Summary
Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour créer un modèle par éléments finis spatialement détaillée de l’architecture intracellulaire des cardiomyocytes de microscopie électronique et d’images de microscopie confocale. La puissance de ce modèle dans l’espace détaillé est démontrée à l’aide d’études de cas en signalisation calcique et la bioénergétique.
Abstract
Avec l’avènement des trois dimensions (3D) technologies d’imagerie telles que la tomographie électronique, serial-îlot balayage, microscopie confocale, microscopie électronique et la communauté scientifique a accès sans précédent aux grands ensembles de données au micromètre sous résolution qui caractérisent le remodelage architectural qui accompagne les changements dans la fonction cardiomyocyte sain ou malade. Cependant, ces ensembles de données ont été sous-utilisées pour enquêter sur le rôle de l’architecture cellulaire se transformant en fonction du cardiomyocyte. Ce protocole vise à décrire comment créer un modèle par éléments finis précis d’un cardiomyocyte à l’aide de la microscopie électronique à haute résolution et des images de microscopie confocale. Un modèle détaillé et précis de l’architecture cellulaire a un potentiel important d’offrir de nouvelles perspectives sur la biologie du cardiomyocyte, plus que peuvent recueillir des expériences seuls. La puissance de cette méthode réside dans sa capacité à fusionner des informations provenant des deux modalités d’imagerie disparates de l’ultrastructure du cardiomyocyte pour développer un modèle unifié et détaillé de la cardiomyocyte. Ce protocole décrit les étapes pour intégrer la tomographie électronique et des images de microscopie confocale de cardiomyocytes mâles adultes de rat Wistar (nom d’une race spécifique de rat albinos) d’élaborer un modèle de moitié-sarcomère par éléments finis de la cardiomyocyte. La procédure génère un modèle éléments finis 3D qui contient une description précise, haute résolution (sur l’ordre de ~ 35 nm) de la distribution des mitochondries, des myofibrilles et des grappes de récepteurs de la ryanodine qui libèrent du calcium nécessaire pour cardiomyocyte contraction du réseau réticulaire sarcoplasmique (SR) dans le myofibrillaire et le compartiment cytosolique. Le modèle généré ici comme une illustration n’intègre pas les détails de l’architecture de tubules transverses ou le réseau réticulaire sarcoplasmique et est donc un modèle minimal de la cardiomyocyte. Néanmoins, le modèle peut déjà s’appliquer dans les enquêtes basées sur des simulations dans le rôle de structure cellulaire en bioénergétique de signalisation et mitochondrial calcium, qui est illustrée et discutées à l’aide de deux études de cas qui se présentent après la Protocole détaillé.
Introduction
Couplage excitation-contraction (ECC) dans le coeur se réfère à l’important et complexe de couplage entre l’excitation électrique de la membrane du cardiomyocyte et la contraction mécanique ultérieure de la cellule au cours de chaque battement cardiaque. Des modèles mathématiques ont joué un rôle clé dans le développement d’une compréhension quantitative des processus biochimiques liées entre elles qui régulent le potentiel d’action1, calcium cytosolique,2,3de bioénergétique, de signalisation et suivantes génération de la force contractile. Ces modèles ont prédit avec succès les changements de la fréquence cardiaque quand on ou plusieurs de ces processus biochimiques subissent des altérations4,5. L’ultrastructure très organisés de la cardiomyocyte reconnue plus en plus à jouer un rôle essentiel dans la fonction contractile normale de la cellule et le coeur entier. En effet, les modifications de la morphologie et l’Organisation des composantes de l’ultrastructure cardiaque surviennent parallèlement aux changements biochimiques de pathologies telles que l’hypertrophie6, insuffisance cardiaque7et8de la cardiomyopathie diabétique. Si ces changements structurels sont mineures, adaptatives ou pathologiques des réponses à l’évolution des conditions biochimiques est encore largement inconnue9. L’accouplement intrinsèquement étroit entre forme et fonction en biologie signifie que des études expérimentales ne peuvent fournir des idées plus profondes que les corrélations entre remodelage structural et fonction cardiomyocyte. Une nouvelle génération de modèles mathématiques qui peuvent incorporer l’ensemble structurel des composants subcellulaires, ainsi que les processus biochimiques bien étudiés, sont nécessaires pour développer une compréhension globale et quantitative de la relation entre la structure, la biochimie et la force contractile dans les cardiomyocytes. Ce protocole décrit les méthodes qui peuvent être utilisées pour produire des modèles d’éléments finis structurellement précis des cardiomyocytes qui peut être utilisés pour de telles enquêtes.
La dernière décennie a connu des avancées significatives en microscopie 3D10, confocale11et Super-résolution microscopie12 qui donnent un aperçu sans précédent, à haute résolution de l’Assemblée-l’échelle du nanomètre et micro-échelle de la composants subcellulaires du cardiomyocyte. Récemment, ces ensembles de données ont été utilisés pour générer des modèles de calcul du cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. Ces modèles utilisent une méthode de simulation technique bien établie, appelée la méthode des éléments finis17, pour créer des éléments finis computational mailles sur lequel les processus biochimiques et les cardiomyocytes des contractions peuvent être simulées. Cependant, ces modèles sont limités par la résolution et les détails qu’une méthode de microscopie peut fournir dans un ensemble de données image. Par exemple, la microscopie électronique peut générer nanomètre-niveau de détail de la structure cellulaire, mais il est difficile d’identifier des protéines spécifiques au sein de l’image qui serait nécessaire pour créer un modèle. En revanche, la microscopie optique Super-résolution peut fournir des images à fort contraste avec des résolutions sur l’ordre de 50 nm de seulement un choisir quelques moléculaire les composants de la cellule. Seulement en intégrant des informations complémentaires de ces modalités d’imagerie peut on Explorer avec réalisme la sensibilité de la fonction de changements dans la structure. Microscopie corrélative photonique et électronique n’est toujours pas une procédure de routine et il souffrirait toujours la limitation que seulement un nombre limité de composants puisse être teinté dans la vue de l’immunofluorescence et en corrélation avec la vue au microscope électronique.
Ce protocole présente une nouvelle approche de18 qui utilise des méthodes statistiques19 pour analyser et par le calcul fusible microscopie photonique informations sur la distribution spatiale des canaux ioniques avec des microscopes sur autre cardiaque composants de l’ultrastructure, tels que les mitochondries et les myofibrilles. Ceci produit un modèle éléments finis qui peut être utilisé avec les modèles biophysiques des processus biochimiques d’étudier le rôle d’organisation subcellulaire cardiomyocyte sur les processus biochimiques qui régulent la contraction cardiomyocyte. Par exemple, ce protocole pourrait être utilisé pour créer des modèles de bonne santé et les myocytes cardiaques diabétique par streptozotocine pour étudier les effets du remodelage structural sur la fonction des cellules cardiaques qui est observée chez l’animal diabétique modèles8. Un autre avantage de la nature statistique de la méthode présentée est également illustré dans le protocole : la méthode peut générer plusieurs instances des géométries d’éléments finis qui imitent les variations observées expérimentalement dans la structure cellulaire.
Comme un aperçu, les étapes du protocole comprennent : (i) préparation du tissu cardiaque pour la microscopie électronique générer des images 3D avec suffisamment de résolution et de contraste ; (ii) la reconstruction et la segmentation des piles 3D image de microscopie électronique de données à l’aide d’une reconstruction 3D de la microscopie et analyse d’images logiciel appelé IMOD20; (iii) l’utilisation d’iso2mesh21 pour générer un maillage éléments finis en utilisant les données segmentées comme entrée ; (iv) en utilisant les codes et un nouvel algorithme pour cartographier la distribution des canaux ioniques sur le maillage éléments finis.
Le principe de l’approche de chaque étape est décrite dans le protocole, et les résultats représentatifs sont fournis dans les figures qui l’accompagne. Une vue d’ensemble est exposé précisant comment les modèles spatialement détaillés générés peuvent servir à étudier les dynamiques spatiales de calcium durant ECC, ainsi que bioénergétique mitochondriale. Certaines des limites actuelles du protocole sont discutés, ainsi que les nouveautés qui sont en cours pour y remédier et de favoriser une compréhension quantitative du rôle de la structure cellulaire de biologie des systèmes cardiaque. Comment ces méthodes puissent être généralisés pour créer des modèles d’éléments finis d’autres types de cellules sont également abordé.
Les utilisateurs du présent protocole peuvent ignorer étape 1 et la partie de la reconstruction de l’étape 2 s’ils ont accès à une pile d’image au microscope électronique préexistants. Les utilisateurs qui ont l’intention d’acquérir leurs données en collaboration avec les plus expérimentés électrons microscopistes voudra discuter et comparer la fixation et les méthodes de coloration à l’étape 1 avec l’expert afin de déterminer un protocole optimal pour l’acquisition.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université d’Auckland Animal Ethics Committee et la University of California San Diego Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme, où le protocole de tissus a été développé à l’origine.
1. préparation expérimentale
- Préparer les solutions de 0,15 M et 0,3 M sodium cacodylate tampons à pH 7,4 selon le tableau 1.
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Préparer le fixateur de glutaraldéhyde (glutaraldéhyde à 2,5 %, 2 % de paraformaldéhyde (PFA) + 0,2 % l’acide tannique dans le tampon de cacodylate de sodium de 0,15 M à pH 7,4) à l’aide de composants énumérés au tableau 1.
- Dissoudre 2 g de poudre PFA dans 20 mL d’eau distillée à 60 ° C sur une plaque de cuisson en remuant constamment.
- Ajouter la solution de NaOH 1 M jusqu'à ce que la solution est claire.
- Attendez que la température de la solution est inférieure à 40 ° C, puis ajouter 10 mL de glutaraldéhyde et 20 mL de cacodylate de sodium 0,3 M.
- Ajouter 0,2 g d’acide tannique et dissoudre dans la solution.
- Ajouter 50 mL de cacodylate de sodium 0.15 M.
- Stocker les trois ou quatre flacons de scintillation de 20 mL de fixateur au réfrigérateur à 4 ° C, ou sur la glace si utilisé le jour même.
- Préparer une solution de Tyrode avec 20 mM 2, 3-butanedione monoxime (BDM), selon la recette dans le tableau 1.
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Construire un appareil de Langendorff à l’intérieur d’une hotte.
- Fixez deux tubes de seringue en plastique de 100 mL à deux cornue différents stands, environ 70 cm de hauteur de la base de support.
- Connecter les tubes de la seringue en plastique et un tube de raccord à l’aide de 3 mm-diamètre intérieur tuyau et un robinet à trois voies tel qu’illustré à la Figure 1.
- Insérer une canule 3 mm de diamètre extérieur vers le bas du connecteur du tuyau, où le cœur sera lié pour la fixation de la perfusion.
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Remplir les tubes de seringue avec solution Tyrode et fixateur à 37 ° C.
- Enlever les bulles d’air dans le tuyau en passant les solutions de la seringue à travers eux.
2. acquérir des données de microscopie électronique de l’Ultrastructure du Cardiomyocyte
- Préparer l’animal à l’excision et la fixation chimique du cœur.
Remarque : Ce protocole détaille les étapes pour traiter les adultes mâles Wistar (nom d’une race spécifique de rat albinos) rat tissu cardiaque. Le protocole peut-être nécessiter des modifications lorsque le tissu cardiaque est provenant d’autres espèces.- Anesthésier l’animal en traitant le rat (200-250 g de poids corporel), 0,5 ml d’héparine 250 de U/mL par injection intrapéritonéale. Attendez pendant 10 min, puis traiter le rat avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (210 mg/kg de poids corporel).
- Confirmer un degré approprié de l’anesthésie en testant le réflexe de pincée d’orteil.
- Euthanasier l’animal par dislocation cervicale.
- Récolte le coeur utilisant dissection des procédures similaires d’articles déjà publiés de JoVE22,23, puis placer dans une solution saline glacée.
- Isoler l’aorte ascendante et de canuler. Veiller à ce que l’extrémité de la canule se trouve juste au-dessus de la valve semi-lunaire, où les artères coronaires se bifurquent. Nouer un fil serré autour de l’aorte ascendante.
- Raccorder la canule à l’appareil de Langendorff gravitaire fonctionné à environ 70 cm au-dessus de la base du système (Figure 1).
- Tournez le robinet d’arrêt sur le système de Langendorff pour perfuse le cœur avec une solution de Tyrode, y compris 20 mM BDM (un inhibiteur de la myosine) pendant 2-3 min.
- Tourner le robinet pour commencer la perfusion avec fixateur de paraformaldéhyde à 2 %, glutaraldéhyde à 2,5 % et 0,2 % l’acide tannique dans cacodylate de sodium 0.15 M à 37 ° C pendant 10 min. En cas de succès, le cœur sera tourner brun pâle et devenir raide et caoutchouteux.
- À l’aide d’une lame de rasoir, disséquer des blocs de tissus de la paroi ventriculaire gauche de libre (latérale) et obtenir des tissus bloque environ 1 mm3 en taille.
- Conserver les échantillons en flacons scintillation refroidis préalablement 20 mL de la même fixateur sur la glace pendant 2 h. conserver les échantillons autant que possible dans les flacons et faire en sorte que les échantillons soient immergés dans la solution.
ATTENTION : Il est important de conserver les échantillons froid qu’après l’étape de déshydratation 100 % ci-dessous.
- Autre fixation et coloration des échantillons pour la microscopie électronique.
- Verser 100 mL de tampon de cacodylate de sodium de 0,15 M dans une carafe en verre et refroidir sur glace.
- Préparer des volumes égaux de 4 % le tétroxyde d’osmium et 0,3 M cacodylate de sodium, suivi par l’addition de 0,08 g de ferrocyanure de potassium pour faire une solution de tache de métaux lourds contenant de ferrocyanure de potassium 2 % à 2 % le tétroxyde d’osmium et 0,15 M cacodylate de sodium. Refroidir la solution sur la glace.
- Pipeter le fixateur dehors et remplacez-le par assez tampon de cacodylate de sodium 0.15 M froid de submerger les échantillons dans les flacons. Placer les flacons sur la glace pendant 5 min.
- Répétez l’étape 2.2.3 quatre fois plus avec 0,15 M cacodylate de sodium pour éliminer les excès fixateur.
ATTENTION : Ne pas utiliser des pipettes en verre car minuscules éclats peuvent pénétrer dans l’échantillon et peuvent ruiner les couteaux diamant pendant la découpe de bloc de tissu. Il est important de refroidir préalablement toutes les solutions sur la glace avant de les ajouter à l’échantillon. Il est également important que l’échantillon reste couverte par la solution de tous les temps (très brèves périodes de couverture partielle, pas plus de quelques secondes peuvent être brièvement tolérées lors d’échanges de solution). Lorsque le lavage ou le remplacement de solutions, ajoutez la nouvelle solution rapidement après avoir enlevé la solution précédente. Garder les flacons scintillation sur glace entre les lavages. Notez que cette étape n’est pas temps sensible, les blocs de tissu peuvent être lavées en un peu Pluss, si nécessaire. - Remplacez tampon de cacodylate de sodium solution tache glacee heavy metal et stocker sur glace du jour au lendemain. S’assurer que le ferrocyanure est bien mélangé en agitant le flacon à la main ; la solution devrait noircissent.
ATTENTION : Les travaux dans la hotte lorsque vous effectuez cette étape car l’osmium est toxique. - Diluer la solution stock acétate (UA) uranyle aqueux à 4 % (tableau 1) à 2 % en utilisant des volumes égaux de stock solution UA et de l’eau bidistillée et refroidir sur glace.
- Remplacer le métal lourd tache avec glace refroidi par le tampon de cacodylate de sodium 0.15 M et laisser l’échantillon à incuber pendant 5 min sur la glace.
- Répétez l’étape 2.2.7 encore quatre fois sur la glace à rincer toute solution de tache d’excès de métaux lourds.
- Rincer les échantillons quatre fois, avec une période d’attente de 2 min entre les deux dans l’eau purifiée (bidistillée suffit).
- Remplacer l’eau purifiée avec glacee 2 % d’UC et de laisser l’échantillon incuber pendant 60 à 120 minutes sur la glace.
- Refroidir 5 flacons scintillation de 20 mL d’éthanol (assez pour submerger les échantillons) sur la glace qui sera utilisé lors de l’étape de déshydratation. Les six flacons ont des pourcentages croissants d’éthanol dans l’eau distillée : 20 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 %.
- Versez l’acétone pure dans un autre flacon de 20 mL à scintillation et laisser refroidir sur glace ainsi que les flacons d’éthanol.
- Rincer les échantillons dans de l’eau purifiée quatre fois avec les périodes d’attente de 2 min sur glace à laver UA excès.
- Déshydrater les échantillons dans de l’éthanol.
- Déshydrater en série de l’éthanol froid en remplaçant successivement les solution dans le flacon d’échantillon comme suit, sur la glace : 20 % d’éthanol pendant 10 min ; éthanol à 50 % pendant 10 min ; éthanol à 70 % pendant 10 min ; éthanol à 90 % pendant 10 min ; puis deux fois en éthanol 100 % pendant 10 min.
- Échantillon à la température ambiante de transition en remplaçant la finale 100 % d’éthanol avec de l’acétone pur refroidi et placez le flacon d’échantillon sur un banc de laboratoire à température ambiante pendant 10 min.
- Effectuer un lavage plus de 10 min dans l’acétone pure à la température de la pièce pour éliminer la condensation qui est observable dans les flacons. Pendant l’incubation, composent les solutions acétone/résine.
- Remplacez l’acétone pure dans les flacons avec 50/50 pur l’acétone et résine époxy (avec les proportions des composants en résine époxy comme indiqué par le fabricant). Utiliser tous les composants provenant du même lot. Laisser les flacons à échantillon rempli de résine pendant la nuit sur un rotor.
- Incorporer des échantillons en résine.
- Remplacer la résine de 50/50 avec de la résine de 75 % (25 % d’acétone) et incuber pendant 3 h, suivie d’autres incubation/infiltration en résine 100 % pendant 4 heures à température ambiante.
- Remplacez la résine 100 % avec une résine 100 % frais et laisser les flacons d’échantillon du jour au lendemain pour une pénétration plus profonde de la résine dans les échantillons de tissus.
- Prélever des échantillons sur les flacons et les placer dans des contenants qui soient favorables à four et ont un fond plat ; aluminium ou Lampwork tasses de cuisson peut être utilisé à cette fin, par exemple.
- Verser doucement (pour éviter le déplacement des échantillons) frais de résine sur les échantillons (donc l’enrobage d’échantillons en résine) et polymériser la résine et les échantillons dans une étuve à 60 ° C pendant 48 h.
- Réorienter les blocs de résine aux cellules des images en coupe transversale.
- Obtenir 1 µm test épais sections partir des blocs de résine avec un ultramicrotome avec un couteau de verre pour évaluer cellule orientation24.
- Tacher les sections épaisses test pendant 20 s avec 1 % de toluène bleu et 1 % de borax.
- Examiner l’orientation cellule musculaire sous un microscope à champ lumineux.
- Basé sur l’orientation déduite à partir des images des sections colorées test, réorienter longitudinalement ou obliquement orienté (semblable à la Figure 2 a) blocs pour s’assurer que les cellules sont exposées à la lame de verre pour qu’ils seront découpés en coupe transversale (en résine semblable à la Figure 2 b).
- Sections de tissu image en utilisant la tomographie électronique.
- Obtenir des sections minces semi (~ 300 nm) du tissu réorienté blocs à l’aide d’un diamant couteau et transférer les sections sur les grilles cuivre25.
- Tacher les coupes épaisses avec 2 % d’UC et Sato plomb25.
- Appliquer des particules colloïdales d’or sur les deux côtés des sections25.
- Obtenir des ensembles de single ou double-axe d’inclinaison série des images projetées de-70 ° à + 70 °25.
- IMOD20 permet de reconstituer la pile d’image 3D (une série d’images 2D qui fournissent les informations 3D d’une section de tomographie d’un seul électron) de la cellule. Cette pile reconstruite va être segmentée dans l’étape suivante.
3. le segment myofibrilles et régions des mitochondries dans le Dataset d’Image 3D EM
- Exécutez le programme IMOD « 3dmod ».
- Au sein de l’interface utilisateur graphique de 3dmod, entrez l’adresse de la « .rec » ou « .mrc » fichier qui contient la 3D reconstruit image dataset de la cellule (générée à l’étape 2.7) dans la case d’entrée « ou les fichiers d’Image : », puis appuyez sur « OK ».
- Sous le menu « Fichier », sélectionnez le nouveau modèle, puis enregistrez le fichier avec un nom approprié à l’aide du modèle en tant que « enregistrer »... le menu sous « Fichier ».
Remarque : Un objet dans l’IMOD peut contenir une collection d’éléments segmentés qui composent le « objet ». Par défaut, un nouveau modèle contient un objet avec l’id « #1 ». - Sous le menu « Spécial », sélectionnez « Outils de dessin ». Ceci ouvrira une nouvelle barre d’outils similaire à celle illustrée à la Figure 3 a.
Remarque : Il existe plusieurs outils qui peuvent servir à créer des contours autour des limites des différents organites. Plus d’aide sur les moyens d’utiliser ces outils se trouvent dans la documentation de20 IMOD. - Choisissez l’option « Sculpter » dans le menu « Outils de dessin » et déplacez la souris sur la fenêtre d’image ; un contour circulaire centré sur le pointeur de la souris s’affiche.
- Maintenez le bouton central de la souris sur une mitochondrie (régions plus foncées des fichiers image, comme en témoigne les démarcations avec des lignes de contour verts dans la Figure 3 a), faites glisser le périmètre du contour cercle dans la forme de sa frontière.
- Une fois que le contournement de la limite de la mitochondrie est terminée, relâcher le bouton du milieu et répétez les étapes 3.6 pour chaque mitochondrie dans les données. Chaque contour sera automatiquement reconnu par IMOD comme un nouveau contour dans le même objet.
- Sous le « Edit | Objet « menu, sélectionnez « Nouveau » pour créer un nouvel objet. Ceci automatiquement incrémenter le nombre total d’objets par l’un et attribue ce numéro vers le nouvel objet.
- Répétez les étapes 3.6 et 3.7 de segmenter et de sauver des contours myofibrillaire.
- Répétez l’étape 3.8, suivi par étape 3.6, permet de segmenter la limite de la cellule aussi bien.
- Enregistrez le fichier de modèle dans le menu « Fichier ».
- Exécutez les commandes suivantes dans une fenêtre de ligne de commande pour convertir chaque objet groupant dans un masque binaire, comme illustré dans la Figure 4A-C.
- Extrait un objet spécifique à partir du modèle « imodextract objet modelfile outputmodelfile » où « l’objet » est le numéro de l’objet à extraire.
- Créer un masque pour cet objet : imodmop-masque 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
- Convertissez le fichier en une pile de tif : mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. créer un maillage éléments finis des composants segmentés
- Iso2mesh est un programme MATLAB librement disponible pour convertir les piles d’image TIFF en maillages éléments finis tétraédrique volumétrique. Télécharger et ajouter iso2mesh au chemin de MATLAB de iso2mesh.sourceforge.net.
- Télécharger les codes sources et données pour simuler des grappes de RyR sur le maillage de la github site Web https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
- Lancez l’application CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figure 5).
- Charger les masques de composant différents organites dans MATLAB en utilisant les trois boutons sur le côté supérieur gauche de l’interface graphique.
- Créer une autre pile d’image binaire qui délimite les écarts entre les myofibrilles et mitochondries comme illustré à la Figure 6 a.
- Ouvrez ImageJ.
- En utilisant le fichier | Ouvrez la boîte de dialogue, charger les piles de tiff de myofibrilles et mitochondries dans le programme.
- Lancer le plugin d’ajout image en sélectionnant « processus | Calculatrice Plus ».
- Sélectionnez la pile d’image myofibrillaire i1, les mitochondries pile comme i2 l’image, puis choisissent l’opérateur « Ajouter ». Cliquez sur « OK ».
- Après une nouvelle pile d’image qui représente le résultat de 4.5.4 apparaît, sélectionnez « Edit | Inverser » pour produire une pile d’image similaire à la Figure 6 a.
- Chargez le fichier contenant la pile d’image binaire des écarts entre les myofibrilles et les mitochondries en appuyant sur le bouton « RyRGapsFile » sur le programme CardiacCellMeshGenerator.
- Appuyez sur « Générer le maillage » sur le GUI. Cela va déclencher la v2m iso2mesh de commande avec l’option « cgalmesh » pour générer un maillage tétraédrique semblable à la Figure 4E. Trois fichiers sera émis à la fin de cette étape : un fichier .ele, un fichier .face et un fichier .node qui contiendra la liste des nœuds qui constituent les éléments, les nœuds qui composent les visages et les coordonnées des nœuds , respectivement.
5. mathématiquement, mappez la variation spatiale de la densité des canaux ioniques d’intérêt sur le maillage éléments finis.
-
Générer les intrants nécessaires pour le simulateur de RyR en appuyant sur le bouton intitulé entrées générer RyR-simulateur sur le GUI.
Remarque : Le bouton déclenchera une fonction generateRyRsimulatorInputs.m, qui utilise les informations suivantes à l’étape 4 pour générer les entrées :
(1) outDir : l’emplacement pour les fichiers de sortie qui sont nécessaires pour la simulation de cluster RyR.
(2) imres : la résolution en pixels dans les trois directions des piles d’image.
(3) myofibril_file : le fichier contenant la pile d’image binaire comme celle illustrée à la Figure 4 b.
(4) sarcolemma_file : le fichier contenant la pile d’image binaire comme celle illustrée à la Figure 4 a.
(5) ryrgaps_file : le fichier contenant la pile d’image binaire comme celle illustrée à la Figure 5 a.- Après l’exécution de cette fonction, vérifier que les fichiers suivants ont été créés dans le répertoire spécifié dans le chemin d’accès outDir :
- d_axial_micron.txt, qui représente la distance axiale entre le poste du z-disque et le reste des pixels dans la pile de l’image.
- d_radial_micron.txt, qui représente la distance euclidienne (à l’exception de la composante axiale) de chaque pixel dans l’ensemble des emplacements possibles de cluster RyR aux pixels sur le plan z-disque.
- W_micron.txt, qui représente la liste des coordonnées spatiales de tous les postes disponibles pour RyR clusters soient présents.
- Les 3 autres fichiers dans le dossier portent le suffixe « _pixel » plutôt que « _micron » pour indiquer que les valeurs dans ces fichiers ont été écrit sous forme de coordonnées pixel.
-
Simuler des distributions de cluster RyR dans la pile d’image binaire des myofibrilles.
- Appuyez sur le bouton portant la mention « Open RyR-simulateur en R » pour lancer le programme de R.
- Dans le R-gui, sélectionnez « fichier | Open » et recherchez le fichier « paramètres. R » dans le package de RyR-Simulator (RyR-simulateur/source/paramètres. R).
- Également ouvrir le fichier ryr-simulateur-parallèle. R (situé à Adieu bazou-simulateur/source/ryr-simulateur-parallèle. R). environnements comme Rstudio (https://www.rstudio.com) ou une simple interface de ligne de commande peut être utilisée, par exemple à l’aide de la commande R64 dans une fenêtre shell ou commande.
- Modifiez les paramètres dans les paramètres. R fichier comme indiqué ci-dessous :
- L’adresse du dossier qui contient les fichiers répertoriés dans 5.1.2 pour une pile d’image confocale acquises expérimentalement des grappes de RyR et myofibrilles la valeur Path2.
Remarque : La github référentiel dossier entrée-fichiers/maître-cellule / contient déjà des fichiers qui ont été générés pour une pile d’images recueillies précédemment. - La valeur Path4 une adresse de dossier où sont stockés les fichiers qui ont été générés à l’étape 5.1.2.
- Configuration Path3 point sur un dossier où l’utilisateur veut les emplacements de cluster RyR simulés pour être sauvé.
- Valeur N le nombre de clusters RyR simulé dans le modèle (typiquement de l’ordre de 200 à 300).
- La valeur etol, une tolérance fixant, pour la différence entre la distribution spatiale mesurée expérimentalement de RyR grappes et la distribution spatiale du modèle simulé des grappes de RyR.
- La valeur numIter pour limiter le nombre de tentatives que le simulateur de RyR devrait prendre pour trouver un modèle de cluster RyR simulé qui satisfait la valeur etol.
Remarque : Les valeurs pour etol et numIter ont été définies à des valeurs dans les paramètres. Fichier de R. - Définissez numPatterns sur le nombre de différents modèles de cluster RyR qui l’utilisateur souhaite simuler (en règle générale, il est utile que simulant 99 modèles de confiance statistique).
- La valeur numCores pour permettre l’utilisation de plusieurs threads d’UC (carottes) pour traitement avec R pour simuler les modèles de point de parallèle plus rapide.
- L’adresse du dossier qui contient les fichiers répertoriés dans 5.1.2 pour une pile d’image confocale acquises expérimentalement des grappes de RyR et myofibrilles la valeur Path2.
- Vérifiez que les paquets suivants sont installés à l’aide de l’installateur de package gui dans r : neige, doSNOW, doparallel, foreach, itérateurs et rgl.
- Exécuter le simulateur en entrant la commande suivante dans la fenêtre de commande R : source (' chemin de ryr-simulateur-parallèle. R', chdir = TRUE)
Remarque : La sortie du programme Adieu bazou-Simulator est une liste de fichiers .txt (un fichier numPatterns sera généré) qui contiennent des listes de coordonnées à N lignes et 3 colonnes, qui représentent les x et y coordonnées z n simulant RyR grappes.
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Carte points comme la densité spatiale sur un modèle de calcul à l’aide de la CardiacCellMeshGenerator.
- En cliquant sur le bouton portant la mention « Select RyR points fichier », choisissez un fichier de texte simulé pour RyR cluster distribution de ceux qui ont été sorties par le simulateur de RyR.
- Exécutez « RyR densité Mapper » sur l’interface graphique en MATLAB. Il mappe les emplacements spatiaux des clusters RyR simulées dans le fichier .txt à l’étape 5.3.1 sur le maillage éléments finis qui a été généré à l’étape de 4,8 à l’aide d’une méthode appelée un noyau sphérique intensité estimateur méthode26.
Remarque : La sortie de cette étape est un fichier portant l’extension .txt qui contient une liste de valeurs pour la densité numérique du canal ionique par unité de volume sphérique à chacun des nœuds du maillage de calcul.
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Representative Results
Figure 2 à la Figure 7 fournit des résultats représentatifs de plusieurs étapes clés dans le présent protocole : (i) visualisation et réorientation des blocs de tissus pour des vues transversales microscopie électronique ; (ii) générant une pile d’image de microscopie 3D ; (iii) segmentation subcellulaire ultrastructure des organites d’intérêt ; (iv) la génération d’un maillage éléments finis à l’aide d’iso2mesh ; (v) simulant une répartition réaliste de RyR grappes sur le maillage ; (vi) suivie de la cartographie de cette distribution spatiale comme une densité spatiale sur le maillage de calcul.
Figure 2 affiche des images de champ lumineux typique qui montrent l’aspect de cellules quand orientés longitudinalement (Figure 2 a, étiqueté L), oblique (Figure 2 a, étiquetés O) et rigole (Figure 2 b) pour ce qui est le plan de coupe. Obliques et orientées longitudinalement échantillons montrent des stries, alors que les échantillons orientés rigole ne présentent pas de stries. Les capillaires apparaissent également plus circulaires dans les vues en coupe que dans les vues obliques.
Figure 3 a montre une image représentative d’une pile de tomodensitométrie : de bonne qualité pouvant être acquis lorsque le protocole de préparation de tissus à l’étape 1 est suivi. Il faut lorsque vous effectuez une reconstruction 3D de la série d’inclinaison image microscope. Mauvais suivi des particules d’or colloïdal, ou manque de particules d’or suffisamment peut affecter la qualité — image contraste et l’image mise au point, de la tomodensitométrie : considérablement. Cela influe sur la capacité à segmenter les différentes structures significativement. Les soins et l’expérience sont nécessaires pour assurer que les blocs de tissu sont suffisamment colorés et qu’il y a une répartition égale des particules d’or colloïdal dans le volume de tissu. En cas de doute, il peut être utile de consulter un laboratoire spécialisé ou un établissement à l’institution locale. Si la génération de modèle est tentée en faible contraste ou reconstruit pas correctement les données, modèles peuvent toujours être générés, mais la correspondance des résultats avec les propriétés des systèmes biologiques à simuler des modèles peut être mauvaise. Figure 3 b montre une image représentative de ce à quoi ressemble un modèle segmenté de myofibrilles et les mitochondries.
4E de la figure montre un rendu 3D du maillage tétraédrique qui est produit par iso2mesh. Tant que les tâches de pile et de la segmentation image originales sont de bonne qualité, cette étape est assez robuste. Figure 6 b et 6 de la Figure montrent une distribution typique de cluster RyR (en rouge) au sein de la topologie cellulaire 3D. À ce stade, la maille elle-même n’est pas l’entrée dans le simulateur de RyR. Une pile d’image de la limite de la cellule et les écarts entre les mitochondries et les myofibrilles — générée à partir des images segmentées en Figure 4 — forment les principales entrées dans le simulateur de RyR. Il faut pour segmenter les limites des myofibrilles et mitochondries aussi exactement que possible ; segmentations inexactes seraient traduirait par une représentation inexacte de la topologie de la cellule dans les données, ce qui affecteront donc RyR placement dans le maillage. Ensuite, cela affecterait la dynamique spatio-temporelle du calcium la signalisation dans les cardiomyocytes (1 Application).
La figure 7 illustre la topologie en mailles 3 instances de clusters de RyR simulés sur le même après l’utilisation de l’algorithme d’estimateur noyau sphérique intensité. Remarquez la variation dans l’Organisation des clusters RyR. Ces variations ont été mesurées pour se situer dans la variabilité qui se trouvait dans les données expérimentales18. Il faut choisir le rayon de sphère de noyau et de la taille de palier sur lesquelles le noyau échantillonne la densité de cluster RyR. Ces deux facteurs affectent comment brusquement ou diffuse une représentation de la densité des grappes de RyR va être représentée sur le maillage. Une analyse de l’effet de différentes valeurs pour ces paramètres vous aidera à affiner sur les choix de paramètre pour un maillage raisonnable.
Le maillage résultant des clusters RyR, myofibrilles et mitochondries est un modèle minimal de la structure du cardiomyocyte. Ce maillage a été appliqué, ainsi que les variations de celui-ci qui proviennent d’autres données de la structure cellulaire, pour étudier la bioénergétique et dynamique du calcium. Un aperçu de ces deux applications est exposé ci-après pour illustrer la puissance de la modélisation par éléments finis de structure cellulaire en donnant des idées sur les relations structure-fonction.
Application 1 18 : Des dynamiques spatio-temporelles de calcium libèrent dans les cardiomyocytes. Ce modèle a été utilisé pour examiner le rôle de la distribution hétérogène de RyR clusters, myofibrilles et mitochondries sur signalisation calcique. La figure 8 montre la dynamique spatio-temporelle du calcium cytosolique durant la phase ascendante du transitoire lorsque simulé sur la topologie maillée générée par ce protocole. Figure 8 b montre l’hétérogène calcium libre et la concentration du fluorophore-lié-calcium au fil du temps. Les flèches pointent vers les petites taches de haute teneur en calcium en raison d’une densité plus élevée de RyR glomérules ou de mitochondries dans ces régions. Figure 8 montre des images simulées balayage linéaire qui peuvent être comparées aux images de balayage de ligne expérimentale de dynamique du calcium qui est généralement collectée par microscopie confocale direct. Le modèle de simulation fournit un supérieur résolution vue beaucoup de l’hétérogénéité spatiale de calcium qu’une image acquise expérimentalement. En outre, en raison du modèle étant dérivé de données structurales de la microscopie, le nombre de clusters qui doit rester inactive (~ 4-6) après que activation électrique pour les hétérogénéités de se produire dans l’image confocale balayage linéaire peut être déterminée avec précision. Hétérogénéités similaires sont observées dans les images acquises expérimentalement balayage linéaire de la dynamique du calcium dans des modèles animaux d’insuffisance cardiaque,18
Application 2 27 : Dynamique spatio-temporelle de la bioénergétique mitochondriale dans les cardiomyocytes. Un objectif global de ce travail est d’étudier la relation entre la dynamique du calcium, bioénergétique mitochondriale et la contraction musculaire. Dans un premier temps, les simulations de la phosphorylation oxydative mitochondriale isolément dans les myocytes cardiaques ont été réalisées. Par conséquent, la distribution des amas de RyR n’est pas nécessaire, et on peut simplement utiliser le maillage à l’étape 3.4. Comme une application plus complexe, la bioénergétique (application 2) pourrait être couplée à la dynamique du calcium (1 application) dans un modèle qui utilise tous les éléments pris en considération dans la maille et modélisme, c'est-à-dire de mitochondries, myofibrilles et ryanodine récepteurs.
Figure 9 représente les résultats de ces simulations spatiales métabolisme au cours de différentes régions d’un maillage généré à l’aide d’étape 3.4. Figure 9 a représente la concentration d’oxygène dans l’ensemble de la section de la cellule, tandis que la Figure 9 b montre la concentration en ADP seulement dans le compartiment myofibrillaire de la cellule. La figure 9 illustre la répartition du potentiel de membrane mitochondrial du réseau mitochondrial. Ces chiffres révèlent la distribution non uniforme des mitochondries et des myofibrilles dans la section de la cellule. Elles révèlent aussi le paysage métabolique hétérogène résultant de cette ultrastructure non uniforme. Cela démontre que la puissance des données de microscopie basée des simulations par éléments finis pour donner des idées sur les relations structure-fonction qui seraient autrement difficiles à obtenir par le biais des méthodes expérimentales.
Figure 1 : préparation de Langendorff du cœur pour fixation chimique. (A) Représentation schématique du dispositif de perfusion de Langendorff. Le robinet d’arrêt contient une vanne pour basculer entre Tyrode et solutions de fixateur. Le bol à la base sert à recueillir les solutions qui perfuse à travers le cœur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : examen d’orientation de la cellule en microscopie de champ lumineux. (A) champ lumineux vue de section de toluène bleu teinté épaisse de tissu cardiaque illustrant les cellules qui sont orientée longitudinalement (L) et (O) orientée obliquement par rapport au plan d’imagerie ; Notez les stries dans la cellule orientée longitudinalement, par exemple. (B) champ lumineux d’une section de tissu qui comporte la coupe transversale, de la cellule alignée sur le plan d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Segmentation des données microscopie. (A) instantané de segmentation manuelle des mitochondries à l’aide de l’outil sculpter. (B) une vue 3D de la complète segmentée manuellement les mitochondries, les myofibrilles (dans une variété de couleurs) et sarcolemme (en rose). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : conversion de piles d’image binaire en maillage tétraédrique 3D. (A-C) Masque binaire du sarcolemme, les myofibrilles et les mitochondries, respectivement. (D) : fusion Découvre des masques binaires des myofibrilles (en rouge) et des mitochondries (en vert). (E) représentant maillage tétraédrique qui provenait de la pile d’image en (D) à l’aide d’iso2mesh. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : CardiacCellMeshGenerator. Une capture d’écran de l’interface utilisateur graphique qui accompagne cette publication de protocole pour les utilisateurs d’exécuter les étapes 4 et 5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : simulation d’une distribution de cluster RyR réaliste sur une pile d’image segmenté de microscopie électronique de l’ultrastructure cardiaque. (A) A pile image binaire représentant les écarts entre les myofibrilles et les mitochondries, qui représentent l’ensemble de tous les pixels, où on trouvait des grappes de RyR. (B) un 3D rendu (ne pas dessiné à l’échelle de l’image) d’un du RyR simulé cluster distributions (représentées par les sphères rouges) au sein de la géométrie 3D représenté dans la pile d’image 3D ; les surfaces vertes représentent les mitochondries dans la pile de l’image. (C), A-grossissement supérieur (donc une petite partie est découpée dans la section de la cellule aux frontières) vue de la superposition de la RyR grappes à l’étape 4 et le maillage de calcul de l’étape 3 sur une tranche de la pile d’image de tomographie électronique 3D. (B) et (C) ont été modifiés de Rajagopal et al. 18 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : distribution spatiale de la densité numérique de RyR grappes de trois simulés modèles de cluster RyR. Tous les nœuds du maillage sont codées par du blanc pour la densité numérique 0.0 RyR grappes/µm3 au rouge pour une densité numérique maximale de 0.99 RyR grappes/µm3couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : L’hétérogénéité spatiale [Ca2 +]i durant la phase ascendante de la Ca2 + transitoire. (A) la moyenne cytosolique diffusant librement [Ca2 +]i (à gauche) et Fluo-4 lié Ca2 +, [F4Ca]j’ai (à droite). (B) et (C) show Time-lapse instantanés de diffuser librement Ca2 + et F4Ca au z-disque, plan transversal ; flèches noires marquent les régions de haute [Ca2 +]j’ai due à clustering mitochondrial ; flèches rouges marquent les régions de haute [Ca2 +]i en raison de plusieurs pôles de RyR à proximité. (C) les scans de ligne simulée de [Ca2 +]i (celle du milieu) [F4Ca]j’ai (à droite). La position de ligne est indiquée sur la section transversale de cellule sur la gauche. La dimension horizontale de la section transversale de cellule a été fournie comme indicateur de l’échelle spatiale dans les sections de l’image. Ce chiffre a été modifié par Rajagopal et al. 18 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : distribution spatiale des métabolites et de potentiel de membrane mitochondrial générée à partir de la simulation spatiale du métabolisme énergétique cardiaque. (A) la concentration d’oxygène dans l’ensemble de la section transversale de cellule dans les unités de µM, (B) Concentration d’ADP que dans la partie myofibril de la cellule en unités de µM. (C) Distribution du potentiel dans les mitochondries de membrane mitochondrial réseau d’unités de mV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : visualisation d’un modèle de point de cluster RyR simulé sur le paquet de statistiques R. Cette fenêtre apparaît à l’issue des simulations grappes RyR, illustrant le premier des modèles simulés point. Ceci peut être utilisé comme un indicateur que le simulateur de RyR a conclu ainsi et peut interroger la qualité des modèles de simulations. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Produits chimiques | Quantités |
| 0,2 HCl N | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Eau distillée | 20 mL |
| Stock de cacodylate de Sodium 0.15 M | |
| Cacodylate de sodium | 32,1 g [3H2O] |
| 0,2 HCl N | 25 mL |
| Composent de 1 L avec de l’eau distillée | |
| pH 7,4 | |
| 0,3 stock de cacodylate de Sodium M | |
| Cacodylate de sodium | 64,2 g [3H2O] |
| 0,2 HCl N | 25 mL |
| Composent de 1 L avec de l’eau distillée | |
| pH 7,4 | |
| Composition de la Solution de Tyrode | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glucose | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probénécide | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| Solution de NaCl/KCl/NaHCO3 L 1 | |
| NaCl (poids moléculaire 58.44 g/mol) | 81,2 g |
| KCl (poids moléculaire 74.55 g/mol) | 2,24 g |
| NaHCO3 (poids moléculaire 84.01 g/mol) | 14,28 g |
| Dissoudre dans l’eau 1 L eau distillée | |
| Solution de MgCl2/CaCl2 L 1 | |
| CaCl2 (2H2O) (poids moléculaire 147 g/mol) | 1,764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | 0,814 g |
| Dissoudre dans l’eau 1 L eau distillée | |
| Solution de 200 mL de glucose 1 M | |
| Dextrose (poids moléculaire 180.16 g/mol) | 36,03 g |
| Dissoudre dans 200 mL d’eau distillée double | |
| Tyrode Solution 500 mL de solution | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glucose | 6 mL |
| Eau bidistillée | 400 mL |
| Oxygène de bulle dans la solution pendant 5 min | |
| 2 % PFA + 2,5 % glutaraldéhyde + 0,2 % mostafa acide fixatif dans cacodylate de sodium 0.15 M | |
| Poudre de paraformaldéhyde (PFA) | 2 g |
| Acide mostafa | 0,2 g |
| Eau distillée | 20 mL |
| 25 % glutaraldéhyde | 10 mL |
| 0,3 cacodylate de sodium M | 20 mL |
| Cacodylate de sodium 0.15 M | 50 mL |
| NaOH N 1 | 4 g NaOH/100 mL d’eau distillée |
| 4 % Solution mère d’acétate d’uranyle | |
| Acétate d’uranyle | 4 g |
| Près de bouillante double d’eau distillée | 96 mL |
| Dissoudre l’UA dans l’eau près de bioling à l’aide d’un agitateur sous une hotte. | |
| UA filtrer sur un filtre Whatman #1 dans le flacon de 200 mL brun pour la protection contre la lumière | |
| Cap fermement et étiqueté, conserver à 4 ° C | |
Tableau 1 : Réactifs et les quantités pour la préparation du tissu pour la microscopie électronique.
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Discussion
Le protocole ci-dessus donne un aperçu des étapes clés pour générer un modèle géométrique de nouveaux éléments finis de l’ultrastructure du cardiomyocyte. La méthode permet aux modalités de calcul de fusion des différents microscopes (ni, en principe, autres données) à développer un modèle de calcul plus complète du cardiomyocyte dynamique qui inclut des détails de l’architecture cellulaire spatiale. Il n’y a actuellement aucun autre protocole disponible pour créer un tel modèle d’un cardiomyocyte.
Étape 1 décrit un protocole pour la fixation de la perfusion. Alternativement, le coeur pourrait être excisé, découpé en petits morceaux et immergé dans le fixateur. Toutefois, ce processus doit être fait rapidement et peut ont des résultats, selon la taille des échantillons variés. Dans l’expérience des auteurs, perfusion assure une infiltration approfondie du fixateur dans les tissus et les cellules. Les auteurs ont également déjà perfusé le cœur avec une solution de Krebs-Henseliet pour faire le coeur battre avant la fixation. Cela a permis des mesures sur le cœur de travail avant la fixation.
Les étapes de traitement de la microscopie électronique à l’étape 2 sont typiques pour la tomographie électronique. Les quantités de solution de traitement, en particulier des solutions de coloration et horaires peuvent varier lors de l’utilisation d’autres techniques d’imagerie comme série-îlot microscopie électronique à balayage ou concentré de microscopie de faisceau d’ions28. Les images de microscopie acquis doivent être divisés en régions différents organites comme les mitochondries, les myofibrilles et tubules transverses. Cela peut être effectuée manuellement ou de manière automatisée. Le contraste dans la pile d’image dépend en partie le succès du protocole de coloration, mais une partie de ce contraste est perdue lors de l’exécution de tomographie. Ce protocole décrit les étapes manuelles pour la segmentation des différentes structures, bien que les nouvelles méthodes pour effectuer une segmentation automatique29 sera plus favorables en général à améliorer le débit des données.
Les qualités les plus importantes à examiner dans le dataset de microscopie électronique sont la préservation de contraste et de la structure d’image. La recette de la coloration et la résine enrobage des mélanges dans le présent protocole ont été refondus pour un contraste élevé entre les myofibrilles, les mitochondries et les z-disques de la cellule cardiaque. Par exemple, les auteurs ont utilisé précédemment chlorure de calcium à la place de l’acide tannique à l’étape 1.2 pour délimiter le réseau réticulaire sarcoplasmique. Cela a permis d’identifier les limites extérieures des faisceaux myofibrillaire au cours de la segmentation de l’organite. Fois et autres composants chimiques coloration peuvent également être utilisés pour la visualisation des structures membranaires, tels que le réticulum sarcoplasmique ou les tubules transverses-axial30.
Les images doivent aussi être examinées pour dégradation structurelle. Traitement de fixation ou microscopie électronique de mauvaise qualité peut entraîner une perte grave de crêtes mitochondriales, la forte proportion des mitochondries délogées ou gonflées et la désintégration des portions de la membrane cellulaire (sarcolemme). Un examen attentif et plus étroit peut également indiquer la perte du t-tube et membranes de SR, mais sont moins évident à le œil non averti. Les solutions à ce problème comprennent : (i) assurer la perfusion approfondie ; (ii) le tissu de dissection en petits échantillons qui assurent également une pénétration profonde du fixateur et taches ; (iii) veiller à ce que le traitement de microscopie électronique se fait dans les solutions de froides ou sur glace dans la mesure spécifiée ; et (iv) veiller à ce que les programmation des horaires pour la coloration et la déshydratation (déshydratation en particulier) sont strictement suivies.
Un cardiomyocyte typique est environ 20 µm de diamètre de coupe transversale et ~ 100 µm de longueur. Ce qui rend les cellules de coeur entier d’imagerie un défi important. En outre, l’orientation changeante des fibres musculaires au sein du cœur31 plus complique l’acquisition d’un volume de l’image dont les axes sont alignés avec les axes transverses et longitudinaux d’une cellule d’intérêt. Programmes d’analyse image comme IMOD activez réalignement synthétique des données dans une orientation désirée. Avances récentes en îlot série balayage microscopie électronique28 et image associée traitement algorithmes29 également aident à résoudre ces problèmes. Néanmoins, l’examen attentif des coupes épaisses sous un microscope optique et réorientation ultérieure du bloc (étape 2.5) augmenteront la probabilité de l’imagerie de cellules avec alignement raisonnable des axes longitudinales et transversales avec l’imagerie axes. Cela fera en sorte que la plupart du volume cellulaire est saisie dans le champ de vision.
Étapes du protocole 3, 4 et 5 nécessitent un logiciel énuméré dans la Table des matières doit être installé. IMOD, le paquet R-statistiques, iso2mesh et Fidji (une version de ImageJ pour les données de la microscopie) ont une abondante documentation et tutoriels sur la façon de les utiliser. CardiacCellMeshGenerator est une application MATLAB a été conçue pour rendre plus facile pour l’utilisateur de construire le modèle dans un workflow simple. Utilisateurs peuvent télécharger le code source complet et le package d’application depuis le lien de dépôt github RyR-simulator (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). L’application, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, peut être installée en MATLAB comme une application. Les entrées pour le maillage généré par le présent Protocole se trouvent à l’intérieur de RyR-simulateur/entrée-fichiers /-tomo-cellule cible /, tandis que les entrées supplémentaires pour le simulateur de RyR-cluster se trouvent à l’intérieur de RyR-simulateur/entrée-fichiers/maître-cellule /. Avant de lancer l’app, les utilisateurs doivent s’assurer que le dossier d’installation iso2mesh et ses sous-dossiers ont été ajoutés au chemin de MATLAB. De même, s’assurer que le R-paquets nécessaire (Table des matières) pour le simulateur de cluster a également installé au sein de la R.
Une barre de progression a été incluse dans l’application lors de la génération du maillage, lors de la génération des entrées pour le simulateur de cluster RyR et lors du mappage des densités de cluster RyR sur le maillage à l’aide du mappeur de densité RyR ; l’app rendra le maillage 3D dans l’interface utilisateur lors de l’étape de génération de maillage a conclu. Après avoir effectué les simulations de cluster RyR sur l’interface utilisateur, une fenêtre graphique s’affiche (Figure 10), représentant une des modèles de point de cluster de RyR 3D simulés.
Le bouton « Générer Mesh » sur l’interface graphique déclenche la fonction iso2mesh pour générer un maillage tétraédrique. La résolution du modèle peut être ajustée en définissant les paramètres « iso2mesh » sur le GUI qui ajustent la longueur maximum d’élément tétraédrique de volume et edge. Le programme distingue actuellement les éléments qui composent la région myofibrillaire et les régions de mitochondries ; Cette fonctionnalité sera étendue afin d’inclure les autres composants de la cellule à l’avenir.
Utilisateurs peuvent utiliser le rendu 3D de la maille et les grappes de RyR pour dépanner ces étapes. Les paramètres de simulation du cluster RyR, etol et numIter, à l’intérieur de paramètres. R affectent la précision des simulations RyR cluster ; ces deux paramètres déterminent quelle met fin à une simulation de modèle de cluster RyR. Ces paramètres peuvent être ajustés lors de l’inspection de la distribution des clusters RyR dans la fenêtre R (Figure 10) pour veiller à ce que : (i) toutes les grappes sont proches des z-disques ; et (ii) les grappes sont répartis dans toute la section entière plutôt que de les agréger dans toute une région. Une analyse de sensibilité ad hoc des simulations à ces deux paramètres peut être effectuée pour déterminer une combinaison appropriée d’etol et numIter.
L’estimateur d’intensité noyau sphérique à l’étape 5 utilise une sphère de diamètre choisi comme un noyau, qui est passé sur le volume d’intérêt (le modèle spatial 3D dans ce contexte). Ces paramètres peuvent être ajustés à ce lissage algorithme sur l’interface graphique à la Figure 5: r_sphere (1) définit le rayon du noyau sphérique lissage ; (2) hval définit la taille de l’itératif étape spatiale sur laquelle le noyau sphérique doit être passé par itération sur le volume.
Une approche simple pour déterminer si les paramètres de densité spatiale sont suffisamment est d’inspecter la distribution des valeurs de densité cluster RyR tel qu’illustré à la Figure 7. Les valeurs de densité devraient être distribués tel que le quartier des valeurs de haute densité est une taille similaire à la taille d’une grappe de RyR dans données de la microscopie.
Le protocole actuel produit un modèle éléments finis qui ne contient que la répartition réaliste des myofibrilles, mitochondries et des amas de RyR. Une extension à cette étape serait pour simuler la distribution des autres canaux ioniques qui jouent un rôle dans ECC, tels que des pompes à calcium réticulaire sarco-endoplasmique (SERCA2a), échangeurs de sodium-calcium (NCX) et les pompes à calcium du sarcolemme. La clé de ces extensions est une analyse de la répartition spatiale des canaux ioniques de données de l’immunofluorescence. Par exemple, on a mesuré les canaux NCX pour uniformément répartie sur la membrane tubulaire-t à un espacement moyen de 0.67 µm, mais leur relation aux clusters de RyR n’est pas si clair32. En revanche, les anticorps ciblant SERCA2a avaient déjà été utilisés pour marquer la SR33, mais la densité spatiale des SERCA2a n’a pas été signalée dans la littérature. Par conséquent, à ce stade, une distribution uniforme de SERCA 2 a sur le réseau de SR et NCX sur les tubules t peut supposer avec prudence.
Comme le montre les résultats de représentant, le maillage éléments finis qui en résulte peut être utilisé avec éléments finis solveurs34 pour simuler les processus biochimiques comme le calcium signalisation18 et bioénergétique27 comme réaction-diffusion processus. À cette fin, canaux ioniques est représentés comme sites de réaction au niveau des nœuds dans la topologie maillée. Les sites de réaction servent de sources ou de puits de différentes espèces chimiques pour représenter le flux d’espèces chimiques par le biais de ces canaux ioniques dans les différents compartiments de la cellule. Le maillage de sortie et les fichiers de densité de RyR du présent protocole peuvent être utilisés avec n’importe quel autre intégrateur ou dans tout autre environnement, sous réserve que le logiciel a la particularité de reconnaître ces fichiers texte. Les fichiers texte peuvent également être manipulés par des scripts ou des logiciels tiers pour satisfaire les exigences de format de fichier d’entrée de l’environnement de choix. La première application sur la dynamique du calcium seulement démontre l’utilité de ce modèle pour la branche ascendante de calcium, mais cela n’indique pas que le maillage ne peut servir pour des échelles de temps plus longues. Les densités de maillage et de cluster peuvent être utilisées pour simuler les cycles multiples de calcium, avec le maintien de l’homéostasie et de la stabilité seulement dépend le solveur éléments finis qui est utilisé.
Un objectif à plus long terme est d’améliorer ce pipeline du modèle de construction pour rendre plus facile créer des modèles d’éléments finis structurellement précis des cardiomyocytes et autres types de cellules. Un algorithme de segmentation automatisée a été développé récemment, qui peuvent être appliquées aux données de microscopie électronique à balayage série-îlot des cardiomyocytes pour créer un modèle de la distribution de myofibrilles et des mitochondries dans la cellule entière avec minimale de l’utilisateur entrée29. Cette méthode sera étendue pour segmenter les tubules t et les réseaux de membrane de SR à l’avenir. Une version plus généralisée de l’algorithme de RyR-simulateur qui permettra aux utilisateurs d’analyser et simuler des regroupements entre les canaux ioniques et des organites, ainsi qu’entre les types de canaux ioniques différentes, de façon à haut débit est également en cours d’élaboration. Un protocole sans soudure pour la construction d’un modèle complet de la cellule permettrait aux scientifiques d’effectuer des tests d’hypothèses basées sur le modèle sur la relation entre la structure cellulaire et la fonction des cellules plus régulièrement qu’actuellement avec des approches expérimentales seul.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Royal Society de New Zealand Marsden vite commencer Grant 11-LABNT-184, la subvention de recherche de programme de Science frontières humaines RGP0027/2013 et l’australien recherche Conseil découverte projet Grant DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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