Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

יצירת מודל גיאומטרי מבנית מציאותי סופיים של Cardiomyocyte ללמוד את התפקיד של אדריכלות הסלולר Cardiomyocyte במערכות ביולוגיות

Published: April 18, 2018 doi: 10.3791/56817
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3, 2,4, 5, 6, 2,3,4,7,8, 9
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודל מפורט במרחב סופיים של הארכיטקטורה תאיים של cardiomyocytes מיקרוסקופ אלקטרונים ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כוחו של המודל מפורט במרחב הזה הוכח באמצעות חקרי מקרה סידן איתות, ביואנרגיה.

Abstract

עם כניסתו של טכנולוגיות הדמיה תלת מימדי (3D) כגון טומוגרפיה של אלקטרון, סדרתי-בלוק-פרצוף סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית, הקהילה המדעית יש גישה חסרת תקדים אלגוריתמית תת מיקרומטר רזולוציה המאפיינות את שיפוץ אדריכלי זה מלווה שינויים בתפקוד cardiomyocyte על בריאות ומחלה. עם זאת, אלה נתונים (datasets) היה תחת שימוש עבור חוקרים את התפקיד של אדריכלות הסלולר שיפוץ בפונקצית cardiomyocyte. המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר כיצד ליצור מודל מדויק סופיים של cardiomyocyte באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מודל מפורט ומדויק של אדריכלות הסלולר יש פוטנציאל משמעותי לספק תובנות חדשות cardiomyocyte ביולוגיה, יותר מאשר ניסויים לבד יכול גארנר. הכוח של שיטה זו טמון ביכולתה שהמפתחות מיזוג מידע מתוך שתי שיטות הדמיה ובתחזוקה של cardiomyocyte ultrastructure לפתח מודל אחד מאוחד ומפורט של cardiomyocyte. פרוטוקול זה מתאר את השלבים כדי לשלב את האלקטרונים טומוגרפיה ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של מבוגרים cardiomyocytes חולדה זכר Wistar (שם עבור סוג מסויים של לבקן עכברוש) לפתח מודל חצי-סרקומר סופיים של cardiomyocyte. ההליך יוצר דגם תלת-ממד סופיים המכיל של תיאור מדויק, ברזולוציה גבוהה (גודל ~ 35 ננומטר) של ההתפלגות של המיטוכונדריה, myofibrils אשכולות קולטן ryanodine לשחרר את הסידן הדרוש עבור cardiomyocyte התכווצות מהרשת רשתי sarcoplasmic (SR) לתוך myofibril תא cytosolic. המודל שנוצר כאן כפי המחשה שאינו כולל הפרטים של הארכיטקטורה צנורית-רוחבי או מהרשת רשתי sarcoplasmic, ולכן מודל מינימלי של cardiomyocyte. ובכל זאת, הדגם ניתן כבר ליישם מבוסס סימולציה חקירות את תפקיד של מבנה תאים בסידן איתות, מיטוכונדריאלי ביואנרגיה, אשר מומחש ודן באמצעות שני מחקרים בתיק המוצגים הבאים פרוטוקול מפורט.

Introduction

צימוד עירור-התכווצות (ECC) בלב מתייחס חשוב ומורכב צימוד בין עירור חשמלי של קרום cardiomyocyte התכווצות מכנית עוקבות של התא במהלך כל פעימת לב. מודלים מתמטיים יש תפקיד מפתח בפיתוח הבנה כמותית של תהליכים ביוכימיים היררכיות המסדירים את פוטנציאל הפעולה1, סידן cytosolic איתות2, ביואנרגיה3, ובעקבות יצירת כח כויץ. מודל שכזה גם בהצלחה לחזות שינויים פעימות הלב כאשר אחד או מספר תהליכים ביוכימיים אלה עוברים שינויים4,5. Ultrastructure מאורגן של cardiomyocyte הוכרה יותר ויותר כדי לשחק תפקיד קריטי הפונקציה כויץ נורמלי של התא לבין בלב שלם. אכן, מתרחשים שינויים מורפולוגיה וארגון של רכיבי ultrastructure לב במקביל לשינויים ביוכימיים בתנאים מחלות כגון היפרטרופיה6, אי ספיקת לב7קרדיומיופתיה סוכרת8. בין אם שינויים מבניים אלה הן התגובות קלים, גמישים או פתולוגית שינוי תנאי הביוכימי הוא עדיין אינו מודע לקיומם9. המושבים מטבעו צר בין צורה ופונקציה בביולוגיה אומר כי מחקרים ניסיוניים לבד לא יכול לספק תובנות עמוקות יותר מאשר מתאמים בין שיפוץ מבנה ותפקוד cardiomyocyte. דור חדש של מודלים מתמטיים ניתן לשלב את מכלול מבנית של מרכיבי תת הסלולר, יחד עם תהליכים ביוכימיים, למד היטב נחוצים לפתח הבנה מקיפה, כמותית של מערכת היחסים בין מבנה, ביוכימיה כויץ בכוח cardiomyocytes. פרוטוקול זה מתאר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור מודלים סופיים מדויק מבחינה מבנית של cardiomyocytes יכול לשמש עבור חקירות.

בעשור האחרון ראה התקדמות משמעותית מיקרוסקופ אלקטרונים 3D10קונאפוקלית11, מיקרוסקופיה סופר רזולוציה12 המספקים תובנות הרכבה בקנה מידה ננו, מיקרו-מידה של חסר תקדים, ברזולוציה גבוהה רכיבי משנה הסלולר cardiomyocyte. לאחרונה, datasets אלה שימשו כדי ליצור מודלים של cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. מודלים אלה להשתמש ומבוססת הנדסה הדמיה שיטה, הנקראת שיטת סופיים17, כדי ליצור סופיים חישובית רשתות על אילו תהליכים ביוכימיים, cardiomyocyte ניתן לדמות התכווצויות. עם זאת, מודלים אלה מוגבלים על ידי הרזולוציה ואת פירוט שיטת מיקרוסקופ שיכול לספק ב- dataset התמונה. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להפיק ננומטר ברמת פירוט מבנה התא, אבל קשה לזהות חלבונים ספציפיים בתוך התמונה זה יהיה צורך ליצור מודל. מצד שני, מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה סופר יכול לספק תמונות חדות גבוהה ברזולוציות גודל 50 ננומטר מרכיבים בלבד בחר כמה מולקולרית של התא. רק באמצעות שילוב של שיטות הדמיה אלה משלימים מידע יכולים אחת מעשית לחקור את הרגישות של פונקציה לשינויים במבנה. אור correlative ואלקטרון עדיין לא הליך שגרתי, זה עדיין יסבול המגבלה כי רק מספר מוגבל של רכיבים יכול להיות מוכתם בתצוגה immunofluorescence, בקורלציה עם הנוף מיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול זה מציג הגישה הרומן18 העושה שימוש בשיטות סטטיסטיות19 כדי לנתח שהמפתחות נתיך מיקרוסקופ אור מידע על התפלגות מרחבית של תעלות יונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים מידע על הלב אחרים ultrastructure רכיבים, כגון myofibrils של המיטוכונדריה. זה מייצרת מודל סופיים יכול לשמש עם מודלים ביופיזיקלי של תהליכים ביוכימיים ללמוד את התפקיד של הארגון תת הסלולר cardiomyocyte תהליכים ביוכימיים המסדירים התכווצות cardiomyocyte. לדוגמה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ליצור מודלים של בריאה, streptozotocin-induced נייטרלים לב סוכרתית לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב תא זה הוא ציין חיה סוכרתית מודלים8. יתרון נוסף של מהות השיטה הציג סטטיסטי מומחש גם בפרוטוקול: השיטה ניתן להפיק מופעים מרובים של גיאומטריות סופיים מקרוב לחקות את הווריאציות השפעול שנצפה במבנה התא.

כמו סקירה, השלבים פרוטוקול כוללים: (i) הכנה של רקמת הלב מיקרוסקופ ליצור תמונות 3D עם רזולוציה וניגודיות מספיק; (ii) שחזור ואת פילוח של אוספי תמונות 3D של מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 3D שחזור וניתוח התמונה תוכנה בשם IMOD20; (iii) שתשמש את iso2mesh21 ליצירת רשת סופיים באמצעות הנתונים מקוטע כקלט; (iv) באמצעות אלגוריתם הרומן קודים כדי למפות את ההפצה של תעלות יונים על גבי רשת השינוי סופיים.

