Summary
Questo protocollo descrive un nuovo metodo per creare un modello ad elementi finiti spazialmente dettagliate dell'architettura intracellulare dei cardiomiociti da microscopia elettronica e immagini di microscopia confocale. Il potere di questo modello spazialmente dettagliato è dimostrato mediante studi di caso nella segnalazione di calcio e bioenergetica.
Abstract
Con l'avvento di tridimensionale (3D) tecnologie di imaging come la tomografia elettronica, serial-blocco-faccia microscopia elettronica e confocale, la comunità scientifica ha accesso senza precedenti a DataSet di grandi dimensioni alle sub-micrometriche risoluzione che caratterizzano la ristrutturazione architettonica che accompagna i cambiamenti nella funzione del cardiomyocyte nella salute e nella malattia. Tuttavia, tali set di dati sono state sotto-utilizzate per investigare il ruolo dell'architettura cellulare che ritocca in funzione dei cardiomiociti. Lo scopo del presente protocollo è illustrato come creare un modello ad elementi finiti accurata di un cardiomyocyte usando microscopia elettronica ad alta risoluzione e immagini di microscopia confocale. Un dettagliato e preciso modello di architettura cellulare ha un potenziale significativo per fornire nuove intuizioni del cardiomyocyte biologia, più di esperimenti da solo possono raccogliere. La potenza di questo metodo risiede nella sua capacità di fondere computazionalmente informazioni da due diverse modalità di imaging di cardiomyocyte ultrastruttura di sviluppare un modello unificato e dettagliato dei cardiomiociti. Questo protocollo viene descritta la procedura per integrare tomografia elettronica e immagini di microscopia confocal di adulto maschi cardiomiociti di ratto Wistar (nome per una specifica razza di ratto dell'albino) per sviluppare un modello agli elementi finiti emisarcomero del cardiomyocyte. La procedura genera un modello 3D agli elementi finiti che contiene una rappresentazione accurata, ad alta risoluzione (dell'ordine di ~ 35 nm) della distribuzione dei mitocondri, miofibrille e cluster di recettore rianodinico che rilasciano il calcio necessario per cardiomyocyte contrazione della rete reticolare sarcoplasmatico (SR) nella miofibrilla e vano citosolico. Il modello generato qui come un'illustrazione non incorporare dettagli dell'architettura tubulo trasverso o la rete reticolare sarcoplasmatica ed è quindi un modello minimo dei cardiomiociti. Tuttavia, il modello può essere applicato già nelle indagini basate su simulazione nel ruolo della struttura cellulare in bioenergetica mitocondriale e segnalazione del calcio, che è illustrato e discusso con due studi di casi che vengono presentati seguendo le protocollo dettagliato.
Introduction
Accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) nel cuore si riferisce all'importante e intricato di accoppiamento tra eccitazione elettrica della membrana dei cardiomiociti e la successiva contrazione meccanica della cella durante ogni battito cardiaco. Modelli matematici hanno giocato un ruolo chiave nello sviluppo di una comprensione quantitativa dei processi biochimici interconnessi che regolano il potenziale d'azione1, il calcio citosolico segnalazione2, bioenergetica3e successive generazione di forza contrattile. Tali modelli hanno predetto con successo anche le modifiche per il battito cardiaco quando uno o più di questi processi biochimici subiscono alterazioni4,5. L'ultrastruttura altamente organizzato del cardiomyocyte sempre più è stato riconosciuto un ruolo critico nella funzione contrattile normale della cellula e tutto il cuore. Infatti, si verificano modifiche alla morfologia e organizzazione delle componenti della ultrastruttura cardiaca in parallelo ai cambiamenti biochimici in termini di malattia quali ipertrofia6, insufficienza cardiaca7e8di cardiomiopatia diabetica. Se questi cambiamenti strutturali sono minori, adattive o patologiche risposte al mutare le condizioni biochimiche è ancora in gran parte sconosciuto9. L'accoppiamento intrinsecamente stretto tra forma e funzione in biologia significa che gli studi sperimentali da solo non possono fornire più profonde intuizioni di correlazioni tra rimodellamento strutturale e funzione dei cardiomiociti. Una nuova generazione di modelli matematici che possono integrare l'assemblea strutturale dei componenti sub-cellulari, insieme con i processi biochimici ben studiati, sono necessari per sviluppare una comprensione completa, quantitativa del rapporto tra struttura, biochimica e forza contrattile in cardiomiociti. Questo protocollo descrive i metodi che possono essere utilizzati per generare modelli agli elementi finiti strutturalmente accurati dei cardiomiociti che possono essere utilizzati per tali indagini.
L'ultimo decennio ha visto progressi significativi nella microscopia 3D10, confocale11e di microscopia di Super-risoluzione12 che forniscono approfondimenti senza precedenti, ad alta risoluzione nell'assembly su scala nano e micro-scala della componenti sub-cellulari del del cardiomyocyte. Recentemente, questi set di dati sono stati utilizzati per generare modelli computazionali di cardiomyocyte ultrastruttura13,14,15,16. Questi modelli utilizzano un metodo di simulazione ingegneria ben consolidata, chiamato il metodo agli elementi finiti17, per creare elementi finiti reticoli computazionali su cui processi biochimici e del cardiomyocyte contrazioni possono essere simulate. Tuttavia, questi modelli sono limitati dalla risoluzione e dettaglio che può fornire un metodo di microscopia in un set di dati di immagine. Ad esempio, la microscopia elettronica in grado di generare nanometro-livello dettaglio della struttura cellulare, ma è difficile identificare proteine specifiche all'interno dell'immagine che sarebbe necessario per creare un modello. D'altra parte, microscopia ottica super-risoluzione in grado di fornire immagini ad alto contrasto a risoluzioni dell'ordine di 50 nm di solo un selezionare alcuni componenti molecolari della cellula. Solo integrando le informazioni complementari da queste modalità di imaging si può realisticamente esplorare la sensibilità della funzione cambiamenti nella struttura. Correlativo luce e microscopia elettronica non è ancora una procedura di routine e ne deriverebbe ancora la limitazione che solo un numero limitato di componenti potrebbe essere macchiato nella visualizzazione immunofluorescenza e correlato con la vista di microscopia elettronica.
Questo protocollo presenta un nuovo approccio18 che utilizza metodi statistici19 per analizzare e computazionalmente fusibile microscopia chiara informazioni sulla distribuzione spaziale dei canali ionici con microscopia elettronica informazioni su altri cardiaco componenti, ultrastruttura, quali miofibrille e mitocondri. Questo produce un modello agli elementi finiti che può essere utilizzato con modelli biofisici di processi biochimici per studiare il ruolo dell'organizzazione subcellulare dei cardiomiociti sui processi biochimici che regolano la contrazione dei cardiomiociti. Ad esempio, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per creare modelli da sano e miociti cardiaci diabetici streptozotocin-indotti per studiare l'effetto di rimodellamento strutturale sulla funzione delle cellule cardiache che è osservata in animali diabetici modelli8. Un ulteriore vantaggio della natura statistica del metodo presentato è illustrato anche nel protocollo: il metodo può generare più istanze di geometrie di elementi finiti che imitano molto attentamente le variazioni sperimentalmente osservate nella struttura delle cellule.
