Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Cardiomyocyte 시스템 생물학에서 세포 아키텍처의 역할을 연구 하기 Cardiomyocyte의 구조적으로 현실적인 유한 요소 형상 모델 생성

Published: April 18, 2018 doi: 10.3791/56817

Summary

이 프로토콜은 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법 심상에서 cardiomyocytes의 세포내 구조의 공간적 상세한 유한 요소 모델을 생성 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 이 공간 세부 모델의 파워는 칼슘 신호 및 생체에서 사례 연구를 사용 하 여 보여 줍니다.

Abstract

3 차원 (3D) 영상 기술 전자 단층 촬영 등의 출현으로 시리얼-블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법, 과학계는 큰 데이터 집합에 액세스할 수 전례 없는 서브 마이크로미터에서 건축 개장 특징 해상도 cardiomyocyte 기능 건강 및 질병에 있는 변화를 동반 한다. 그러나, 이러한 데이터 집합 조사 cardiomyocyte 함수에 개장 하는 세포질 건축의 역할에 대 한 아래에 활용 되었습니다. 이 프로토콜의 목적은 cardiomyocyte 고해상도 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 이미지를 사용 하 여의 정확한 유한 요소 모델을 생성 하는 방법을 개요입니다. 세포질 건축의 상세 하 고 정확한 모델 cardiomyocyte 생물학, 실험 혼자 올릴 수 보다 더 많은에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하기 위해 상당한 잠재력이 있다. 이 방법의 계산 cardiomyocyte는 cardiomyocyte의 한 통합 하 고 상세한 모델을 개발 하는 열 대권 외의 두 개의 서로 다른 이미지 형식에서 정보를 융합 하는 능력에 있다. 이 프로토콜은 전자 단층 촬영과는 cardiomyocyte의 반 sarcomere 유한 요소 모델을 개발 하기 위해 성인 남성 Wistar (알 비 노 쥐의 특정 품종에 대 한 이름) 쥐 cardiomyocytes의 confocal 현미경 이미지를 통합 하는 단계를 설명 합니다. 한 정확 하 고, 고해상도 묘사를 포함 하는 3 차원 유한 요소 모델을 생성 하는 절차 (순서 ~ 35 nm) 미토 콘 드리 아, myofibrils cardiomyocyte에 필요한 칼슘을 풀어 ryanodine 수용 체 클러스터 배포의 myofibril와 cytosolic 구획 sarcoplasmic 망상 네트워크 (SR)에서 수축. 생성 된 모델 여기 그림 가로 관 건축 또는 sarcoplasmic으로 네트워크의 세부 정보를 포함 하지 않습니다 이며 따라서는 cardiomyocyte의 최소한의 모델. 그럼에도 불구 하 고, 모델 이미에 적용할 수 있는 시뮬레이션 기반에 대 한 조사 역할의 셀 구조를 보여 줍니다 및 다음 표시 되는 두 개의 사례 연구를 사용 하 여 논의 칼슘 신호 및 미토 콘 드리 아 생체에는 자세한 프로토콜입니다.

Introduction

흥분-수축 커플링 (ECC)에 중요 하 고 복잡 한 cardiomyocyte 막의 전기 흥분 및 각 박동 동안 셀의 후속 기계 수축 사이의 커플링을 말합니다. 수학적 모델 활동 전위1,2,3, 생체 신호 cytosolic 칼슘을 조절 하는 류의 생화학 프로세스의 정량적 이해 개발에 중요 한 역할을 이후 수축 성 힘 세대입니다. 같은 모델도 성공적으로 예측 하나 하트 비트에 대 한 변경 또는이 생 화 확 적인 과정의 몇 가지 변경4,5를 받 다. cardiomyocyte의 높은 조직 열 대권 외 점점 셀 및 전체 심장의 정상적인 수축 성 기능에 중요 한 역할을 인정 받고 있습니다. 실제로, 형태학 및 심장 열 대권 외의 구성 요소의 조직 변경 비6,7, 심장 마비 그리고 당뇨병 심근8등 질병 조건에서 생 화 확 적인 변화에 동시에 발생합니다. 이러한 구조적인 변화는 변화에 대 한 사소한, 적응, 또는 병 적인 응답 생화학 조건 여전히 크게 알 수 없는9입니다. 형태와 생물학에서 기능 사이의 본질적으로 밀접 한 결합 실험 연구 혼자 개장 하는 구조와 cardiomyocyte 기능 사이의 상관 관계 보다 더 깊은 통찰력을 제공할 수 없습니다 의미 합니다. 잘 공부 생화학 프로세스 함께 하위 세포 구성 성분의 구조 어셈블리를 통합할 수 있는 수학적 모델의 새로운 세대는 관계의 종합적, 정량적 이해를 개발 하는 데 필요한 구조 사이, 생화학, cardiomyocytes에 수축 성 힘. 이 프로토콜 같은 수사를 위해 사용 될 수 있는 cardiomyocytes의 구조적으로 정확한 유한 요소 모델을 생성 하는 데 사용할 수 방법을 설명 합니다.

지난 10 년간 본 3D 전자 현미경10, confocal11및 슈퍼 해상도 현미경12 의 나노 및 마이크로 스케일 어셈블리에 대 한 전례 없는, 고해상도 통찰력을 제공 하는 중요 한 발전은 cardiomyocyte의 하위 세포질 구성 요소입니다. 최근, 이러한 데이터 집합 cardiomyocyte 열 대권 외의13,14,,1516의 계산 모델을 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 모델 만들 유한 요소 계산 메시 생화학 프로세스 및 cardiomyocyte 수축 시뮬레이션할 수 유한 요소 방법17, 라는 잘 설립 엔지니어링 시뮬레이션 메서드를 사용 합니다. 그러나, 이러한 모델은 해상도 현미경 메서드는 이미지 데이터 집합에 제공할 수 있는 세부 사항에 의해 제한 됩니다. 예를 들어 전자 현미경의 셀 구조를 나노미터 수준의 세부를 생성할 수 있습니다 하지만 그것은 이미지 모델을 만드는 데 필요한 것입니다 내에서 특정 단백질을 파악 하기가 어렵습니다. 최고 해결책 광학 현미경 해상도 50 순서에서 높은 콘트라스트 이미지를 제공할 수 있는 다른 한편으로만 선택 몇 분자의 구성 요소는 셀의 nm. 만 이러한 이미징 형식에서 상호 보완적인 정보를 통합 하 여 둘러볼 수 있습니다 하나 현실적으로 기능의 감도 변화 구조에. 상호 빛과 전자 현미경 검사 법은 여전히 일상적인 절차 그리고 그것은 여전히 제한만 제한 된 수의 구성 요소 면역 형광 보기에서 스테인드 하 고 전자 현미경 보기와 상관 수를 겪을 것입니다.

이 프로토콜 선물 통계적 방법19 를 사용 하 여 분석 하 고 계산 다른 심장에 대 한 전자 현미경 정보 이온 채널의 공간 분포에 가벼운 현미경 검사 법 정보를 융합 하는 새로운 접근 방식을18 열 대권 외의 구성 요소, myofibrils 미토 콘 드리 아 등입니다. 이 생 화 확 적인 과정의 생물 모델 cardiomyocyte 수축 조절 하는 생 화 확 적인 프로세스에 cardiomyocyte 하위 세포 조직의 역할을 연구 하기 사용 될 수 있는 유한 요소 모델을 생성 합니다. 예를 들어이 프로토콜에서 건강 한 모델을 만드는 데 사용할 수 하 고 당뇨병 동물에서 관찰 되는 심장 세포 기능에 구조 리 모델링의 효과 연구를 당뇨병 심장 myocytes streptozotocin 유발 모델8. 제시 방법의 통계 자연의 추가적인 이점은 또한 프로토콜에서 설명 된다: 방법을 유한 요소 기 하 도형 셀 구조에 실험적으로 관찰 된 변화를 밀접 하 게 모방의 여러 인스턴스를 생성할 수 있습니다.

개요, 프로토콜 단계 포함 됩니다: (i) 충분 한 해상도 및 대비; 3D 이미지를 생성 하는 전자 현미경에 대 한 심장 조직의 준비 (ii) 재건 및 3D 이미지 스택 3D 전자 현미경 재건 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 전자 현미경 검사 법 데이터에서의 시장 세분화 라는 아이 모드20; (iii)를 사용 하 여 iso2mesh21 입력;으로 세그먼트 데이터를 사용 하 여 유한 요소 메쉬 생성 (4) 사용 하 여 새로운 알고리즘 및 코드 유한 요소 메쉬에 이온 채널의 분포를 매핑하는 데.