הנחת היסוד של הגישה לקבר כל שלב המותווה בתוך הפרוטוקול, התוצאות נציג הינם מסופקים בכל הדמויות הנלוות. סקירה מחולקת לרמות המציין כיצד ניתן להשתמש הדגמים מפורט במרחב שנוצר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של סידן במהלך ECC, וכן מיטוכונדריאלי ביואנרגיה. חלק מהמגבלות הנוכחי של הפרוטוקול נידונות, כמו גם פיתוחים חדשים אשר נמצאות בעיצומן להתגבר עליהם, לקדם הבנה כמותית של התפקיד של מבנה תאים מערכות הלב לביולוגיה. מופנית גם כמה שיטות אלה יכול להכליל ליצור מודלים סופיים של סוגי תאים אחרים.

משתמשים של פרוטוקול זה יכול לדלג על שלב 1 ואת החלק שחזור של שלב 2 אם יש להם גישה לאוסף תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הקיימת מראש. משתמשים אשר מתכוונים לרכוש את הנתונים שלהם בשיתוף עם microscopists אלקטרון מנוסים יותר ייתכן שתרצה לדון ולהשוות את הקיבעון ואת הנהלים מכתימים בשלב 1 עם המומחה כדי לקבוע פרוטוקול אופטימלית עבור רכישת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת אוקלנד חיה ועדת האתיקה ואת אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו טיפול בבעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה, היכן פרוטוקול רקמות פותחה במקור.

1. הכנה ניסיוני

  1. להכין מלאי פתרונות של נתרן 0.15 מ' ו- 0.3 M cacodylate מאגרי ב- pH 7.4 לפי טבלה 1.
  2. להכין גלוטראלדהיד מקבע (2% paraformaldehyde (PFA) + 2.5% גלוטראלדהיד + 0.2% חומצה טאנית במאגר cacodylate נתרן 0.15 מ' ב- pH 7.4) באמצעות רכיבי המפורטים בטבלה 1.
    1. לפזר 2 גר' אבקה מחברים ב- 20 מ ל מים מזוקקים ב 60 מעלות צלזיוס על גזייה עם ערבוב מתמיד.
    2. מוסיפים 1 מ' NaOH פתרון עד הפתרון ברור.
    3. המתן עד הטמפרטורה של הפתרון הוא מתחת 40 ° צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 10 מ של גלוטראלדהיד, 20 מ של 0.3 M נתרן cacodylate.
    4. הוסף 0.2 גרם חומצה טאנית ' להמיס בפתרון.
    5. להוסיף 50 מ של 0.15 מ' נתרן cacodylate.
    6. חנות שלושה או ארבעה 20 מ"ל צלוחיות נצנוץ של מקבע במקרר 4 ° C, או על קרח אם נעשה שימוש באותו יום.
  3. להכין הפתרון של Tyrode עם 20 מ מ 2, 3-butanedione monoxime (BDM), במתכון בטבלה1.
  4. לבנות מנגנון Langendorff בתוך ארון fume.
    1. תהדק את שני צינורות מזרק פלסטיק 100 מ ל שני אביק שונות עומדת, כ 70 ס מ מבסיס לעמוד.
    2. לחבר את הצינורות מזרק פלסטיק, צינור המחבר באמצעות צינורות מ"מ-הפנימית-קוטר 3, צימוד-כיוונית כפי שמוצג באיור1.
    3. מתאים בצינורית הקוטר החיצוני של 3 מ מ לחלק התחתון של המחבר אבובים, איפה הלב יהיו כבולות עבור קיבעון זלוף.
  5. למלא את הצינורות מזרק של Tyrode פתרון ופתרונות מקבע ב 37 º C.
    1. להסיר בועות אוויר בתוך הצנרת על ידי עובר את הפתרונות מזרק דרכם.

2. לרכוש מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים של Cardiomyocyte Ultrastructure