Come una panoramica, la procedura di protocollo comprende: (i) preparazione del tessuto cardiaco per microscopia elettronica generare immagini 3D con sufficiente risoluzione e contrasto; (ii) ricostruzione e segmentazione delle serie di immagini 3D da microscopia elettronica dati utilizzando una ricostruzione 3D di microscopia elettronica e software di analisi di immagine denominato IMOD20; (iii) utilizzando iso2mesh21 per generare una mesh di elementi finiti utilizzando i dati segmentati come input; (iv) utilizzando l'algoritmo romanzo e codici per mappare la distribuzione dei canali ionici sulla maglia di elementi finiti.
La premessa dell'approccio ad ogni passaggio è descritto all'interno del protocollo e risultati rappresentativi sono previste le figure di accompagnamento. Una panoramica è delineata che specifica come i modelli spazialmente dettagliati generati possono essere utilizzati per studiare la dinamica spaziale di calcio durante ECC, nonché bioenergetiche mitocondriali. Alcune delle attuali limitazioni del protocollo sono discusse, così come nuovi sviluppi che sono in corso per superarli e promuovere una comprensione quantitativa del ruolo della struttura cellulare di biologia dei sistemi cardiaco. Si rivolge anche come questi metodi potrebbero essere generalizzati per creare modelli ad elementi finiti di altri tipi cellulari.
Gli utenti del presente protocollo possono saltare la fase 1 e la parte di ricostruzione del passaggio 2 se hanno accesso a una serie di immagini di microscopia elettronica pre-esistenti. Gli utenti che intendono acquisire i loro dati in collaborazione con più esperti microscopisti dell'elettrone potrebbero desiderare discutere e confrontare la fissazione e colorazione procedure nel passaggio 1 con l'esperto per determinare un protocollo ottimale per l'acquisizione.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'Università di Auckland animale comitato etico Comitato uso, dove è stato originariamente sviluppato il protocollo di tessuto e University of California San Diego istituzionali cura degli animali.
1. preparazione sperimentale
- Preparare soluzioni di riserva di sodio 0,15 M e 0,3 M cacodylate buffer a pH 7.4 secondo la tabella 1.
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Preparare il fissativo di glutaraldeide (glutaraldeide 2,5% + 2% paraformaldeide (PFA) + acido tannico 0,2% in tampone di cacodilato di sodio 0,15 M a pH 7.4) utilizzando componenti elencati nella tabella 1.
- Sciogliere 2 g di polvere PFA in 20 mL di acqua distillata a 60 ° C su una piastra riscaldante con agitazione costante.
- Aggiungere la soluzione di NaOH 1 M fino a quando la soluzione è limpida.
- Attendere che la temperatura della soluzione è inferiore a 40 ° C, quindi aggiungere 10 mL di glutaraldeide e 20 mL di 0,3 M sodio cacodilato.
- Aggiungere 0,2 g di acido tannico e scioglierlo nella soluzione.
- Aggiungere 50 mL di 0.15 M sodio cacodilato.
- Negozio tre o quattro flaconcini di scintillazione 20 mL di fissativo in frigorifero a 4 ° C, o il ghiaccio se utilizzati nello stesso giorno.
- Preparare la soluzione di Tyrode con 20 mM 2,3-butanedione monoxime (BDM), secondo la ricetta in tabella 1.
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Costruire un apparato di Langendorff all'interno di una cappa.
- Fissare due provette di siringa in plastica 100 mL a due differenti storta stand, circa 70 cm di altezza dalla base del supporto.
- Collegare i tubi di plastica siringa e un tubo connettore utilizzando 3 mm di diametro interno della tubazione e un rubinetto a tre vie come illustrato nella Figura 1.
- Inserire una cannula di diametro esterno di 3 mm verso il basso del connettore della tubazione, dove il cuore sarà legato per la fissazione di aspersione.
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Riempire i tubi siringa con soluzione di Tyrode e fissativi soluzioni a 37 ° C.
- Rimuovere le bolle d'aria all'interno della tubazione passando le soluzioni siringa attraverso di loro.
2. acquisire dati di microscopia elettronica dell'ultrastruttura dei cardiomiociti
- Preparare l'animale per l'asportazione e la fissazione chimica del cuore.
Nota: Questo protocollo descritti i passaggi per elaborare adulto maschio tessuto cardiaco di Wistar (nome per una specifica razza di ratto dell'albino) del ratto. Il protocollo può richiedere modifiche quando il tessuto cardiaco è di provenienza da altre specie.- Anestetizzare l'animale trattando il ratto (200-250 g di peso corporeo) con 0,5 mL di eparina di U/mL 250 tramite l'iniezione intraperitoneale. Attendere 10 minuti, poi trattare il topo con l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (210 mg/kg di peso corporeo).
- Confermare un adeguato grado di anestesia testando il riflesso di pizzico di punta.
- Eutanasia animale di dislocazione cervicale.
- Raccolto il cuore utilizzando procedure di dissezione simili agli articoli precedentemente pubblicati di Giove22,23, poi metterlo in soluzione salina ghiacciata.
- Isolare l'aorta ascendente e incannulare. Assicurarsi che la punta della cannula si trova appena sopra la valvola semilunare, dove si diramano le arterie coronarie. Legare un filo strettamente intorno all'aorta ascendente.
- Collegare la cannula per l'apparato di Langendorff gravità operato a ~ 70 cm sopra la base del sistema (Figura 1).
- Ruotare il rubinetto sul sistema Langendorff per irrorare il cuore con soluzione di Tyrode, tra cui 20 mM BDM (un inibitore di miosina) per 2-3 min.
- Ruotare il rubinetto per iniziare l'aspersione con fissativo del paraformaldeide al 2%, 2,5% glutaraldeide e acido tannico 0,2% a 0,15 M sodio cacodilato a 37 ° C per 10 min. In caso di successo, il cuore sarà girare il colore marrone chiaro e diventano duri e gommosi.
- Utilizzando una lama di rasoio, sezionare i blocchi di tessuto da parete libera (laterale) ventricolare sinistra e ottenere tessuto blocca circa 1 mm3 dimensioni.
- Conservare i campioni in flaconi di scintillazione pre-raffreddata 20 mL di fissativo stesso sul ghiaccio per 2 h. conservare i campioni come molti possibili nelle fiale e assicurano che i campioni sono immersa nella soluzione.
Attenzione: È importante mantenere i campioni freddo fino a dopo il passaggio di disidratazione 100% qui sotto.
- Ulteriore la fissazione e colorazione dei campioni per microscopia elettronica.
- Versare 100 mL di tampone di cacodilato di sodio 0,15 M in un becher di vetro e raffreddarlo sul ghiaccio.
- Preparare volumi uguali di 4% tetrossido di osmio e 0,3 M sodio cacodilato, seguita dall'aggiunta di 0,08 g di ferrocianuro di potassio per ottenere una soluzione di macchia di metalli pesanti che contiene ferrocianuro di potassio 2% a 2% tetrossido di osmio e 0,15 M sodio cacodilato. Raffreddare la soluzione sul ghiaccio.
- Pipettare il fissativo fuori e sostituirlo con abbastanza freddo buffer di cacodilato di sodio 0,15 M per immergere i campioni nelle fiale. Posizionare le fiale in ghiaccio per 5 min.
- Ripetere il passaggio 2.2.3 altre quattro volte con 0,15 M sodio cacodilato per rimuovere l'eccesso fissativo.