각 단계에 대 한 접근의 전제는 프로토콜 내에서 설명 하는 및 대표 결과 동반 숫자에서 제공 됩니다. ECC, 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아 생체 칼슘의 공간적 역학 공부 하 생성 된 공간 상세한 모델을 사용 하는 방법을 지정 하는 개요 요약. 프로토콜의 현재 제한의 일부는 그들을 극복 하 고 더 심장 시스템 생물학에 세포 구조의 역할의 정량적 이해를 사전에 진행 되 고 새로운 개발 뿐만 아니라, 설명 되어 있습니다. 다른 세포 유형의 유한 요소 모델을 만들 이러한 메서드를 일반화 수 어떻게도 해결 됩니다.

이 프로토콜의 사용자 기존 전자 현미경 이미지 스택에 액세스할 경우 단계 1와 단계 2의 개조 부분 건너뛸 수 있습니다. 경험된 많은 전자 microscopists와 공동으로 그들의 데이터를 획득 하려는 사용자는 토론 하 고 고정 및 수집을 위한 최적의 프로토콜을 결정 하기 위해 전문가와 1 단계에서 착 절차를 비교 하실 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 오클랜드 동물 윤리 위원회와 캘리포니아 대학 샌디에고 제도 동물 보호와 사용 위원회, 조직 프로토콜은 원래 개발의 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 실험 준비

  1. 표 1에 따라 pH 7.4에서 cacodylate 버퍼 0.15 M과 0.3 M 나트륨의 재고 솔루션을 준비 합니다.
  2. 준비도 정착 액 (2 %paraformaldehyde (PFA) + 2.5%도 + 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4에에서 0.2% 타 닌 산) 표 1에 나열 된 구성 요소를 사용 하 여.
    1. 지속적인 교 반으로 열판에 60 ° C에서 증류수 20 mL에 PFA 가루 2g을 디졸브.
    2. 솔루션은 분명 때까지 1m NaOH 솔루션을 추가 합니다.
    3. 솔루션의 온도 40 ° c 때까지 기다려 다음 10 mL의 글과 0.3 M 나트륨 cacodylate의 20 mL를 추가 합니다.
    4. 타 닌 산의 0.2 g을 추가 하 고 솔루션에 용 해.
    5. 0.15 M 나트륨 cacodylate의 50 mL를 추가 합니다.
    6. 같은 날에 사용 하는 경우에, 정착 액의 3 개 또는 4 개의 20 mL 섬광 튜브 4 ° C, 또는 얼음에 냉장고에 저장 합니다.
  3. 1에서 제조 법에 따라 20 m m 2, 3-butanedione monoxime (BDM), Tyrode의 솔루션을 준비 합니다.
  4. 증기 찬 장 안에 Langendorff 장치를 구성 합니다.
    1. 두 개의 다른 쌈 스탠드, 약 70 cm 높이 스탠드 기지에서 하 두 100 mL 플라스틱 주사기 튜브 클램프.
    2. 플라스틱 주사기 튜브 및 그림 1에서 보듯이 3 m m 내부 직경 튜브와 3 방향 자 지를 사용 하 여 커넥터 튜브를 연결 합니다.
    3. 심장 관류 고정을 위한 연결 하는 것입니다 어디 튜브 커넥터의 하단에 3 m m-외경 정 맥에 맞게.
  5. Tyrode의 솔루션 및 37 ° c.에 통 솔루션 주사기 튜브를 채우기
    1. 그들을 통해 주사기 솔루션을 전달 하 여 튜브 내 기포를 제거 합니다.

2. Cardiomyocyte 열 대권 외의 전자 현미경 검사 법 데이터 수집

  1. 절단 및 심장의 화학 정착에 대 한 동물을 준비 합니다.
    참고:이 프로토콜은 성인 남성 Wistar (알 비 노 쥐의 특정 품종에 대 한 이름) 쥐 심장 조직을 처리 하는 단계를 자세히 설명 합니다. 프로토콜 심장 조직 다른 종에서 공급 하는 경우 수정이 필요할 수 있습니다.
    1. 복 주입을 통해 250 U/mL 덤플링의 0.5 mL와 쥐 (몸 무게에 의해 200-250 g) 하 여 동물을 anesthetize. 10 분 기다립니다 다음 pentobarbital (210 mg/kg의 몸 무게)의 복 주사로 쥐를 치료 합니다.
    2. 발가락 핀치 반사를 테스트 하 여 마 취의 적절 한 학위를 확인 합니다.
    3. 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.
    4. 이전에 게시 정돈 기사와 비슷한 해 부 절차를 사용 하 여 심장22,23, 장소 차가운 식 염 수에 추수.
    5. 오름차순 대동맥을 분리 하 고 cannulate. 그는 정 맥의 끝 바로 위에 앉아 반 달 밸브 관상 동맥 분기를 확인 하십시오. 오름차순 대동맥 주위 단단히 스레드 넥타이.
    6. 중력 구동 Langendorff 장치 시스템 (그림 1)의 기초 위에 ~ 70 cm에서 운영 하는 정 맥을 연결 합니다.
    7. Perfuse Tyrode의 솔루션을 2-3 분 20 m m BDM (myosin 억제제)를 포함 하 여 심장 Langendorff 시스템에는 자 지를 트위스트.
    8. 트위스트 2 %paraformaldehyde, 2.5%도, 및 0.15 M 나트륨 cacodylate에서 10 분 동안 37 ° C에 0.2% 타 닌 산의 정착 액으로 살포 하려면 자 지. 성공 하면 마음 것 창백한 갈색으로 바뀌고 뻣 뻣 하 고 고무 되.
    9. 고 해 부 조직 블록 왼쪽된 심 실 (측면) 무료 벽에서 면도날을 사용 하 여, 조직 블록 약 1 m m3 크기에.
    10. 2 헤에 얼음 같은 정착 액의 사전 냉각된 20 mL 섬광 튜브에서 샘플 튜브에 가능한 많은 샘플을 저장 고는 샘플 솔루션에 잠긴가 게.
      주의: 그것은 샘플을 아래 100% 탈수 단계 이후까지 차가운 유지 하는 것이 중요입니다.
  2. 추가 고정 고 전자 현미경에 대 한 샘플의 얼룩이 지기.
    1. 유리 비 커에 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼의 100ml를 부 어 하 고 얼음에 냉각 하십시오.
    2. 4% 오스뮴 tetroxide 그리고 0.3 M 나트륨 cacodylate, 칼륨 ferrocyanide 2% 칼륨 ferrocyanide 2% 오스뮴 tetroxide와 0.15 M 나트륨 cacodylate에 포함 된 중 금속 얼룩 솔루션의 0.08 g의 추가 의해 다음의 동일한 볼륨을 준비 합니다. 차가운 얼음에 솔루션.
    3. 밖으로 정착 액을 플라스틱 하 고 충분 한 찬 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 튜브에 샘플을 잠수함으로 대체. 5 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
    4. 2.2.3 단계 초과 정착 액 제거를 0.15 M 나트륨 cacodylate와 4 번 더 반복 합니다.
      주의: 작은 파편 샘플을 들어갈 수 있는 조직 블록 단면 중 다이아몬드 칼을 망칠 수 있기 때문에 유리 펫을 사용 하지 마십시오. 미리 샘플에 그들을 추가 하기 전에 얼음에 모든 솔루션을 중요 하다. 그것은 또한 중요 한 샘플 남아 있는 솔루션으로 덮여 모든 시간 (부분 범위를 더 이상 몇 초 지속의 아주 짧은 기간 동안 수 있습니다 짧게 용납 솔루션 교류 중). 세척 또는 교체 솔루션 때 이전 솔루션을 제거한 후 새로운 솔루션 신속 하 게 추가 합니다. 세척 사이 얼음에 섬광 튜브를 유지. 참고가이 단계 구분, 조직 블록 시간 아닙니다는 약간 이상 하 고, 필요한 경우 세척 될 수 있다.
    5. 얼음 처럼 차가운 중 금속 얼룩 솔루션 나트륨 cacodylate 버퍼를 교체 하 고 밤새 얼음에 저장. ferrocyanide 손으로; 유리병을 흔들어 잘 혼합 되도록 솔루션 검정 설정 해야 합니다.
      주의: 오스뮴은 독성이 있기 때문에이 단계를 수행할 때 증기 두건에서 작동 합니다.
    6. UA 솔루션 주식의 동일한 볼륨 및 두 배 증류수를 사용 하 여 2 %4% 수성 uranyl 아세테이트 (UA) 재고 솔루션 (표 1)을 묽 게 하십시오 그리고 얼음에 그것을 진정.
    7. 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 얼음 냉각 중 금속 얼룩 바꿉니다 그리고 얼음에 5 분 동안 품 어 샘플.
    8. 어떤 초과 중 금속 얼룩 솔루션을 씻어 얼음에 단계 2.2.7 4 번 더 반복 합니다.
    9. 샘플 4 시간, 2 분 대기 기간 사이 물에 씻어 정화 (충분 한는 이중 증 류).
    10. 순화 된 물 대체 얼음 2 %UA 샘플 품 어 얼음에 60-120 분.
    11. 5 20 mL 섬광 튜브 (충분히 샘플 잠수함) 에탄올의 탈수 단계에서 사용 될 얼음에 식혀. 6 튜브는 증류수에 에탄올의 증가 비율: 20%, 50%, 70%, 90%, 및 100%.
    12. 에탄올 튜브 함께 얼음에 다른 20 mL 섬광 유리병과 멋진에 순수한 아세톤을 붓으십시오.
    13. 샘플 정화 물에 4 시간 2 분 대기 기간 초과 UA 씻어 얼음에 린스.
  3. 샘플 에탄올에서 탈수.
    1. 연속적으로 얼음에 다음과 같이 샘플 유리병 내 솔루션을 대체 하 여 냉 에탄올 시리즈에 탈수: 10 분;에 대 한 20% 에탄올 50% 에탄올 10 분; 70% 에탄올 10 분; 10 분;에 대 한 90% 에탄올 다음 10 분에 100% 에탄올 두 번.
    2. 최종 100% 에탄올 냉각된 순수한 아세톤 대체 하 여 실내 온도에 샘플을 전환 하 고 10 분 동안 실내 온도 실험실 벤치에 샘플 유리병을 놓습니다.
    3. 튜브 내에서 관찰은 결로 제거를 위해 상 온에서 순수한 아세톤에 하나 더 많은 10 분 워시를 수행 합니다. 동안 잠복기, 아세톤 또는 수 지 솔루션을 확인 합니다.
    4. 튜브에 순수한 아세톤을 50: 50 순수한 아세톤 및 에폭시 수 지 (에폭시 수 지 부품 제조 업체에 의해 명시 된 대로 비율)으로 바꿉니다. 동일한 일괄 처리에서 모든 구성 요소를 사용 합니다. 로 터에 수 지 가득 샘플 튜브를 하룻밤 둡니다.
  4. 수 지에 샘플을 포함 합니다.
    1. 75%는 수 지 (25% 아세톤)와 50: 50 수 지를 교체 하 고 3 h, 뒤에 실 온에서 4 h에 대 한 100% 수 지에 추가 부 화/침투에 대 한 품 어.
    2. 신선한 100% 수 지, 100% 수 지를 대체 하 고 조직 샘플에 하룻밤 수 지의 깊은 침투에 대 한 샘플 튜브를 둡니다.
    3. 샘플 튜브에서 오븐-친화 하는 컨테이너에 배치 하 고 평면 기반; 알루미늄 또는 박 베이킹 컵 사용할 수 있습니다이 위해 예를 들면.
    4. (샘플의 변위를 피하기 위해)을 부 어 부드럽게 신선한 샘플 (따라서 수 지에 샘플 포함) 수 지 및 수 지 및 48 h에 대 한 60 ° C에서 오븐에서 샘플 유해.
  5. 다시 이미지 셀 단면에 수 지 블록을 방향을 정하십시오.
    1. 셀 방향24평가 하기 위해 유리 칼으로는 ultramicrotome를 사용 하 여 수 지 블록에서 1 µ m 두께 테스트 섹션을 가져옵니다.
    2. 20 대 한 두꺼운 테스트 섹션 얼룩 s 1% 톨루엔 블루와 1% 붕 사.
    3. 근육 세포 방향 밝은 분야 현미경 검사.
    4. 얼룩진된 테스트 섹션의 이미지에서 유추 하는 방향에 따라, 다시 방향을 경도 또는 비스듬히 지향 ( 그림 2A와 유사한) 횡단면 (에서 삭감 될 것 이다 그래야 세포 유리 칼에 노출 되어 있는지 확인 하려면 블록 수 지 비슷한 그림 2B).
  6. 이미지 조직 섹션 전자 단층 촬영을 사용 하 여입니다.
    1. 구하는 반 얇은 섹션 (~ 300 nm) 방향도 조직의 다이아몬드를 사용 하 여 블록 칼 및 구리 격자25에 섹션을 전송.
    2. 2 %UA 사토 리드25두꺼운 부분 얼룩.
    3. 섹션25의 양쪽에 콜 로이드 골드 입자를 적용 합니다.
    4. -70 °에서 70 °25영사 된 이미지의 단일 또는 이중 축 기울기 시리즈의 집합을 가져옵니다.
  7. 아이 모드20 를 사용 하 여 3D 이미지 스택 (단일 전자 단층 촬영의 3 차원 정보를 제공 하는 2D 이미지의 시리즈)를 재구성 하는 셀의. 이 재건된 스택 다음 단계에서 세그먼트 것입니다.

3. 세그먼트 Myofibrils와 EM 3D 이미지 데이터 집합에서 미토 콘 드리 아 지역

  1. 아이 모드 프로그램 "3dmod"를 실행 합니다.
  2. 3dmod 그래픽 사용자 인터페이스 내에서 ".rec"의 주소를 입력 또는 3D를 포함 하는 ".mrc" 파일 재구성 (2.7 단계에서 생성 된) 셀의 이미지 데이터 집합 항목 상자에 "이미지 파일:", "확인"을 누릅니다.
  3. "파일" 메뉴에서 새로운 모델을 선택한 다음 "저장 모델"을 사용 하 여 적절 한 이름을 가진 파일을 저장... "파일" 메뉴 항목.
    참고: 아이 모드에서 개체 "개체" 구성 하는 세그먼트 구성 요소 컬렉션을 포함할 수 있습니다. 기본적으로 새 모델 id "#1" 새 개체를 포함합니다.
  4. "특별 한" 메뉴에서 "그리기 도구"를 선택 합니다. 이 새로운 도구 모음 그림 3A에 표시 된 것과 비슷한 열 것 이다.
    참고: 다른 세포 기관이 경계 주위 윤곽선을 만드는 데 사용할 수 있는 여러 도구가 있습니다. 이러한 도구를 사용 하는 방법에 대 한 더 많은 도움 아이 모드20 설명서에서 찾을 수 있습니다.
  5. "그리기 도구" 메뉴에서 "조각" 옵션을 선택 하 고 이미지 창; 위로 마우스를 이동 마우스 포인터를 중심으로 원형 윤곽 표시 됩니다.
  6. Mitochondrion (이미지 파일, 그림 3A에서 녹색 등고선으로 경계 설정에 의해 볼 수 있듯이 어두운 지역)를 통해 마우스 가운데 단추를 누른, 그것의 경계를의 모양으로 원 윤곽선의 경계를 끕니다.
  7. Mitochondrion 경계의 컨투어링 완료 되 면, 가운데 버튼을 해제 하 고 각 mitochondrion 데이터에 대 한 단계 3.6를 반복 합니다. 각 윤곽선 동일한 개체 내에서 새 윤곽으로 아이 모드에 의해 자동으로 인식 됩니다.
  8. 아래는 "편집 | 개체 "메뉴,"새로운 "를 선택 하는 새 개체를 만들려고 합니다. 이 자동으로 하나씩 개체의 총 수를 증가 하 고이 숫자는 새 개체를 할당.
  9. 3.6, 3.7 세그먼트를 myofibril 윤곽을 저장 단계를 반복 합니다.
  10. 단계 3.8, 단계 3.6, 뿐만 아니라 셀 경계 세그먼트에 다음 반복 합니다.
  11. "파일" 메뉴에서 모델 파일을 저장 합니다.
  12. 그림 4A-C에서 볼 수 있듯이 이진 마스크에 그룹화 하는 각 개체를 변환 하려면 명령줄 창에서 다음 명령을 실행 합니다.
    1. 모델 "imodextract 개체 modelfile outputmodelfile" "개체"가 추출 될 개체의 수에서에서 특정 개체를 추출 합니다.
    2. 해당 개체에 대 한 마스크를 만들기: imodmop-마스크 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Tif 스택 파일 변환: mrc2tif-s outputmask.mrc outputmask.tif

4. 세그먼트 구성 요소에서 유한 요소 메쉬 작성

  1. Iso2mesh 체적 사면체 유한 요소 메쉬 TIFF 이미지 스택 변환을 자유롭게 사용할 수 있는 MATLAB 프로그램 이다. 다운로드 하 고 iso2mesh.sourceforge.net에서 MATLAB 경로에 iso2mesh를 추가 합니다.
  2. 소스 코드와 github 웹사이트 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator에서 메시에 RyR 클러스터 시뮬레이션 데이터 다운로드.
  3. (그림 5) CardiacCellMeshGenerator MATLAB 응용 프로그램을 시작 합니다.
  4. GUI의 왼쪽 상단에 3 개의 푸시 버튼을 사용 하 여 MATLAB으로 다른 세포 기관이 컴포넌트 마스크를 로드 합니다.
  5. Myofibrils와 미토 콘 드리 아 그림 6A와 같이 사이 간격을 정하는 다른 바이너리 이미지 스택을 만듭니다.
    1. ImageJ를 엽니다.
    2. 파일을 사용 하 여 | 대화 상자를 열고, 프로그램에 myofibrils 및 미토 콘 드리 아 tiff 스택 로드.
    3. 선택 하 여 이미지 추가 플러그인을 시작할 "프로세스 | 계산기 플러스 ".
    4. I1 myofibril 이미지 스택을 선택, mitochondria i2,으로 스택 이미지 "Add" 연산자를 선택 하십시오. "확인"을 클릭 합니다.
    5. 4.5.4의 결과 나타내는 새로운 이미지 스택 나타나면 선택 합니다 "편집 | 반전 " 그림 6A와 비슷한 이미지 스택 생산.
  6. CardiacCellMeshGenerator 프로그램에 "RyRGapsFile" 버튼을 누르면 myofibrils와 미토 콘 드리 아 사이 간격의 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일을 로드 합니다.
  7. GUI에서 "메쉬 생성"을 눌러. 이 iso2mesh 명령 v2m 비슷한 그림 4E사면체 메시 생성을 'cgalmesh' 옵션을 사용 하 게 됩니다. 3 파일이이 단계 끝에 출력 될 것입니다:.ele 파일,.face 파일 및 요소, 얼굴, 구성 하는 노드를 구성 하는 노드 목록과 노드 좌표를 포함 하는.node 파일 각각.

5. 수학적으로 유한 요소 망에 대 한 관심의 이온 채널의 다양 한 공간적 밀도 지도.

  1. Gui 생성 RyR 시뮬레이터 입력을 표시 하는 버튼을 누르면 RyR 시뮬레이터에 대 한 필요한 입력을 생성 합니다.
    참고: 버튼 4 단계에서 다음 정보를 사용 하 여 입력을 생성 하는 함수 generateRyRsimulatorInputs.m를 일으킬 것 이다:
    (1) outDir: RyR 클러스터 시뮬레이션에 필요한 출력 파일 위치.
    (2) imres: 이미지 스택의 3 개의 방향에서 픽셀 해상도.
    (3) myofibril_file: 4B 그림과 같은 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일.
    (4) sarcolemma_file: 4A 그림과 같은 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일.
    (5) ryrgaps_file: 5A 그림과 같은 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일.
    1. 이 기능을 실행 한 후 다음 파일 outDir 경로로 지정 된 디렉터리 내에서 생성 된 확인:
    • d_axial_micron.txt z 디스크의 위치와 이미지 스택에 픽셀의 나머지 사이 축 거리를 나타냅니다.
    • d_radial_micron.txt z 디스크 평면에 픽셀을 가능한 RyR 클러스터 위치 집합에서 각 픽셀에서 유클리드 거리 (축 구성 요소 제외)을 나타냅니다.
    • W_micron.txt RyR 있어야 클러스터에 대 한 모든 가능한 위치의 공간 좌표 목록을 나타냅니다.
    • 폴더에 나머지 3 파일 "_micron" 픽셀 좌표 형태로 쓰여지는 되었습니다이 파일에서 값을 표시 하는 대신 접미사 "_pixel"를 포함 합니다.
  2. Myofibrils의 바이너리 이미지 스택에 RyR 클러스터 배포판을 시뮬레이션 합니다.
    1. "오픈 RyR-R에서 시뮬레이터"를 표시 하는 버튼을 눌러 R 프로그램을 시작 하려면.
    2. R-gui에서 선택 "파일 | 열기"찾을 파일"설정입니다. R "RyR 시뮬레이터 패키지 (RyR-시뮬레이터/소스/설정. R)입니다.
    3. 또한 파일 ryr 시뮬레이터-병렬 열. R (RyR 시뮬레이터/소스/ryr-시뮬레이터-병렬에 위치. R). 환경 처럼 Rstudio (https://www.rstudio.com) 또는 일반 커맨드 라인 인터페이스를 사용할 수 있습니다, 예를 들어 셸 또는 명령 창에서 R64 명령을 사용 하 여.
    4. 설정에서 매개 변수를 변경 합니다. R으로 아래 파일.
      1. 5.1.2 RyR 클러스터 및 myofibrils의 실험적으로 획득된 confocal 이미지 스택에 대 한에 나열 된 파일이 들어 있는 폴더 주소에 Path2를 설정 합니다.
        참고: github 저장소 폴더 입력-파일/마스터-셀 이전에 수집한 이미지 스택 생성 된 파일에 이미 포함 되어 있습니다.
      2. 5.1.2 단계에서 생성 된 파일의 저장 위치 폴더 주소에 Path4을 설정 합니다.
      3. 사용자 시뮬레이션된 RyR 클러스터 위치 저장을 원하는 폴더에 Path3 포인트를 설정 합니다.
      4. N (일반적으로 200 ~ 300의 범위)에 모델에서 시뮬레이션 RyR 클러스터의 수를 설정 합니다.
      5. Etol, 설정, RyR 클러스터의 실험적으로 측정 된 공간 분포와 RyR 클러스터의 시뮬레이션 모델 공간 분포의 차이 대 한 허용 오차를 설정 합니다.
      6. RyR 시뮬레이터 etol 값을 만족 하는 시뮬레이션된 RyR 클러스터 패턴을 찾을 수를 취해야 하는 시도의 수를 제한 하는 numIter를 설정 합니다.
        참고: etol 및 numIter 값을 설정 내에 전형적인 값으로 설정 되었습니다. R 파일입니다.
      7. NumPatterns 다른 RyR 클러스터 패턴을 시뮬레이션 하는 사용자가 수 설정 (일반적으로, 그것은 유용한 연습 통계 신뢰에 대 한 99 패턴 시뮬레이션).
      8. NumCores R 포인트 패턴 시뮬레이션을 처리 하는 빠른 병렬에 대 한 여러 CPU 스레드 (코어)를 사용 하 여 사용할 수 있도록 설정 합니다.
    5. 다음 패키지는 패키지 설치 관리자를 사용 하 여 설치 되어 있는지 확인 하십시오 r: 눈, doSNOW, doparallel, foreach, 반복기, 및 rgl gui.
    6. R 명령 창에서 다음 명령을 입력 하 여 시뮬레이터를 실행: 소스 (' ryr 시뮬레이터 병렬 경로. R', chdir = TRUE)
      참고: RyR 시뮬레이터 프로그램의 출력은 N 행에 좌표 목록을 포함 하는.txt 파일 (numPatterns 파일 생성 됩니다)의 목록을 하 고 x, y 및 z 좌표 N의 대표 하는 3 열 시뮬레이션 RyR 클러스터.
  3. 공간 밀도 CardiacCellMeshGenerator를 사용 하 여 계산 모델에로 포인트를 매핑하십시오.
    1. 표시 단추를 선택 하 여 "RyR 포인트 파일 선택", 그런 RyR 시뮬레이터에서 출력 했다에서 시뮬레이션된 RyR 클러스터 배포 텍스트 파일을 선택.
    2. MATLAB에서 gui "RyR 밀도 매퍼"를 실행 합니다. 이 단계 5.3.1 4.8 구형 커널 강도 견적 방법26라는 메서드를 사용 하 여 단계에서 생성 된 유한 요소 메쉬에.txt 파일에 시뮬레이션된 RyR 클러스터의 공간적 위치 지도.
      참고:이 단계에서 출력 계산 메쉬 노드의 각 단위 구면 볼륨당 이온 채널의 숫자 밀도 대 한 값의 목록을 포함 하는.txt 확장명을 가진 파일입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 프로토콜의 몇 가지 주요 단계의 대표적인 결과 제공 하는 그림 2 - 그림 7 : (i) 시각화 및 전자 현미경 횡단면 뷰;에 대 한 조직 블록을 reorienting (ii) 생성 3 차원 전자 현미경 이미지 스택; (iii) 세그먼트 하위 세포 열 대권 외의의; 세포에 대 한 (4) iso2mesh;를 사용 하 여 유한 요소 메쉬 생성 (v) 시뮬레이션 메시;에 RyR 클러스터의 실제 분포 (6) 전산 메쉬 이상의 공간 밀도로 공간 배급이 매핑 옵니다.

그림 2 표시 셀 때 경도 중심을 표시 하는 방법을 보여 주는 전형적인 밝은 필드 이미지 (그림 2A, L로 표시), 비스듬히 (그림 2A, O 표시) 및 cross-sectionally (그림 2B)에 절단 비행기입니다. 오블리크 및 경도 방향 샘플 전시 강선, cross-sectionally 지향된 샘플 강선을 전시 하지 않는 동안. 모세도 더 비스듬한 보기 보다 횡단면 뷰에서 원형 표시 됩니다.

그림 3A 단계 1에서에서 조직 준비 프로토콜을 따를 때 취득 될 수 있는 좋은 품질 tomogram 스택의 대표 이미지를 보여줍니다. 현미경 이미지 기울기 시리즈에서 3 차원 재구성을 수행할 때 주의 해야 합니다. 콜 로이드 골드 입자의 잘못 된 추적 또는 부족 충분 한 금 입자의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다-이미지 대비 및 이미지 초점-는 tomogram의 상당히. 이 다른 구조를 크게 세그먼트 수를 영향을 줍니다. 관심과 경험 되도록 조직 블록 충분히 얼룩진 조직 볼륨을 통해 콜 로이드 골드 입자의 동등한 배급이 필요 하다. 의심 하는 경우에 그것은 상담 전문가 실험실 또는 로컬 기관에 시설을 유용할 수 있습니다. 모델 생성 낮은 대비 시도 하거나 데이터를 제대로 재구성, 모델은 여전히 생성 될 수 있습니다 있지만 결과 시뮬레이션을 생물 학적 시스템의 속성을 모델링의 통신 가난한 수 있습니다. 그림 3B myofibrils 및 미토 콘 드리 아의 세그먼트 모델 같은 외모의 대표 이미지를 보여줍니다.

그림 4E iso2mesh에 의해 생산 되는 사면체 메시의 3D 렌더링을 보여 줍니다. 원본 이미지 스택과 세분화 작업은 좋은 품질의,이 단계는 상당히 강력. 그림 6B그림 6 c 3D 셀룰러 토폴로지 내에서 (빨간색)으로 전형적인 RyR 클러스터 배포를 나타냅니다. 이 단계 자체는 메쉬 RyR 시뮬레이터에 입력 되지 않습니다. 셀 경계 및 myofibrils와 미토 콘 드리 아 사이 간격의 이미지 스택-세그먼트 이미지 그림 4에서에서 생성 된-RyR 시뮬레이터 주요 입력 양식. 주의 myofibrils 및 미토 콘 드리 아의 경계를 정확 하 게 가능한; 세그먼트에 해야 합니다. 부정확 한 세그먼트 셀 토폴로지 결과적으로 메시 내에서 RyR 배치에 영향을 미칠 것 이다 데이터에의 부정 확 한 표현 귀 착될 것 이다. 이 다음 cardiomyocyte (응용 프로그램 1)에서 신호 하는 칼슘의 spatio 시간적 역학 영향을 미칠 것 이다.

그림 7 3 인스턴스의 동일한 시뮬레이션된 RyR 클러스터 메쉬 토폴로지 후 구형 커널 강도 견적 알고리즘을 사용 하 여 보여 줍니다. RyR 클러스터의 조직에 변화를 알 수 있습니다. 이 변이 실험 데이터18에서 발견 되었다 변화 내 측정 되었다. 커널 영역 반지름과는 커널 RyR 클러스터 밀도 샘플링 단계 크기 선택에 주의 해야 합니다. 이 두 가지 요소에 영향을 얼마나 크게 또는 RyR 클러스터의 밀도의 표현을 메시에 묘사 하는 것 이다 만들어진다. 이러한 매개 변수에 대 한 값이 다른 효과의 분석을 합리적인 망에 대 한 매개 변수 선택에 도움이 됩니다.

RyR 클러스터, myofibrils, 그리고 미토 콘 드리 아의 결과 메시 cardiomyocyte 구조의 최소한의 모델 이다. 이 메쉬 적용 되었습니다, 칼슘 역학 및 생체 연구를 다른 세포 구조 데이터에서 파생 된 그것의 유사에 뿐만 아니라. 이러한 두 응용 프로그램에 대 한 개요는 셀 구조 구조-기능 관계에 통찰력을 주는에서 유한 요소 모델링의 힘을 설명 하기 위해 아래 설명 되어.

응용 프로그램 1 18 : 칼슘의 spatiotemporal 역학 릴리스 cardiomyocytes에. 이 모델은 RyR 클러스터, myofibrils, 및 칼슘 신호에 미토 콘 드리 아의 이기종 분배의 역할을 검토에 사용 되었습니다. 그림 8 은이 프로토콜에서 생성 된 메시 토폴로지에서 시뮬레이션할 때 과도의 상승 단계 cytosolic 칼슘의 spatiotemporal 역학을 보여줍니다. 그림 8B 이기종 무료 칼슘과 시간이 지남에 fluorophore-바운드-칼슘 농도 보여 줍니다. 화살표는 RyR 클러스터 또는 그 지역에서 미토 콘 드리 아의 높은 밀도 인해 높은 칼슘의 작은 반점 가리킵니다. 그림 8C 라이브 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 일반적으로 수집 된 칼슘 역학의 실험 라인 스캔 이미지에 비해 수 있는 시뮬레이션된 라인 스캔 이미지를 보여줍니다. 모델 시뮬레이션 볼을 수 있습니다 훨씬 더 높은 해상도 칼슘의 공간이 성분의 실험적으로 얻은 이미지 보다. 또한, 모델 구조 현미경 데이터에서 파생 되 고, 인 유지 해야 하는 클러스터 수 비활성화 (~ 4-6) 후 전기 활성화 confocal 라인 스캔 이미지에서 발생 하는 heterogeneities에 대 한 정확 하 게 결정 될 수 있었다. 유사한 heterogeneities 심장 마비18 의 동물 모델에서 칼슘 역학의 실험적으로 획득된 라인 스캔 이미지에서 관찰 된다

응용 프로그램 2 27 : Cardiomyocytes에 미토 콘 드리 아 생체의 spatiotemporal 역학. 이 작품의 지배적인 목표 칼슘 역학, 미토 콘 드리 아 생체 및 근육 수축 사이의 관계를 연구 하는 것입니다. 첫 번째 단계로 서, 격리는 cardiomyocyte 내의 미토 콘 드 리아 산화 인 산화의 시뮬레이션 실시 되었습니다. 따라서, RyR 클러스터 배포 필요 하지 않습니다, 그리고 하나 단순히 단계 3.4에서 메시를 사용할 수 있습니다. 더 복잡 한 응용 프로그램으로 생체 (응용 프로그램 2) 메쉬 및 모델, 미토 콘 드리 아, myofibrils, 건설과 ryanodine에서 고려 하는 모든 구성 요소를 사용 하는 모델에서 칼슘 역학 (응용 프로그램 1)와 결합 될 수 있습니다. 수용 체입니다.

그림 9 는 단계 3.4를 사용 하 여 생성 된 메시의 다른 지구에 이러한 공간 대사 시뮬레이션에서 결과를 나타냅니다. 그림 9A 그림 9B 에서는 ADP의 집중력만 셀의 myofibril 구획 동안 셀 단면에 걸쳐 산소 농도를 보여 줍니다. 그림 9C 미토 콘 드 리아 네트워크를 통해 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 분포를 보여 줍니다. 이러한 수치는 미토 콘 드리 아와 세포 횡단면에 myofibrils의 비 균등 분포 공개. 그들은 또한이 비균일 열 대권 외에서 유래한 휘도가 대사 프리 공개. 이 현미경 데이터의 힘 기반 유한 요소 시뮬레이션 혼자 실험 방법을 통해 얻을 수 없는 구조-기능 관계에 통찰력을 주는 방법을 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1: 화학 고정을 위한 마음의 Langendorff 준비. Langendorff 관류 장치의 (A) 회로도 자 지 포함 Tyrode의 사이 전환 하려면 밸브 및 통 솔루션. 기지에서 비 커 마음을 통해 perfuse 솔루션을 잡아 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 밝은 분야 현미경 검사 법에서 셀 방향 검토. (A) 톨루엔 파란색 두꺼운 스테인드 부분의 심장 조직 경도 방향된 (L)와 비스듬히 지향된 (O) 이미징 평면;을 기준 셀을 보여주는의 밝은 시야 예를 들어 경도 방향된 셀에 강선 note. (B) 영상 평면에 부합 하는 셀의 가로, 횡단면은 조직 단면도의 밝은 필드 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 전자 현미경 검사 법 데이터의 세분화. 조각 도구를 사용 하 여 미토 콘 드리 아의 수동 세분화의 (A) 스냅샷. (B) A의 완전 한 3D 보기 수동으로 미토 콘 드리 아, (다양 한 색상의)에 myofibrils sarcolemma (분홍색)에 세그먼트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 3 차원 사면체 메시 바이너리 이미지 스택 변환. (A C) 이진 마스크 sarcolemma, myofibrils의 미토 콘 드리 아, 각각. (D) 결합 된 이진 마스크 (빨간색)에 myofibrils의 (녹색)에서 미토 콘 드리 아의 볼. (E) 대표 사면체 메시 스택에서 이미지 (D) iso2mesh를 사용 하 여 생성 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: CardiacCellMeshGenerator. 4-5 단계를 수행 하는 사용자를 위해이 프로토콜 게시와 함께 제공 되는 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 심장 열 대권 외의 세그먼트 전자 현미경 이미지 스택에 현실적인 RyR 클러스터 배포를 시뮬레이션. (A) A 바이너리 이미지 스택 myofibrils RyR 클러스터를 찾을 수 있는 모든 픽셀의 집합을 대표 하는 미토 콘 드리 아 사이 간격을 묘사한. (B)는 3D 렌더링 (이미지 스케일을 그려 하지) 시뮬레이션된 RyR의 배포판 (빨간색 구체로 표시) 내 3 차원 형상 3D 이미지 스택;에 묘사 된 클러스터 녹색 표면 이미지 스택에 미토 콘 드리 아를 나타냅니다. (C) 높은 확대 (따라서 작은 부분 잘라 셀 횡단면의 경계에서) 보기는 RyR의 오버레이의 4 단계에서 3D 전자 단층 촬영 이미지 스택에의 한 조각에 3 단계에서 계산 메쉬 클러스터. (B)와 (C) Rajagopal 에서 수정 되었습니다. 18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 3에서 RyR 클러스터의 숫자 밀도의 공간 분포 시뮬레이션 RyR 클러스터 패턴. 모든 메시 노드는 0.99 RyR 클러스터 / µ m3의 최대 숫자 밀도 대 한 빨간색 흰색 0.0 RyR 클러스터 / µ m3 의 숫자 밀도 대 한 코딩 된 색상입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: [캘리포니아2 +]i 캘리포니아2 + 과도의 상승 단계에서 공간이. (A) 평균 자유롭게 확산 [캘리포니아2 +] (왼쪽)와 Fluo-4 cytosolic 바인딩된 캘리포니아2 +, [F4Ca](오른쪽). (B)와 (C) z-디스크, 가로 평면;에서 캘리포니아2 + 그리고 F4Ca를 자유롭게 확산의 시간 경과 스냅샷 보기 검은 화살표 표시 높은 [캘리포니아2 +] 때문에 미토 콘 드리 아 클러스터링;의 지역 빨간색 화살표 가까이에 높은 [캘리포니아2 +] 때문에 여러 RyR 클러스터의 영역을 표시합니다. [캘리포니아2 +] (가운데) [F4Ca](오른쪽)의 (C) 시뮬레이션된 라인 스캔. 줄 위치 왼쪽에 셀 단면에 표시 됩니다. 셀 횡단면의 수평 차원 이미지의 횡단면에서 공간 규모의 표시기로 제공 되었습니다. 이 그림은 Rajagopal 에서 수정 되었습니다. 18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 심장 에너지 물질 대사의 공간 시뮬레이션에서 생성 하는 대사 산물과 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 공간 분포. (A) µ M의 단위에서 셀 단면에 걸쳐 산소 농도의 µ M. 단위 셀의 myofibril 부분에만 ADP (B) 농도 미토 콘 드리 아에서 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 (C) 배포 mV의 단위에서 네트워크입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10: R-통계 패키지에 시뮬레이션된 RyR 클러스터 포인트 패턴의 시각화. 이 창이 RyR 클러스터 시뮬레이션, 시뮬레이션된 포인트 패턴의 첫번째 묘사의 결론에 나타납니다. 이것은 RyR 시뮬레이터 뿐만 아니라, 결론 및 시뮬레이션 된 패턴의 품질을 심문 수 표시기로 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

화학 물질 수량
0.2 N HCl
1 N HCl 5 mL
증류수 20 mL
0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 재고
나트륨 cacodylate 32.1 g [3 H2O]
0.2 N HCl 25 mL
1 L 증류수와 메이크업
pH 7.4
0.3 M 나트륨 cacodylate 버퍼 재고
나트륨 cacodylate 64.2 g [3 H2O]
0.2 N HCl 25 mL
1 L 증류수와 메이크업
pH 7.4
Tyrode 솔루션 구성
NaCl 139 mM
KCl 3 m m
CaCl2 3 m m
MgCl2 1mm
포도 당 12 m m
NaHCO3 17 mM
Probenecid 1mm
BDM 20 mM
NaCl 또는 KCl/NaHCO3 1 L 솔루션
NaCl (분자량 58.44 g/mol) 81.2 g
KCl (분자량 74.55 g/mol) 2.24 g
NaHCO3 (분자량 84.01 g/mol) 14.28 g
증류수 1 L 물에 용 해
MgCl2/CaCl2 1 L 솔루션
CaCl2 (2H2O) (분자량 147 g/mol) 1.764 g
MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) 0.814 g
증류수 1 L 물에 용 해
1 M 포도 당 200 mL 해결책
포도 당 (분자량 180.16 g/mol) 36.03 g
두 배 증류수 200 mL에 녹
Tyrode 솔루션 500 mL 해결책
NaCl 또는 KCl/NaHCO3 50 mL
포도 당 6 mL
두 배 증류수 400 mL
5 분에 대 한 솔루션에서 버블 산소
2 %PFA + 2.5%도 0.2 %tanic 산 정착 액 0.15 M 나트륨 cacodylate에
Paraformaldehyde 분말 (PFA) 2 세대
Tanic 산 0.2 g
증류수 20 mL
25%도 10 mL
0.3 M 나트륨 cacodylate 20 mL
0.15 M 나트륨 cacodylate 50 mL
1 N NaOH 4 g NaOH/100 mL 증류수
4 %uranyl 아세테이트 재고 솔루션
Uranyl 아세테이트 4 g
두 배 비등 근처 증류수 96 mL
UA는 fumehood에는 교 반기를 사용 하 여 bioling 근처 물에 용 해.
가벼운 보호에 대 한 200 mL 갈색 병으로 UA Whatman #1 필터를 통해 필터링
단단히 캡 및 레이블, 4 ° C에서 저장

표 1: 시 약 그리고 조직 전자 현미경 검사 법에 대 한 준비에 대 한 수량.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

위의 프로토콜 cardiomyocyte 열 대권 외의 기하학적 소설 유한 요소 모델을 생성 하는 주요 단계를 설명 합니다. 메서드 다른 현미경의 (또는, 원칙적으로, 다른 데이터) 계산 퓨전 modalities를 cardiomyocyte 역학 공간 셀 아키텍처의 세부 정보를 포함 하는 보다 포괄적인 전산 모델을 개발 하는 것을 수 있습니다. 현재는 cardiomyocyte의 같은 모델을 만드는 데 사용할 수 없습니다 다른 프로토콜이입니다.

1 단계는 관류 고정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 심장 수 수 excised, 작은 조각으로 해 부 및 정착 액에. 그러나,이 과정은 신속 하 게 할 수 있다 하 고 결과, 샘플의 크기에 따라 다양 한 수 있습니다. 저자의 경험에서 관류는 조직과 세포에는 정착 액의 철저 한 침투를 보장합니다. 저자 또한 이전 Krebs Henseliet 솔루션 마음을 마음을 끼얹는다는 고정 하기 전에 비트. 이 정착 하기 전에 작업 심장에 측정을 사용할 수 있습니다.

2 단계에서에서 전자 현미경 검사 법 처리 단계는 전자 단층 촬영에 대 한 전형적인. 처리 솔루션 수량 얼룩 솔루션 및 타이밍의 특히 직렬-블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는 이온 빔 현미경28집중 등 다른 이미징 기술을 사용 하는 경우 달라질 수 있습니다. 미토 콘 드리 아, myofibrils, 가로 tubules 등 다른 세포 기관이 지역으로 취득된 전자 현미경 이미지를 세그먼트 해야 합니다. 이 수동으로 또는 자동화 된 방식으로 수행할 수 있습니다. 이미지 스택에 대비 얼룩 프로토콜의 성공에 부분적으로 의존 하지만 일부이 대비의 단층 촬영을 수행할 때 손실 됩니다. 이 프로토콜 비록 자동 세분화29 를 수행 하는 새로운 방법을 더 유리한 것 일반적으로 데이터 처리량을 개선 하기 위해 다른 구조를 세그먼트에 대 한 수동 단계를 설명 합니다.

전자 현미경 검사 법 데이터 집합에서 검사 가장 중요 한 자질 있습니다 이미지 대비 및 구조 보존. 얼룩 레시피와이 프로토콜에 혼합물을 포함 하는 수 지 myofibrils, 미토 콘 드리 아, 그리고 심장 세포의 z 디스크 간의 높은 대비를 위한 세련 되었습니다. 예를 들어 저자는 이전 사용 타 닌 산 대신 칼슘 염화 단계 1.2에서에서 sarcoplasmic으로 네트워크를 구분 하. 이 세포 기관이 분할 하는 동안 myofibril 번들의 외부 경계를 식별 도움이. 추가 얼룩 화학 구성 요소와 시간 또한 sarcoplasmic 그물 또는 가로 축 tubules30같은 막 구조를 시각화에 대 한 사용할 수 있습니다.

이미지 구조 저하에 대 한 검사도 해야 합니다. 품질이 고정 또는 전자 현미경 처리 cristae 미토 콘 드리 아의 심각한 손실, 빠질 또는 부 미토 콘 드리 아의 높은 비율 및 세포 막 (sarcolemma)의 일부의 해체 될 수 있습니다. 가까이 하 고 주의 깊은 시험 t 관의 손실을 표시 또한 수 있습니다 및 SR 막, 하지만 덜 분명 연습을 쌓지 않은 눈에. 솔루션이이 문제에는: (i) 보장 철저 한 관류; (ii) 정착 제와 얼룩;의 깊은 침투 되도록 작은 샘플으로 해 조직 부 (iii) 지정; 어디 얼음 또는 차가운 솔루션에서 전자 현미경 검사 법 처리 수행 됩니다 보장 그리고 (iv) 보장 얼룩이 지 고 탈수 (특히에서 탈수)에 대 한 타이밍은 엄격 하 게 따 랐 다.

전형적인 cardiomyocyte 횡단면 직경에서 ~ 20 µ m 이며 ~ 100 µ m 길이에서. 이것은 전체 심장 세포 이미징 중요 한 도전. 또한, 심장31 추가 내 근육 섬유의 변화 방향이 복잡 누구의 축 관심의 셀의 가로 및 세로 축 정렬 됩니다 이미지 볼륨의 수집. 아이 모드 같은 이미지 분석 프로그램을 원하는 방향으로 데이터의 합성 다시 정렬 가능 최근 발전 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법28 관련된 이미지 처리 알고리즘29 도에 이러한 문제 해결에 도움이. 그럼에도 불구 하 고, 가벼운 현미경 두꺼운 섹션의 주의 깊은 검사 및 블록 (2.5 단계)의 후속 재교육은 영상과 경도 가로 축의 합리적인 맞춤으로 세포 이미징의 가능성을 증가할 것 이다 축입니다. 이렇게 하면 대부분 셀 볼륨의 보기의 필드 내에서 캡처됩니다.

3, 4, 5 단계 프로토콜 설치할 자료의 테이블에 에서 나열 된 소프트웨어를 필요 합니다. 아이 모드는 R 통계 패키지, iso2mesh, 피지 (현미경 데이터 ImageJ의 버전)을 사용 하는 방법에 광범위 한 문서 및 자습서 있다. CardiacCellMeshGenerator는 쉽게 간단한 워크플로 모델을 빌드하는 사용자에 대 한 개발 되었습니다 MATLAB 응용 프로그램. 사용자는 github RyR 시뮬레이터 저장소 링크 (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE)에서 전체 소스 코드 및 응용 프로그램 패키지를 다운로드할 수 있다. 응용 프로그램, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, MATLAB에는 응용 프로그램으로 설치할 수 있습니다. RyR 클러스터 시뮬레이터 RyR 시뮬레이터/입력-파일/마스터-셀 안에 찾을 수 있습니다 위한 RyR 시뮬레이터/입력-파일/대상-토모-셀 내부 / 추가 입력 하는 동안 메쉬 생성이 프로토콜에 대 한 입력을 찾을 수 /. 응용 프로그램을 시작 하기 전에 사용자는 설치 된 iso2mesh 폴더 및 해당 하위 폴더 MATLAB 경로에 추가 되었는지 확인 해야 합니다. 마찬가지로, R. 내 클러스터 시뮬레이터에 대 한 R-패키지 필요 (자료 테이블)는 설치도 확인

진행률 표시줄 RyR 클러스터 시뮬레이터에 대 한 입력을 생성할 때, 메시를 생성 하 고 RyR 클러스터 밀도 RyR 밀도 매퍼;를 사용 하 여 메쉬를 매핑할 때 응용 프로그램에 포함 되어 메쉬 생성 단계 결론 때 app GUI에서 3D 메쉬를 렌더링 합니다. 시 R 사용자 인터페이스에서 RyR 클러스터 시뮬레이션, 그래픽 창 (그림 10), 표시 됩니다 묘사 시뮬레이션된 3D RyR 클러스터 포인트 패턴 중 하나.

GUI에 "메시 생성" 버튼 사면체 메시를 생성 하는 iso2mesh 함수를 트리거합니다. 모델 해상도 최대 사면체 요소 볼륨 및 가장자리 길이 조정 하는 GUI에 "iso2mesh 매개 변수"를 설정 하 여 조정할 수 있습니다. 프로그램은 현재 myofibril 지역 및 미토 콘 드리 아 지역; 구성 하는 요소를 구별 이 기능은 나중에 셀의 다른 구성 요소를 포함 하도록 연장 됩니다.

사용자 이러한 단계를 문제를 해결 하는 메쉬 및 RyR 클러스터의 3D 렌더링을 사용할 수 있습니다. RyR 클러스터 시뮬레이션 설정, etol 및 numIter 설정 내부. R; RyR 클러스터 시뮬레이션의 정확도 영향을 이러한 두 매개 변수는 RyR 클러스터 패턴 시뮬레이션 종료 하는 때를 결정 합니다. 이 매개 변수는 되도록 R 창 (그림 10)에서 RyR 클러스터 배포의 검사 시 조정 될 수 있다: (i) 모든 클러스터 z-디스크; 가까이 (ii) 클러스터 분산은 어느 한 지역에서 집계 하는 것 보다는 전체 횡단면. 이러한 두 개의 매개 변수를 시뮬레이션의 임시 민감도 분석 etol와 numIter의 적절 한 조합 결정을 수행할 수 있습니다.

5 단계에서 구형 커널 강도 견적 관심 (이런이 맥락에서 3 차원 공간 모델)의 볼륨을 통해 전달 되는 커널으로 선택한 직경의 구형을 사용 합니다. 이러한 매개 변수 스무 딩 알고리즘 그림 5에 GUI에이 조정 될 수 있다: (1) r_sphere 구형 커널 스무 딩;의 반지름을 정의 합니다. (2) hval는 구형 커널 전달 되어야 합니다 반복적으로 볼륨을 통해 반복 공간 단계 크기를 정의 합니다.

그림 7에서 같이 RyR 클러스터 밀도 값의 분포를 검사 공간 조밀도 매개 변수는 충분 한 여부를 결정 하는 간단한 방법이입니다. 높은 밀도 값의 동네는 현미경 데이터에서 RyR 클러스터의 크기는 비슷한 크기 밀도 값을 배포 한다.

현재 프로토콜만 myofibrils, 미토 콘 드리 아, 및 RyR 클러스터의 실제 분포를 포함 하는 유한 요소 모델을 생성 합니다. 이 단계에 대 한 확장 ECC, sarco endoplasmic으로 칼슘 펌프 (SERCA2a), 나트륨 칼슘 교환기 (NCX), sarcolemmal 칼슘 펌프와 같은 역할을 다른 이온 채널의 배포를 시뮬레이션 하는 것입니다. 이러한 확장에 열쇠 면역 형광 검사 데이터에서 이온 채널의 공간 배급의 분석 이다. 예를 들어, NCX 채널 0.67 μ m의 평균 간격에 t 관 막에 균일 하 게 분산 측정 되었습니다 하지만 RyR 클러스터에 그들의 관계는 그렇게 분명32. 다른 한편으로, SERCA2a 대상 항 체 이전 SR33, 표시 하는 데 사용 되었습니다 하지만 문학에 SERCA2a의 공간적 밀도 보고 하지 않은. 따라서,이 단계에서 SR 네트워크 SERCA 2A 및 t-tubules 통해 NCX의 균일 한 분포는 주의 가정 수 있습니다.

대표 결과 에서처럼 결과 유한 요소 메쉬를 사용할 수 있는 유한 요소 해법34 와 함께 칼슘27 반응 보급으로를18 및 생체 신호 등 생화학 프로세스 시뮬레이션 처리합니다. 이 위해, 이온 채널 노드 메쉬 토폴로지 내에서 반응 사이트로 표시 됩니다. 반응 사이트 소스 또는 싱크를 셀의 다른 구획으로 이러한 이온 채널을 통해 화학 종의 흐름을 나타내는 다른 화학 종의 역할. 출력 메쉬 및 RyR 밀도 파일이이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다 다른 통합자 또는 다른 환경 내에서 제공 되는 소프트웨어 이러한 텍스트 파일을 인식 하는 기능. 텍스트 파일은 스크립트 또는 제 3-파티 소프트웨어 선택의 환경에의 입력된 파일 형식 요구 사항을 충족 하 여도 조작할 수 있습니다. 칼슘 역학에 첫 번째 응용 프로그램에서는 칼슘 상승 운동에 대 한이 모델의 유틸리티만 설명 하지만이 더 긴 시간의 척도에 메쉬를 사용할 수 없습니다 표시 되지 않습니다. 메쉬 및 클러스터 밀도 항상성 및 안정성만 사용 되는 유한 요소 해결사에 의존의 유지 보수와 함께 여러 칼슘 사이클 시뮬레이션을 사용할 수 있습니다.

장기 목표는 쉽게 cardiomyocytes와 다른 세포 유형 구조적으로 정확한 유한 요소 모델을 만들 수 있도록 건물 모델의이 파이프라인 개선 이다. 자동화 된 세그먼트화 알고리즘 개발 되었습니다 최근에 최소한의 사용자는 전체 셀에 myofibrils 및 미토 콘 드리 아 유통의 모델을 만드는 데 cardiomyocytes의 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 데이터에 적용할 수 있습니다. 입력된29. 이 방법은 미래에 t 관 및 SR 막 네트워크 세그먼트를 확장할 것입니다. RyR 시뮬레이터 알고리즘을 분석 하 고 시뮬레이션 높은 처리량 패션에서 다른 이온 채널 유형 사이 에서도 이온 채널 및 세포, 사이 공동 위치 사용자의 더 일반적인된 버전도 개발 중입니다. 셀의 완전 한 모델을 구축 하기 위한 완벽 한 프로토콜에는 정기적으로 현재 실험적인 접근 가능한 것 보다 세포 구조와 세포의 기능 사이의 관계에 가설 모델 기반 테스트를 수행 하는 과학자 수 있게 될 것 혼자.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 왕 사회의 뉴질랜드 마 즈 빠른 시작 그랜트 11-UOA-184, 인간 프론티어 과학 프로그램 연구 그랜트 RGP0027/2013와 오스트레일리아 연구 위원회 발견 프로젝트 교부 금 DP170101358에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2393
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405
Dextrose Sigma-Aldrich D9434
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) Merck 354400-500ML
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Tannic Acid Sigma-Aldrich 403040-500G 100g EM grade
Sodium cacodylate Sigma-Aldrich C0250
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4593
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 75632-10ML 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available)
Uranyl Acetate EM Sciences 22400 25g bottle
Potassium Ferrocyanide Merck Millipore 104973
Toluene blue Sigma-Aldrich T3260
Borax Sigma-Aldrich S9640 also termed sodium borate
Ethanol Sigma-Aldrich 792780 Diluted to different percentages with pure water
Acetone EM Sciences RT10017
Resin kit EM Sciences 14040 ACM Durcupan works well
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H9892 1Normal solution
Equipment
Ultramicrotome Leica EM UC7
Transmission electron microscope ThermoFisher Scientific Tecnai F30 http://www.leica-microsystems.com/
Retort stand Proscitech T752
Tubing BioStrategy 75831-346 for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential
Stopcocks SDR QP13813 for langendorff tubing; product is only an example, user can select any
retort stand clamps Proscitech T715
Plastic syringes SDR QPC1108 for solutions on langendorff apparatus
Cannulation silk suture, 7-0 TeleFlex 15B051000 for tieing heart on langedorff apparatus
Cannula Made from 3 mm outer-diameter steel needle
Rubber petri dish mat Proscitech H068 for use as cutting board during fixed-heart dissection
Razor blades Proscitech L056 for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing
Glass bottles BioStrategy 89000-236 for storing solutions during tissue fixation and processing for EM
Beakers BioStrategy 213-0477 for storing solutions temporarily and during perfusion
Scintillation vials BioStrategy 548-2170 for tissue samples during EM processing
Dissection kit Proscitech T161 for animal dissection
Syringe Filters Proscitech WS3-02225S for purification of Uranyl Acetate
Aluminium/silver foil baking cups From any baking products store
Dupont Diamond knife BioStrategy 102680-780 35 degree angle version produces best sections.
Colloidal Gold BBI Solutions EM. GC15 15 nm colloidal gold
EM mesh grids Proscitech GCU150 a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example
Plastic disposal pippettes Proscitech LCH20 best to use plastic disposables especially when working with resin
Software
SerialEM University of Boulder tomography acquisition
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD University of Boulder image alignment and segmentation
iso2mesh available at http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji or similar image processing software ImageJ Fiji is Just Image J available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks
RyR-Simulator codes/data CellSMB group available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGenerator CellSMB group comes with RyR-Simulator under folder "gui-version"
R-statistics software R-project Download from https://www.r-project.org
spatstat R-project install via R program
rgl R-project install via R program
doparallel R-project install via R program
foreach R-project install via R program
doSNOW R-project install via R program
iterators R-project install via R program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Tags

바이오 문제점 134 Cardiomyocyte 심장 열 대권 외의 전자 현미경 검사 법 confocal 현미경 검사 법 전산 모델링 유한 요소 모델링 시스템 생물학 칼슘 신호 미토 콘 드리 아 생체
Cardiomyocyte 시스템 생물학에서 세포 아키텍처의 역할을 연구 하기 Cardiomyocyte의 구조적으로 현실적인 유한 요소 형상 모델 생성
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajagopal, V., Bass, G., Ghosh, S.,More

Rajagopal, V., Bass, G., Ghosh, S., Hunt, H., Walker, C., Hanssen, E., Crampin, E., Soeller, C. Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology. J. Vis. Exp. (134), e56817, doi:10.3791/56817 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter