가 필요 합니다. 또한, 소설 소재를 테스트 하는 경우 큐 벳의 전극에서 산화/감소 반응 관찰을 매우 일반적입니다. 샘플의 화학 성분의 지식과 신중한 평가 다시 동일한 cuvette을 사용 하 여의 타당성을 평가 하는 것을 도울 수 있다. 그것은 DL 분석은 특이성 및 PCR, 제공한 감도 아직 DNA 입자 바인딩 프로세스에 대 한 통찰력의 다른 종류를 제공 하는 그것을 언급할 가치가 있다.
모든 분 광 기법 처럼 수정 및 dl 문제 해결 더 정확 하 고 민감한 측정의 개발을 위한 목표. 이 물리적 및 화학적 테스트는 물자의 본질의 더 나은 이해를 제공 하 여 얻을 수 있습니다. 즉, 광 속성 및 화학 성분의 세부 정보는 DL에서 정확 하 고 민감한 데이터를 얻기 위해 키. 광 속성 refractometry, 입자의 화학 성분 동안에 의해 취득 될 수 있다/입자의 표면 다른 분 광 방법, 전기 화학, XPS, FTIR 등 다양 한 기법에 의해 공부 될 수 있다. 이 프로토콜에서 바인딩 솔루션 다양 한 이온 힘, 다른 탈수 에이전트 (예: 소 프로 파 놀), 다양 한 pH 및 낮은 온도 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 다른 한편으로, 입자 표면의 화학 수정 화학자 상상력에 남아 있다.
DNA의 절연 재료의 개발 특이성, 순수성 및 탐지의 한계에 더 많은 초점을 다음 십 년간에서 상승 계속 됩니다. 단일 셀 규모의 연구에 중요 한 역할을 담당 하는 추출 방법의 품질 metagenomic 비늘 고 특이 한 유래의 샘플입니다. 현 시점에서 그것은 DL 나노 입자 및 미 수정 재료의 다양 한 종류의 분석을 수행 하는 것이 중요입니다. 이 단계는 DNA 입자 상호 작용의 동작을 설명 하는 강력한 이론적 모델을 수립 하기 전에 필요 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
체코 과학 재단 (프로젝트가 CR 17-12816S) 및 CEITEC 2020 (LQ1601)에 의해 금융 지원은 크게 인정 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
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