Attenzione: Non utilizzare pipette in vetro perché minuscoli frammenti possono entrare nel campione e possono rovinare coltelli diamante durante il sezionamento blocco di tessuto. È importante per pre-raffreddare tutte le soluzioni sul ghiaccio prima di aggiungerli al campione. È anche importante che il campione rimane coperto dalla soluzione di tutti i tempi (molto brevi periodi di parziale copertura dura non più di pochi secondi possono essere tollerati brevemente durante gli scambi di soluzione). Quando la pulizia o la sostituzione di soluzioni, aggiunge la nuova soluzione rapidamente dopo la rimozione della soluzione precedente. Conservare i flaconcini di scintillazione su ghiaccio tra i lavaggi. Si noti che questo passaggio non è il momento sensibile, i blocchi di tessuto possono essere lavati leggermente più lunghi, se necessario. - Sostituire il tampone cacodilato di sodio con soluzione macchia ghiacciata heavy metal e memorizzarlo sul ghiaccio durante la notte. Assicurarsi che il ferrocianuro è mescolato accuratamente agitando il flacone a mano; la soluzione deve essere nera.
Attenzione: Lavorare nella cappa quando si esegue questo passaggio perché osmio è tossico. - Diluire la soluzione stock acetato (UA) uranile acquosa al 4% (tabella 1) al 2% con volumi uguali di Stock in soluzione UA e doppia acqua distillata e raffreddarlo sul ghiaccio.
- Sostituire il metallo pesante macchia con raffreddato a ghiaccio tampone cacodilato di sodio 0,15 M e lasciare che il campione Incubare per 5 minuti sul ghiaccio.
- Ripetere il passaggio 2.2.7 quattro volte di più sul ghiaccio per togliersi qualsiasi soluzione di macchia di metalli pesanti in eccesso.
- Sciacquare i campioni quattro volte, con un periodo di attesa di 2 min in mezzo in acqua purificata (bidistillata è sufficiente).
- Sostituire l'acqua purificata con gelido 2% UA e lasciare che il campione Incubare per 60-120 min sul ghiaccio.
- Raffreddare con cinque flaconi di scintillazione 20 mL di etanolo (abbastanza per sommergere campioni) sul ghiaccio che verrà utilizzato nella fase di disidratazione. Sei flaconi hanno percentuali crescenti di etanolo in acqua distillata: 20%, 50%, 70%, 90% e 100%.
- Versare acetone puro in un altro flaconcino da 20 mL scintillazione e fresco su ghiaccio con le fiale di etanolo.
- Sciacquare i campioni in acqua purificata quattro volte con periodi di attesa di 2 minuti sul ghiaccio per lavare UA in eccesso.
- Disidratare i campioni in etanolo.
- Disidratare in serie di etanolo freddo sostituendo successivamente soluzione entro la fiala del campione come segue, sul ghiaccio: etanolo al 20% per 10 min; etanolo al 50% per 10 min; etanolo al 70% per 10 min; etanolo al 90% per 10 min; poi due volte in etanolo 100% per 10 min.
- Campione alla temperatura di transizione sostituendo l'etanolo 100% finale con acetone puro raffreddato e posizionare la fiala del campione su un banco di laboratorio di temperatura ambiente per 10 min.
- Eseguire un lavaggio più di 10 min in acetone puro a temperatura ambiente per rimuovere la condensa che è osservabile all'interno le fiale. Durante l'incubazione, costituiscono le soluzioni di acetone/resina.
- Sostituire l'acetone puro nelle fiale con acetone e resina epossidica resina pura 50: 50 (con proporzioni per componenti di resina epossidica come dichiarato dal costruttore). Utilizzare tutti i componenti dello stesso lotto. Lasciare i flaconi riempiti di resina campione durante la notte su un rotore.
- Incorporare i campioni in resina.
- Sostituire il 50: 50 resina con resina 75% (25% di acetone) e incubare per 3 ore, seguita da ulteriore incubazione/infiltrazione in resina 100% per 4 h a temperatura ambiente.
- Sostituire la resina 100% con resina 100% fresca e lasciare le fiale del campione durante la notte per la più profonda penetrazione della resina in campioni di tessuto.
- Prendere campioni fuori le fiale e metterli in contenitori che sono forno-friendly e hanno una base piatta; alluminio o stagnola d'argento pirottini può essere utilizzata per questo scopo, ad esempio.
- Versare delicatamente (per evitare lo spostamento dei campioni) fresco resina sopra i campioni (campioni così l'incorporamento in resina) e polimerizzare la resina e gli esempi in un forno a 60 ° C per 48 h.
- Ri-orientare blocchi in resina per celle di immagine in sezione trasversale.
- Ottenere 1 µm spessore prova sezioni dai blocchi di resina utilizzando un ultramicrotomo con un coltello di vetro per valutare la cella orientamento24.
- Macchia le sezioni spesse prova per 20 s con 1% toluene blu e 1% borace.
- Esaminare l'orientamento delle cellule muscolari con un microscopio a campo chiaro.
- Base all'orientamento dedotto dalle immagini delle sezioni macchiate prova, ri-orientare longitudinalmente o obliquamente orientato (simile alla Figura 2A) blocchi per garantire che le cellule sono esposte per il coltello di vetro affinché essi sarà tagliati in sezione trasversale (in resina simile a Figura 2B).
- Sezioni di tessuto di immagine usando la tomografia dell'elettrone.
- Ottenere sezioni semi-sottile (~ 300 nm) del tessuto riorientato blocchi usando un diamante coltello e trasferire le sezioni sul rame griglie25.
- Macchia le sezioni spesse con 2% UA e Sato piombo25.
- Applicare particelle di oro colloidale su entrambi i lati delle sezioni25.
- Ottenere il set di singolo o doppio asse inclinazione serie delle immagini proiettate da-70 ° a + 70 °25.
- Utilizzare IMOD20 per ricostruire la serie di immagini 3D (una serie di immagini 2D che forniscono le informazioni 3D di una sezione di tomografia del singolo elettrone) della cella. Questo stack ricostruito verrà segmentato nel passaggio successivo.
3. segmento miofibrille e mitocondri regioni del DataSet di immagini 3D di EM
- Eseguire il programma IMOD "3dmod".
- All'interno dell'interfaccia di utente grafica 3dmod, immettere l'indirizzo dei. "REC" o ".mrc" file che contiene il 3D ricostruito immagine dataset della cella (generato nel passaggio 2.7) nella casella di immissione con l'etichetta "file di immagine:", quindi premere "OK".
- Sotto il menu "File", selezionare il nuovo modello, quindi salvare il file con un nome appropriato utilizzando il "Salva modello"... voce di menu "File".
Nota: Un oggetto in IMOD può contenere un insieme di componenti segmentati che costituiscono il "oggetto". Per impostazione predefinita, un nuovo modello contiene un nuovo oggetto con l'id "#1". - Sotto il menu "Speciale", selezionare "Strumenti di disegno". Verrà aperta una nuova barra degli strumenti simile a quella mostrata in Figura 3A.
Nota: Esistono diversi strumenti che possono essere utilizzati per creare contorni intorno i confini di diversi organelli. Ulteriori informazioni sui modi di utilizzare questi strumenti si trovano nella documentazione IMOD20 . - Scegliere l'opzione "Sculpt" nel menu "Strumenti di disegno" e spostare il mouse sopra alla finestra immagine; apparirà un contorno circolare centrato sul puntatore del mouse.
- Tenendo premuto il pulsante centrale del mouse sopra un mitocondrio (le regioni più scure dei file immagine, come illustrato da delimitazioni con linee di contorno verde nella Figura 3A), trascinare il perimetro del contorno cerchio la forma dei suoi limiti.
- Una volta completata la contornatura del confine mitocondrio, rilasciare il pulsante centrale e ripetere i passaggi 3.6 per ogni mitocondrio nei dati. Ogni contorno sarà automaticamente riconosciuto da IMOD come un nuovo profilo all'interno dell'oggetto stesso.
- Sotto il "Edit | Oggetto "dal menu, selezionare"Nuovo"per creare un nuovo oggetto. Verrà automaticamente aumentare il numero totale di oggetti da uno e assegnare questo numero al nuovo oggetto.
- Ripetere i passaggi da 3.6 e 3.7 per segmentare e salvare miofibrilla contorni.
- Ripetere il punto 3.8, seguita da passo 3.6, per segmentare il bordo della cella.
- Salvare il file di modello sotto il menu "File".
- Eseguire i seguenti comandi in una finestra della riga di comando per convertire ogni oggetto in una maschera di binaria di raggruppamento come illustrato nella Figura 4A-C.
- Estrarre un oggetto specifico dal modello "imodextract oggetto modelfile outputmodelfile" dove "oggetto" è il numero dell'oggetto da estrarre.
- Creare una maschera per quell'oggetto: imodmop-maschera 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
- Convertire il file in una pila di tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. creare una Mesh di elementi finiti dai componenti segmentati
- Iso2mesh è un programma MATLAB liberamente disponibile per convertire pile di immagine TIFF in mesh di elementi finiti tetraedrici volumetrica. Scaricare e aggiungere iso2mesh al percorso MATLAB da iso2mesh.sourceforge.net.
- Scaricare i codici sorgente e dati per simulare i cluster di RyR sulla mesh dal https://github.com/CellSMB/RyR-simulator sito Web github.
- Avviare l'applicazione CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figura 5).
- Caricare le maschere di componente di diversi organelli in MATLAB tramite i tre pulsanti sul lato superiore sinistro della GUI.
- Creare un altro stack di immagine binaria che delimita le lacune tra le miofibrille e mitocondri come mostrato in Figura 6A.
- Aprire ImageJ.
- Utilizzando il File | Aprire la finestra di dialogo, caricare le pile tiff miofibrille e mitocondri nel programma.
- Avviare il plugin di aggiunta immagine selezionando "processo | Calculator Plus ".
- Selezionare la serie di immagini di miofibrilla come i1, i mitocondri immagine stack come i2 e scegliere l'operatore "Add". Fare clic su "OK".
- Dopo un nuovo stack di immagine che rappresenta il risultato di 4.5.4 viene visualizzata, selezionare "Edit | Inverti"per produrre una serie di immagini simile alla Figura 6A.
- Caricare il file contenente lo stack di immagine binaria dei divari tra le miofibrille e mitocondri premendo il pulsante "RyRGapsFile" sul programma CardiacCellMeshGenerator.
- Spingere "Generare Mesh" sulla GUI. Ciò attiverà il v2m di comando iso2mesh con l'opzione 'cgalmesh' per generare una mesh tetraedrica simile a Figura 4E. Tre file sarà emesso alla fine di questo passaggio: un file di .ele, un file 48x48 e un file .node che conterrà l'elenco di nodi che costituiscono gli elementi, i nodi che compongono i volti e le coordinate dei nodi , rispettivamente.
5. matematicamente mappa la densità spazialmente variabile dei canali ionici di interesse sulla maglia di elementi finiti.
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Generare gli input necessari per il simulatore di RyR premendo il pulsante etichettato ingressi di generare RyR-simulatore sulla GUI.
Nota: Il pulsante si innescherà una funzione generateRyRsimulatorInputs.m, che utilizza le seguenti informazioni dal passaggio 4 per generare gli ingressi:
(1) outDir: il percorso al file di output che sono necessari per la simulazione di cluster di RyR.
(2) imres: la risoluzione in pixel nelle tre direzioni degli stack di immagine.
(3) myofibril_file: il file contenente lo stack di immagine binaria come quella mostrata nella Figura 4B.
(4) sarcolemma_file: il file contenente lo stack di immagine binaria come quella mostrata nella Figura 4A.
(5) ryrgaps_file: il file contenente lo stack di immagine binaria come quella mostrata nella Figura 5A.- Dopo questa funzione viene eseguita, controllare che i seguenti file sono stati creati all'interno della directory specificata come percorso outDir:
- d_axial_micron.txt, che rappresenta la distanza assiale tra la posizione del z-disco e il resto dei pixel nello stack di immagine.
- d_radial_micron.txt, che rappresenta la distanza euclidea (escluse la componente assiale) da ciascun pixel nell'insieme delle possibili sedi di cluster di RyR ai pixel sul piano z-disco.
- W_micron.txt, che rappresenta l'elenco delle coordinate spaziali di tutte le posizioni disponibili per cluster di RyR per essere presenti.
- I restanti 3 file nella cartella contengono il suffisso "_pixel" piuttosto che "_micron" per indicare che i valori all'interno di questi file sono stati scritti in forma coordinata di pixel.
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Simulare distribuzioni di cluster di RyR nello stack di immagine binaria di miofibrille.
- Premere il pulsante etichettato "Open RyR-simulator in R" per avviare il programma di R.
- Sulla R-gui, selezionare "File | Open"e trovare il file"impostazioni. R"all'interno del pacchetto di RyR-Simulator (RyR-simulatore/origine/impostazioni. R).
- Anche aprire il file ryr-simulatore-parallelo. R (che si trova in RyR-simulatore/origine/ryr-simulatore-parallelo. R). ambienti come Rstudio (https://www.rstudio.com) o una semplice interfaccia a riga di comando può essere utilizzata, ad esempio utilizzando il comando R64 in una finestra di shell o di comando.
- Modificare i parametri nelle impostazioni. File R come dettagliato qui sotto:
- Impostare l'indirizzo della cartella che contiene i file elencati in 5.1.2 per una serie di immagini confocal sperimentalmente acquisito dei cluster di RyR e miofibrille Path2.
Nota: Il github repository cartella input-file/master cella / contiene già i file che sono stati generati per una serie di immagini raccolte in precedenza. - Impostare Path4 su un indirizzo della cartella dove vengono memorizzati i file che sono stati generati nel passaggio 5.1.2.
- Impostare punto di Path3 in una cartella dove l'utente vuole che le posizioni di cluster di RyR simulate per essere salvati.
- Insieme N per il numero di cluster di RyR per essere simulate nel modello (in genere nell'intervallo di 200-300).
- Impostare etol, una tolleranza che fissa, per la differenza tra la distribuzione spaziale misurata sperimentalmente di RyR cluster e la distribuzione spaziale del modello simulato di cluster di RyR.
- Impostare numIter per limitare il numero di tentativi che il simulatore di RyR dovrebbe prendere per trovare un modello di cluster di RyR simulato che soddisfa il valore etol.
Nota: I valori per etol e numIter impostati ai valori tipici all'interno delle impostazioni. File R. - Impostare numPatterns sul numero di diversi modelli di cluster di RyR che l'utente vuole simulare (in genere, è utile pratica simulando 99 pattern per confidenza statistica).
- Impostare numCores per consentire l'utilizzo di più thread della CPU (Core) per l'elaborazione con R per simulare i modelli punto parallela più veloce.
- Impostare l'indirizzo della cartella che contiene i file elencati in 5.1.2 per una serie di immagini confocal sperimentalmente acquisito dei cluster di RyR e miofibrille Path2.
- Verificare che i seguenti pacchetti sono installati utilizzando il pacchetto di installazione gui in r: neve, doSNOW, doparallel, foreach, iteratori e rgl.
- Eseguire il simulatore inserendo il seguente comando nella finestra di comando R: origine (' percorso di ryr-simulatore-parallelo. R', chdir = TRUE)
Nota: L'output del programma RyR-Simulator è un elenco di file. txt (verrà generato un file di numPatterns) che contengono gli elenchi delle coordinate in N righe e 3 colonne, che rappresentano la x, y e le coordinate z della N simulato cluster di RyR.
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Mappa luoghi come densità spaziale su un modello computazionale utilizzando il CardiacCellMeshGenerator.
- Selezionando il pulsante etichettato "Selezionare RyR punti file", scegliere un file di testo di RyR cluster distribuzione simulato da quelli che sono stati di uscita dal RyR-simulatore.
- Eseguire "RyR densità Mapper" sulla GUI in MATLAB. Questo mapperà le posizioni spaziali dei glomeruli di RyR simulati nel file txt nel passaggio 5.3.1 sulla maglia di elementi finiti che è stata generata nel passaggio 4.8 utilizzando un metodo chiamato un kernel sferica intensità stimatore metodo26.
Nota: L'output di questo passaggio è un file con estensione txt che contiene un elenco di valori per la densità numerica del canale ionico per unità di volume sferico a ciascuno dei nodi della mesh computazionale.
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Representative Results
Figura 2 e Figura 7 fornire risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave in questo protocollo: (i) visualizzare e riorientare i blocchi di tessuto per le viste di sezione trasversale di microscopia elettronica; (ii) generando una serie di immagini di microscopia 3D; (iii) segmentazione ultrastruttura sub-cellulare per organelli di interesse; (iv) generazione di una mesh di elementi finiti utilizzando iso2mesh; (v) che simula una realistica distribuzione di cluster di RyR sulla mesh; (vi) seguita da mappatura questa distribuzione spaziale come una densità spaziale sopra la maglia computazionale.
Figura 2 Visualizza campo luminoso tipico immagini che mostrano come le cellule appaiono quando orientato longitudinalmente (Figura 2A, etichettati L), obliquamente (Figura 2A, etichettati O) e sezione trasversale (Figura 2B) rispetto ai piano di taglio. I campioni obliqui e longitudinalmente orientati mostrare striature, mentre campioni orientati trasversalmente non presentano striature. I capillari appaiono anche più circolari nelle viste di sezione trasversale rispetto a viste oblique.
Figura 3A Mostra un'immagine rappresentativa di una pila di tomogramma di buona qualità che possa essere acquistata quando il protocollo di preparazione del tessuto nel passaggio 1 è seguito. Deve prestare attenzione quando si esegue la ricostruzione 3D della serie di inclinazione immagine microscopio. Non corretto rilevamento di particelle di oro colloidale, o la mancanza di sufficienti particelle d'oro può influenzare la qualità — immagine contrasto e immagine messa a fuoco — del tomogramma considerevolmente. Questo problema riguarda la capacità di segmentare significativamente diverse strutture. Cura e l'esperienza sono necessarie per garantire che i blocchi di tessuto sono macchiati sufficientemente e che non esiste una distribuzione uniforme delle particelle di oro colloidale attraverso il volume di tessuto. In caso di dubbio, può essere utile consultarsi con un laboratorio specializzato o un impianto presso l'ente locale. Se la generazione del modello viene tentata con basso contrasto o ricostruito in modo non corretto dei dati, modelli possono ancora essere generati ma la corrispondenza dei risultati con le proprietà dei sistemi biologici deve essere simulato di modellazione può essere povera. Figura 3B Mostra un'immagine rappresentativa di quello che sembra un modello segmentato di miofibrille e mitocondri.
Figura 4E Mostra un rendering 3D del reticolo tetraedrico che è prodotto da iso2mesh. Come i compiti dello stack e segmentazione di immagini originali sono di buona qualità, questo passaggio è abbastanza robusto. Figura 6B e Figura 6 Mostra una tipica distribuzione di cluster di RyR (in rosso) all'interno della topologia cellulare 3D. In questa fase, la rete stessa non è l'ingresso nel simulatore RyR. Una serie di immagini del bordo della cella e le lacune tra le miofibrille e mitocondri — generati dalle immagini segmentate in Figura 4 — formano gli ingressi principali nel simulatore di RyR. Cura deve essere presa per segmentare i confini delle miofibrille e mitocondri più accuratamente possibile; segmentazioni inesatte si tradurrebbe in una rappresentazione inesatta della topologia delle cellule nei dati, che saranno di conseguenza influenzano RyR posizionamento all'interno della mesh. Quindi questo potrebbe influenzare le dinamiche spazio-temporali di calcio segnalazione in cardiomiociti (domanda 1).
La figura 7 Mostra 3 istanze di cluster di RyR simulato sulla stessa topologia mesh dopo utilizzando l'algoritmo di stimatore di intensità sferica del kernel. Notare la variazione nell'organizzazione dei cluster di RyR. Queste variazioni sono state misurate per essere all'interno della variabilità che è stata trovata nei dati sperimentali18. Deve prestare attenzione nella scelta del raggio della sfera del kernel e le dimensioni di passaggio in cui il kernel campioni la densità di cluster di RyR. Questi due fattori influenzano come acutamente o diffuso una rappresentazione della densità di cluster di RyR sarà essere raffigurata sulla mesh. Un'analisi dell'effetto di diversi valori per questi parametri vi aiuterà a restringere le scelte di parametro per un ragionevole mesh.
La mesh risultante di cluster di RyR, miofibrille e mitocondri è un modello minimo della struttura dei cardiomiociti. Questa maglia è stata applicata, così come variazioni di esso che sono state derivate da altri dati di struttura cellulare, per studiare la bioenergetica e dinamica del calcio. Una panoramica di queste due applicazioni è descritta di seguito per illustrare la potenza della modellazione agli elementi finiti della struttura cellulare nel dare approfondimenti sulle relazioni struttura-funzione.
Applicazione 1 18 : Spatiotemporal dynamics di calcio rilasciare in cardiomiociti. Questo modello è stato utilizzato per esaminare il ruolo della distribuzione eterogenea dei cluster di RyR, miofibrille e mitocondri su segnalazione del calcio. Figura 8 Mostra la dinamica spazio-temporale di calcio citosolico durante la fase di lievitazione del transitorio quando simulato sulla topologia mesh generata da questo protocollo. Figura 8B Mostra il calcio libero eterogeneo e concentrazione fluorophore-limite-calcio nel corso del tempo. Le frecce puntano a piccole macchie di alto calcio a causa di una maggiore densità di cluster di RyR o mitocondri in quelle regioni. Figura 8 Mostra le immagini di scansione lineare simulato che possono essere paragonati a sperimentale linea-scan immagini della dinamica del calcio che è in genere raccolti usando la microscopia confocal dal vivo. Il modello di simulazione fornisce una maggiore risoluzione vista molto dell'eterogeneità spaziale di calcio rispetto a un'immagine acquisita sperimentalmente. Inoltre, a causa del modello deriva dai dati strutturali microscopia, il numero di cluster che deve rimanere inattivato (~ 4-6) dopo l'attivazione elettrica per eterogeneità si verifichi nell'immagine scansione confocale potrebbe essere determinata con precisione. Eterogeneita ' simili sono stati osservati in linea-scan sperimentalmente acquisite immagini della dinamica del calcio nei modelli animali di infarto18
Applicazione 2 27 : Spatiotemporal dinamica della bioenergetica mitocondriale nei cardiomyocytes. Un obiettivo generale di questo lavoro è quello di studiare la relazione tra la dinamica del calcio, bioenergetiche mitocondriali e contrazione muscolare. Come primo passo, sono state condotte simulazioni di fosforilazione ossidativa mitocondriale in isolamento all'interno del cardiomyocyte. Come tale, la distribuzione di cluster di RyR non è necessario, e una può usare semplicemente la maglia al punto 3.4. Come un'applicazione più complessa, la bioenergetica (domanda 2) potrebbe essere accoppiata con dinamica del calcio (domanda 1) in un modello che utilizza tutte le componenti considerate in mesh e costruzione del modello, vale a dire i mitocondri, miofibrille e rianodina ricevitori.
Figura 9 rappresenta i risultati di queste simulazioni spaziali metabolismo sulle diverse regioni di una mesh generata utilizzando il punto 3.4. Figura 9A raffigura la concentrazione di ossigeno in tutta la sezione trasversale delle cellule, mentre figura 9B Mostra la concentrazione di ADP solo nel vano miofibrilla della cella. Figura 9 illustra la distribuzione di potenziale di membrana mitocondriale attraverso la rete mitocondriale. Queste cifre rivelano la distribuzione non uniforme dei mitocondri e miofibrille nella sezione trasversale delle cellule. Rivelano anche il paesaggio metabolico disomogeneo risultanti da questo ultrastruttura non uniforme. Questo dimostra la potenza dei dati di microscopia basato su simulazioni agli elementi finiti per dando intuizioni sulle relazioni struttura-funzione che altrimenti sono difficili da ottenere attraverso metodi sperimentali da solo.
Figura 1: preparazione di Langendorff del cuore per la fissazione chimica. (A) schema di Langendorff apparecchi di perfusione. Il rubinetto contiene una valvola per passare tra di Tyrode e soluzioni di fissativo. Il bicchiere alla base viene utilizzato per intercettare soluzioni in grado di irrorare attraverso il cuore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esame di orientamento della cella sotto microscopia del campo luminoso. (A) campo luminoso vista di toluene blu macchiato spessore sezione di tessuto cardiaco che illustrano le cellule che sono orientato longitudinalmente (L) e (O) orientato obliquamente rispetto al piano di formazione immagine; Nota le striature nella cella longitudinalmente orientata, per esempio. (B) vista campo luminoso di una sezione di tessuto che ha la sezione trasversale, della cella allineata con il piano di formazione immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: segmentazione dei dati microscopia. (A) Snapshot di segmentazione manuale dei mitocondri utilizzando lo strumento sculpt. (B) una vista 3D dell'intero sistema segmentato manualmente i mitocondri, miofibrille (in una varietà di colori) e sarcolemma (in rosa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: convertire pile di immagine binaria in 3D mesh tetraedriche. (A-C) Maschere di binarie del sarcolemma, miofibrille e mitocondri, rispettivamente. (D) Merged Mostra delle maschere binarie delle miofibrille (in rosso) e dei mitocondri (in verde). (E) maglia tetraedrica rappresentante che è stata generata dallo stack di immagine in (D) utilizzando iso2mesh. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: CardiacCellMeshGenerator. Uno screenshot dell'interfaccia utente grafica che accompagna questa pubblicazione protocollo per agli utenti di eseguire i passaggi 4 e 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: simulazione di una distribuzione di cluster di RyR realistica su uno stack di immagine di microscopia elettronica segmentato di ultrastruttura cardiaca. (A) A stack di immagine binaria raffigurante le lacune tra le miofibrille e mitocondri, che rappresentano l'insieme di tutti i pixel dove potrebbe essere trovato cluster di RyR. (B) un 3D rendering (immagine disegnata non in scala) di uno del RyR simulato del cluster distribuzioni (indicati come sfere rosse) all'interno della geometria 3D raffigurato nello stack di immagine 3D; le superfici verdi rappresentano i mitocondri nello stack di immagine. (C), A più alto-ingrandimento (così una piccola parte è tagliata fuori la sezione trasversale delle cellule ai confini) visualizzazione della sovrapposizione del RyR cluster dal passaggio 4 e la mesh computational dal passaggio 3 su una fetta della serie di immagini di tomografia 3D elettrone. (B) e (C) sono state modificate da Rossi et al. 18 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: distribuzione spaziale della densità numerica dei cluster di RyR da tre simulato modelli di cluster di RyR. Tutti i nodi della mesh sono colorati dal bianco per densità numerica di 0.0 RyR cluster/µm3 al rosso per una massima densità numerica di 0.99 RyR cluster/µm3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Eterogeneità spaziale in [Ca2 +]i durante la fase di lievitazione del transitorio Ca2 + . (A) la media citosolica liberamente diffondere [Ca2 +]i (a sinistra) e Fluo-4 associato Ca2 +, [F4Ca]io (a destra). (B) e (C) mostrano time-lapse istantanee di diffondere liberamente Ca2 + e F4Ca presso il z-disco, piano trasversale; frecce nere contrassegno regioni di alta [Ca2 +]ho dovuto clustering mitocondriale; frecce rosse contrassegno regioni di alta [Ca2 +]i a causa di diversi cluster di RyR nelle immediate vicinanze. (C) Scan line simulato del [Ca2 +]i (centrale) [F4Ca]io (a destra). La posizione di linea è indicata sulle sezioni trasversali delle cellule sulla sinistra. La dimensione orizzontale della sezione trasversale delle cellule è stata fornita come un indicatore della scala spaziale in sezioni trasversali dell'immagine. Questa figura è stata modificata da Rossi et al. 18 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: distribuzione spaziale di metaboliti e di potenziale di membrana mitocondriale generato dalla simulazione spaziale del metabolismo energetico cardiaco. (A) la concentrazione di ossigeno in tutta la sezione trasversale delle cellule nelle unità di µM, (B) concentrazione di ADP solo nella parte di miofibrille della cella in unità di µM. (C) distribuzione del potenziale attraverso il mitocondriale della membrana mitocondriale rete in unità di mV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: visualizzazione di un modello di punto di cluster RyR simulato sul pacchetto R-statistiche. Questa finestra viene visualizzata a conclusione delle simulazioni di cluster di RyR, raffigurante il primo dei modelli punto simulato. Questo può essere utilizzato come un indicatore che ha concluso anche il simulatore di RyR e può interrogare la qualità dei modelli simulati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Prodotti chimici | Quantità |
| 0.2 HCl N | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Acqua distillata | 20 mL |
| 0,15 M sodio cacodilato buffer stock | |
| Sodio cacodilato | 32,1 g [3H2O] |
| 0.2 HCl N | 25 mL |
| Make up 1 L con acqua distillata | |
| pH 7,4 | |
| 0,3 M sodio cacodilato buffer stock | |
| Sodio cacodilato | 64,2 g [3H2O] |
| 0.2 HCl N | 25 mL |
| Make up 1 L con acqua distillata | |
| pH 7,4 | |
| Composizione della soluzione di Tyrode | |
| NaCl | 139 mM |
| HCO | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glucosio | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probenecid | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| Soluzione di NaCl/KCl/NaHCO3 1 L | |
| NaCl (peso molecolare 58,44 g/mol) | 81,2 g |
| KCl (peso molecolare 74.55 g/mol) | 2,24 g |
| NaHCO3 (peso molecolare 84,01 g/mol) | 14,28 g |
| Sciogliere in acqua 1 L di acqua distillata | |
| Soluzione di 1 L di MgCl2/CaCl2 | |
| CaCl2 (2H2O) (peso molecolare 147 g/mol) | 1,764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203,31 g/mol) | 0,814 g |
| Sciogliere in acqua 1 L di acqua distillata | |
| Soluzione 1 M glucosio 200 mL | |
| Destrosio (peso molecolare 180,16 g/mol) | 36,03 g |
| Sciogliere in 200 mL di acqua distillata per doppia | |
| Tyrode soluzione 500 mL soluzione | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glucosio | 6 mL |
| Doppia acqua distillata | 400 mL |
| Ossigeno di bolla in soluzione per 5 min | |
| 2% PFA + 2,5% glutaraldeide + 0,2% tanic acido fissativo in 0,15 M sodio cacodilato | |
| Polvere di paraformaldeide (PFA) | 0% |
| Acido tanic | 0,2 g |
| Acqua distillata | 20 mL |
| 25% glutaraldeide | 10 mL |
| 0,3 M sodio cacodilato | 20 mL |
| 0,15 M sodio cacodilato | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL di acqua distillata |
| 4% acetato di uranile Stock soluzione | |
| Acetato di uranile | 4 g |
| Nei pressi di ebollizione doppia acqua distillata | 96 mL |
| Sciogliere UA in acqua vicino a bioling usando un agitatore in un fumehood. | |
| Filtro UA attraverso un filtro Whatman n. 1 in flacone da 200 mL marrone per protezione dalla luce | |
| Richiudere ermeticamente e label, conservare a 4 ° C | |
Tabella 1: I reagenti e le quantità per la preparazione di tessuti per la microscopia elettronica.
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Discussion
Il protocollo di cui sopra illustra passaggi chiave per generare un modello geometrico del romanzo agli elementi finiti di ultrastruttura dei cardiomiociti. Il metodo consente modalità di fusione computazionale di microscopia diversa (o, in linea di principio, altri dati) sviluppare un modello computazionale più completo della dinamica dei cardiomiociti che include dettagli di architettura spaziale delle cellule. Non esiste attualmente nessun altro protocollo disponibile per creare un modello di un cardiomyocyte.
Passaggio 1 delinea un protocollo per la fissazione di aspersione. In alternativa, il cuore potrebbe essere asportato, sezionato in pezzi più piccoli e immersi nel fissativo. Tuttavia, questo processo deve essere fatto rapidamente e può avere variato risultati, a seconda delle dimensioni dei campioni. Nell'esperienza degli autori, aspersione assicura completa infiltrazione del fissativo nel tessuto e cellule. Gli autori hanno anche tradotto il cuore con soluzione di Krebs-Henseliet a rendere il cuore irrorato del battito prima della fissazione. Questo permesso misure sul cuore di lavoro prima della fissazione.
Le fasi di lavorazione di microscopia elettronica nel passaggio 2 sono tipiche per tomografia elettronica. Le quantità di soluzione di elaborazione, in particolare della macchiatura soluzioni e le temporizzazioni possono differire quando usando altre tecniche di imaging come la serie-blocco-face microscopia elettronica a scansione o focalizzato fascio di ioni microscopia28. Le immagini di microscopia elettronica acquistata devono essere segmentate in regioni diversi organelli, come mitocondri, miofibrille e tubuli trasversali. Questo può essere effettuato manualmente o in modo automatico. Il contrasto nello stack di immagine dipende in parte il successo del protocollo colorazione, ma alcuno di questo contrasto è perso quando si esegue la tomografia. Questo protocollo descrive la procedura manuale per la segmentazione delle diverse strutture, anche se nuovi metodi per eseguire la segmentazione automatica29 sarà più favorevoli in generale per migliorare il throughput di dati.
Le qualità più importanti per esaminare nel dataset microscopia elettronica sono la conservazione di contrasto e struttura di immagine. La ricetta di colorazione e la resina incorporamento miscele in questo protocollo sono stati perfezionati per contrasto elevato tra miofibrille, mitocondri e il z-dischi della cellula cardiaca. Ad esempio, gli autori hanno precedentemente usato cloruro di calcio al posto di acido tannico nel passaggio 1.2 per demarcare la rete reticolare sarcoplasmatica. Questo ci ha aiutato con identificare i confini esterni dei fasci di miofibrille durante la segmentazione dell'organello. Volte e componenti chimici colorazione aggiuntivi possono anche essere utilizzati per visualizzare strutture di membrana, come il reticolo sarcoplasmico o tubuli trasversali-axial30.
Le immagini devono essere esaminate anche per degradazione strutturale. Elaborazione di fissazione o microscopia elettronica di scarsa qualità può causare la perdita severa di cristae mitocondriali, proporzione elevata dei mitocondri sloggiati o gonfiati e disintegrazione delle porzioni della membrana cellulare (sarcolemma). Un esame più vicino e attento può anche mostrare perdita del t-tubolare e membrane di SR, ma sono meno evidente per un occhio non allenato. Le soluzioni a questo problema includono: (i) assicurare approfondita aspersione; (ii) dissezione del tessuto in piccoli campioni che assicurano anche la profonda penetrazione del fissativo e macchie; (iii) garantire che la microscopia elettronica lavorazione avviene in soluzioni a freddo o il ghiaccio ovunque specificato; e (iv) garantire che i tempi per la colorazione e la disidratazione (disidratazione in particolare) sono rigorosamente seguiti.
Un tipico dei cardiomiociti sono ~ 20 µm di diametro a sezione trasversale e ~ 100 µm di lunghezza. Questo rende le cellule del cuore intero imaging una sfida significativa. Inoltre, l'orientamento mutevole delle fibre muscolari all'interno del cuore31 ulteriore complica l'acquisizione di un'immagine volume cui assi sono allineati con gli assi longitudinali e trasversali di una cellula di interesse. Programmi di analisi di immagine quali IMOD abilitare sintetico ri-allineamento dei dati in un orientamento desiderato. Gli avanzamenti recenti in blocco-faccia seriale scansione microscopia elettronica28 e immagine associata l'elaborazione di algoritmi29 anche aiutano a risolvere questi problemi. Tuttavia, l'esame attento delle sezioni spesse sotto un microscopio chiaro e successiva ri-orientamento del blocco (punto 2.5) aumenterà la probabilità di cellule con ragionevole allineamento degli assi longitudinali e trasversali con l'imaging di imaging assi. Questo farà sì che la maggior parte del volume cellulare sarà catturata all'interno del campo visivo.
Passaggi del protocollo 3, 4 e 5 richiedono software elencati in Tabella materiali per essere installato. IMOD, pacchetto R-statistiche, iso2mesh e FiJi (una versione di ImageJ per dati di microscopia) hanno un'ampia documentazione e tutorial su come usarli. CardiacCellMeshGenerator è un'applicazione di MATLAB che è stata sviluppata per rendere più facile per l'utente compilare il modello in un semplice flusso di lavoro. Gli utenti possono scaricare l'intero codice sorgente e il pacchetto dell'applicazione dal link di repository di github RyR-simulator (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). L'applicazione, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, può essere installato in MATLAB come un'app. Gli ingressi per la mesh generata in questo protocollo possono essere trovati all'interno di RyR-simulatore/input-file/destinazione-tomo-cella, mentre gli input aggiuntivi per il simulatore di RyR-cluster può essere trovato all'interno di RyR-simulatore/input file/master-cella /. Prima di avviare l'app, gli utenti dovrebbero assicurarsi che la cartella di iso2mesh installati e relative sottocartelle sono stati aggiunti al percorso di MATLAB. Allo stesso modo, garantire che il necessario R-pacchetti (Tabella materiali) per il simulatore di cluster sono stati installati all'interno di R.
Una barra di avanzamento è stato incluso nell'app durante la generazione della mesh, quando si genera gli ingressi per il simulatore di cluster di RyR e quando il mapping di densità di cluster di RyR sulla mesh utilizzando il mapper di densità di RyR; l'applicazione renderà la mesh 3D nella GUI quando ha concluso il passaggio di generazione di mesh. Dopo aver completato le simulazioni di cluster di RyR nell'interfaccia utente di R, verrà visualizzata una finestra grafica (Figura 10), raffigurante uno dei modelli simulati 3D RyR cluster punto.
Il pulsante "Generare una Mesh" sulla GUI avvia la funzione di iso2mesh per generare una mesh tetraedrica. La risoluzione del modello può essere regolata impostando i parametri di"iso2mesh" sulla GUI che regolare la lunghezza massima dell'elemento tetraedrico di volume e bordo. Il programma distingue attualmente elementi che compongono la regione di miofibrille e le regioni di mitocondri; Questa caratteristica sarà esteso per includere altri componenti della cellula in futuro.
Gli utenti possono utilizzare il rendering 3D di mesh e i cluster di RyR risolvere questi passaggi. Impostazioni di simulazione del cluster RyR, etol e numIter, all'interno di impostazioni. R influiscono sulla precisione delle simulazioni di cluster di RyR; questi due parametri determinano quando termina una simulazione di modello cluster di RyR. Questi parametri possono essere regolati all'ispezione della distribuzione dei cluster di RyR nella finestra R (Figura 10) per garantire che: (i) tutti i cluster si trovano i dischi di z; e (ii) i cluster sono sparsi attraverso l'intera sezione trasversale piuttosto che aggregando in qualsiasi una regione. Un'analisi di sensitività hoc delle simulazioni di questi due parametri possono essere intrapresi per determinare un'appropriata combinazione di etol e numIter.
L'estimatore di intensità sferica del kernel nel passaggio 5 utilizza una sfera di diametro selezionata come un kernel, che viene passato sopra il volume di interesse (il modello spaziale 3D in questo contesto). Questi parametri possono essere regolati per questo arrotondamento algoritmo sulla GUI nella Figura 5: r_sphere (1) definisce il raggio del kernel sferico levigante; (2) hval definisce la dimensione di passaggio spaziale iterativo sopra cui il kernel sferico deve essere passato in modo iterativo sopra il volume.
Un approccio semplice per determinare se i parametri di densità spaziale sono sufficienti è quello di controllare la distribuzione dei valori di densità del cluster di RyR come mostrato nella Figura 7. I valori di densità dovrebbero essere distribuiti in modo che il quartiere di valori ad alta densità è una dimensione simile alla dimensione di un cluster di RyR nei dati di microscopia.
Il protocollo attuale produce un modello agli elementi finiti che contiene solo la distribuzione realistica delle miofibrille, mitocondri e cluster di RyR. Un'estensione di questo passaggio sarebbe per simulare la distribuzione di altri canali ionici che svolgono un ruolo in ECC, quali pompe di reticolo endoplasmatico sarco calcio reticolare (SERCA2a), scambiatore sodio-calcio (NCX) e le pompe di sarcolemmal calcio. La chiave per queste estensioni è un'analisi della distribuzione spaziale delle scanalature dello ione dai dati di immunofluorescenza. Per esempio, canali NCX sono stati misurati per essere distribuito uniformemente sopra le membrane t-tubolare ad una spaziatura media di 0,67 µm, ma il loro rapporto ai cluster di RyR non è così chiaro32. D'altra parte, SERCA2a targeting anticorpi precedentemente sono stati usati per contrassegnare il SR33, ma la densità spaziale di SERCA2a non è stata segnalata nella letteratura. Pertanto, in questa fase, una distribuzione uniforme di SERCA 2A attraverso la rete di SR e NCX sopra t-tubuli può essere assunta con cautela.
Come dimostrato nei risultati del rappresentante, la mesh di elementi finiti risultante può essere utilizzata con elementi finiti solutori34 per simulare processi biochimici quali segnalazione18 e bioenergetica27 come reazione-diffusione calcio processi. A tal fine, canali ionici sono rappresentati come siti di reazione a nodi all'interno della topologia di rete. I siti di reazione agiscono come origini o sink di specie chimiche differenti per rappresentare il flusso di specie chimiche attraverso questi canali ionici in diversi compartimenti della cellula. Il reticolo di output e i file di densità di RyR da questo protocollo possono essere utilizzati con qualsiasi altro integratore o all'interno di qualsiasi altro ambiente, condizione che il software ha la funzione di riconoscere questi file di testo. I file di testo possono anche essere manipolati da script o software di terze parti per soddisfare requisiti di formato di file di input dell'ambiente della scelta. La prima applicazione sulla dinamica del calcio solo dimostra l'utilità di questo modello per la salita di calcio, ma questo non indica che la rete non può essere utilizzata per scale di tempo più lungo. Le densità di mesh e cluster possono essere utilizzate per simulare più cicli di calcio, con il mantenimento dell'omeostasi e stabilità solo dipende il solutore a elementi finiti che viene utilizzato.
Un obiettivo a lungo termine è quello di migliorare questa pipeline del modello di edificio per rendere più facile per creare modelli ad elementi finiti strutturalmente accurati dei cardiomyocytes ed altri tipi di cellule. Recentemente, è stato sviluppato un algoritmo di segmentazione automatizzata che può essere applicato ai dati di microscopia elettronica scansione seriale-blocco-viso di cardiomiociti per creare un modello della distribuzione miofibrille e mitocondri nell'intera cella con utente minima ingresso29. Questo metodo sarà esteso per segmentare il t-tubulo e SR membrana reti in futuro. È anche in fase di sviluppo una versione generalizzata dell'algoritmo RyR-simulatore che permetterà agli utenti di analizzare e simulare co-percorsi canale ionico e organelli, nonché tra tipi diversi di canale ionico, in modo elevato throughput. Un protocollo senza soluzione di continuità per la costruzione di un modello completo della cella permetterebbe agli scienziati di eseguire prove basate sul modello ipotesi sulla relazione tra la struttura delle cellule e la funzione delle cellule più ordinariamente quanto sia attualmente possibile con approcci sperimentali da solo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Royal Society della Nuova Zelanda Marsden veloce avviare Grant 11-UOA-184, il Human Frontiers Science programma Research grant RGP0027/2013 e australiano di ricerca Consiglio Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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