  1. להכין את החיה כריתה, קיבוע כימי של הלב.
    הערה: פרוטוקול זה מפרט את השלבים כדי לעבד למבוגרים זכר Wistar (שם עבור סוג מסויים של לבקן עכברוש) עכברים ברקמת הלב. הפרוטוקול עשויים לדרוש שינויים כאשר רקמת הלב הטרייה מינים אחרים.
    1. עזים ומתנגד החיה על ידי טיפול העכברוש (200-250 גרם לפי משקל גוף) עם 0.5 מ של הפארין U/mL 250 באמצעות הזרקת בקרום הבטן. לחכות 10 דקות, ולאחר מכן להתייחס העכברוש עם בקרום הבטן הזרקת פנטוברביטל (210/kg של משקל גוף).
    2. לאשר מידה נאותה של הרדמה על ידי בוחן את רפלקס קמצוץ של הבוהן.
    3. להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם.
    4. קציר הלב באמצעות ניתוח הליכים דומים בעבר מאמרים יופיטר22,23, ואז למקם אותו בתוך תמיסת מלח קרה כקרח.
    5. לבודד את העורקים, נקרר. ודא כי קצה הצינורית יושב מעל השסתום חצי הירח, שם פנו העורקים הכליליים. לקשור חוט בחוזקה סביב אבי העורקים.
    6. לחבר את הצינורית המנגנון Langendorff מונחה הכבידה המופעל ב ~ 70 ס מ מעל הבסיס של המערכת (איור 1).
    7. סובב את צימוד על מערכת Langendorff כדי perfuse את הלב עם הפתרון של Tyrode, כולל 20 מ מ BDM (מעכב צולבות הקישור חוטים שרירן) למשך 2-3 דקות.
    8. סובב את צימוד להתחיל זלוף עם מקבע של 2% paraformaldehyde, גלוטראלדהיד 2.5% ו- 0.2% חומצה טאנית ב- 0.15 מ' cacodylate נתרן ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אם מצליחים, הלב חיוור משחימים ולהיות נוקשים וכואבים כמו גומי.
    9. בעזרת סכין גילוח, לנתח רקמות רחובות-חדרית (לרוחב) חינם הקיר השמאלי ולקבל רקמות חוסמת כ 1 מ3 בגודל.
    10. חנות הדגימות ב mL 20 טרום מקורר צלוחיות נצנוץ של מקבע אותו על קרח על ה 2 לאחסן דוגמאות רבות ככל האפשר הבקבוקונים, ולוודא כי הדגימות טובע בפתרון.
      שים לב: חשוב לשמור דגימות קר עד לאחר התייבשות 100% השלבים הבאים.
  2. עוד קיבעון, מכתים של דגימות של מיקרוסקופ אלקטרונים.
    1. לשפוך 100 מ של 0.15 מ' נתרן cacodylate מאגר ב גביע זכוכית, לצנן את זה על קרח.
    2. להכין נפחים שווים של 4% אוסמיום ארבע-חמצני ו- 0.3 M נתרן cacodylate, ואחריו התוספת של 0.08 גרם אשלגן ferrocyanide כדי להפוך פתרון הכתם מטאל המכיל 2% אשלגן ferrocyanide ב 2% אוסמיום ארבע-חמצני ו- 0.15 מ' נתרן cacodylate. מגניב הפתרון על קרח.
    3. Pipette מקבע את החוצה ולהחליף אותו עם מספיק 0.15 מ' נתרן cacodylate מאגר קר להטבעת דוגמאות הבקבוקונים. מניחים את הבקבוקונים על קרח למשך 5 דקות.
    4. חזור על שלב 2.2.3 ארבע פעמים נוספות עם 0.15 מ' cacodylate נתרן כדי להסיר עודפי מקבע.
      התראה: אל תשתמש פיפטות זכוכית כי רסיסים זעירים יכול להיכנס המדגם ואני יכול להרוס סכינים יהלום במהלך רקמות בלוק חלוקתה. חשוב מראש לצנן את כל הפתרונות על הקרח לפני הוספתן ל המדגם. חשוב גם כי המדגם נשאר מכוסה על-ידי פתרון כל הזמן (תקופה קצרה מאוד של כיסוי חלקי שנמשך לא יותר מכמה שניות יכול להיות בקצרה נסבל במהלך פתרון חילופי). בעת שטיפה או החלפה פתרונות, להוסיף הפתרון החדש במהירות לאחר הסרת הפתרון הקודם. שמור את הבקבוקונים נצנוץ בקרח בין שוטף. שים לב כי צעד זה לא הזמן רגיש, אבני רקמה יכולים להישטף מעט יותר, אם יש צורך.
    5. החלף מאגר cacodylate נתרן מתכות כבדות קרה כקרח הכתם פתרון ואחסן אותו על קרח בן לילה. להבטיח ferrocyanide הוא מעורב טוב ע י ניעור המבחנה בעבודת יד; הפתרון צריך לפנות שחור.
      התראה: לעבוד בשכונה fume בעת ביצוע שלב זה בגלל אוסמיום הוא רעיל.
    6. לדלל 4% uranyl מימית אצטט (UA) מניות פתרון (טבלה 1) ל-2% באמצעות נפחים שווים של מלאי UA פתרון כפול מים מזוקקים, תקרר אותו בקרח.
    7. להחליף את הכתם מטאל מקורר קרח 0.15 מ' נתרן cacodylate מאגר, והנח את הדגימה תקופת דגירה של 5 דקות על קרח.
    8. חזור על שלב 2.2.7 עוד ארבע פעמים על קרח כדי לשטוף כל פתרון הכתם עודף הבי מטאל.
    9. לשטוף את הדגימות ארבע פעמים, עם רגע-פרק 2-מין בין במים מטוהרים (מזוקק פעמיים מספיקה).
    10. להחליף מים מורתחים עם 2% קר כקרח UA ולתת הדגימה תקופת דגירה של 60-120 דקות על קרח.
    11. לקרר חמש צלוחיות נצנוץ 20 מ"ל של אתנול (מספיק להטבעת דגימות) על קרח שישמש בשלב התייבשות. 6 בקבוקים יש הגדלת אחוזי אתנול במים מזוקקים: 20%, 50%, 70%, 90% ו- 100%.
    12. שופכים אצטון טהור לתוך עוד 20 מ"ל בקבוקון נצנוץ וקריר על הקרח יחד עם הבקבוקונים אתנול.
    13. לשטוף דגימות מים מטוהרים ארבע פעמים עם תקופות ההמתנה 2 דקות על קרח כדי לשטוף את עודף UA.
  3. מייבשים דגימות אתנול.
    1. מייבשים בסדרת אתנול קר על-ידי החלפת במרוכז פתרון בתוך המבחנה מדגם כדלקמן, על הקרח: 20% אתנול 10 דקות; 50% אתנול 10 דקות; 70% אתנול 10 דקות; 90% אתנול 10 דקות; . אז פעמיים בתוך 100% אתנול למשך 10 דקות...
    2. מעבר מדגם לטמפרטורת החדר על-ידי החלפת האתנול 100% הסופי עם אצטון טהור מקורר ולמקם את המבחנה מדגם על ספסל מעבדה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    3. ביצוע אחד עוד 10 דקות לשטוף אצטון טהור בטמפרטורת החדר כדי להסיר עיבוי זה נצפות בתוך הבקבוקונים. בזמן המקננת, לפצות את הפתרונות אצטון/שרף.
    4. החלף אצטון טהור ב הבקבוקונים 50: 50 טהור אצטון, אפוקסי שרף (עם הפרופורציות עבור רכיבי שרף אפוקסי כאמור על ידי היצרן). השתמש כל הרכיבים מאותו סוג. להשאיר את הבקבוקונים מלא שרף מדגם בן לילה רוטור.
  4. להטביע דגימות שרף.
    1. להחליף 50: 50 שרף שרף 75% (25% אצטון), תקופת דגירה של 3 שעות, ואחריו הדגירה/חדירה נוספת ב- 100% שרף במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. להחליף 100% שרף שרף 100% טרי, ולהשאיר את הבקבוקונים מדגם בן לילה לחדירה עמוקה יותר של השרף לתוך דגימות רקמה.
    3. לקחת דגימות מתוך הבקבוקונים, למקם אותם במיכלים שאינם ידידותיים תנור, יש בסיס שטוח; אלומיניום או רדיד כסף מנג'ט יכול לשמש למטרה זו, לדוגמה.
    4. שופכים בעדינות (כדי למנוע תזוזה של הדגימות) טריים שרף על הדגימות (ובכך הטבעה דגימות שרף), פולימריזציה של שרף ודוגמאות בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  5. מחדש אוריינט שרף בלוקים לתאים תמונת חתך הרוחב.
    1. להשיג 1 מיקרומטר מבחן עבה מקטעים של הבלוקים שרף באמצעות ultramicrotome עם סכין זכוכית כדי להעריך תא התמצאות24.
    2. כתם הסעיפים מבחן עבה 20 s עם כחול טולואן 1%, 1% בורקס.
    3. לבחון כיוון תא השריר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
    4. לפי כיוון להסיק מן הדימויים של סעיפים מוכתמים מבחן, מחדש אוריינט longitudinally או בעקיפין מונחה (בדומה איור 2A) שרף בלוקים כדי להבטיח כי תאים נחשפים הסכין זכוכית כך הם יקוצצו ב (חתך רוחב בדומה איור 2B).
  6. סעיפים רקמות התמונה באמצעות טומוגרפיה של אלקטרון.
    1. להשיג חלקים למחצה דק (~ 300 ננומטר) של הרקמה reoriented הבלוקים באמצעות יהלום סכין ולהעביר את הסעיפים על גבי רשתות נחושת25.
    2. כתם הסעיפים עבה עם 2% UA ו- Sato הראשי25.
    3. החל colloidal חלקיקי זהב משני צידיו של סעיפים25.
    4. להשיג סטים של יחיד או כפול-ציר להטות את סדרת תמונות המוקרנת מ-70 ° +70 °25.
  7. השתמש IMOD20 כדי לשחזר את המחסנית תמונה תלת-ממדית (סדרה של תמונות דו-ממד המספקים את נתוני תלת-ממד של מקטע טומוגרפיה אלקטרון יחיד) של התא. זה מחסנית המשוחזרת מקוטע בשלב הבא.

3. קטע Myofibrils ואזורים המיטוכונדריה מן הנתונים (dataset) תמונה תלת-ממדית EM

  1. לבצע את התוכנית IMOD "3dmod".
  2. בממשק משתמש גרפי 3dmod, הזן את הכתובת של ".rec" או ".mrc" קובץ המכיל 3D שיחזר תמונה dataset של התא (נוצר בשלב 2.7) לתוך התיבה ערך שכותרתו "תמונת קבצים:", והקש "אישור".
  3. תחת תפריט "קובץ", בחר דגם חדש ולאחר מכן שמור את הקובץ עם שם מתאים באמצעות "להציל את המודל". פריט התפריט תחת "קובץ".
    הערה: אובייקט IMOD יכולים להכיל אוסף של רכיבים מקוטע, שמרכיבים את "אובייקט". כברירת מחדל, מודל חדש מכיל אובייקט חדש עם מזהה "#1".
  4. תחת תפריט 'מיוחד', בחר 'כלי ציור'. פעולה זו תפתח בר כלי חדש הדומה לזה המוצג באיור 3 א.
    הערה: ישנם מספר כלים יכול לשמש כדי ליצור קווי מתאר סביב הגבולות אברון שונים. עזרה נוספת אודות דרכים להשתמש בכלים אלה ניתן למצוא בתיעוד20 IMOD.
  5. בחר באפשרות "Sculpt" בתפריט "כלים ציור", להזיז את העכבר מעל לחלון התמונה; יופיעו מתאר מעגלי שבמרכזה מצביע העכבר.
  6. על-ידי החזקת לחצן העכבר האמצעי מעל מיטוכונדריון (אזורים כהים קבצי תמונה, כפי שהודגמה בעזרת מטוס עם קווים ירוקים מתאר דמות 3A), גרור את ההיקף מתאר מעגל לצורה של הגבול שלה.
  7. לאחר יצירת מיתאר של הגבול מיטוכונדריון תושלם, שחרר את לחצן האמצעי וחזור על שלבים 3.6 עבור כל מיטוכונדריון בנתונים. כל אחד מתאר באופן אוטומטי תוכר על ידי IMOD מתאר חדש בתוך אותו אובייקט.
  8. תחת "עריכה | אובייקט "תפריט, בחר"חדש"כדי ליצור אובייקט חדש. זה באופן אוטומטי להגדיל את המספר הכולל של אובייקטים באחד ולהקצות את המספר הזה האובייקט החדש.
  9. חזור על שלבים 3.6 ו- 3.7 קטע ולהציל את קווי המתאר myofibril.
  10. חזור על שלב 3.8, ואחריו שלב 3.6, כדי לחלק גם בגבולות התא.
  11. שמור את הקובץ דגם תחת תפריט "קובץ".
  12. להריץ את הפקודות הבאות בחלון שורת הפקודה כדי להמיר כל אובייקט קיבוץ לתוך מסכה בינארי, כמודגם באיור 4A-C.
    1. תמצית אובייקט מסוים מן מודל "imodextract אובייקט modelfile outputmodelfile" "אובייקט" איפה המספר של האובייקט כדי לחלץ.
    2. ליצירת מסיכה עבור אובייקט זה: imodmop-מסכת 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. להמיר את הקובץ לתוך ערימה tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. ליצור את רשת סופיים של הרכיבים מקוטע

  1. Iso2mesh היא תוכנית MATLAB זמינה בחופשיות להמרת אוספי תמונות TIFF רשתות שינוי נפח tetrahedral סופיים. להוריד ולהוסיף iso2mesh לנתיב MATLAB של iso2mesh.sourceforge.net.
  2. הורד את קודי המקור ואת הנתונים כדי לדמות RyR אשכולות על רשת השינוי של https://github.com/CellSMB/RyR-simulator באתר github.
  3. הפעל את היישום CardiacCellMeshGenerator MATLAB (איור 5).
  4. לטעון את המסכות רכיב אברון שונים לתוך MATLAB באמצעות הלחצנים לדחוף שלוש בצד השמאלי העליון של GUI.
  5. ליצור עוד מחסנית תמונה בינארי demarcates פערים בין myofibrils המיטוכונדריה כפי שמוצג באיור 6A.
    1. פתח ImageJ.
    2. באמצעות הקובץ | פתח את הדו-שיח, לטעון את הערימות tiff myofibrils של המיטוכונדריה לתוכנית.
    3. ליזום את תוסף תוספת של התמונה על-ידי בחירה "תהליך | מחשבון פלוס ".
    4. בחר של אוסף התמונות myofibril i1, המיטוכונדריה תמונה מחסנית כמו i2, בחר באופרטור 'הוסף'. לחץ על "אישור".
    5. לאחר ערימה תמונה חדשה המייצג את התוצאה של 4.5.4 מופיע, בחר ' עריכת | היפוך"כדי לייצר אוסף תמונות הדומה 6A איור.
  6. לטעון את הקובץ המכיל את ערימת תמונה בינארי הפערים בין myofibrils המיטוכונדריה על-ידי לחיצה על כפתור "RyRGapsFile" תוכנית CardiacCellMeshGenerator.
  7. לדחוף "ליצור רשת" ב- GUI. זה יפעיל את v2m הפקודה iso2mesh עם האפשרות 'cgalmesh' כדי ליצור רשת tetrahedral הדומה איור 4E. שלושה קבצים יהיה הפלט בסוף שלב זה: קובץ .ele קובץ להתייצב, קובץ .node שיכיל את הרישום של צמתי המרכיבות את היסודות, הצמתים המרכיבות את הפנים, את הקואורדינטות של הצמתים , בהתאמה.

5. מתמטית מפת צפיפות במרחב בדרגות שונות של יון-ערוצי עניין על גבי רשת השינוי סופיים.

  1. צור את הקלט הנדרשים עבור RyR-הסימולטור על-ידי לחיצה על לחצן מתויג תשומות ליצור RyR-סימולטור ב- GUI.
    הערה: הלחצן יגרום לקריסה של פונקציה generateRyRsimulatorInputs.m, העושה את המידע הבא משלב 4 כדי להפיק את הקלט:
    (1) outDir: מיקום קבצי פלט הנחוצים RyR אשכול סימולציה.
    (2) imres: פיקסלים ברזולוציה ב משלושה כיוונים של אוספי תמונות.
    (3) myofibril_file: הקובץ המכיל את המחסנית תמונה בינארי כזה באיור איור 4B.
    (4) sarcolemma_file: הקובץ המכיל את המחסנית תמונה בינארי כזה באיור איור 4A.
    (5) ryrgaps_file: הקובץ המכיל את המחסנית תמונה בינארי כזה באיור איור 5A.
    1. לאחר מפעילה פונקציה זו, בדוק הקבצים הבאים נוצרו בתוך הספריה שצוינה כנתיב outDir:
    • . d_axial_micron.txt, אשר מייצג את המרחק בין המיקום של z-הדיסק השארית של הפיקסלים באוסף תמונות.
    • . d_radial_micron.txt, אשר מייצג את מרחק אוקלידי (למעט הרכיב צירית) של כל פיקסל בקבוצת מיקומים אפשריים של אשכול RyR הפיקסלים במישור z-דיסק.
    • . W_micron.txt, אשר מייצג את רשימת קואורדינטות המרחבי של כל המיקומים הזמינים עבור RyR אשכולות להיות נוכח.
    • 3 הקבצים הנותרים בתיקיה להכיל את הסיומת "_pixel" ולא "_micron" לציון כי הערכים בתוך קבצים אלה נכתבו בצורת קואורדינטות פיקסלים.
  2. לדמות RyR הפצות אשכול על ערימת myofibrils תמונה בינארי.
    1. לחצו על הכפתור מתויג "פתוח RyR-סימולטור ב- R" כדי להפעיל את התוכנית R.
    2. R-gui, בחר ' קובץ | פתוח"ולמצוא הקובץ"הגדרות. R"בתוך החבילה RyR-סימולטור (RyR-סימולטור מקור הגדרות. R).
    3. גם לפתוח את הקובץ ryr-סימולטור-במקביל. R (ממוקם RyR-סימולטור/מקור/ryr-סימולטור-במקביל. R)-סביבות כמו Rstudio (https://www.rstudio.com) או ממשק שורת פקודה פשוטה ניתן להשתמש, למשל באמצעות הפקודה R64 בחלון קש או הפקודה.
    4. לשנות את הפרמטרים בהגדרות. R הקובץ כמפורט להלן:
      1. הגדר Path2 הכתובת תיקיה המכילה את הקבצים שמופיעים 5.1.2 עבור אוסף תמונות קונאפוקלית רכשה השפעול של אשכולות RyR myofibrils.
        הערה: github מאגר התיקייה הקלט-הקבצים/המאסטר-התא / כבר מכיל קבצים אשר נוצרו עבור אוסף תמונות שנאספו בעבר.
      2. הגדר Path4 כתובת תיקיה שבה מאוחסנים הקבצים נוצרו בשלב 5.1.2.
      3. לקבוע נקודת Path3 לתיקייה שבה המשתמש רוצה המיקומים מדומה של אשכול RyR להינצל.
      4. סט N על מספר אשכולות RyR ניתן לדמות במודל (בדרך כלל בטווח של 200-300).
      5. הגדר etol, סובלנות הגדרת, על ההבדל בין ההתפלגות המרחבי נמדד השפעול של אשכולות RyR את התפוצה המרחבית של מודל הדמיה של RyR אשכולות.
      6. הגדר numIter כדי להגביל את מספר הניסיונות RyR-הסימולטור צריך לנקוט כדי למצוא תבנית אשכול RyR המדומה המקיים את הערך etol.
        הערה: ערכים עבור etol ו- numIter הוגדרו ערכים אופייניים בתוך ההגדרות. R הקובץ.
      7. מוגדר numPatterns מספר דפוסים אשכולות שונים RyR המשתמש שרוצה לדמות (בדרך כלל, זה תרגול שימושי להדמיית 99 דפוסי על האמון סטטיסטית).
      8. הגדר numCores כדי לאפשר את השימוש ב- CPU מספר חוטי (ליבות) מקבילי מהיר עיבוד עם R כדי לדמות את דפוסי נקודת.
    5. בדוק החבילות הבאות מותקנים באמצעות ' מתקין החבילות ' gui ב r: שלג, doSNOW, doparallel, foreach, iterators ו- rgl.
    6. לבצע את הסימולטור על-ידי הזנת את הפקודה הבאה בחלון הפקודה R: מקור (' נתיב ryr-סימולטור-במקביל. R', הפקודה chdir = TRUE)
      הערה: הפלט של התוכנית RyR-סימולטור הוא רשימה של קבצי. txt (קובץ numPatterns ייווצר) המכילים רשימות קואורדינטות N שורות, עמודות 3, אשר מייצגים את x, y ו- z הקואורדינטות של N מדומה RyR אשכולות.
  3. מפת נקודות כמו המרחבי הצפיפויות על גבי מודל חישובי באמצעות CardiacCellMeshGenerator.
    1. על-ידי בחירת לחצן מתויג "בחר קובץ נקודות RyR", לבחור אלו שהיו פלט על-ידי RyR-הסימולטור מדומה RyR אשכול חלוקת קובץ טקסט.
    2. לבצע "RyR צפיפות ממפה" ב- GUI ב- MATLAB. זה ימפה את המיקומים המרחבי של האשכולות RyR מדומה, הקובץ. txt בשלב 5.3.1 על גבי רשת השינוי סופיים שנוצר בשלב 4.8 באמצעות שיטה הנקראת שיטת26משערך העוצמה הקרנל כדורית.
      הערה: הפלט של שלב זה הוא קובץ עם סיומת. txt המכיל רשימה של ערכים עבור צפיפות המספרי של יון-הערוץ לכל יחידת נפח כדורית בכל אחד מהצמתים רשת חישובית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 - איור 7 לספק תוצאות נציג מספר שלבים מרכזיים ב פרוטוקול זה: (i) להמחיש, לצידוד גושי רקמה לתצוגות מיקרוסקופ אלקטרונים חתך הרוחב; (ii) יצירת ערימה תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים תלת-ממד; (iii) הממיין ultrastructure תת הסלולר עבור organelles עניין; (iv) דור של רשת סופיים באמצעות iso2mesh; (v) הדמיה מציאותית הפצת RyR אשכולות על רשת השינוי; (vi) ואחריו מיפוי זה התפוצה המרחבית כמו צפיפות המרחבי על רשת השינוי חישובית.

איור 2 מציג תמונות שדה בהיר טיפוסי להראות כיצד התאים יופיעו כאשר מונחה longitudinally (איור 2 א, מתויג L), מלכסן מבט (איור 2 א, מתויג O) ו cross-sectionally (איור 2B) ביחס חיתוך המטוס. דוגמאות המלוכסן ומודעים longitudinally התערוכה לקווקוו, בעוד cross-sectionally אוריינטציה דגימות לא מוצג לקווקוו. הנימים מופיעים גם יותר מעגלי בתצוגות חתך הרוחב מאשר בתצוגות עקיפה.

איור 3A מציג תמונת הנציגה של ערימה tomogram באיכות טובה שניתן לרכשה כאשר פרוטוקול הכנה רקמות בשלב 1 מלווה. חייבים להקפיד בעת ביצוע שחזור תלת-ממד מתוך הסדרה הטיה של תמונת מיקרוסקופ. מעקב שגוי של colloidal חלקיקי זהב, או חוסר מספיקות חלקיקי זהב יכולים להשפיע על האיכות – תמונת המוקד החדות של התמונה — של tomogram במידה ניכרת. הדבר משפיע על היכולת לחלק מבנים שונים באופן משמעותי. טיפול וניסיון נחוצים להבטיח כי אבני רקמה מוכתמים מספיק וכי אין ריפודי כתופיים של colloidal חלקיקי זהב דרך נפח הרקמה. במקרה של ספק, זה עשוי להיות שימושי כדי להתייעץ עם מומחה מעבדה או מתקן במוסד המקומי. אם דגם הדור מתבצע ניסיון עם ניגודיות נמוכה או שגוי שיחזר נתונים, מודלים עשויים להיווצר עדיין אך ההתכתבות של דגמי תוצאות עם המאפיינים של מערכות ביולוגיות ל ניתן לדמות עלולים להיות דלים. איור 3B מציג תמונת הנציגה של איך נראה דגם מקוטע של myofibrils של המיטוכונדריה.

איור 4E מראה מודל 3D של רשת השינוי tetrahedral המיוצר על ידי iso2mesh. כל עוד מחסנית התמונה המקורית והמשימות פילוח הם באיכות טובה, השלב זה די חסונים. 6B איור , איור 6C להציג התפלגות אשכול RyR טיפוסי (באדום) בתוך הטופולוגיה סלולרית תלת-ממד. בשלב זה, רשת השינוי עצמו אינה הקלט RyR סימולטור. אוסף תמונות בגבולות התא ואת הפערים בין myofibrils המיטוכונדריה — שנוצר מן התמונות מקוטע באיור 4 – הפכו את הקלט העיקרי RyR סימולטור. יש לנקוט כדי לחלק את גבולות myofibrils ואת המיטוכונדריה במדויק ככל האפשר; לא מדויק segmentations כתוצאה ייצוג לא מדויק של הטופולוגיה תא בנתונים, אשר כתוצאה מכך ישפיעו על מיקום RyR בתוך רשת השינוי. . זה עלול להשפיע ואז את הדינמיקה-עתיים של סידן איתות ב cardiomyocyte (יישום 1).

איור 7 מראה 3 מופעים של אשכולות RyR מדומה על אותו רשת שינוי טופולוגיה לאחר שימוש האלגוריתם משערך העוצמה הקרנל כדורית. שים לב וריאציית בארגון של האשכולות RyR. וריאציות אלה נמדדו תוך ההשתנות שנמצא נתוני הניסוי18. חייבים להקפיד בבחירת רדיוס כדור הקרנל ואת גודל צעד שעליו הליבה דגימות RyR אשכול צפיפות. שני הגורמים הללו משפיעים על איך בחדות או diffusely ייצוג של הצפיפות של אשכולות RyR להיות מסופר על רשת השינוי. ניתוח ההשפעה של ערכים שונים עבור פרמטרים אלה יסייע לצמצם על האפשרויות פרמטר עבור רשת סבירה.

רשת השינוי שנוצר של RyR אשכולות, myofibrils המיטוכונדריה הוא מודל מינימלי של המבנה cardiomyocyte. רשת זו הוחלה, כמו גם וריאציות של זה זה נגזר נתונים אחרים המבנה התאי, ללמוד dynamics סידן ו ביואנרגיה. סקירה כללית של שני יישומים המותווה להלן כדי להדגים את כוחה של דגמי סופיים של מבנה תאים לתת תובנות על מבנה-תפקוד מערכות יחסים.

יישום 1 18 : ייתכן הדינמיקה של סידן משחרר לתוך cardiomyocytes. מודל זה שימש כדי לבחון את התפקיד של הטרוגניות חלוקת RyR אשכולות myofibrils, המיטוכונדריה על סידן איתות. איור 8 מציג את הדינמיקה ייתכן של סידן cytosolic בשלב העולה של והחולף כאשר מדומה על הטופולוגיה רשת להפיק של פרוטוקול זה. איור 8 ב' מציגה את הטרוגניות סידן חינם fluorophore-מאוגד-סידן ריכוז לאורך זמן. החצים הצבע כתמים קטנים של סידן גבוהה עקב צפיפות גבוהה יותר של אשכולות RyR או המיטוכונדריה באזורים אלה. איור 8C מציגה קו מדומה-לסרוק תמונות זה ניתן להשוות קו נסיוני-לסרוק תמונות של דינמיקה סידן בדרך כלל הנאספים באמצעות קונפוקלית בשידור חי. מודל סימולציה מספק הרבה גבוה יותר רזולוציה תצוגה של הטרוגניות המרחבי של סידן מאשר תמונה נרכשת השפעול. יתר על כן, בשל המודל להיות נגזר מיקרוסקופ מבני הנתונים, מספר אשכולות חייבים להישאר להשבית (~ 4-6) לאחר הפעלת חשמל עבור heterogeneities להופיע בתמונה קונאפוקלית קו סריקה יכול להיקבע בדיוק. Heterogeneities דומים הם נצפו קו השפעול נרכשת-לסרוק תמונות של סידן דינמיקה במודלים חייתיים של אי ספיקת לב18

יישום 2 27 : ייתכן דינמיקת ביואנרגיה מיטוכונדריאלי ב cardiomyocytes. . זו מטרה העל של עבודה זו היא ללמוד את הקשר בין סידן dynamics, ביואנרגיה מיטוכונדריאלי התכווצות שרירים. כצעד ראשון, נערכו סימולציות של זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי בבידוד בתוך cardiomyocyte. ככזה, חלוקת RyR אשכולות לא נחוצה ולאחר אחד יכולים פשוט להשתמש ברשת השינוי בשלב 3.4. כיישום מורכבים יותר, ביואנרגיה (יישום 2) יכול להיות בשילוב עם סידן דינמיקה (יישום 1) במודל העושה כל הרכיבים נחשב ב רשת, בניית דגם, קרי המיטוכונדריה, myofibrils ו ryanodine קולטנים.

איור 9 מייצגת את התוצאות סימולציות המרחבי חילוף חומרים אלו על פני אזורים שונים של רשת שינוי שנוצר באמצעות שלב 3.4. איור 9 א מתארת את ריכוז החמצן בכל חתך הרוחב תא, בעוד דמות 9B מציגה את הריכוז של ADP רק בתא myofibril של התא. איור 9C מתארת את חלוקת מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית ברחבי הרשת מיטוכונדריאלי. נתונים אלה חושפים את ההתפלגות לא אחידה של המיטוכונדריה, myofibrils של חתך הרוחב תא. הם גם מגלים הנוף מטבולית inhomogeneous הנובע הזה ultrastructure לא אחידה. זה מדגים הכוח של מיקרוסקופיית נתונים המבוסס על הדמיות סופיים נותן תובנות על יחסים מבנה פונקציה אחרת קשה להשיג באמצעות שיטות נסיוניות לבד.

Figure 1
איור 1: הכנה Langendorff של הלב קיבוע כימי. תיאור סכמטי של המנגנון זלוף Langendorff (א). צימוד מכילה שסתום כדי לעבור בין של Tyrode ופתרונות מקבע. הספל בבסיס משמש כדי לתפוס פתרונות perfuse דרך הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: בחינת תא כיוון תחת מיקרוסקופיית שדה בהיר. תצוגת שדה בהיר (א) סעיף טולואן blue מוכתמת עבה של רקמת הלב הממחישות תאים שנמצאים longitudinally מונחה (L), מלכסן מבט מונחה (O) ביחס המטוס הדמיה; שימו לב החריצים בתא אוריינטציה longitudinally, למשל. (B) שדה בהיר נוף של קטע רקמה בעלת חתך רוחבי, התא מיושר עם המטוס הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פילוח הנתונים מיקרוסקופ אלקטרונים. תמונת מצב של פילוח ידנית של המיטוכונדריה בעזרת הכלי sculpt (A). (B) A תצוגת תלת-ממד של השלם מחולקים באופן ידני המיטוכונדריה myofibrils (במגוון צבעים), sarcolemma (בורוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: המרת תמונה בינארי בערימות תלת-ממדית tetrahedral. (A-C) מסכות בינארי של sarcolemma, myofibrils המיטוכונדריה, בהתאמה. (ד) ממוזג להציג המסכות בינארי של myofibrils (באדום), המיטוכונדריה (בירוק). (E) נציג tetrahedral רשת שנוצר מן אוסף התמונות ב- (D) באמצעות iso2mesh. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: CardiacCellMeshGenerator. תצלום מסך של ממשק משתמש גרפי המלווה פרסום פרוטוקול זה עבור משתמשים לבצע שלבים 4 ו- 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: הדמיית התפלגות אשכול RyR מציאותית על גבי ערימת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים מקוטע ultrastructure לב. (א) A בינארי אוסף תמונות המתארות את הפערים בין myofibrils המיטוכונדריה, אשר מייצגים את קבוצת כל הפיקסלים שבו תימצא RyR אשכולות. (B) תלת-ממד עיבוד (תמונה לא נמשכת אל קנה מידה) של אחד RyR מדומה אשכול הפצות (מוצג כדורים אדומים) בתוך הגיאומטריה 3D מתואר במחסנית תמונה תלת-ממדית; משטחים ירוקים מייצגים במיטוכונדריה אוסף התמונות. (ג) A גבוהה יותר-הגדלה (ולכן רק חלק קטן הוא לגזור חתך הרוחב תא-הגבולות) תצוגה הכיסוי של RyR אשכולות משלב 4 ורשתות חישובית משלב 3 על פרוסה אחת של אוסף התמונות של טומוגרפיה אלקטרון תלת-ממד. (B) ו- (ג) שונו מ נגה תדמר ואח. 18 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: התפוצה המרחבית של צפיפות המספרי של אשכולות RyR משלוש מדומה RyR אשכול דפוסי. כל צמתי רשת הם צבע מקודד לבן צפיפות המספרי של RyR 0.0 אשכולות/מיקרומטר3 לאדום עבור צפיפות מספרי מרבי של 0.99 RyR אשכולות/מיקרומטר3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: הטרוגניות המרחבי ב [Ca2 +]i בשלב העולה של Ca2 + והחולף. (א) הממוצע cytosolic בחופשיות לשדר [Ca2 +]אני (משמאל) ו- Fluo-4 מאוגד Ca2 +, [F4Ca]אני (מימין). (B) ו- (ג) להראות תמונות בצילום מואץ של בחופשיות לשדר Ca2 + ו- F4Ca-z-הדיסק, מישור רוחבי; חצים שחורים לסמן אזורים גבוהים [Ca2 +]אני בשל התקבצות מיטוכונדריאלי; חצים אדומים מסמנים מחוזות גבוהה [Ca2 +]i עקב מספר אשכולות RyR בסמיכות. (ג) קו מדומה סריקות של [Ca2 +]אני (האמצעי) [F4Ca]אני (מימין). מיקום קו מוצג על חתך הרוחב תא בצד השמאל. הממד אופקי של חתך הרוחב תא סופק כמחוון של המידה המרחבי ב חתכי רוחב של התמונה. איור זה השתנה מ נגה תדמר ואח. 18 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: התפוצה המרחבית של מטבוליטים, מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית המופקים ההדמיה המרחבי של חילוף החומרים האנרגיה לב. (א) ריכוז החמצן בכל חתך הרוחב תא ביחידות של מיקרומטר, (B) ריכוז של ADP רק בחלק myofibril של התא ביחידות של מיקרומטר. חלוקת מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית על פני מיטוכונדריאלי (C) רשת ביחידות של mV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10: ויזואליזציה של דפוס נקודה אשכול RyR מדומה על החבילה R-סטטיסטיקה- בחלון זה מופיעה בסיום RyR אשכולות הסימולציות, המתארים הראשון של הדפוסים נקודת מדומה. זה יכול לשמש כמחוון כי RyR-הסימולטור הגיע למסקנה באותה מידה, אפשר לחקור את האיכות של הדפוסים מדומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כימיקלים כמויות
0.2 N HCl
1 N HCl 5 מ
מים מזוקקים 20 מ
מלאי מאגר cacodylate של נתרן 0.15 מ'
נתרן cacodylate 32.1 g [3H2O]
0.2 N HCl 25 מ
לפצות 1 ליטר עם מים מזוקקים
pH 7.4
0.3 מלאי מאגר cacodylate של נתרן M
נתרן cacodylate 64.2 g [3H2O]
0.2 N HCl 25 מ
לפצות 1 ליטר עם מים מזוקקים
pH 7.4
Tyrode תמיסה הרכב
NaCl מ מ 139
אשלגן כלורי 3 מ מ
CaCl2 3 מ מ
MgCl2 1 מ מ
גלוקוז 12 מ מ
NaHCO3 17 מ"מ
Probenecid 1 מ מ
BDM 20 מ מ
פתרון 1 ליטר NaCl/אשלגן כלורי/NaHCO3
NaCl (משקל מולקולרי 58.44 g/mol) 81.2 g
אשלגן כלורי (משקל מולקולרי 74.55 g/mol) 2.24 g
NaHCO3 (משקל מולקולרי 84.01 g/mol) 14.28 g
מתמוססים במים מזוקקים 1 ליטר
פתרון 1 ליטר של2 /CaCl2MgCl
CaCl2 (2H2O) (147 משקל מולקולרי ג'י/mol) 1.764 g
MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) 0.814 g
מתמוססים במים מזוקקים 1 ליטר
1 מ' תמיסת גלוקוז 200 מ
דקסטרוז (משקל מולקולרי 180.16 g/mol) 36.03 g
מתמוססים במים מזוקקים זוגי 200 מ
Tyrode פתרון 500 מ ל פתרון
NaCl/אשלגן כלורי/NaHCO3 50 מ
גלוקוז 6 מ
מים מזוקקים כפול 400 מ
בועה חמצן בתמיסה למשך 5 דקות
2% PFA + 2.5% גלוטראלדהיד +0.2% tanic חומצה מקבע ב- 0.15 מ' נתרן cacodylate
אבקת paraformaldehyde (PFA) דור 2
חומצה tanic 0.2 g
מים מזוקקים 20 מ
25% גלוטראלדהיד 10 מ
0.3 cacodylate נתרן M 20 מ
Cacodylate נתרן 0.15 מ' 50 מ
1 N NaOH 4 g NaOH/100 מ ל מים מזוקקים
4% uranyl אצטט פתרון מניות
Uranyl אצטט 4 g
ליד רותח כפול מים מזוקקים 96 מ"ל
להמיס UA במים ליד-bioling שימוש של בחישה fumehood.
מסנן UA דרך מסנן וטמן #1 לתוך חום 200 מ"ל בבקבוק להגנה אור
. קאפ בחוזקה, תווית, לאחסן ב 4 ° C

טבלה 1: ריאגנטים וכמויות להכנה רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול הנ ל מתאר את השלבים החשובים ליצירת מודל גיאומטרי סופיים הרומן של cardiomyocyte ultrastructure. השיטה מאפשרת פיוז'ן חישובית מיקרוסקופיה שונים (או, באופן עקרוני, נתונים אחרים) שיטות לפיתוח מודל חישובי מקיף יותר של הדינמיקה cardiomyocyte הכולל פרטים של ארכיטקטורה התא מרחבית. אין כרגע שום פרוטוקול אחר זמין ליצור מודל כזה cardiomyocyte.

שלב 1 מתאר פרוטוקול עבור קיבעון זלוף. לחלופין, הלב יכול להיות טוחנות, גזור לחתיכות קטנות יותר, שקוע מקבע. עם זאת, תהליך זה צריך להיעשות במהירות, יכולים להיות מגוונים תוצאות, בהתאם לגודל של הדגימות. בחוויה של המחברים, זלוף מבטיח חדירה יסודי של מקבע רקמות ותאים. המחברים גם בעבר יש perfused את הלב עם פתרון קרבס-Henseliet להפוך את הלב מכות לפני קיבוע. זה זמין מדידות על הלב לעבוד לפני קיבוע.

השלבים. מיקרוסקופ אלקטרונים עיבוד בשלב 2 אופייניות עבור אלקטרון טומוגרפיה ממוחשבת. הכמויות פתרון עיבוד, במיוחד של פתרונות מוכתמים, וכן תזמונים עשויים להיות שונים בעת שימוש הדימות האחרות כגון סידורי-בלוק-פרצוף סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים או ממוקד יון-קרן מיקרוסקופ28. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הנרכש חייב ניתן לחלק את אזורים שונים אברון, כגון המיטוכונדריה, myofibrils בקוריאנית רוחבי. זה יכול להתבצע באופן ידני או באופן אוטומטי. הניגוד באוסף תמונות תלויים גם ההצלחה של פרוטוקול מוכתמים, אך חלק זה הניגוד אובדים בעת ביצוע טומוגרפיה ממוחשבת. פרוטוקול זה מתאר שלבים ידניים ולהפרדת המבנים שונים, למרות שיטות חדשות כדי לבצע פילוח אוטומטי29 תהיה יותר חיובית באופן כללי כדי לשפר את קצב העברת הנתונים.

התכונות החשובות ביותר לבחון ב- dataset מיקרוסקופ אלקטרונים הם תמונות חדות ומבנה לשימור. את המתכון מוכתמים, שרף הטבעה תערובות של פרוטוקול זה היה מעודן לניגודיות גבוהה בין myofibrils, המיטוכונדריה z-דיסקים של התא הלב. לדוגמה, המחברים בעבר השתמשו סידן כלורי במקום חומצה טאנית בשלב 1.2 לתיחום sarcoplasmic הרשת רשתי. זה עזר עם המזהה את הגבולות החיצוניים של חבילות myofibril במהלך אברון פילוח. רכיבים כימיים נוספים מכתימים ושעות עשוי לשמש גם להמחשת מבני ממברנה, כגון sarcoplasmic רשת או בקוריאנית רוחבי-צירית30.

התמונות חייב להיבדק גם עבור השפלה מבנית. עיבוד קיבוע או מיקרוסקופ באיכות ירודה עלולה לגרום אובדן חמור של cristae מיטוכונדריאלי, אחוז גבוה של המיטוכונדריה ונדרש או נפוח, התפוררות חלקים של קרום התא (sarcolemma). בדיקה מקרוב וזהיר עשויה להציג גם אובדן של הכרישים-t ו- SR ממברנות, אבל הם פחות ברורים לעין. פתרונות לבעיה זו כוללים: (i) הבטחת זלוף יסודי; (ii) לנתח את הרקמה לתוך דוגמאות קטנות גם להבטיח חדירה עמוקה של מקבע, כתמים; (iii) להבטיח כי מיקרוסקופ אלקטרונים העיבוד מתבצע בפתרונות קר או על קרח בכל מקום שצוין; (iv) להבטיח התזמונים עבור צביעת והתייבשות (התייבשות בפרט) עוקבים בקפדנות.

Cardiomyocyte טיפוסי הוא ~ 20 מיקרומטר בקוטר בחתך ~ 100 מיקרומטר באורכו. זה הופך תאים בלב שלם הדמיה אתגר משמעותי. יתר על כן, שינוי הכיוון של סיבי השריר בתוך הלב31 עוד יותר מסבך רכישת אמצעי אחסון תמונות שציריה מיושרים עם הצירים רוחביים האורך והרוחב של תא עניין. התמונה ניתוח תוכניות כגון IMOD מאפשרות סינתטי יישור מחדש של הנתונים לתוך כיוון הרצוי. התפתחויות אחרונות פרצוף-בלוק טורי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים28 ותמונה המשויך עיבוד אלגוריתמים29 גם לפתור את הבעיות שהתעוררו. יחד עם זאת, בדיקה של מקטעים עבה תחת מיקרוסקופ אור וכיוון מחדש העוקבים של גוש (שלב 2.5) להגביר את הסבירות של הדמיה תאים עם יישור סבירה של הצירים אורכי, כלי עם ההדמיה צירים. פעולה זו תבטיח כי רוב נפח התאים ייתפס בתוך שדה הראייה.

פרוטוקול שלבים 3, 4 ו-5 דורשים התוכנות המפורטות בטבלה של חומרים להתקנה. IMOD R-סטטיסטיקה החבילה, iso2mesh, פיג'י (גירסה של ImageJ עבור נתונים מיקרוסקופ) יש תיעוד נרחב ומדריכים על איך להשתמש בהם. CardiacCellMeshGenerator הוא יישום MATLAB אשר פותחה כדי להקל על המשתמש לבנות את המודל של זרימת עבודה פשוטה. משתמשים יכולים להוריד את קוד המקור כולו, ואת חבילת היישומים מהקישור github RyR-סימולטור מאגר (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). ניתן להתקין את היישום, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, ב- MATLAB אפליקציה. הקלט עבור הרשת המופקים פרוטוקול זה יכול להימצא בתוך RyR-סימולטור/הקלט-קבצים /-טומו-תא היעד /, תוך תוספת כניסות עבור סימולטור RyR-אשכול להימצא בתוך RyR-סימולטור/הקלט-קבצים/מאסטר-תא /. לפני ביצוע app, משתמשים צריכים לוודא את התיקיה iso2mesh המותקנת ואת תיקיות המשנה שלה נוספו לנתיב MATLAB. באופן דומה, להבטיח כי צורך R-חבילות (טבלה של חומרים) עבור סימולטור אשכול גם הותקנו בתוך R.

ההתקדמות הוא נכלל ב- app בעת יצירת רשת השינוי, בעת יצירת את הקלט עבור סימולטור אשכול RyR, וכאשר מיפוי RyR צפיפויות אשכול על רשת השינוי באמצעות RyR צפיפות ממפה נקודות הקצה; האפליקציה יעבד את תלת-ממדית ב- GUI כאשר השלב רשת דור הגיע למסקנה. לאחר סיום הסימולציות אשכול RyR על ממשק המשתמש של R, יופיע חלון גרפי (איור 10), המתארים את אחד מדומה 3D RyR אשכול נקודת הדפוסים.

לחצן "צור רשת" ב- GUI מפעילה את הפונקציה iso2mesh כדי ליצור רשת tetrahedral. ניתן להתאים את הרזולוציה דגם על-ידי הגדרת הפרמטרים"iso2mesh" ב- GUI זה להתאים את אורך ונפח קצה של רכיב tetrahedral המרבי. התוכנית כרגע מבחין בין היסודות המרכיבים את אזור myofibril ואת האזורים המיטוכונדריה; תכונה זו יורחב לכלול רכיבים אחרים של התא בעתיד.

משתמשים יכולים להשתמש רינדור 3D של רשת השינוי, האשכולות RyR כדי לפתור את השלבים הבאים. RyR אשכול סימולציה, etol וההגדרות numIter, בתוך הגדרות. R להשפיע על הדיוק של הסימולציות אשכול RyR; אלה שני פרמטרים קובעים מתי סימולציה דפוס אשכול RyR מסתיימת. פרמטרים אלה ניתן להתאים בכפוף לבדיקה של ההתפלגות של האשכולות RyR בחלון R (איור 10) כדי להבטיח כי: (א) כל אשכולות קרובים z-דיסקים; ו- (ii) האשכולות מפוזרים כל חתך הרוחב ולא צבירה בכל אזור אחד. אד הוק רגישות ניתוח של הסימולציות לפרמטרים אלה שני יכול להתבצע כדי לקבוע שילוב נכון של etol ו- numIter.

משערך העוצמה הקרנל כדורית בשלב 5 משתמש כדור של קוטר שבחרת גרעין, אשר היא עברה את עוצמת הקול של הריבית (הדגם המרחבי התלת-ממדי בהקשר זה). פרמטרים אלה ניתן להתאים לזה החלקת אלגוריתם ב- GUI באיור5: r_sphere (1) מגדיר את הרדיוס של הקרנל כדורית החלקה; (2) hval מגדיר את גודל צעד המרחבי איטרטיבי שבמהלכן הקרנל כדורית חייבים להיות iteratively מועברים על אמצעי האחסון.

גישה פשוטה כדי לקבוע הפרמטרים הצפיפות המרחבי מספיקים היא לבחון את חלוקת RyR אשכול צפיפות הערכים כפי שמוצג באיור 7. ערכי צפיפות יופצו כך השכונה של ערכי דחיסות גבוהה היא בגודל דומה לגודל של אשכול RyR בנתוני מיקרוסקופ.

בפרוטוקול הנוכחי מייצרת מודל סופיים מכיל רק חלוקת myofibrils, המיטוכונדריה ואשכולות RyR מציאותי. הרחבה שלב זה יהיה כדי לדמות את ההפצה של ערוצים אחרים-יון זה לשחק תפקיד ECC, כגון משאבות סידן רשתי sarco-endoplasmic (SERCA2a), נתרן סידן מחליפי (NCX) את המשאבות sarcolemmal סידן. המפתח הרחבות אלה הוא ניתוח של התפוצה המרחבית של תעלות היונים מנתונים immunofluorescence. למשל, NCX ערוצי נמדדו יחולקו בצורה אחידה על פני הממברנות t-צינורי-המרווח הממוצע של 0.67 מיקרומטר, אבל את הקשר RyR אשכולות היא לא כל כך ברור32. מצד שני, נוגדנים מיקוד SERCA2a השתמשו בעבר כדי לסמן ה SR33, אך הצפיפות המרחבי של SERCA2a לא דווחה בספרות. לכן, בשלב זה, ייתכן להניח בהתפלגות אחידה של SERCA 2A ברשת SR ו- NCX על t-בקוריאנית בזהירות.

כפי שמתואר בתוצאות נציג, הנובעת סופיים רשת השינוי יכולה לשמש עם סופיים מפענחי34 לחקות תהליכים ביוכימיים כגון סידן איתות18 ו ביואנרגיה27 בתור ריאקציה-דיפוזיה תהליכים. לשם כך, תעלות יונים מיוצגים כאתרי התגובה על צמתי הטופולוגיה רשת. האתרים התגובה לשמש מקורות או כיורים ממינים כימיים שונים כדי לייצג את הזרימה של צורון כימי דרך תעלות יונים אלה לתוך תאים שונים של התא. הפלט רשת וקבצים RyR צפיפות של פרוטוקול זה ניתן להשתמש עם כל אינטגרטור אחרים או בתוך בכל סביבה אחרים, ובלבד התוכנה יש תכונה לזהות אלה קבצי טקסט. קבצי הטקסט יכולים גם להיות מניפולציות על-ידי קבצי script או תוכנת צד שלישי כדי לספק את הדרישות תבנית קובץ הקלט של הסביבה של בחירה. היישום הראשון בדינמיקה סידן רק מדגים את התועלת של מודל זה של upstroke סידן אך זה אינו מציין רשת השינוי, אינם יכולים לשמש עבור פרקי זמן ארוכים יותר. צפיפויות רשת השינוי, אשכול יכול לשמש כדי לדמות מספר מחזורי סידן, עם שמירה על הומאוסטזיס והיציבות תלויה רק solver סופיים המשמש.

מטרה וקהילותיהם היא לשפר את זה צינור של מודל הבניין כדי להקל ליצור מודלים סופיים מדויק מבחינה מבנית של cardiomyocytes ואת סוגי תאים אחרים. אלגוריתם פילוח אוטומטיות פותחה לאחרונה, אשר ניתן ליישם סדרתי-בלוק-הפנים נתונים מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה של cardiomyocytes כדי ליצור מודל של ההתפלגות myofibrils של המיטוכונדריה בתא כולו עם המשתמש מינימלי קלט29. שיטה זו יורחב כדי לחלק את t-צנורית ורשתות ממברנה SR בעתיד. גירסה כללית יותר של האלגוריתם RyR-סימולטור שיאפשרו למשתמשים לנתח, לדמות מיקומי שיתוף בין תעלת יונים organelles, כמו גם בין סוגים שונים של תעלת יונים, אופנה תפוקה גבוהה הוא גם תחת פיתוח. פרוטוקול חלקה לבניית מודל שלם של התא תאפשר למדענים לבצע בדיקות מבוססות השערות על הקשר בין התא מבנה ותפקוד התא יותר באופן שגרתי ממה שאפשרי כיום עם גישות ניסיוניות לבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי את המלוכה בחברה של ניו זילנד מרסדן מהר להתחיל גרנט 11-UOA-184, המענק האנושי גבולות המדע תוכנית מחקר RGP0027 2013, את אוסטרליה מחקר המועצה גילוי פרוייקט גרנט DP170101358.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2393
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405
Dextrose Sigma-Aldrich D9434
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) Merck 354400-500ML
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Tannic Acid Sigma-Aldrich 403040-500G 100g EM grade
Sodium cacodylate Sigma-Aldrich C0250
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4593
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 75632-10ML 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available)
Uranyl Acetate EM Sciences 22400 25g bottle
Potassium Ferrocyanide Merck Millipore 104973
Toluene blue Sigma-Aldrich T3260
Borax Sigma-Aldrich S9640 also termed sodium borate
Ethanol Sigma-Aldrich 792780 Diluted to different percentages with pure water
Acetone EM Sciences RT10017
Resin kit EM Sciences 14040 ACM Durcupan works well
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H9892 1Normal solution
Equipment
Ultramicrotome Leica EM UC7
Transmission electron microscope ThermoFisher Scientific Tecnai F30 http://www.leica-microsystems.com/
Retort stand Proscitech T752
Tubing BioStrategy 75831-346 for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential
Stopcocks SDR QP13813 for langendorff tubing; product is only an example, user can select any
retort stand clamps Proscitech T715
Plastic syringes SDR QPC1108 for solutions on langendorff apparatus
Cannulation silk suture, 7-0 TeleFlex 15B051000 for tieing heart on langedorff apparatus
Cannula Made from 3 mm outer-diameter steel needle
Rubber petri dish mat Proscitech H068 for use as cutting board during fixed-heart dissection
Razor blades Proscitech L056 for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing
Glass bottles BioStrategy 89000-236 for storing solutions during tissue fixation and processing for EM
Beakers BioStrategy 213-0477 for storing solutions temporarily and during perfusion
Scintillation vials BioStrategy 548-2170 for tissue samples during EM processing
Dissection kit Proscitech T161 for animal dissection
Syringe Filters Proscitech WS3-02225S for purification of Uranyl Acetate
Aluminium/silver foil baking cups From any baking products store
Dupont Diamond knife BioStrategy 102680-780 35 degree angle version produces best sections.
Colloidal Gold BBI Solutions EM. GC15 15 nm colloidal gold
EM mesh grids Proscitech GCU150 a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example
Plastic disposal pippettes Proscitech LCH20 best to use plastic disposables especially when working with resin
Software
SerialEM University of Boulder tomography acquisition
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD University of Boulder image alignment and segmentation
iso2mesh available at http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji or similar image processing software ImageJ Fiji is Just Image J available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks
RyR-Simulator codes/data CellSMB group available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGenerator CellSMB group comes with RyR-Simulator under folder "gui-version"
R-statistics software R-project Download from https://www.r-project.org
spatstat R-project install via R program
rgl R-project install via R program
doparallel R-project install via R program
foreach R-project install via R program
doSNOW R-project install via R program
iterators R-project install via R program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Tags

בביו-הנדסה בעיה 134 Cardiomyocyte ultrastructure הלב מיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופיה קונפוקלית דגמי חישובית דגמי סופיים ביולוגיה מערכתית סידן איתות המיטוכונדריה ביואנרגיה
יצירת מודל גיאומטרי מבנית מציאותי סופיים של Cardiomyocyte ללמוד את התפקיד של אדריכלות הסלולר Cardiomyocyte במערכות ביולוגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajagopal, V., Bass, G., Ghosh, S.,… More

Rajagopal, V., Bass, G., Ghosh, S., Hunt, H., Walker, C., Hanssen, E., Crampin, E., Soeller, C. Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology. J. Vis. Exp. (134), e56817, doi:10.3791/56817 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter